مطالعۀ آنزیمی و بیوانفورماتیکی باکتری های بومی کوتینازی · Mortazavi et al. An enzymatic and bioinformatic study of cutinase bacteria

39 39/

های نوین در علوم زیستییافته (1398) 49الي 39، صفحات 1، شماره ٦جلد

انتشارات دانشگاه خوارزمي

Nova Biologica Reperta 6(1): 39-49 (2019)

Print ISSN: 2423-6330/Online ISSN: 2476-7115

https://nbr.khu.ac.ir; Kharazmi University Press

های بومی کوتینازی یمی و بیوانفورماتیکی باکتریمطالعۀ آنز

یمسعود ترکزاده ماهان و پرورش نینسری، مرتضو یمجتب ، ایرانکرمان شرفته،یپ یو فناور يصنعت يلیتکم التیدانشگاه تحص ،يطیو علوم مح شرفتهیپ یپژوهشگاه علوم و تکنولوژ ،يطیپژوهشکده علوم مح ،یوتکنولوژیگروه ب

[email protected] ی،مرتضو يمجتب :مکاتبات لئومس

زا ایفرا حفاظت از گیاهان در برابرر عوامرب بیمراری نقش کلیدی درو د آمدهوجواز تراکم و اکسیدشدن اسیدهای چرب در گیاهان به که است یمریپل نیکوت .چکیده

کنندۀ آنزیم های تولیدهدف این پژوهش استخراج کوتین سیب قرمز، بررسي فعالیت باکتری .کندمي تجزیه را کوتین که است دروالزیهی آنزیم یک کوتیناز کند.مي

ای هراگرزاالت، کروتین جداسرازی شرد. سریه سرویه سیب قرمز و به کمرک برافر های بیوانفورماتیکي است. بدین منظور، از پوست میوهو تحلیب LBکوتیناز در محیط

کشرت داده LBداده شدند. په از کشت اولیه، باکتریها را در محیط حیتلقکوتین کشت طیمح یحاو یهاتیداخب پل اند، درتولیدکنندۀ آنزیم که قبالً جداسازی شده

شرده شرش ی بیوانفورمراتیکي، تروالي جداسرازیهرامنظور انجام تحلیرببهها سنجیده شد. و به کمک سوبسترای اختصاصي پارانیتروفنول بوتیرات فعالیت کوتینازی نمونه

هرای تولیدکننردۀ سریه، تروالي آنزیمري نمونره. تحلیب شد و درخت فیلوژنتیکي هرر تروالي تهیره شردهای محاسباتي نمونۀ باکتریایي تولیدکنندۀ آنزیم کوتیناز در پایگاه

انرد. در ادامره، نشان داد که کوتینازهرای پروکراریوتي از یوکراریوتي جردا شرده شد. نتایج ها تحلیبکوتیناز بررسي و با رسم درخت فیلوژنتیکي میزان شباهت این توالي

شد. این تحلیب نشان داد که تروالي جدیرد در نییها تعگونه نیا يکیلوژنتیروابط ف جدید، ارزیابي شده و هایبه همراه توالي نمونه هانمونه نیا 16S rDNAتوالي ناحیه

هرا، ممکرن اسرت شده، از نظر ساختار و کارکرد با آنزیم کوتیناز ایرن براکتریهای شناسایيگیرد؛ بنابراین، احتماالً آنزیم کوتیناز نمونهریایي قرار ميهای باکتکنار نمونه

شباهت زیادی داشته باشد.

ي، کلبسیالکیلوژنتیدرخت فاینتروباکتر، ، ، اسیلیت تری فور، نازیکوت میآنز های کلیدی.واژه

An enzymatic and bioinformatic study of native cutinase bacteria

Mojtaba Mortazavi, Nasrin Parvaresh, & Masoud Torkzadeh-Mahani Department of Biotechnology, Institute of Science and High Technology and Environmental Science, Graduate

University of Advanced Technology, Kerman, Iran Correspondent author: Mojtaba Mortazavi, [email protected]

Abstract. Cutin is a polymer that is constructed in plants by the condensation and oxidation of fatty acids and plays a

key role in the protection of plants against pathogens. Cutinase is a hydrolase enzyme that breaks down the cutin. The

purpose of this study was to extract cutin from red apples with oxalate buffer, cutinase enzyme activity assay in LB

culture, and bioinformatic analysis. To attain these purposes the cutinase-producing strains that had previously been

isolated were inoculated in culture medium containing cutin. After initial culture, the bacteria were cultured in LB

medium and cutinase activity was measured using the p-Nitrophenyl butyrate. In order to execute bioinformatic

analysis, the isolated sequences of six cutinase-producing bacteria were analyzed based on computational data bases

and their phylogenetic trees were prepared. Then, the similarities in the sequences of a large number of cutinase-

producing samples were analyzed by drawing the phylogenetic tree. The results showed the separation of cutinase-

producing prokaryotes from cutinase-producing eukaryotes. Then, the sequence of 16S rDNA of these cutinase-

producing samples as well as the samples we had prepared were evaluated and their phylogenetic relationships were

determined. This analysis showed that the new sequence stood alongside the bacterial samples. Thus, our cutinases may

be similar with these bacterial cutinases in structure and function. Keywords. cutinase enzyme, enterobacter, Klebsiella, phylogenetic tree, SplitsTree4

