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书书书
DOI:10.3760/cma.j.issn.1673422X.2015.06.001
基金项目:昆明医科大学2013年研究生创新基金(2013N15)
作者单位:650118昆明医科大学第三附属医院干部医疗科(付凤莲),中西医结合肿瘤临床研究中心(蒋永新、刘珊、王红);昆明医科大学海
源学院病理教研室(程荫)
通信作者:蒋永新,Email:598104374@qq.com
·论著·
蒿甲醚激活 PPARγ途径抑制小鼠 Lewis肺癌细胞体外增殖和侵袭机制研究
付凤莲 蒋永新 程荫 刘珊 王红
【摘要】 目的 研究青蒿素类衍生物蒿甲醚(ARE)对小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC)体外生长和侵袭的影响,探讨其可能的作用机制。方法 采用MTT法观察ARE对LLC细胞生长的抑制效应。Transwell侵袭实验检测对照组、ARE组、GW9662[过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(PPARγ)特异性抑制剂]组和GW9662+ARE组4组LLC细胞的侵袭力。实时 PCR和 Westernblotting法检测4组细胞 PPARγ、NFκBp65、Caspase3mRNA和蛋白表达。结果 ARE呈时间和剂量依赖性方式抑制 LLC细胞生长,24、48、72hARE对LLC的IC50值分别为271.29、189.08、65.99μg/ml。4组中ARE组的荧光值最低,为1744.67,对照组为6887.00,GW9662+ARE组为4597.00,GW9662组为10012.67,表明ARE组侵袭力最弱,而且相比对照组侵袭力明显减弱(t=12.411,P=0.000)。ARE组、GW9662组PPARγmRNA相对表达量分别为2.276±0.534和0.362±0.206,与对照组相比差异均有统计学意义(t=4.785,P=0.001;t=2.395,P=0.044);ARE组PPARγ蛋白表达量为27688.33±3593.06,比对照组(17716.33±2273.95)、GW9662+ARE组(21816.00±1644.07)高(t=5.159,P=0.001;t=3.038,P=0.016)。NFκBp65mRNA表达量在 GW9662+ARE组(0.346±0.149)最低,其次为 ARE组(0.392±0.187),GW9662组最高(1.720±0.338),ARE组与对照组和GW9662组相比差异有统计学意义(t=3.592,P=0.007;t=7.851,P=0.000)。Caspase3mRNA和蛋白在各组的表达差异没有统计学意义(F=1.181,P=0.376;F=0.647,P>0.05)。结论 蒿甲醚可以通过上调PPARγ表达抑制NFκB的途径来抑制LLC细胞体外增殖和侵袭,提示PPARγ可能为肺癌治疗提供一个新的靶点。 【关键词】 青蒿素类;肺肿瘤;过氧化物酶体增殖物激活受体;核因子κB受体活化因子
ArtemetherinhibitsproliferationandinvasionviathemediationofperoxisomeproliferatoractivatedreceptorgammaactivationpathwayinLewislungcancercells FuFenglian,JiangYongxin,ChengYin,LiuShan,WangHong.DepartmentofSpecialMedicalTreatment,ThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniveristy,Kunming650118,ChinaCorrespondingauthor:JiangYongxin,Email:598104374@qq.com
【Abstract】 Objective Toinvestigatetheinhibitoryeffectofartemether(ARE),oneofartemisininderivatives,onthegrowthandinvasionofLewislungcancercells(LCCs)invitroandexplorethepossiblemechanism.Methods