INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA - UNCP UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ FACULTAD DE AGRONOMÍA INFORME DE PRÁCTICAS PRE PROFESIONALES Presentado por: BULLÓN CASTILLO, Erika Wendy
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA - UNCP
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE AGRONOMÍA
INFORME DE PRÁCTICAS PRE PROFESIONALES
Presentado por:
BULLÓN CASTILLO, Erika Wendy
HUANCAYO – PERÚ
2012
ÍNDICE PRIMERA PARTE
INTRODUCCIÓN 3
OBJETIVOS 4
I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5
1.1 TÉCNICAS Y EQUIPOS DE LABORATORIO 5
1.2 EXTRACCIÓN DE DNA 8
1.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS 10
1.4 CORTES HISTOLÓGICOS DE TEJIDO VEGETAL 12
1.5 RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS 15
II. LUGAR DE EJECUCIÓN Y UBICACIÓN GEOPOLÍTICA 18
III. PLAN Y CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DESARROLLADAS 19
IV. DESCRIPCIÓN DE LAS PRÁCTICAS 20
4.1 RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO 20
4.2 EXTRACCIÓN DE DNA 24
4.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS 27
4.4 CORTES HISTOLÓGICOS DE TEJIDO VEGETAL 32
4.5 RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS 35
V. CONCLUSIONES 43
VI. RECOMENDACIONES 44
VII. BIBLIOGRAFÍA 45
VIII. ANEXOS 46
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INTRODUCCIÓN
El presente informe de Prácticas Pre-profesionales describe las actividades realizadas
en el Instituto de Biotecnología e Ingeniería Genética de la Universidad Nacional del
Centro del Perú, realizado desde el 31 de enero al 31 de marzo de 2011 para cumplir
un requisito académico y optar el grado de bachiller en Agronomía
Además se tiene en cuenta que en Biotecnología e Ingeniería Genética, la
investigación está tomando mayor importancia en su contexto cognoscitivo y práctico a
través de la creatividad e innovación científica.
En este marco académico juega un rol importante este Instituto, donde se logra mejorar
las capacidades y habilidades de uso y manejo de herramientas adecuadas para la
investigación genética de la Agronomía. Asimismo se trabajó diversas técnicas
científicas en distintas investigaciones que sirvieron de motivación para ampliar los
conocimientos en biotecnología y biología.
También se describen las actividades realizadas que fueron, extracción de DNA de
tejidos vegetales, cultivo de bacterias y microorganismos, análisis de bacterias
colifecales en agua potable de la UNCP, reconocimiento de proteínas y cortes
histológicos vegetales; entre otros. Las que se consideraron relevantes por su utilidad
necesaria y esencial para el desarrollo integral de la agricultura en nuestro país fueron
la extracción de DNA y el cultivo de bacterias y microorganismos.
.
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OBJETIVOS:
Objetivo General:
Ensayar algunas actividades prácticas relevantes en el laboratorio de genética y
biotecnología aplicadas a la solución de problemas agronómicos.
Objetivos Específicos:
Reforzar habilidades y destrezas en el manejo de laboratorio en biotecnología
que permita la incorporación de esta área en la investigación científica de acuerdo con
las necesidades de la Región Central.
Adquirir herramientas adecuadas de la biotecnología para utilizarlas en el
campo de acción del ingeniero agrónomo en la investigación genético-científica.
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I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1 TÉCNICAS Y EQUIPOS DE LABORATORIO
1.1.1 TÈCNICA DE MICROSCOPÍA
Conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los objetos de estudio
que por su pequeñez están fuera del rango de resolución del ojo normal. Si bien el
microscopio es el elemento central de la microscopía, el uso del mismo requiere
para producir las imágenes adecuadas, de todo un conjunto de métodos y técnicas
afines pero extrínsecas al aparato.
Tipos de Microscopía:
Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a
observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y
revelan detalles que no aprecian de otra manera.
Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La
luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente
coloreados.
El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un
cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo se
encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja
en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen aparecen como un
fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como
una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para
analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con
iluminación normal.
- Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el
contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal
para especímenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina
el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo
oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y
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entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de
anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un
cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones
minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo
visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos,
por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina.
1.1.2 MATERIALES VOLUMÉTRICOS
- Pipetas y pipeteadores
Se usan para medir volúmenes de líquidos de forma más precisa que con una
probeta. Y son más versátiles, sobre todo al manejar volúmenes pequeños.
Las pipetas de bulbo son útiles para medir volúmenes que no requieren de
mucha precisión. Las pipetas volumétricas vienen en distintos tamaños, desde 1
ml hasta 200 ml, y con distintas formas, de acuerdo al uso que se les dé.
- Micropipetas
Son extremadamente útiles en los laboratorios de biotecnología. Estas permiten
medir con precisión volúmenes tan pequeños como 0.1 μl hasta 1 ml. Estas
requieren de unos pipeteadores especiales que deben ser tratados con mucho
cuidado para evitar que se descalibren. Los pipeteadores son de distintos tipos.
La mayoría pueden servir muestras individuales. También pueden usarse para
muestras múltiples, por medio de multicanales: pipetas que sirven 8 o 12
muestras a la vez.
- Fiolas: Existen de diferentes denominaciones, 10, 25, 50, 100, 250, 500 y
1000 ml, este material no debe calentarse a temperaturas altas ya que se
dañara su aforo afectando en su precisión.
- Buretas: Existen las microburetas de 10 ml y las normales de 25, 50, 100 ml.
Obviamente tiene mayor precisión las de menor volumen. Siempre llenarse
más arriba del cero y luego abrir la llave para que la solución pase al pico,
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tener cuidado de que no queden burbujas. Es importante que antes de utilizar
una bureta se compruebe su buen funcionamiento.
1.1.4 TÉCNICAS Y EQUIPOS PARA MARCADORES MOLECULARES
ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos
nucleicos) sobre la base de su tamaño molecular y carga eléctrica. Para la
separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida(fibras cruzadas, como una
malla). Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se
moverán y deberán ir pasando por la malla, por la que las pequeñas se moverán
mejor y más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes
quedarán cerca del lugar de partida.
- Aparatos de electroforesis
Son cámaras que contienen un circuito eléctrico expuesto a un líquido
electrolítico, llamado amortiguador. El aparato se usa para separar mezclas de
moléculas grandes de acuerdo a su carga y/o su tamaño. La técnica consiste en
inocular la muestra en un medio semisólido, la fase estacionaria, que se somete
a un campo eléctrico, en una cámara donde en un extremo se encuentra un
filamento que actúa como polo positivo, y en el extremo opuesto hay otro
filamento formando el polo negativo. Las moléculas con cargas netas positivas
se moverán hacia el polo negativo y las de carga negativa se irán hacia el polo
positivo. Dependiendo del tipo de electroforesis, las moléculas que viajen hacia
uno de los polos se separarán por tamaño, viajando más en la fase estacionaria
las moléculas más pequeñas. El tipo y concentración de la fase estacionaria
dependerá del tipo de moléculas que nos interesa correr.