Received 05.04.2017/ Revised 10.09.2018/ Accepted 25.09.2018 / Published 01.05.2019 11/02/1398انتشار /03/07/1397پذیرش /19/0٦/1397اصالح /1٦/01/139٦دریافت

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]

https://nbr.khu.ac.ir/article-1-2802-fa.html

http://dx.doi.org/10.29252/nbr.6.1.39

Mortazavi et al. An enzymatic and bioinformatic study of cutinase bacteriaناز کوتیمرتضوی و همکاران. مطالعۀ آنزیمی و بیوانفورماتیکی باکتری

40 40/

مقدمه ترشح مستلزم هامیکروارگانیسم توسط گیاهي پلیمرهای از استفاده

. (Fich et al., 2016) استکوتیناز همانند هیدروالزی هایآنزیم

-و پلي (Heredia, 2003) استرها انواع هیدرولیز توانایي کوتیناز

.(Degani et al., 2006) داراست را کوتین مانند کوچک استرهای

یایهبوده و ساختمان چندال یکولکوت ۀدهندیبتشک يجزء اصل ینکوت

یهارا در قسمت یدرماپ یهاسلول یوارۀد يکه در سطح خارج دارد

,Kutschera & Niklas) پوشانديم يعلف یاهانهمه گ یيهوا

یدهایاس یدشدناست که از تراکم و اکس یاادهم ین. کوت(2007

است که اییچیدهچرب پ ۀماد و آیديبه وجود م یاهانچرب در گ

Carvalho et) است یردر مقابب آب نفوذناپذ توجهي درخورطور به

al., 1998). آنزیمي سرین استرازها است و ۀکوتیناز متعلق به رست

& LIN)والزها است یک عضو از باالخانواده الفا/ بتا هیدر

Kolattukudy, 1980) .یساختار این آنزیم شامب صفحات بتا

دو یا سه هلیکه در دو بامرکزی شامب پنج رشته موازی است که

کوتیناز . (Tenhaken et al., 1997) طرف صفحه پوشیده شده است

شده بسیار محافظت ۀرزیدو و صفحات بتای کشید 197یک پروتئین با

دهند که در چهار سیستئین ثابت تشکیب دو پب سولفیدی ميدارد که با

,.Jelsch et al)کند مي ایفاتمامیت ایجاد ساختار کلي نقش مهمي

دارویي مواد افزایش اثر موجباستفاده از آنزیم کوتیناز . (1998

لییولیتیک يآنزیم ۀمثابکوتیناز به از شیمیایي کشاورزی شده و همچنین

(Carvalho et al., 1998) لباس و ظرف برای ۀدر مواد شویند

ۀمنزل به محیطيزیست هایآلودگي حذف و زدایيچربي

biocatalyst یک وbioprocesses استفاده بیوتکنولوژی در صنعتي

-ازبین توانایي سبز آنزیم مثب آنزیم این. (Okkels, 1997) است شده

-پلي مانند هایيیکپالست تواندمي و دارد را استریپلي هایزباله بردن

Abou-Zeid) کند یهبه محصوالت محلول در آب تجز کاپروالکتون

et al., 2004) .در شرکت ازکاربردهای کوتیناز عبارت است دیگر

به توانمي آنها ازجملۀ که است هیدرولیتیک و سنتزی هایواکنش

ساختاری گلیسریدهایتری سنتز و لبني صنایع در شیر چربي هیدرولیز

در کوتیناز هایآنزیم. (Carvalho et al., 1998)اره کرد اش

هایگونه کوتیناز هایآنزیم اما اندشده مطالعه هاقارچ و هاباکتری

Van) اندگرفته قرار بررسي تحت کمتری میزان به تاکنون باکتریایي

der Vlugt-Bergmans et al., 2004).

ینچنررد از تینررازکو آنررزیم یسررتاليسرراختار کر یررراخ هررایدر سررال

,.Longhi et al) پستانداران گزارش شده است ییازو ل یکروارگانیزمم

انجرام يسروالن یرومقارچ فوزار ینازمطالعات روی کوت بیشترین. (1996

,.Martinez et al) اسرت شرده یرانکلرون و ب E.coliدر کره شرده

و زسرنت و آنزیم این بیوتکنولوژی ایکاربرده گسترۀ به توجه با. (1993

مرورد یاربیوتکنولوژی بسر ۀترکیبات مختلف، این آنزیم در حوز ۀتجزی

همرین در. (Raziyafathima et al., 2016) توجه قرار گرفتره اسرت

انردشرده شناسایي آنزیم این بومي باکتریایي نمونۀ چند تازگي به راستا،

:دو ۀشررمار ۀنمونرر KP893565.1: کیرر ۀشررمار ۀنمونرر ثبررت:)شررماره

KT795107.1، سرره: ۀشررمار ۀنمونررKT795108.1، ۀشررمار ۀنمونرر

ۀنمونرر ،KT795109.1 :پررنج ۀشررمار ۀنمونرر ،KT692943.1چهررار:

یرنا ۀدر ادام .(Parvaresh et al., 2017) (ثبت حال در: شش ۀشمار

بومي هایسویهآنزیمي یتفعال یزانم و قرمز یبس ینکوت یزانمطالعه، م

مطالعرات د. همچنرین،شر يبررسر LBکشت یطدر مح شدهجداسازی

پروکراریوتي و یوکراریوتي هرایسرویه بررسي قبیب از بیوانفورماتیکي،

جایگراه بررسري و فیلروژنتیکي درخت رسم کوتیناز، آنزیم تولیدکنندۀ

انجرام نیز ي،درخت تکامل یناین آنزیم در ا ۀبومي تولیدکنند هایسویه

شد.