EffectsofAREonproliferationofLLCswereevaluatedbyMTT.TheinvasivenesswasdetectedbyTranswellinvasionassay,includingcontrol,ARE,GW9662[thespecificinhibitorofperoxisomeproliferatoractivatedreceptorγ(PPARγ)]andGW9662+AREgroup.TheexpressionlevelsofPPARγ,NFκBp65,Caspase3mRNAandproteininabovementionedfourgroupswereanalyzedbyRTPCRandWesternblotting,respectively.Results AREcouldinhibittheproliferationofLLCsintimeanddosedependentmanner,theIC50valueofwhichin24,48,and72hwere271.29,189.08,65.99μg/ml,respectively.ThefluorescentvalueofAREgroupwas1744.67,andthatofcontrolgroupwas6887.00,4597.00ofGW+AREgroup,aswellas10012.67ofGW9662group.ItmanifestedtheinvasivenessofAREgroupwastheweakest,whichdeclinedsignificantlycomparedwithcontrolgroup(t=12.411,P=0.000).TherelativequantitativeexpressionsofPPARγ
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mRNAinAREandGW9662groupwere2.276±0.534and0.362±0.026,respectively.Comparedwithcontrolgroup,PPARγmRNAlevelinbothofAREandGW9662groupreachedstatisticalsignificance(t=4.785,P=0.001;t=2.395,P=0.044).PPARγproteinexpressioninAREgroup,GW9662+AREgroupandcontrolgroupwere27688.33±3593.06,21816.00±1644.07,17716.33±2273.95,respectively,whichwashigherinAREgroupthanthatincontrolandGW+AREgroup(t=5.159,P=0.001;t=3.038,P=0.016).NFκBp65mRNAexpressioninGW9662+AREgroupwas0.346±0.149,whichinAREgroupandGW9662groupwere0.392±0.187and1.720±0.338,respectively.ThedifferencesofNFκBp65mRNAexpressionlevelbetweenARE,andcontrolorGW9662groupwerestatisticallysignificant(t=3.592,P=0.007;t=7.851,P=0.000).While,thedifferencesofCaspase3mRNAandproteinexpressionlevelsamongthefourgroupswerenotstatisticallysignificant(F=1.181,P=0.376;F=0.647,P>0.05).Conclusion AREmayrestrainNFκBthroughupregulatingPPARγtoinhibittheproliferationandinvasivepotentialofLLCinvitro,whichsuggeststhatPPARγmaybeanoveltherapeutictargetforlungcancer.
【Keywords】 Artemisinins;Lungneoplasms;Peroxisomeproliferatorsactivatedreceptors;ReceptoractivatorofnuclearfactorkappaB
近年来,多项研究[13]表明曾经用于治疗疟疾的
一线中药青蒿素类衍生物有明显的抗肿瘤活性,但具
体机制尚不十分明确。过氧化物酶体增殖物激活受
体 γ(peroxisomeproliferatoractivated receptorγ,PPARγ)是一类配体依赖的核转录因子,其在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移和逆转肿瘤细胞耐药等方
面发挥重要作用[47]。本课题组前期研究发现蒿甲醚
(artemether,ARE)与顺铂联用可协同抑制小鼠肺癌3LL细胞株的生长,ARE还能增强 Lewis肺癌小鼠的免疫功能,改善其生命质量。联合应用 ARE与顺铂可促进肿瘤细胞坏死、诱导凋亡,这可能与细胞周期