- Centrífugas
Son muy útiles para precipitar células y moléculas. Vienen en distintos tamaños
y con distintas capacidades en el manejo de muestras. Este aparato somete la
muestra a fuerzas de aceleración que obligan a las moléculas a concentrarse en
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el fondo del envase utilizado, separándolas del medio en que se encuentran.
Incluso, bajo ciertos métodos se puede generar un gradiente de concentraciones
dentro del mismo tubo, separando distintas moléculas a distintos niveles o fases
dentro del tubo. Con ayuda de jeringas, se puede perforar la pared del tubo y
extraer del mismo sólo aquella fase donde se encuentren las moléculas de
interés.
1.2 EXTRACCIÓN DE DNA
1.2.1 ADN
Es una molécula compleja formada por cientos y miles de nucleótidos distintos en
secuencias diversas formando una cadena larga. En el hombre la dotación haploide de
cromosomas presenta una molécula de ADN con una longitud total de
aproximadamente dos a tres cuartos de billón de nucleótidos. En el ácido nucleico, los
nucleótidos se unen unos a otros mediante el enlace azúcar-fosfórico-azúcar-fosfórico,
etc. (S-P) con las purinas y las pirimidinas unidas como grupos laterales a las
moléculas de azúcar.
- Secuencia del ADN
El ADN es un polímero de desoxirribonucleótidos formados por miles o incluso
millones de residuos monoméricos. Los desoxirribonucleótidos están formados de
una base de purina (adenina, guanina) o de pirimidina (citosina, timina) unida
covalentemente al átomo de carbono 1´ de la 2´- desoxirribosa. Una unión
fosfodiéster une el grupo 5´- hidroxilo de la desoxirribosa al grupo 3´- hidroxilo de
un desoxirribonucleótido adyacente para formar un esqueleto repetido. La
secuencia específica distingue al ADN de un gen al de otro. La secuencia de base
representa el contenido de información del ADN. La cadena de
polidesoxirribonucleótido tiene polaridad. Un grupo 5´- hidroxilo se encuentra hacia
el extremo 5´, y el grupo 3´- hidroxilo hacia el extremo 3´; la dirección 5´→ 3´ de
una molécula de ácido nucleico es muy importante. Tal polaridad se puede
encontrar aun en el ADN circular que no tiene un extremo 5´- hidroxilo ó 3´-
hidroxilo libre.
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- Desnaturalización del ADN
Es el cambio físico del ADN cuando se somete a: pHs extremos, cambios de
temperatura, disminución de la constante dieléctrica del medio acuoso por
incorporación de alcoholes, cetonas, etc., exposición a la urea, amidas y otras
soluciones similares. Cuando la temperatura alcanza el punto de fusión del ADN,
la agitación térmica es capaz de separar las dos hebras y producir una
desnaturalización. Dos conjuntos de fuerzas son las responsables de mantener la
estructura de la doble hélice del ADN: Los puentes de hidrógeno están entre los
pares de base y las interacciones del apilado son las bases sucesivas. Cuando
cualquiera de los dos conjuntos de fuerza se interrumpen, la estructura duplo
helicoidal nativa experimenta su transición a una forma con lazos al azar,
denominada ADN desnaturalizado o monofilar. En la desnaturalización de la
estructura del ADN dúplex se distinguen dos etapas:
a. Las dos hebras se desarrollan parcialmente pero permanecen unidas por lo
menos mediante un corto segmento de la estructura duplo helicoidal con algunas
bases complementarias todavía en registro. Los segmentos desenrollados de las
hebras adoptan una conformación cambiante y al azar.
b. En la segunda etapa ambas hebras se separan por completo una de otra, si en
este estado se enfrían rápidamente cada una de las hebras se doblan sobre sí
misma para formar unos segmentos duplo helicoidales intracatenarios.
- Renaturalización del ADN
Este es un proceso reversible, ya que al bajar la temperatura se puede producir
una renaturalización. Las cadenas del ADN separada se renaturalizarán o
reasociarán cuando se alcance la temperatura fisiológica y las condiciones de
salinidad adecuada. La desnaturalización de un ADN homogéneo es fácilmente
reversible si el proceso de desenrollamiento no ha pasado de la primera etapa.
Mientras un segmento duplo helicoidal esté uniendo a las dos hebras con los pares
de base en su sitio, los segmentos desplegados de las dos hebras volverán a
enrollarse espontáneamente reformando un dúplex completo instantáneamente se
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produce un retorno a la conformación nativa, que es la de mínima energía libre.
Sin embargo, si las dos hebras se han separado por completo la renaturalización
es más lenta.
1.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS
1.3.1 Medios de Cultivo:
Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o
en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos
nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la
sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a
partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio
de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras
muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una
colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la
original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá
como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.
- Disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de
contener como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas.
En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias
inductoras del crecimiento. Todas estas sustancias se suministraban
originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos
de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación
a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios
es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible
de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen
utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los
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aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la
peptona.
- Consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio líquido se puede modificar su consistencia añadiendo
productos como albúmina, gelatina o agar, con lo cual se obtendrían medios en
estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran
inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente
a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros
tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y
comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está
ampliamente extendido en el laboratorio.
- Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de
oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán
adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio,
los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas
parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los
anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de
las citadas condiciones.
- Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en
los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las
estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que
se deseque el medio.
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1.3.2 Conteo de Bacterias
Principales métodos de recuento del número de bacterias en una
muestra
El número de bacterias puede determinarse directamente por recuento del
número total de células o indirectamente por la estimación del número más
probable, por filtración o por el recuento de células viables en placa (células
capaces de dividirse en un medio de cultivo sólido, también se refieren como
unidades formadoras de colonias, UFCs).
- Recuento directo de bacterias al microscopio
Es una técnica para determinar el número total de organismos de una
muestra: Se utilizan cámaras de recuento (cámara de Petroff-Hauser) y
visualización al microscopio. Es un método rápido del número total de células
de una muestra pero no distingue entre viables o no viables.
- Recuento directo con contadores electrónicos
Se utiliza el contador Coulter recuenta el número de células suspendidas en
un líquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente eléctrica. Se
puede determinar a su vez el tamaño de las células pero tampoco distingue
entre viables, muertas o partículas.
- Recuento del número de bacterias viables mediante el método de
dilución y siembra en placa por siembra en superficie
Es la siembra de un volumen conocido de la dilución de la muestra sobre la
superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este método todas las
colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta
técnica para el recuento de bacterias aerobias.