هاروش و مواد اصی تهیۀ کوتین و محیط کشت اختص

توسررط پرررورش و شرردهگررزارش روش طبررق کرروتین، ۀتهیرر منظرروربرره

هیرته قرمز بیس مرحله سه در ، (Parvaresh et al., 2017) همکاران

اگزالیررکگرررم 2) اگررزاالت بررافر در کررردن،وزن از بعررد آن پوسرت و

چهرار مردت بره( آب لیترر میلري 500 اگرزاالت، آمونیومگرم 8 اسید،

بعرد و هشرد وزن لترشدهیف محصول سیه،. شد رفیلت و جوشانده ساعت

فرررموکلر محلررولدر (Sebastião et al., 1993) شرردنخشررک از

افرزودن آب و سرانتریفیوژ اشد. سریه، بر ختهیر 1 به 2 نسبت به متانول

. بره شرد حاصرب کروتین ترا کررده خشک را جداشده زیری فازکردن،

بررای محیط کشت اختصاصي حراوی کروتین کی ن،یکوت نیکمک ا

.شرد هیته کوتیناز آنزیم ۀتولیدکنند شدهیيشناسا هاینمونه مجدد رشد

نیرا در (Parvaresh et al., 2017) شردهیيشناسرا یهرانمونره سیه

شریکرانکوباتور در روز 5 ترا 3 مدت به و داده کشت ياختصاص طیمح

Gerard et) ندشد داده قرار rpm 150و گراديسانت ۀدرج 30 دمای با

al., 1993).

LBتهیۀ محیط کشت

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]



Nova Biologica Reperta 6(1): 39-49 (2019) (1398) 39-49: 1 ، شمارۀ:6زیستی، جلد های نوین در علومیافته

41 41/

گررم 10گررم مخمرر، Broth LB-، 5 کشرت محریط ۀتهیر منظروربه

کیر حجرم به مقطر آب با و شده اضافه هم به NaClگرم 5ترییتون و

بعرد Broth LB کشرت محیطاز لیترمیلي 5. شد اتوکالو و رسانده لیتر

هررایهنررو نمو هشررد ختررهیر لیترررمیلرري 50 هررایفالکون در اترروکالو از

در ا آنهرا ر. سریه ندانتقرال داده شرد هراقبب، بره آن ۀرشدکرده در مرحل

در نهراآ جرذب زانیرم ها،نمونه رشد از بعد و دادهشیکر انکوباتور قرار

ایرن در نرازیکوت میآنرز تیرفعال در ادامرهشد. یریگاندازه نانومتر 405

.شد يبررس هانمونه

سنجش آنزیمی

نرور کره ،آنزیمي از دسرتگاه اسریکتروفتومتر سنجش فعالیت منظوربه

هرایفرالکون. شرد اسرتفاده ،آوردوجود ميثابت با طول موج دلخواه به

دور 9000در دسرتگاه سرانتریفیوژ در دقیقره 10حاوی نمونه بره مردت

و دو طبرق کیدو بافر يمیآنز تیشدند. برای سنجش فعالعسانتریفیوژ

در سرریه، .(Parvaresh et al., 2017) شررد هیررته مطالعررات قبلرري

150میکرولیتر برافر دو و 100میکرولیتر بافر یک، 750کووت دستگاه

قبرب ۀمرحلر ۀموجود در محیط مایع سرانتریفیوژ شرد ۀمیکرولیتر از نمون

ۀمیکرولیترر از هرر نمونر Blank، 200 یرۀته یشد. همچنین، بررا ختهیر

قیقره در آب در د 5و بره مردت ختهییک ویال ر درموجود در فالکون

100میکرولیترر برافر یرک و 700حال جوش گذاشته و سریه بره آنهرا

ۀ. بعرد از تهیر(Parvaresh et al., 2017) میکرولیتر بافر دو اضافه شد

هرر قره،یدق سرتیب کوتینرازی، فعالیرت يبررس منظوربه Blankنمونه و

,.Calado et al) خوانده شد هانمونه جذب میزان بار کی قهیدق کی

هرر فعالیرت يمنحن و شده Excel ۀوارد برنام هاداده نهایت در. (2002

.شد يبررس آنزیم

های بیوانفورماتیکتحلیل

هرا در ابتردا بره کمرک پایگراه نمونره يبیوانفورمراتیک بیرمنظور تحلبه

-http://umr5558-bibiserv.univ ایاطالعرررررررراتي محاسرررررررربه

lyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi بیرشش نمونه تحل نیا یۀناح یهاتوالي