阻滞及调控细胞凋亡相关基因的表达有关[8],但
ARE抗癌作用的具体机制尚不十分明晰。本研究旨在探索 ARE的抗癌机制与 PPARγ信号途径可能的关系。
1 材料与方法11 材料
小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC)为昆明医科大学第三附属医院肿瘤研究所传代保存。
12 主要试剂与仪器注射用ARE由昆明制药集团股份有限公司提
供,产品批号:2011122801。PPARγ特异性抑制剂GW9662购自美国 Sigma公司,产品编号:M6191。FBS、DMEM高糖培养基购自美国 Hyclone公司。QCMTM24wellCellInvasionAssay(Fluorometric)(ECM554)购自美国Chemicon公司,该试剂盒本身配备有24孔板、细胞分离液、4×LysisBuffer和CyQuantGRDye,每个24孔板带12个有包被基质胶的聚碳酸酯膜小室,CyQuantGRDye与细胞的核酸结合能发绿色荧光。qRTPCR试剂盒为广州复能公司产品。PPARγ一抗(产品编号:07466)、核转录因子κB
(NFκB)P65一抗(产品编号:06418)、Caspase3氨基酸104~117一抗(产品编号:AB3640)、β肌动蛋白(βactin)一抗(产品编号:041116)和羊抗兔二抗(产品编号:AP307P)为美国 Millipore公司产品。主要仪器包括Therom普通酶标仪、Tecan荧光酶标仪、Leica荧光显微镜、ABIPCR仪和定量PCR仪。13 方法131 细胞培养:将 LLC细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于含5%CO2、37℃的培养箱中常规培养,每1~2天换液1次。132 MTT法测定 ARE及 GW9662对 LLC细胞生长的抑制作用:取对数生长期的细胞,消化离心后进
行细胞计数,调整细胞密度为 5×104个/ml,以200μl/孔接种于96孔板中央孔内,周边孔加磷酸盐缓冲液。实验分为空白组只加培养基;溶剂组为培养
细胞或培养细胞加0.1%DMSO;实验组分别加入不同浓度的 ARE或 GW9662。每种实验药物(ARE和GW9662)设6个浓度,每个浓度设6个复孔。实验组ARE的浓度梯度为1000、500、250、125、62.5、31.3μg/ml(60mgARE先用5ml生理盐水完全溶解,再用55ml培养基稀释至1mg/ml,使用前用培养基稀释到所需浓度),GW9662的浓度梯度为 40、20、10、5、2.5、1.25μmol/L(5mgGW9662用450μlDMSO充分溶解,使用前先取50μl母液,用50ml培养基稀释配成40μmol/LGW9662)。待细胞贴壁生长达80%左右,吸去旧的培养液,加药孔分别加入不同浓度的含药培
养基200μl,分别培养24、48、72h。到达培养时间后,每孔加入新鲜配制的5mg/mlMTT溶液20μl,继续培养 4h后取出,小心吸去孔内液体,各孔加入DMSO150μl,振荡10min,使沉淀充分溶解。用酶标仪测定波长为490nm处的吸光度(A)值,并求均值。
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根据如下公式计算抑制率并求出半数抑制浓度
(IC50):抑制率 =[1-(A实验组 -A空白组)/(A溶剂组 -A空白组)]×100%,lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4],Xm为 lg最大剂量,I为 lg(最大剂量/相邻剂量),P为抑制率之和,Pm为最大抑制率,Pn为最小抑制率。
133 Transwell法检测4组细胞侵袭力:取对数生长期细胞,以2×105个/ml的密度接种于6孔板,每孔加入2ml细胞悬液。待 6孔板中细胞融合度达80%左 右 时 分 别 加 入 以 下 药 物,GW9662组:20μmol/LGW96622ml,ARE组:125μg/mlARE2ml,GW9662+ARE组:先用 40μmol/LGW96621ml处理30min后,再加入250μg/mlARE1ml,对照组:仅更换培养基。培养24h后,将4组细胞分别消化离心(离心半径为15cm,转速为1000r/min)5min,用磷酸盐缓冲液洗 1~2遍,再分别以不含FBS的 DMEM培养液重悬细胞进行计数,调整细胞密度为5×105个/ml,每个小室接种250μl。向小室下层(即24孔板中)加入含10%胎牛血清的 DMEM培养液500μl,将 24孔板置于培养箱中培养。24h后小心吸出小室上层的细胞悬液,将每个小室置于其
他孔,向孔中加入预热的细胞分离液225μl,在37℃温育30min;在温育过程中倾斜24孔板来回多次使小室膜底部的侵袭细胞完全被驱散出来,弃除小室。