1.4 CORTES HISTOLÓGICOS VEGETALES
La Técnica Histológica abarca varios procedimientos a los que se somete un tejido
para proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubre objeto con
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imágenes de estructuras contrastadas, para su estudio bajo microscopía óptica o
electrónica. Para la obtención de cortes para observar a microscopio, hay que seguir
un protocolo en el que se incluye la obtención de la muestra, su corte y montaje.
1.4.1 Fijación
Es el proceso mediante el cual los elementos constitutivos de las células, y por tanto de
los tejidos, son fijados en cuanto a su estado físico, y parcialmente en su estado
químico, de manera que puedan resistir el tratamiento sucesivo con varios reactivos sin
pérdida, distorsión importante, o descomposición. La mayoría de los agentes fijadores
actúan desnaturalizando o precipitando las proteínas, que forman entonces una
esponja o malla que tiende a englobar los otros componentes celulares. En
condiciones ideales, un fijador debe penetrar rápidamente al tejido, su acción debe ser
inmediata, y debe causar una pérdida y una alteración química y física mínima de las
células y de sus componentes; debe además ser barato, estable y de fácil manejo.
El tiempo de fijación oscila entre 30 minutos a 12 horas dependiendo del grosor del
tejido, las células libres requieren solo de 30 minutos, tejido delgado de 2 horas y más
grueso hasta de 12 horas, entre más delgado sea el tejido mejor se fijará.
1.4.2 Deshidratación
Los tejidos contienen gran cantidad de agua, tanto intra como extracelular, que debe
ser eliminada y reemplazada por parafina. Este proceso debe realizarse mediante el
uso de alguna sustancia que se mezcle con el agua y tenga cierta afinidad con ella, de
manera que pueda penetrar fácilmente entre las células de los tejidos. El alcohol etílico
es el mejor agente para la deshidratación, esto se logra utilizando alcoholes en distinta
concentración, empezando por el 70%. La deshidratación es también indispensable
antes de que puedan montarse los cortes teñidos.
1.4.3 Aclaramiento o limpieza
Permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado por un líquido que disuelva la
parafina con la cual el tejido va a ser impregnado. Los aclaradores además de eliminar
el alcohol, tienen la propiedad de volver transparentes los tejidos. Ello se debe a sus
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elevados índices de refracción, y a los cambios ópticos que se producen cuando el
agente aclarante penetra entre los elementos tisulares muy refractantes; es decir, el
índice de refracción de los agentes aclarantes es aproximadamente igual al de los
tejidos. La mayoría de las sustancias verdaderamente aclarantes son aceites
esenciales. Los buenos agentes aclarantes deben eliminar pronto el alcohol y aclarar
rápidamente sin endurecimiento; no deben disolver los colorantes de anilina, ni
evaporarse demasiado rápido en los baños de parafina.
1.4.4 Corte
Se debe cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de
la luz. La mayor parte de los preparados para microscopía óptica tienen un grosor entre
5 a 10 micrómetros. Para un estudio riguroso se utiliza un aparato llamado
MICROTOMO, con cuchillas de acero.
Microtomo para cortes ultradelgados: Para la microscopía electrónica, los cortes deben
tener de 50 a 120 µm; para ello existen microtomos especiales.
1.4.5 Coloración
Proceso por el cual un cuerpo toma color bajo la acción de un colorante y no
desaparece con lavados de la misma sustancia en que se disolvió el colorante.
Las estructuras contenidas en las preparaciones histológicas, poseen poco contraste o
carecen de él completamente, por lo que no van a poder ser distinguidas al
microscopio. Este inconveniente queda salvado por la propiedad que tienen los
distintos componentes celulares y tisulares de incorporar con variable intensidad
sustancias colorantes. En la Técnica Histológica corriente se usan principalmente
colorantes como Hematoxilina y Eosina.
Tipos de colorantes: a) Colorantes naturales, extraídos de productos animales o
vegetales, como el carmín, la hematoxilina, la orceína y la safranina; b) Colorantes
artificiales, conocidos como colorantes de anilina, colorantes de carbón o colorantes
sintéticos.
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1.4.6 Decoloración
Este paso se hace con objeto de llevar a cabo la diferenciación, es decir, por lo general
los cortes se tiñen con exceso con hematoxilina y es preciso quitar el colorante de
aquellas estructuras celulares que no son específicas de la hematoxilina y que la
retienen con poca intensidad. Para ello se utiliza una solución de alcohol-agua que se
prepara uno a uno. Luego se procede a lavar con agua destilada.
1.4.7 Montaje
Los cortes una vez teñidos pueden ser conservados por muchos años una vez que son
protegidos del medio exterior utilizando resinas sintéticas o bálsamo de Canadá.
El medio de montaje clásico es el Bálsamo del Canadá, el cual prácticamente se ha
dejado de utilizar debido a que ha sido superado por los medios sintéticos como el
DPX y otros.
1.5 RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS
1.5.1 REACCIONES COLOREADAS ESPECÍFICAS (BIURET):
Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos ya que
se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los
aminoácidos.
El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa, y el Cu, en un medio
fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de
color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de
proteínas.
El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la
condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Esta reacción
está dada por aquellas sustancias cuyas moléculas contienen dos grupos carbamino (-
CO.NH) unidos directamente o a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno. El
reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia
de Na (OH) o KOH). La reacción se basa en la formación de un complejo de
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coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del
nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. Esta última reacción provoca un
cambio de coloración: violeta púrpura o violeta rosado. Debe señalarse que el color
depende de la naturaleza de las proteínas; proteínas y péptidos dan un color rosado; la
gelatina da un color azul.
1.5.2 REACCIÓN XANTOPROTEICA
Esta prueba caracteriza a los aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptófano.
Esta reacción se debe a la presencia de un grupo fenilo en la molécula proteica. Los
complejos de la molécula proteica que son de importancia en esta reacción son la
tirosina y el triptófano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza
en el laboratorio. Para esta prueba se produce la nitración del anillo bencénico
presente en los aminoácidos obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo, que se
vuelven anaranjado en medio fuertemente alcalino (formación de ácido picrámico o
trinitrofenol). No puede realizarse esa reacción para identificar albúmina en orina, por el
color anaranjado de la reacción final. Las proteínas que tienen en su composición estos
aminoácidos también darán la reacción. La positividad se reconoce por la aparición de
un color amarillo o verde debido a la formación de nitrocompuestos.