هرر فیلروژنتیکي روابرط تیسا نیا .(Flandrois et al., 2015) شدند

داده و ابرزار یها گاهیاز پا یمجموعه ا کرده و مشخص کامالً را يتوال

فراهم ي وتیپروکار يتوال کیلوژنتیخودکار ف بیو تحل هیتجز یوب برا

یگراه اطالعراتيپاایرن . در(Flandrois et al., 2015) اسرتکررده

يبررسر شردهثبرت یهرايتوال ریسا با شباهت نظر از را يتوال هر گاهیجا

ادامره، در. شرودداده مري شینمرا يکیلروژنتیف درخت صورتبه و شده

مطالعه و يوتیپروکار و يوتیوکاری نازیکوت میآنز ۀدکنندیتول یهاگونه

-جمرع آنهرا اطالعرات ریسرا و یانرهیآم دیاس يتوال و هاثبت ژن ۀشمار

و شرباهت زانیرم SplitsTree4 افرزارنررم کمک به سیه،. شد یآور

ن،یهمچنر .(Huson & Bryant, 2006) شرد بیرآنهرا تحل يترادفهم

برنامره SplitsTree4 افزارنرم .شد نییتع هاگونه نیا يکیلوژنتیف روابط

يتروال یهااز داده شهیبدون ر کیلوژنتیف یهامحاسبه شبکه یبرا شرویپ

ایرفاصرله هیهرا، مراتريتروال یتررازاسرت. برا توجره بره هرم يولکولم

شرربکه کیرر ایرردرخررت کیرربرنامرره نیررااز درخترران، یامجموعرره

ۀشرربک م،یتقسرر میماننررد تقسرر یيهررارا بررا اسررتفاده از روش يکیلرروژنتیف

محاسرربه یهرراروش ایررابرشرربکه یهررااجمرراع، روش ۀبکشرر ه،یهمسررا

نیا ن،یچنهمکند. يساده محاسبه م بینوترک یهاشبکه ای ونیداسیبریه

قابرب انجرام زیرن MEGA 6هماننرد یگرید یافزارهانرم در محاسبات

-بره هانمونه نیا srDNA 1٦ هیناح يشباهت توال زانیادامه، م دراست.

يابیرارز میآنرز ۀدکنندیتول يبوم یۀسو srDNA 1٦ یۀناح يتوال همراه

آنها رسم شد. يکیلوژنتیو درخت ف شده

جینتا مطالعۀ کوتین

اگرزاالت برافر در سراعت 4 مردتقرمرز بره بیس پوست جوشاندن با

در شرکب خمیرری ایمرادهایرن . سریه تهیه شرد شکب خمیری ایماده

تهیره ماننرد آرد پرودر و شرودمي آسیاب دستگاه با و شده خشک ونآ

-يمر مخلرو مترانول -کلروفرم محلول در آسیاب از حاصب پودر شد.

-يمر خشرک اون در و شوديم جدا زیری فاز سانتریفیوژ از بعد و ودش

میروۀ سریب، وزن پوسرت میروه، وزن میزانکه همان کوتین است. شود

شرده، وزن کروتین وزن پوست په از جوشاندن، وزن پوسرت آسریاب

طرور نترایج نشران داد کره بره گرزارش شرد. 1در جردول نهایي و بازده

گررم کروتین وجرود میلري 5/8قرمرز میانگین در هر گرم پوسرت سریب

داشت.

LB یطکوتیناز در مح یفعالیت آنزیم

یطدر محر شردهیغربرالگر یهرایبراکتر یمآنز یتسنجش فعال یبرا

در کشت داده شردند. LB طیو سیه در مح نیکوت يکشت اختصاص

. از لحظه صفر افزایش شد هیهت Blank یالو یکنمونه و در یالو یک

یرکدقیقه، هرر ستیببه مدت PNPB یسوبسترا یهزتج یبدلجذب به

طرول مروج در PNPBتغییرات جذب سوبسرترای یزانم بار یک یقهدق

. (Pocalyko & Tallman, 1998) شرد گیرریانردازهنرانومتر 405

. شدند محاسبه هایمآنز یتسیه با رسم کردارهای مربوطه میزان فعال

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]




42 42/

.کوتین وزن )بر حسب گرم( بررسي میزان -1جدول

Table 1. The study of cutin weight (in grams). بازده کوتین پودر پوست پوست جوشانده پوست

4/8 90/0 88/1 3/80 10٦ 1نمونۀ

٦/8 95/0 95/1 5/8٦ 110 2نمونۀ

4/8 9٦/0 99/1 7/88 114 3نمونۀ

.LBمحیط کشت شده درهای جداسازینمونه PNPBمیزان تغییرات جذب -1شکل

Fig. 1. The absorption changes of PNPB of isolated samples in the LB medium.

2نمونۀ شمارۀ

1شمارۀ نمونۀ

3نمونۀ شمارۀ 4نمونۀ شمارۀ

5 نمونۀ شمارۀ ٦ نمونۀ شمارۀ

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]




43 43/

نشران 1شکب در مختلف هاینمونه در PNPBمیزان تغییرات جذب

تیرفعال نیشرتریب یدارا 4که نمونرۀ دهدينشان م جینتا. داده شده است

است. ینازیکوت تیفعال زانیم نیکمتر یدارا 3 ۀو نمون ینازیکوت

های بیوانفورماتیکیانجام تحلیل

کامب اليتو بیولوژی افزارهاینرم و اطالعاتي هایبه کمک پایگاه

ایگاهپ کمک به ابتدا، در. شد مطالعه یهشش سو ینا شدهکلون ناحیۀ

ز و آنالی بیشش توالي تحل اینleBIBI-QBPP ایمحاسبه اطالعاتي

ره فیلوژنتیکي روابط تیسا نیا. (Flandrois et al., 2015) شدند

ارش گز 2در شکب بی. نتایج این تحلکنديم مشخص کامال را يتوال

شده است.