用4×LysisBuffer以75∶1的比例稀释 CyQuantGRDye(例如:4μlDye用300μlBuffer来稀释),向含225μl细胞分离液的孔中加入75μl的 LysisBuffer/Dye混合液,在室温下孵育15min。在荧光显微镜下观察4个孔的荧光数。再分别转移每孔中200μl混合液到 Greiner96孔板,在荧光酶标仪上 480nm/520nm(激发光/发射光波长)过滤设置下读数。134 RTPCR检 测 4组 细 胞 PPARγ、NFκB、Caspase3mRNA表达:常规培养 LLC细胞,待培养瓶中细胞融合度达80%左右时分别加入以下药物,GW9662组加入20μmol/LGW96625ml,ARE组加入 125μg/mlARE5ml,GW9662+ARE组先用40μmol/LGW96622.5ml预处理30min后,再加入250μg/mlARE2.5ml,而对照组仅予以更换培养液,培养24h后按照上述方法换液继续培养。48h后,按照InvitrogenTrizol试剂盒提取细胞总 RNA,提取RNA溶解后,用紫外分光光度仪测RNA纯度和浓度(A260/A280>2.0)。将 RNA按照反转录试剂盒反转录成 cDNA进行定量 PCR。PCR扩增条件为:95℃预变性 10min,95℃ 变性 15s,60℃ 复性
1min,共40个循环。产物用1%的琼脂糖凝胶进行
检测。
135 Westernblotting检测 4组细胞 PPARγ、NFκB、Caspase3蛋白水平:按上述方法分组处理细胞,培养48h后,提取细胞总蛋白,经BioRad法定量蛋白,取10μg总蛋白上样,经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)后,转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭 3~4h,4℃与 βactin、PPARγ、Caspase3氨基酸104117、NFκBP65一抗孵育过夜,辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗室温下孵育
2h,充分洗膜后用DAB显色并拍照。14 统计学方法
每组实验均重复3次以上,数据以x±s表示,采用SPSS17.0软件进行统计分析,采用单因素方差分析和LSD法,以P<0.05为差异有统计学意义。2 结果21 ARE和GW9662对LLC细胞的生长抑制作用
由图1可见,ARE对LLC细胞生长有抑制作用,且呈现出一定的剂量和时间依赖性。根据抑制率计
算出 ARE对 LLC在 24、48、72h的 IC50值分别为271.29、189.08、65.99μg/ml。GW9662对 LLC没有抑制作用,抑制率见表1。
注:ARE为蒿甲醚;LLC为小鼠Lewis肺癌细胞株
图1 ARE对LLC细胞抑制作用的量效时效关系曲线
表1 不同浓度GW9662对LLC细胞在不同时间的抑制率
GW9662浓度(μmol/l) 24h 48h 72h
40 -0.616 -0.294 -0.503
20 -0.514 -0.202 -0.501
10 -0.510 -0.144 -0.458
5 -0.317 -0.010 -0.401
2.5 -0.136 -0.124 -0.330
1.25 -0.710 -0.171 -0.325
注:GW9662为过氧化物酶体增殖物激活受体 γ特异性抑制剂;
LLC为小鼠Lewis肺癌细胞株;-表示 GW9662对 LLC细胞生长无抑
制作用
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22 4组细胞侵袭力的变化荧光显微镜下 4组细胞碎片的荧光见图 2,
GW9662组细胞碎片的荧光最多,为10012.67,其次为对照组,再次为 GW+ARE组,ARE组最少。ARE组的荧光值为1744.67,相比对照组(6887.00)明显下降(t=12.411,P=0.000),而 GW +ARE组为4597.00,相比对照组稍微下降(t=5.527,P=0.001),但仍要远远高于 ARE组(t=6.884,P=0.000)。
注:A为对照组;B为GW9662组;C为GW9662+ARE组;
D为ARE组;GW9662为过氧化物酶体增殖物激活受体γ特异性
抑制剂;ARE为蒿甲醚
图2 荧光显微镜下4组细胞碎片的荧光×400
23 4组细胞PPARγ、Caspase3和NFκBp65mRNA相对表达量