1.5.3 DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR CALOR Y pH EXTREMOS
Efecto del pH sobre la estructura de las proteínas
Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero además de afectar a la
envoltura acuosa de las proteínas también afectan a la carga eléctrica de los grupos
ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta alteración de la
carga superficial de las proteínas elimina las interacciones electrostáticas que
estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitación. La solubilidad
de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico, ya que su carga neta es cero y
desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera dificultar la
formación de agregados.
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Efecto de la temperatura sobre la estructura de las proteínas
Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo
que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan.
Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y
desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrófobo interacciona
con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína
desnaturalizada.
1.5.4 REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS
Aminoácidos con azufre
Los dos aminoácidos azufrados son esenciales, la metionina estrictamente, mientras
que la cisteína puede formarse a partir de la metionina (no al revés). Las dietas
basadas en leguminosas pueden ser deficientes en estos aminoácidos. Además,
ambos son bastante inestables frente a condiciones de oxidación. La cisteína es muy
importante en el mantenimiento de la estructura terciaria y cuaternaria de la mayoría de
las proteínas mediante la formación de puentes bisulfuro, en dímeros de la cisteína
formados por oxidación.
Prueba o reacción de los grupos SH:
Es una prueba para identificar aminoácidos azufrados y las proteínas que los
contienen, se reconocen por la formación de una coloración negra o gris. Los
Aminoácidos azufrados como Metionina, Cisteína y Cistina se reconocen por la
formación de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se
forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino.
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II. LUGAR DE EJECUCIÓN Y UBICACIÓN GEOPOLÍTICA
LUGAR DE EJECUCIÓN DE LAS PRÁCTICAS: Instituto de Biotecnología e Ingeniería
Genética – U.N.C.P.
El Instituto de Biotecnología e Ingeniería Genética (I.B.I.G.) está ubicado en el pabellón
“G” de la Universidad Nacional del Centro del Perú en la provincia de Huancayo.
UBICACIÓN GEOGRÁFICA:
Latitud : 12°43´00´´ S
Longitud : 75°06´05´´ O
Altitud: : 3.244 m.s.n.m.
UBICACIÓN GEOPOLÍTICA
Región : Junín
Departamento : Junín
Provincia : Huancayo
Distrito : El Tambo
Dirección : Km. 5 Av. Mariscal Castilla, Ciudad Universitaria
Pabellón “G” 3er Piso. Teléfono (064)481082-anexo Centro de
investigación.
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III. PLAN Y CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DESARROLLADAS
MESES2011
FEBRERO MARZO
SEMANAS 1°
2°
3°
4°
1°
2°
3°
4°
ACTIVIDADES
Reconocimiento de equipos de laboratorio X X
Extracción de DNA de tejidos vegetales,
equipos de marcadores molecularesX X
Cultivos de bacterias y microorganismos X X X
Cortes histológicos de tejido vegetal X
Reconocimiento de proteínas X
Repaso de todas las prácticas X
Fecha de inicio : 31-01-11
Fecha de culminación : 31-03-11
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IV. DESCRIPCIÓN DE LAS PRÁCTICAS
4.1 RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS DE LABORATORIO
Antes de empezar a trabajar en un laboratorio, es necesario conocer las normas de
seguridad y el uso adecuado de reactivos, estos alcances fueron dados por el Ing. a
cargo de este laboratorio y fueron seguidas en todas las prácticas realizadas.
4.1.1 Normas de Seguridad para la Utilización del Espacio en Prácticas de
Laboratorio
Usar guardapolvo de laboratorio para cada práctica y no utilizar calzado
destapado.
Usar guantes, mascarilla y gorra, cuando se requieran.
No pipetear con la boca, usar un pipeteador.
No llevarse los dedos a la boca, ojos o nariz, ni respirar directamente sobre
ningún reactivo pues sus vapores pueden ser tóxicos.
No ingerir alimentos o bebidas en el laboratorio.
No usar durante las prácticas anillos, cadenas, prendedores, pulseras o
collares.
No ubicar bolsos, mochilas o paquetes, en los lugares de trabajo.
4.1.2 Utilización de Reactivos
Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona
que lo preparó y la fecha de preparación.
No arrojar por los sumideros, ácidos, bases o algún otro reactivo, depositarlos
en los recipientes de desecho.
Evitar derrames de sustancias en las mesas de trabajo, así se previene que
algún compañero se queme la piel o se deteriore la ropa.
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No arrojar al piso ningún reactivo.
No arrojar al piso papeles u otros elementos. Utilizar el recipiente para la
basura.
4.1.3 Asepsia en el Laboratorio
Mantener el ambiente libre de organismos infecciosos y contaminantes que
pueden ser perjudiciales para la salud.
Al ingresar al laboratorio se debe usar guardapolvo para prevenir la
contaminación del ambiente de trabajo.
La limpieza de mesas y repisas se realiza utilizando algodón empapado con
alcohol e hipoclorito de sodio para así dejar el medio libre de contaminantes, y
finalmente se pulveriza con alcohol de 70°.
Toda prueba de manipulación de microorganismos se debe hacer con un
mechero al lado para calcinar los residuos que quedan en los instrumentos de
manipulación, para evitar su diseminación o contaminación.
4.1.4 Reconocimiento de Materiales y Equipos de Laboratorio
Bisturí: Es un instrumento con hoja de filo cortante, su mango puede ser de madera,
plástico o metal. Viene a ser por sus dimensiones un instrumento en forma de cuchillo
pequeño y que su uso se ha extendido para practicar incisiones en tejidos blandos.
Placa Petri: Sirve para observar microorganismos en el laboratorio.
Placa Petri Gradilla
Porta objetos: Pueden ser laminillas de cristal con ligeras hendiduras, o sin ellas, en
donde son depositadas las sustancias que posteriormente se observarán al
microscopio.
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Cubreobjetos: Sirven para cubrir las muestras de animales, plantas o
microorganismos que serán observados al microscopio y prevenir su contaminación.
Estufa eléctrica: Se utiliza para secado de sustancias y esterilización. Alcanza
temperaturas ente 250 y 300º C.
Gotero: Consiste en un pequeño tubo de vidrio y en uno de sus extremos tiene un
capuchón de hule, que permite succionar o arrojar las soluciones. Debe mantenerse
siempre limpio; por tanto, hay que lavarlo después de cada manipulación.
Gradilla: Apoyar tubos de ensayo.
Mechero de Alcohol: Puede ser cualquier recipiente que contenga alcohol, mecha, el
tapón de rosca agujerado donde sobresalga la mecha y un tapón para cubrir la mecha
una vez que se ha utilizado.
Mechero de alcohol Pipetas
Pipeta (para llenado): Tienen una sola marca y miden una sola cantidad determinada
de líquido; las hay de varias formas y generalmente consiste en un tubo de cristal con
un ensanchamiento cilíndrico en el centro; en el extremo inferior está estirado y con un
orificio de salida en la punta. Las pipetas de este tipo, conocidas como volumétricas,
tienen capacidad para 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50, 100 y 200 mililitros. Para transvasar un
volumen fijo y un líquido determinado, resulta más exacto usar las pipetas que los
matraces y las buretas.