هايتوال نیا از کدام هر است، شده داده نشان 2که در شکب طورهمان

نیشتریب يژن بانک در شدهثبت یيایباکتر یهاگونه از یکسری با

يکینزد و شباهت ها،بیتحل ها،دندروگرام نیا در. دارند را شباهت

،Klebsiella سویه های از یيهاگونه با شدهیيشناسا یهايتوال

Enterobacter ،Larouletlla ،Citrobacte ،Yokenella ،

Leclercia و kluyvera ۀشمار ۀنمون ي. توالداده شده استان نش

oxytoca Klebsiella (Tگونهرا با يکینزد نیشتریب کی

AB004754 )گونهرا با يکینزد نیشتریب دو ۀشمار ۀنمون ي. توالدارد

Klebsiella oxytoca (T AJ871858 )ۀشمار ۀنمون يدارد. توال

oxytoca Klebsiella (Tرا با گونه يکینزد نیشتریسه ب

JQ0703000 )با را يکینزد نیشتریب چهار ۀشمار ۀنمون يتوال. دارد

دارد. Escherichiaو Enterobacter، Yokenella ي ازیهاگونه

Klebsiella را با گونه يکینزد نیشتریپنج ب ۀشمار ۀنمون يتوال

oxytoca را با گونه يکینزد نیشتریب زیشش ن ۀشمار ۀنمون يدارد. توال

Klebsiella oxytoca های که نمونهدهند ن مينشا هابیتحل نیا. دارد

های گونه شمارۀ یک، دو، سه، پنج و شش در زیر مجموعه باکتری

Klebsiella oxytoca قرار داشته و نمونۀ شمارۀ چهار در زیر

قرار گرفته است. Enterobacterمجموعه گونه

های تولیدکننده آنزیم کوتینازمطالعه باکتریه ثبرت شرمار نرازیکوت میآنرز دکننردهیتول هاییمطالعه باکترمنظور به