4组细胞PPARγ、Caspase3和NFκBp65mRNA相对表达量见表2。ARE组PPARγmRNA表达较对照组显著升高(t=4.785,P=0.001),GW9662组和GW+ARE组 PPARγmRNA表达量较对照组下降(t=2.395,P=0.044;t=1.037,P=0.330)。ARE组NFκBp65mRNA表达较对照组降低(t=3.592,P=0.007),相比 GW9662组明显下降(t=7.851,P<0.01)。Caspase3mRNA表达量各组间差异没有统计学意义(F=1.181,P=0.376)。
表2 4组细胞中PPARγ、Caspase3、NFκBp65基因相对表达量(x±s)
组别 PPARγ Caspase3 NFκBp65
对照组 1 1 1
GW9662组 0.362±0.206 4.572±4.473 1.720±0.338
GW9662+ARE组 0.723±0.314 1.395±1.034 0.346±0.149
ARE组 2.276±0.534 1.996±2.272 0.392±0.187
注:GW9662为过氧化物酶体增殖物激活受体 γ特异性抑制剂;
ARE为蒿甲醚;PPARγ为过氧化物酶体增殖物激活受体 γ;NFκB为
核转录因子κB;Caspase3为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3
24 4组细胞 PPARγ、NFκBP65、Caspase3蛋白水平
3种蛋白的表达量见图3和表3。PPARγ蛋白在ARE组较对照组明显升高(t=5.159,P=0.001),而GW9662组表达量较对照组降低(t=2.127,P>0.05),GW9662+ARE组PPARγ蛋白水平较ARE组下降(t=3.038,P=0.016),但比对照组表达量高(t=2.121,P>0.05)。Caspase3表达量在各组间的差异没有统计学意义(F=0.647,P>0.05),各组间NFκBP65蛋白表达水平与RTPCR结果基本一致。
注:1为对照组;2为GW9662组;3为GW9662+ARE组;4为ARE
组;PPARγ为过氧化物酶体增殖物激活受体γ;GW9662为PPARγ
特异性抑制剂;NFκB为核转录因子κB;Caspase3为半胱氨酸
天冬氨酸蛋白酶3
图3 4组细胞中3个蛋白表达水平
表3 Westernblotting方法检测4组细胞中PPARγ、NFκBP65、Caspase3蛋白的灰度值(x±s)
组别 PPARγ NFκBP65 Caspase3
对照组 17716.33±2273.95 54528.67±5296.58 10883.54±947.76
GW9662组 13605.00±1278.03 58325.67±7160.60 11765.57±1597.84
GW9662+ARE组 21816.00±1644.07 48785.00±697.68 10023.49±674.93
ARE组 27688.33±3593.06 47851.00±1709.44 10496.49±837.64
注:PPARγ为过氧化物酶体增殖物激活受体γ;GW9662为PPARγ特异性抑制剂;ARE为蒿甲醚;NFκB为核转录因子κB;Caspase3为半胱
氨酸天冬氨酸蛋白酶3
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3 讨论有研究[910]报道PPARγ在多种肿瘤组织较正常
组织高表达,与肿瘤临床分期密切相关,提示 PPARγ在肿瘤的发生发展中起重要作用。众多学者[1113]发
现PPARγ激动剂如罗格列酮、环格列酮等能通过多种途径抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡以及抑制细
胞侵袭和远处转移。因此,作者设想 ARE抑癌作用机制与PPARγ可能有内在的联系。本研究 MTT实验显示ARE能抑制 LLC细胞的体外增殖,且抑制作用呈剂量和时间依赖性。侵袭实验发现经ARE处理后的LLC细胞较对照组细胞的侵袭能力明显减弱(P<0.01),证明了 ARE能显著抑制肺癌细胞的体外侵袭力。先用GW9662预处理再用ARE作用的细胞较对照组细胞侵袭力下降(P<0.01),但比 ARE组的侵袭力仍然要高得多(P<0.01),说明 GW9662可以逆转ARE对肺癌细胞的侵袭抑制作用。推测可能是GW9662抑制了 PPARγ的活性,ARE不能有效地与PPARγ结合进而无法完全发挥抑制肿瘤细胞侵袭力的效应,这提示ARE可能是通过激活PPARγ来抑制肺癌细胞体外侵袭的。有研究[14]证实 PPARγ激活剂曲格列酮可以通过PPARγ途径来抑制乳腺癌细胞的体外生长。祝海等[9]发现曲格列酮作用前列
腺癌细胞PC3后PPARγ的表达上调,进而呈剂量依赖性抑制癌细胞增殖,加速细胞凋亡。另外,沈波和
聂玉强[15]用腺病毒转染使肝癌细胞高表达 PPARγ,发现其能明显抑制癌细胞增殖分化,诱导细胞凋亡,
而且能够显著降低肝癌细胞的运动和侵袭能力。
诸多报道阐明 PPARγ的抗癌效应可能与Caspase、NFκB信号途径相关。刘加军等[16]研究发