Tubo De Ensayo: Están elaborados de vidrio; se usan para contener diversas
sustancias en pequeños volúmenes; para preparar cultivos de bacterias y hongos; para
realizar diferentes experimentos y pueden ser de diferentes medidas.
22
Tubos de ensayo
Probeta Graduada: Las probetas son instrumentos para medir volúmenes y su uso es
muy frecuente. Este tipo de recipientes son los más usados en los laboratorios. Es un
tubo de cristal con pie, en éste caso cerrada por un extremo y destinada a contener
líquidos o bien gases, se usan para medir los líquidos o sustancias en centímetros
cúbicos.
Probeta Vaso de precipitado
Varilla De Cristal: Sirve para lograr una perfecta mezcla de las combinaciones que
deseamos obtener, ya sea entre líquidos o bien entre líquido y polvo químico o sea
sólido. Desempeña también la función de un poderoso agitador.
Vaso De Precipitado: Son de vidrio y los hay de diferentes tamaños, están graduados
y tienen pico, pueden ser también de plástico. Útiles para hacer mezclas o soluciones,
preparar colorantes, realizar evaporaciones o para que contengan líquidos.
Centrifuga: Una centrífuga es una máquina que pone en rotación una muestra para
separar por fuerza centrífuga sus componentes o fases (generalmente una sólida y una
líquida), en función de su densidad.
23
Centrífuga
Destilador de agua: Este aparato tiene un sistema que logra destilar como su mismo
nombre lo dice el agua.
Horno: Este instrumento de laboratorio sirve para darle temperatura a ciertas
sustancias y como tienen temporizador mantiene el calor en una temperatura
constante.
Horno
4.2 EXTRACCIÓN DE DNA DE TEJIDOS VEGETALES
4.2.1 FUNDAMENTO:
La extracción de DNA se fundamenta en que es una molécula que puede ser extraída
de cualquier parte de los organismos, por ejemplo en los vegetales, de la raíz, tallo,
hojas, etc. La extracción de muestras celulares (tejidos) se basa en el hecho de que los
iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas de los enlaces fosfodiéster del
DNA lo que permite su disolución y posterior extracción de la célula.
24
4.2.2 EXPERIMENTO: EXTRACCIÓN DE DNA DE TEJIDOS VEGETALES
MATERIALES
1. Materiales de vidrio
Vasos de precipitado de 150 ml y 250 ml (10 u)
Tubos de ensayo
Gradillas
Varillas de vidrio
Pipeta
2. Reactivos
Agua pura (millipore)
Amortiguador salino: (NaCl 0,15 M)
Bicarbonato sódico
Solución detergente BX-31
Alcohol isoamílico a 0°C
Alcohol de 96°
3. Equipos
Homogenizador
Centrífuga y microcentrífuga
Freezer
Balanza analítica
Agitador magnético
Vortex
4. Muestras biológicas vegetales
Homogenatos de tomate, papaya.
TÉCNICA
1. Preparación de la solución tampón
En 120 ml de agua pura Millipore disolver 1,5 g de cloruro de sodio (pm) y 5 g
de bicarbonato de sodio, luego se añade 5 ml de solución detergente BX-31
(Biomol). Mantener el preparado en el freezer a baja T°, evitar el contacto con
el medio ambiente.
25
2. Preparación de la muestra biológica
Elegir la muestra de la que se va extraer el DNA, (tomate, papaya) y
homogenizarla a 800 rpm verificando que el homogenato tenga una
consistencia coloidal.
3. Extracción y precipitación de DNA
En un recipiente limpio mezclar cuidadosamente 5 ml del homogenato con 10
ml del tampón frío y llevar al vórtex agitando durante 2 minutos. Centrifugar a -
19°C y 3000 rpm durante 5 min.
4. Precipitación final
Retirar 2,5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo limpio y esterilizado,
luego añadir con micropipeta 2,5 ml de alcohol isoamílico enfriado previamente
a 0° escurriendo lentamente el alcohol por la cara interna del tubo teniéndolo
inclinado hasta que el alcohol quede flotando sobre el tampón. Se deja reposar
unos 10 min, luego se agregan unas 3-4 gotas de alcohol etílico de 70° y se
deja reposar 10-15 min.
5. Extracción de la “medusa” de DNA
Introducir la punta de una varilla de vidrio fina en la interfase entre el alcohol y
el tampón. Remover la varilla hacia adelante y hacia atrás hasta que poco a
poco se enrollen las “fibras” de DNA. Luego de un minuto retirar la varilla
atravesando la capa de alcohol con lo cual el DNA quedará adherido a su
extremo con el aspecto de un copo de algodón mojado. Transferir
cuidadosamente la muestra a un portaobjeto limpio y estéril, dejar secar y
observar al microscopio.
RESULTADO Y DISCUSIÓN
Se realizó la extracción de DNA de los homogenatos de tomate y papaya, lo
cual se evidenció por la presencia de algunas fibras blanquecinas inmersas en
un líquido transparente, éstas correspondían al DNA extraído. Sin embargo
para estudios más estrictos se requiere utilización de enzimas especiales que
degraden el ARN y así se obtenga DNA puro.
26
Esta práctica evidenció la utilidad de realizar una correcta extracción de DNA en
una investigación biotecnológica ya que a partir de ella, es posible conocer con
exactitud la cantidad de genes presentes en cualquier cultivo. Además es muy
útil en investigaciones sobre caracterizaciones moleculares de cualquier
especie vegetal que hoy en día se hacen cada vez más frecuentemente.
4.3 CULTIVO DE BACTERIAS Y MICROORGANISMOS
4.3.1 FUNDAMENTO:
El cultivo de microorganismos consiste en brindarles las condiciones físicas, químicas,
nutritivas y ambientales adecuadas para que éstos se multipliquen en forma
controlada, lo que requiere conocer los medios de cultivo adecuados para cada
microorganismo, las técnicas de su preparación y los cuidados que se requieren.
4.3.2 EXPERIMENTO: CONTEO DE BACTERIAS COLIFORMES AEROBIAS
TOMADAS DE LA LAGUNA DE OXIDACIÓN DE LA UNCP
MATERIALES
Medio de cultivo líquido: AGP: Agar, Glucosa, Peptona.