هرررای یوکررراریوت و هرررای تولیدکننرررده آنرررزیم کوتینرررازی گونرررهژن

ی آورمطالعره و جمرع NCBIای داده-از پایگاه محاسرباتيپروکاریوت

دهد.ها را نشان مياین شماره ثبت 2شد. جدول

SplitsTree4افرزار نررم ها به کمرکسیه، روابط فیلوژنتیکي این گونه

نمودار ایرن درخرت 3. شکب (Huson & Bryant, 2006) تعیین شد

کره دهرديم نشان بیتحل نیا نشان داده شده است. 3تکاملي در شکب

منظور به ادامه، در .اندشده جدا يوتیوکاری از يوتیپروکار ینازهایکوت

هیرناح يتروال ز،نرایکوت میشده از نظر آنرز یآورجمع یهانمونه يابیارز

srDNA 1بانرک ژن در و داشرتند قررار باال دارنمو در که یيهانمونه ٦

ثبرت شرده یهراياز تروال نمونره کیر يتروال همرراه به بودند شده ثبت

یيایرباکتر یهرانمونره کنار در دیجد يتوال بیتحل نیابا . شدند يابیارز

(.4)شکب داده شد قرار

بحث -بیمراری عوامرب ازت خود قادر نیستند به سادگي به خاطر باف گیاهان

از دیگرری هرایکننرد بلکره بایرد از راه دوری يقارچ و یيایباکتر یزا

سرطح در کروتین الیره ایجراد هاراه این از یکي. نمایند حفاظت خویش

از و شرده اهرانیگ به هاقارچ و هاباکتری نفوذ از مانع کوتین. است گیاه

Serrano) ساختاری کوتیکول گیاهان عالي محسوب مي شود یاجزا

et al., 2015). هرایزیستگاه به نسبت خشک مناطق گیاهي هایگونه

ضررخامت پلیمررر در میرران .هسررتند تررریضررخیم کرروتین دارای مرطرروب

یرتفعال بررسري منظرور بره. اسرت متفاوت گیاه یک هایواندام هاگونه

کشرت محریط هیرته و ینکروت یوبسرتراس یهبه ته اجیاحت ینازکوت میآنز

اتیرح بررای کرربن منبع کی فقط ياختصاص طور به که است یاژهیو

مطالعره پررورش و توجه به با. باشد داشتهمانند کوتین هامیکروارگانیزم

بیسر کره برود شده( ، مشخص Parvaresh et al., 2017)همکاران

یوهسه نوبت م درمنظور ین. به ااست دارا را نیکوت از یيباال زانیم قرمز

کره دهردمي نشان نتایجشد. بیتحلآن ینکوت یزانشد و م یهقرمز ته یبس

بره نسربت و داشته میوه پوست گرم هر در نیکوت یادیز زانیم قرمز سیب

کروتین ازبنرابراین، است. ترمقاوم آفات و هانسبت به بیماری هامیوه سایر

استفاده شد. کوتین ي حاویکشت اختصاص طیمح هیته جهتسیب

اسرت کره یردروالزهاه ینمدل از خانواده سر یمآنز یک ینازکوت یمآنز

,.Murphy et al) اسرت Ser-His-Asp یتیرکسه گانره کاتال یدارا

ینرازکوت یمآنرز یرژه،و یکردو عمب یخواص ساختار یببه دل. (1996

. (Zhang et al., 2010) مطرح است یاربس یوتکنولوژیدر صنعت و ب

هرابراکتری و (Sebastian et al., 1987) هراقرارچ در کوتینراز آنزیم

هرای کوتیناز اگرچه. (Kolattukudy et al., 1981) یافت شده است

قررارچي و باکتریررایي دارای خصوصرریات کاتررالیتیکي و مکانیسررم عمررب

-مشابه هستند اما از نظر توالي و ساختار متفاوتند، از این رو پیشرنهاد مري

کوتینازهرای یوکراریوتي و پروکراریوتي تقسریم ۀشود به دو زیر خانواد

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]




44 44/

A

B

.C .دوشمارۀ نمونۀ .B .یک نمونۀ شمارۀ .A. ها به آنهاصورت مجزا و شناسایي نزدیکترین گونهه تحلیب روابط فیلوژنتیکي توالي شش جداسازی شده ب -2شکل

شمارۀ شش.نمونۀ .F .پنجشمارۀ نمونۀ .E. شمارۀ چهارنمونۀ .D .شمارۀ سهنمونۀ

Fig. 2. Phylogenetic relationship analysis of six isolated sequences and identification of their closest species. A. sample:

1. B. sample 2. C. sample 3. D. sample 4. E. sample 5. F. sample 6.

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]




45 45/

C

D

ادامه. -2شکل

Fig. 2. Continued.

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]




46 4٦/

E

F

ادامه. -2شکل

Fig. 2. Continued.

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]




47 47/

.NCBIای کوتینازهای میکروبي و شماره ثبت آنها از پایگاه داده -2جدول

Table 2. Microbial cutinases and their GenBank accession number in NCBI.

GenBank accession number

Species

AAZ54921.1

AAA33334.1

AHN19769.1 GAT21998.1

ABF50887.1

CAL00335.1 KJK61323.1

BAA07428.1

AAZ95012.1 CAB40372.1

CAA93255.1

ADQ27862.1 AKH80819.1

CCO31306.1

WP_023536233.1 EU435153.1

ADV92525.1 ADV92527.1

AAZ54920.1

CRG87219.1 CAA61622.1

KEP43672.1

AIB50196.1 BAO42836.1

EKD18956.1

Thermobifida fusca YX

Fusarium solani pisi

Fusarium oxysporum Aspergillus luchuensis

Aspergillus nidulans

Aspergillus niger Aspergillus parasiticus SU-1

Aspergillus oryzae

Monilinia fructicola Pyrenopeziza brassicae

Botrytis cinerea

Colletotrichum truncatum Colletotrichum gloeosporioides

Rhizoctonia solani

Pseudomonas putida Coprinopsis cinerea

Thermobifida alba Thermobifida cellulosilytica

Thermobifida fusca YX

Talaromyces islandicus Phytophthora capsici

Mycobacterium kansasii

Mycobacterium tuberculosis K Saccharomonospora viridis

Marssonina brunnea

.1وتینازی و شماره ثبت آنها در بانک ژن براساس جدول های کهای کوتیناز. گونهتحلیب فیلوژنتیک ژن -3 شکل

Fig. 3. Phylogenetic analysis of cutinase genes. The species and GenBank accession numbers of the cutinase-producing

specimens were based on Table 1.

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]




48 48/

.16sDNAساس توالي تحلیب روابط فیلوژنیکي شش نمونه برا -4شکل

Fig. 4. Phylogenetic analysis of six samples based on16sDNA.

ز ا یها و تعداد. بیشتر قارچ(Calado et al., 2002) تقسیم شوند

. (Liu et al., 2017) هستند کوتیناز هایآنزیم ۀتولیدکنند هاباکتری

-نزیمآ اما ،است گرفته صورت قارچي هایآنزیم روی مطالعات بیشتر

تینازکو. برخوردارند بیشتری مقاومت و پایداری از باکتریایي های

یکياست. کوچک را دار استرهایپلي و استرها انواع هیدرولیز توانایي

-يپل هایزباله ۀتجزی امروزی جوامع در محیطي زیست مشکالت از

.(Yoshida et al., 2016)و پالستیک در محیط زیست است استری

ترهایاسپلي ایهزباله بردن بینسبز قادر به از يآنزیم ۀمثاببه ازکوتین

از زین میآنز نیا يبوم هاییهسو یيشناسا و است طبیعت در تجزیه قابب

در انمونه ه ابتدا مجدد يبررس دراست. برخوردار اییژهو یتاهم

LBکشت یطدر مح هاسیه، نمونهو نیکوت یحاو کشت یطمح

ه بکوتیناز م میزان فعالیت آنزی ها،باکتری رشد از بعد .شدندکشت داده

ي بررس نانومتر 405در طول موج و یکمک دستگاه اسیکتوفوتومتر

متفاوت مه با هانمونه این فعالیت میزان که دهدينشان م یجنتا شد.