现PPARγ激动剂罗格列酮可显著抑制白血病 NB4细胞生长,同时检测到 Casapse3被活化出现相对分子质量20000亚单位片段,表明通过 PPARγ信号途径激活 Casapse3可能是其诱导 NB4细胞发生凋亡的重要作用机制之一。Lee等[17]研究发现PPARγ激动剂能通过上调其表达、抑制 NFκB来阻断人前列腺癌细胞生长。
因此,作者设想ARE激活PPARγ抑制肺癌细胞增殖和侵袭的机制是否与 Caspase3活化、NFκB活性受抑制有关联,于是课题组进一步检测用 ARE、GW9662、先用GW9662处理再用ARE作用的LLC以及对照LLC这4组细胞 PPARγ、Caspase3和 NFκBp65mRNA和蛋白表达水平,结果表明:ARE作用后细胞 PPARγ表达水平较对照组显著升高(P<0.01),说明ARE能增强LLC细胞中PPARγ的表达;而GW9662+ARE组 PPARγ表达量较对照组下降,
同ARE组相比也明显减弱(P<0.01),表明GW9662逆转了ARE增强PPARγ表达的作用。另外,ARE组NFκB表达量较对照组降低(P=0.007),相比GW9662组明显下降(P<0.01),提示可能ARE增强PPARγ活性后,通过对抗 NFκB来发挥抗肿瘤的作用。但是在GW9662+ARE组,NFκB表达量比ARE组还要低(P>0.05),因此课题组高度怀疑 ARE还可能通过其他途径来抑制肿瘤生长和侵袭。NFκB在NSCLC组织中高表达,能促进肿瘤的发生、进展和上皮向间充质转变,进而促进远处转移[18],而敲除
NFκBp65亚基能通过诱导细胞凋亡显著抑制 Lewis肺癌小鼠移植瘤的生长[19]。Caspase3表达量各组间差异没有统计学意义,推测 ARE抗肿瘤效应与Caspase3可能没有直接的关联。
本研究证实了ARE能抑制肺癌细胞的体外生长和侵袭,显著上调 PPARγ的表达,说明 ARE能通过激活PPARγ来发挥抗肿瘤作用。同时,也发现 ARE能抑制 NFκB的表达量,但这种抑制作用未能被PPARγ特异性抑制剂 GW9662逆转,提示 ARE可能既可以通过上调 PPARγ表达抑制 NFκB的活性,还可以通过其他途径来抑制 NFκB表达。当然,这需要更深层次的研究来揭开这些纷繁复杂的关系网。
Ban等[13]证实 PPARγ激动剂曲格列酮通过糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase3β,GSK3β)介导阻断NFκB活性来抑制人结肠癌细胞生长,而GSK3β是激活 NFκB的一个必需成分。本实验发现ARE激活 PPARγ后下调 NFκB的表达可能是其抗肿瘤作用的机制,这与 Ban等[13]的实验结论也相
当吻合。NFκB是一个重要的转录因子,通过调节多种靶基因如 CyclinD1、Bax、Caspase3、Caspase9和Survivin等发挥抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡的作用。PPARγ与NFκB相互作用后阻断后者的激活,这为NFκB转位到核内并进一步调控其相关靶基因的表达埋下伏笔。用抑制剂或者RNAi使GSK3β失活可以阻止 NFκB的 p5和 p50亚基核转位进而减少NFκBDNA结合活性[20]。
ARE为何能介导 PPARγ的表达?如何介导PPARγ的表达?能否充当后者的配体与之结合激活其表达?ARE能否与 PPARγ信号通路沟通联系?这些都需要进一步探索。另外,从本研究中可能得到
启示,能调节PPARγ信号级联的药物可能对肿瘤的治疗有巨大前景。
参 考 文 献
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(收稿日期:20141125 修回日期:20150215)
(本文编辑:孙娜)
·读者·作者·编者
本刊有关文稿中法定计量单位的书写要求
本刊法定计量单位具体使用要求参照2001年中华医学会杂志社编写的《法定计量单位在医学上的应用》第三版一书。注意单位名称与单位符号不可混合使用,如ng·kg-1·天 -1应改为ng·kg-1·d-1,组合单位符号中表示相除的斜线多于1条时,应采用负数幂的形式表示,如ng/kg/min应采用ng·kg-1·min-1的形式;组合单位中斜线和负数幂亦不可混用,如前例不宜采用ng/kg·min-1的形式。在首次出现不常用的法定计量单位出用括号加注与旧制单位的换算系数,下文再次出现时只列法定计量单位,人体及动物体内的压力单位使用mmHg或cmH2O,但文中首次出现时用括号加注(1mmHg=0.133kPa)。正文中时间的表达,凡前面带有具体数据者应采用d、h、min、s,而不用天、小时、分钟、秒。量的符号一律用斜体字母。
本刊编辑部
·604· 国际肿瘤学杂志2015年6月第42卷第6期 JIntOncol,June2015,Vol42,No6