Proporciones para 1 L de agua destilada millipore:
- Agar: 14 g
- Glucosa: 5 g
- Peptona: 5 g
Microorganismo: 5 Cepas K-13 de Escherichia coli
TÉCNICA
1. Selección de materiales, equipos e insumos.
Autoclave Agar
27
Glucosa Peptona
2. Limpieza y asepsia personal: Lavado de manos, uso de mascarilla y gorra.
3. Esterilización de materiales.
Vía húmeda: en autoclave a 120°C por 20 minutos.
Vía seca: Horno Pasteur a 200°C por 20 minutos.
4. Preparación del medio de cultivo
Pesar 14 g de agar, 5 g de glucosa y 5 g de peptona bacteriana.
Medir 1 L de agua en una probeta y verter en un vaso de precipitación.
Disolver la glucosa y la peptona en vasos de precipitación separados
utilizando 100 ml en cada uno de ellos.
Disolver el agar en agua fría en un vaso de precipitación removiendo con
una varilla.
Verter las disoluciones en un vaso de precipitación y enrasar a 1 L.
Autoclavar a 120°C durante 20 minutos.
Verter en dos vasos de precipitación de 500 ml.
5. Dispensado
Verter en cada placa Petri el medio de cultivo hasta 1/3 de su capacidad
aproximadamente. Esta operación se realiza en cámara de flujo laminar.
Tapar el frasco del medio con papel metálico.
Dejar enfriar durante 5 minutos hasta solidificarse e identificar la placa:
clave, fecha, iniciales.
6. Siembra
Abrir la placa Petri dentro de la cámara de flujo.
Flamear el asa de Kolle hasta rojo vivo en un mechero de alcohol o
bunsen.
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Sumergir el asa en el inóculo, dejar unos segundos.
Sembrar sobre el tapiz de agar sin rasgarlo según la técnica indicada:
puntos, estrías, doble estría, etc.
Cerrar la placa dentro de la cámara de flujo.
7. Incubación
Programar la incubadora a 37,5 °C
Trasladar la placa a la incubadora y deslizarla suavemente en forma
invertida.
Incubar durante 24 a 48 horas.
RESULTADO Y DISCUSIÓN
Luego de 24 horas se procedió a sacar las placas Petri (2 por alumno) y no se
observó crecimiento de coliformes en ninguna de ellas, por lo que se esperó 24
horas más y luego de revisar las placas en esta ocasión, algunas presentaron
crecimiento de colonias de bacterias de E. coli, y algunas otras se contaminaron
seguramente debido a algún error humano en la siembra del inóculo en la cámara
de flujo laminar.
La práctica capacitó al alumno en la preparación de un medio de cultivo para
microorganismos lo cual es muy útil para la realización de innumerables trabajos
de investigación que requieren el cultivo de microorganismos. Asimismo, fue
interesante observar colonias de bacterias E. coli presentes en la laguna de
oxidación de la UNCP.
4.3.3 EXPERIMENTO: DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE BACTERIAS
COLIFORMES FECALES TOTALES EN EL AGUA POTABLE DE LA UNIVERSIDAD
NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
MÉTODOS:
Método de Recuento por Dilución en Tubo: Necesita T° del agar de 40°C.
Protocolo IBIG
29
- Preparar el medio de cultivo: esterilizar en autoclave
- Preparar diluciones hasta 10-3
- Preparar dos, tres o cinco tubos por dilución según sea el caso.
- En la cámara de flujo dispensar en placas Petri el medio sin solidificar.
- Añadir con una pipeta 1 ml de dilución según sea el caso a cada placa
Petri.
- Incubar a 37°C durante 24-36 horas.
- Para evaluar contar el número de colonias/placa y multiplicar por el
factor de dilución.
TÉCNICA
Se tomó muestras de agua en frascos de vidrio previamente esterilizados de 12
pabellones de la UNCP, y se siguió el siguiente protocolo:
- Esterilizar las placas Petri por 20 min en el horno a 200°C.
- Lavar botellas, cada una por espacio de 2 minutos.
- Traer muestras de agua codificadas (fecha, pabellón)
- Preparación del medio de cultivo siguiendo el protocolo antes
mencionado.
- Preparar diluciones hasta 10-2.
Diluciones:
- Echar 9 ml de agua millipore en un tubo de ensayo.
- Agregar al tubo 1ml del agua de la zona muestreada (d1:10 -1), y diluir a
partir de éste en un segundo tubo (d2:10-2) echando 1 ml del primer tubo. Cada
dilución cuenta con dos repeticiones (h1, h2). Este procedimiento se hace para
todas las muestras.
- Preparar el medio de cultivo siguiendo el protocolo ya mencionado.
- Previo a la siembra esterilizar los instrumentos antes de su utilización.
- En la cámara de flujo dispensar el medio de cultivo (no esperar a que se
solidifique)
- Agregar con pipeta 1 ml de dilución a cada placa Petri
- Incubar por 24-36 h a 37°C.
30
- Evaluar: contar el N° de colonias.
En la práctica realizada, se utilizó el método “Recuento del número de bacterias
viables mediante el método de dilución y siembra en placa”
Conteo de Bacterias por el Método de Conteo Directo
El número de *UFC contadas dentro de la cuadrícula se multiplican por el inverso del factor de dilución, por ejemplo si el factor de dilución es 1 x 10-1, una colonia representaría: 1x1x10 = 10 UFC /ml.La cantidad de coliformes fecales totales recomendada por las Guías de la OMS es de 0 UFC (unidades formadoras de colonias) /100ml ó 0 UFC / ml.
RESULTADO Y DISCUSIÓN:
PABELLÓN d1 d2
H1 H2 H1 H2
A 19 19 100 100
B 6 6 0 0
C 0 0 2 2
E 0 0 1 1
F 0 0 0 0
G 0 0 0 0
I 2 2 0 0
IBIG 2 2 100 100
COMEDOR 0 0 2 2
CAFETERÍA 1 1 1 1
BIBLIOTECA 0 0 0 0
ED.INTELIGENTE 0 0 0 0
Datos por ml de agua muestreada.
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* UFC: Unidad formadora de colonias.
Se observó una mayor cantidad de bacterias colifecales por ml en el pabellón A, en
promedio en la dilución 1: 190 UFC por ml, debido a que las tuberías del servicio de
agua potable probablemente estén más desgastadas en esa zona a comparación de
otras áreas de la UNCP o tal vez haya una rotura; en la dilución 2 se contaron 100 UFC
en promedio en las placas, este resultado es muy posiblemente debido a un error
humano, ya que normalmente en la dilución 1 debiera haber mayor número de UFC
que en las diluciones posteriores. Para una conclusión certera se recomienda hacer un
nuevo análisis para descartar el error humano. Así mismo, se observa presencia
considerable de bacterias en el IBIG en la dilución 2, lo cual se podría explicar de la
misma manera que el caso anterior. En el pabellón B se encontró 60 UFC/ml en la
dilución 1, mientras que en la dilución 2 no se hallaron UFC. En la cafetería se
encontró 10 UFC/ml en la dilución 1 y en la dilución 2: 100 UFC/ml, lo cual también
supondría un error humano. En el comedor en la dilución 2 se obtuvo 200 UFC/ml Por
tanto, en ambos casos se estaría superando el límite establecido por la OMS de 0
bacteria/ml, lo cual también tendría que corroborarse con un nuevo análisis de agua
para descartar el error humano.