تیناز و به سطح بیان متفاوت آنزیم کو توانيم آن بیدال از که است

ومطالعات پرورش ۀمطالع مشابهه کرد. اشار محیطي یفاکتورها

میزان زیمطالعه ن نیا در، (Parvaresh et al., 2017) همکاران

هاهنمون سایر به نسبت Enterobacterاز جنه 4 ۀشمار ۀفعالیت نمون

دارد. رتبا ا میزسطح بیان آن ایو میباالتر است که احتماالً به ساختار آنز

هرر کردام از يدر ابتدا توال ،يکیوانفورماتیب یهابیتحل انجام منظوربه

و شرد بیرتحل leBIBI-QBPP يمحاسربات گراهیشش نمونره در پا نیا

در چهرار ۀشمار ۀنمون فیلوژنتیکي درخت رسم با که دهديم نشان جینتا

کرهیحال در ردیرگیم قررار Enterobacter هیسو یهایباکتر ریسا کنار

برهادامره، در. گیرنردمري قررار Klebsiellaهیسو کنار در هانمونه ریسا

-ۀنمونر از یادیز تعداد ابتدا در محاسباتي -اطالعاتي هایپایگاه کمک

و يبررسر نرازیکوت میآنرز دکننردهیتول يوتیپروکرار و يوتیوکاری یها

و يترادفر هرم زانیرم سریه،. شد استخراج و یآورجمع آنها اطالعات

قررار بیرو تحل يتحرت بررسر افرزارنررم کمرکبره هايتوال نیا شباهت

از يوتیپروکررار ینازهررایکرره کوت دهررديمرر نشرران بیررتحل نیرراگرفررت.

نرازیکوت میآنرز يتروال نییجدا شدند که علت آن شباهت پا يوتیوکاری

روابرط نییپرا شرباهت نیرا. اسرت هراوتیوکراری و هراوتیدر پروکار

-نمونره يبایارز منظوربه ادامه، در. است کرده جدا هم از را آنها يتکامل

-نمونره نیرمجدد ا يبا بررس ناز،یکوت میاز نظر آنز شدهیآورجمع یها

را یتعرداد نراز،یکوت میآنرز ۀکننددیتول يوتیو پروکار يوتیوکاری یها

همراه به بودند شده ثبت بانک ژن در آنها srDNA 1٦ هیناح يکه توال

روابط قرار گرفتند و مجدد در نرم افزار يابیارز تحتهای جدید يتوال

يتروال کره داديمر نشان بیتحل نیاشد. نییها به تعگونه نیا يکیلوژنتیف

احتمرال بره ن،یبنرابرا. ردیرگيم قرار یيایباکتر یهانمونه کنار در دیجد

برا کارکرد و ساختار نظر از شدهیيشناسا یهانمونه نازیکوت میآنز اد،یز

داشته باشد. دتوانيم یادیز شباهت هایباکتر نیا نازیکوت میآنز

یسپاسگزار

از پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و دانشرگاه تحصریالت تکمیلري

کرردن امکانرات و حمایرت دلیب فراهمصنعتي و فناوری پیشرفته کرمان به

مالي از این پژوهش کمال تشکر را داریم. این پژوهش از محرب اعتبرارات

انجام گرفته است. ٦88٦/1طرح پژوهشي به شماره قرارداد

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]




49 49/

REFERENCES Abou-Zeid, D-M., Müller, R-J. and Deckwer, W-D. 2004.

Biodegradation of aliphatic homopolyesters and

aliphatic− aromatic copolyesters by anaerobic

microorganisms. – Biomacromolecules. 5: 1687-1697. Calado, C.R., Monteiro, S.M., Cabral, J.M. and Fonseca,

L.P. 2002. Effect of pre-fermentation on the production

of cutinase by a recombinant Saccharomyces cerevisiae.

– J. Biosci. Bioeng. 93: 354-359. Carvalho, C.M., Aires-Barros, M.R. and Cabral, J. 1998.

Cutinase structure, function and biocatalytic

applications. – Electron. J. Biotechnol. 1: 28-29. Degani, O., Salman, H., Gepstein, S., Dosoretz, C.G.

2006. Synthesis and characterization of a new

cutinase substrate, 4-nitrophenyl (16-methyl sulfone

ester) hexadecanoate. – J. Biotechnol. 121: 346-350.

Fich, E.A., Segerson, N.A. and Rose, J.K. 2016. The plant

polyester cutin: biosynthesis, structure, and biological

roles. – Annu. Rev. Plant Biol. 67: 207-233.

Flandrois, J-P., Perrière, G. and Gouy, M. 2015. LeBIBI

QBPP: a set of databases and a web tool for automatic

phylogenetic analysis of prokaryotic sequences. –

BMC bioinformatics.16: 251. Gerard, C.H., Fett, F.W., Osman, F.S. and Moreau, A.R.

1993. Evaluation of cutinase activity of various

industrial lipases. – Biotechnol. Appl. Biochem. 17:

181-189.

Heredia, A. 2003. Biophysical and biochemical

characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer. –

Biochim. Biophys. Acta 1620: 1-7.

Huson, D.H. and Bryant, D. 2006. Application of

phylogenetic networks in evolutionary studies. – Mol.