La determinación de bacterias coliformes totales presentes en el agua potable de la
UNCP fue un ejemplo práctico del agua que muchos consumen a veces sin precaución
directamente del caño y generó un interés particular en realizar estudios más
detallados en todo tipo de agua, por ejemplo en el agua de riego de cultivos.
4.4 CORTES HISTOLÓGICOS DE TEJIDO VEGETAL
4.4.1 FUNDAMENTO:
La técnica histológica fundamental comprende la preparación de los tejidos para su
estudio microscópico, lo cual se logra sometiendo a la totalidad o a una parte
seleccionada del tejido por examinar, a una serie de procesos: fijación, deshidratación,
aclaración, corte y tinción.
32
4.4.2 EXPERIMENTO: CORTES HISTOLÓGICOS DE TEJIDOS VEGETALES
MATERIALES:
Equipos y herramientas:
- Microscopio compuesto.
- Portaobjetos.
- Cubreobjetos.
- Pipeta pasteur o gotero.
- Frasco gotero con agua.
- Hoja de Gillette.
- Aguja de disección.
Reactivos e Insumos:
- Colorante: eosina, fucsina, azul de metileno.
- Alcohol.
- Clorox.
- Fijador de Carnoy.
- Bálsamo de Canadá.
- Esmalte de uñas.
- Etiquetas.
Material Biológico:
- Tejidos vegetales: raíz, hojas, tallo de algún cultivo.
TÉCNICA:
1. Obtención de la muestra
Escoger un órgano de la planta para trabajar: hoja, tallo o raíz.
2. Fijación:
En un frasco de vidrio o plástico se utiliza el fijador de Carnoy, el cual contiene
ácido acético y alcohol 3:1 respectivamente. Colocar aquí los cortes realizados y
mantener 12 horas mínimo en maceración.
33
3. Deshidratación:
En un frasco colocar agua destilada para enjuagar las muestras. En 4 placas de
Petri hacer 4 soluciones con alcohol y agua destilada en diferentes
concentraciones como se indica en el siguiente cuadro:
Concentracione
s Tiempo
Alcohol Agua
1 1 (15 min)
1 2 (15 min)
1 3 (15 min)
1 4 (15 min)
La muestra vegetal se lava en el frasco lavador antes de pasarla a la siguiente
concentración.
4. Aclaración o limpieza:
Generalmente se utiliza el disolvente orgánico Xilol, pero es muy fuerte. Por ello
usamos Clorox, ya que en este caso es más apropiado. La proporción utilizada
para el lavado es: 1:9 (clorox, agua) por 1 min.
5. Corte:
Seccionar manualmente en fragmentos que midan de 2 a 4 cm de longitud
utilizando hoja de Gillette y aguja de disección. En el caso de la hoja, incluir la
nervadura central. Cortar transversal o longitudinalmente el órgano elegido,
procurando que los cortes sean finos, sin desgarramientos y de un solo golpe.
En el caso de la raíz hacer un corte de 25 aproximadamente. Observar al
microscopio los cortes, eligiendo los mejores para montarlos.
6. Coloración:
Se puede usar variados colorantes tales como, azul de metileno, verde, fucsina,
etc. Colocar 1 a dos cortes sobre un portaobjetos y proceder a teñirlos con el
34
colorante elegido utilizando un gotero para añadir dos a tres gotas sobre cada
corte y dejar en coloración por 3 min. Observar al microscopio y descartar los
cortes que no satisfagan.
7. Decoloración:
Para poder aclarar los tejidos se procede a colocar los cortes en una solución de
alcohol y agua al 50% dispuesta en una placa Petri por alrededor de un minuto.
8. Montaje:
Poner una gota de bálsamo de Canadá en un portaobjetos. El bálsamo se puede
reemplazar con glicerina. Encima del bálsamo colocar el pequeño corte de tejido
vegetal. Luego sellar las orillas con esmalte de uñas. Etiquetar.
9. Etiquetado:
Anotar en la etiqueta los datos correspondientes: nombre del cultivo, órgano, tipo
de corte: transversal, longitudinal, sagital, etc., iniciales de quién realizó la
preparación y la fecha.
4.5 RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS
4.5.1 FUNDAMENTO:
Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones
coloidales que pueden precipitar formándose coágulos al ser calentadas a
temperaturas superiores a 70ºC o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos,
alcohol, etc.
La coagulación se debe a la desnaturalización de las proteínas (pérdida de estructura)
y en muchos casos es irreversible.
4.5.2 EXPERIMENTO: RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS
MATERIALES:
Materiales de Vidrio
- Tubos de ensayo
- Gradillas
- Mechero
35
- Vasos de precipitado de 250 ml
- Pipetas
- Gotero
Reactivos
- Ácido nítrico concentrado
- Acetato de plomo al 5%
- Alcohol de 96°
- Solución de sulfato cúprico (SO4Cu) al 1%
- Hidróxido de sodio al 20%
- Hidróxido de sodio al 40%
Muestras Biológicas
- Clara de huevo
- Leche
- Gelatina de postre.
METODOLOGÍA
Determinación cualitativa experimental y análisis de las muestras al aplicar
reactivos específicos.
TÉCNICA:
I. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
1. SULFATO CÚPRICO AL 1%: En un vaso precipitador disolver 2,5 g de
Sulfato cúprico y aforar con agua destilada hasta 250 ml.
2. ACETATO DE PLOMO AL 5%: En un vaso precipitador disolver 2,5 g de
Acetato de plomo y aforar con agua destilada hasta 50 ml.
3. NA (OH) al 20%: En un vaso precipitador disolver 10 g de Na (OH) y
aforar con agua destilada hasta 50 ml. Esta solución provocará una reacción
exotérmica de óxido.
II. EXPERIMENTOS
A) REACCIÓN XANTOPROTEICA (Reacción coloreada)
36
Fundamento
Esta reacción se debe a la formación de un compuesto aromático nitrado de
color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico
concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con
aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia
de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un alcali vira a un
color anaranjado oscuro.
Técnica
Se separa la clara de la yema de huevo en un vaso de precipitado.
Tomar una muestra y agregar en un tubo de ensayo 2-3 ml de albúmina
(clara de huevo). Añadir lentamente por las paredes del tubo 1 ml de ácido
nítrico(HNO3).