Biol. Evol. 23: 254-267. Jelsch, C., Longhi, S. and Cambillau, C. 1998. Packing

forces in nine crystal forms of cutinase. –Proteins 31:

320-333.

Kolattukudy, P., Purdy, R. and Maiti, I. 1981. Cutinases

from fungi and pollen. – Methods Enzymol. 71: 652–664.

Kutschera, U. and Niklas, K. 2007. The epidermal-

growth-control theory of stem elongation: an old and

a new perspective. – J. Plant Physiol.164: 1395-1409.

LIN, T.S.and Kolattukudy, P. 1980. Structural studies on

cutinase, a glycoprotein containing novel amino acids

and glucuronic acid amide at the N terminus. – Eur. J.

Biochem.106: 341-351. Liu, S-H, Zeng, G-M., Niu, Q-Y., Liu, Y., Zhou, L.,

Jiang, L-H., Tan, X.F., Xu, P., Zhang, C. and Cheng,

M. 2017. Bioremediation mechanisms of combined

pollution of PAHs and heavy metals by bacteria and

fungi: A mini review. – Bioresour Technol. 224: 2 Longhi, S., Nicolas, A., Creveld, L., Egmond, M.,

Verrips, C.T., de Vlieg, J., Martinez, C. and

Cambillau, C. 1996. Dynamics of Fusarium solani

cutinase investigated through structural comparison

among different crystal forms of its variants. –

Proteins 26: 442-458. Martinez, C., de Geus, P., Stanssens, P., Lauwereys, M.

and Cambillau, C. 1993. Engineering cysteine

mutants to obtain crystallographic phases with a

cutinase from Fusarium solani pisi. – Protein Eng. 6:

157-165. Murphy, C.A., Cameron, J., Huang, S.J. and Vinopal,

R.T. 1996. Fusarium polycaprolactone depolymerase

is cutinase. – Appl. Environ. Microbiol. 62: 456-460.

Okkels, J. 1997. Preparing polypeptide variants with

improved functional properties. US patent, 97-09664. Parvaresh, N., Mortazavi, M. and Torkzadeh, M.M.

2017. Isolation and identification of cutinase enzyme

production bacteria. – Nova Biol. Reperta 4: 38-46.

Pocalyko, D.J. and Tallman, M. 1998. Effects of

amphipaths on the activity and stability of Fusarium

solani pisi cutinase. – Enzyme Microb. Technol. 22:

647-651. Raziyafathima, M., Praseetha, P. and Rimal Isaac, R.

2016. Microbial degradation of plastic waste: a

review. – J. Pharma. Chem. Biol. Sci. 4: 231-242.

Sebastian, J., Chandra, A. and Kolattukudy, P. 1987.

Discovery of a cutinase-producing Pseudomonas sp.

cohabiting with an apparently nitrogen-fixing

Corynebacterium sp. in the phyllosphere. – J.

Bacteriol. 169: 131-136.

Sebastião, M., Cabral, J. and Aires‐Barros, M. 1993.

Synthesis of fatty acid esters by a recombinant

cutinase in reversed micelles. – Biotechnol. Bioeng.

42: 326-332. Serrano, M., Coluccia, F., Martha, T., Lhardion, F. and

Métraux, J. 2014. The cuticle and plant defense to

pathogens. – Front. Plant Sci. 5: 6-13. Tenhaken, R., Arnemann, M., Köhler, G. and Barz, W.

1997. Characterization and cloning of cutinase from

Ascochyta rabiei. – Z. Naturforsch. C. 52: 197-208. Van der Vlugt-Bergmans, C., Wagemakers, C. and Van

Kan, J. 1997. Cloning and expression of the cutinase

A gene of Botrytis cinerea. – Mol. Plant-Microbe

Interact. 10: 21-29. Yoshida, S., Hiraga, K., Takehana, T., Taniguchi, I.,

Yamaji, H., Maeda, Y., Toyohara, K., Miyamoto, K.

Kimura, Y. and Oda, K. 2016. A bacterium that

degrades and assimilates poly (ethylene

terephthalate). – Science 351: 1196-1199. Zhang, Y., Chen, S., Xu, M., Cavoco-Paulo, A., Wu, J.

and Chen, J. 2010. Characterization of Thermobifida

fusca cutinase-carbohydrate-binding module fusion

proteins and their potential application in bioscouring.

– Appl. Environ. Microbiol. 76: 6870-6876.

*****

How to cite this article:

Mortazavi, M., Parvaresh, N. and Torkzadeh-Mahani, N. 2019. An enzymatic and bioinformatic study of native

cutinase bacteria. – Nova Biol. Reperta 6: 39-49.

.49-39: ٦ های نوین در علوم زیستيیافته –. ینازیکوت يبوم هاییباکتر يکیوانفورماتیو ب يمیآنز ۀمطالع .1398ی، م. و ترکزاده ماهان ، ن.پرورشم.، ، یمرتضو

Dow

nloa

ded

from

nbr

.khu

.ac.

ir at

12:

26 IR

ST

on

Tue

sday

Oct

ober

27t

h 20

20

[ D

OI:

10.2

9252

/nbr

.6.1

.39

]



مطالعۀ آنزیمی و بیوانفورماتیکی باکتری های بومی کوتینازی · Mortazavi et al. An enzymatic and bioinformatic study of cutinase bacteria

Documents