Calentar a baño maría a 100°C y luego enfriar en agua fría.
Agregar por las paredes del tubo cuidadosamente, inclinando el tubo y
despacio unas gotas de una disolución de Na (OH) al 40%.
Resultados
En la muestra de clara de huevo se observó una interfase con forma de anillo
naranja al añadir HNO3 y calentarlo, luego la solución tomó un color amarillo
suave, y al añadir Na (OH) tomó un tono anaranjado. Así mismo se observó
una solidificación de la clara de huevo color blanco en la base del tubo de
ensayo. Dado que los resultados de esta prueba Xantoproteica dan positivos,
queda demostrada la presencia de proteínas en ambas muestras. El hecho de
que la clara solidifique en contacto con el HNO3 es debido a que al cambiar el
pH de la disolución, las proteínas que en ella hay se desnaturalizan y se
vuelven insolubles.
37
Albúmina con HNO3 Albúmina, luego de la adición de Na (OH).
B) DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR CALOR y pH EXTREMOS
Fundamento
Muchas proteínas se desnaturalizan por calor, que afecta las interacciones
débiles como enlaces de hidrógeno. El cambio es abrupto, la pérdida de la
estructura en una parte de la proteína desestabiliza el resto. La acción de los
extremos de pH afecta a las proteínas mediante la acción de los iones de H- y
OH+.
Técnica
En dos tubos de ensayo agregar 5 ml de cada proteína (albúmina y leche).
Añadir a ambos tubos 0,5 ml de ácido nítrico respectivamente, y colocarlos
en baño maría de agua hirviendo por 10 min.
Enfriar a temperatura ambiente y observar los resultados.
En un tercer tubo agregar 10 ml de albúmina y luego gota a gota añadir 5 ml
de alcohol de 96°.Observar los resultados.
Resultados
En el primer experimento con HNO3 al poner ambos tubos en baño maría, se
observa como la albúmina se precipita solidificándose casi completamente y se
torna color blanco amarillento, mientras que en el caso de la leche se observa
un precipitado leve amarillento.
38
Albúmina con HNO3 Leche con HNO3
Albúmina con alcohol
Al agregar alcohol a la albúmina, se observan estructuras blanquecinas que
semejan fibras de algodón en la superficie de la solución.
C) REACCIÓN BIURET (Reacción coloreada)
Fundamento
El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos
cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de
composición desconocida. Cuando una proteína se pone en contacto con un
alcali concentrado se forma este complejo denominado Biuret cuya fórmula es
NH2-C-N-C-NH2 que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida
produce un color violeta característico.
39
Técnica
Colocar en un tubo de ensayo 3 ml de albúmina (clara de huevo)
Añadir 2 ml de solución de Na (OH) al 20%, y a continuación 4-5 gotas
de solución de SO4Cu al 1%.
Agitar para que se mezcle bien y observar los resultados.
Al agregar la solución cúprica se observará una coloración lila
(proteínas) y celeste en forma de anillo en la superficie. La reacción es la
siguiente:
“Proteína + alkali NH2 –C-N-C- NH2 + SO4 Cu”
Resultados:
Al colocar la clara de huevo en un tubo de ensayo y añadirle la solución de
SO4Cu al 1% de color azul turquesa, se observó un color azul fuerte. Luego al
añadirle a esta mezcla el Na (OH) al 20%, se vuelve la disolución de un color
azul más claro. Luego de agitarlo se puede observar que la mezcla se torna
color violeta, lo que nos indica que efectivamente hay presencia de proteínas
gracias a la reacción del Biuret, por la coordinación del Cu en medio alcalino,
con los enlaces peptídicos de las proteínas de la clara del huevo.
Albúmina con reactivo de Biuret
40
D) REACCIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS AZUFRADOS
Fundamento
Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro
de plomo. Esta reacción se basa en la separación mediante un alcali, del azufre
de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo,
forma el sulfuro de plomo.
Técnica
Poner en un tubo de ensayo de 2 a 3 cc. de solución muestra (gelatina
diluida).
Añadir 2 cc. de solución de Na (OH) al 20%.
Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%.
Calentar el tubo cuidadosamente hasta ebullición.
Si se forma un precipitado color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro
de plomo utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que nos sirve para
identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre.
Resultados
Apenas se formó un anillo pequeño color negruzco en la superficie de la
solución con gelatina lo que nos indica una presencia mínima de aminoácidos
azufrados en esta sustancia. Por tanto, en este caso el resultado de la reacción
es negativo, y esto muestra que en la gelatina comercial de postre carece de
proteínas que tienen aminoácidos con azufre.
41
Gelatina con anillo gris en la superficie
DISCUSIÓN
Esta práctica fue muy interesante ya que permitió observar prácticamente a los
componentes proteicos de algunos alimentos y conocer las distintas reacciones que se
generan al añadir determinadas sustancias a éstos, como el ácido nítrico, o el hidróxido
de sodio en la reacción xantoproteica. La aplicación práctica fue diferenciar a las
proteínas de los alimentos de los demás componentes que existen en ellos, es por eso
que se utilizó alimentos con alto contenido proteico para una mejor visualización de las
proteínas.
42
V. CONCLUSIONES
En las prácticas realizadas en el Instituto de Biotecnología e Ingeniería
Genética de la UNCP se realizaron actividades relacionadas con
investigaciones genéticas y científicas las cuales permitieron aplicar las teorías
aprendidas en estas áreas.
Las prácticas llevadas a cabo en el IBIG incluyeron extracción de DNA,
preparación de medios de cultivo para microorganismos, determinación de
bacterias coliformes fecales totales en agua potable, reconocimiento de
proteínas, entre otras.
En cada una de las prácticas se desarrollaron habilidades en el manejo de
instrumentos de laboratorio, así como también se aprendieron técnicas de
experimentación e investigación.
En la práctica de determinación de bacterias coliformes fecales totales en el
agua potable de la UNCP se aprendió un método sencillo de análisis de agua y
ello motivó a realizar mayores investigaciones relacionadas al tema.
En la práctica de reconocimiento de proteínas se observaron algunas de las
propiedades de las proteínas tanto físicas como fisicoquímicas, así como
también las reacciones específicas para cada aminoácido que las constituye.
Las actividades realizadas dentro y fuera del laboratorio ayudaron al practicante
a afianzar los conocimientos adquiridos en genética y biotecnología en la
universidad.
43
VI. RECOMENDACIONES
Se recomienda a los alumnos de Agronomía realizar prácticas en el Instituto de
Biotecnología e Ingeniería Genética de la UNCP ya que es importante tener una
visión integral de la carrera para llegar a ser mejores profesionales.
La UNCP debiera destinar un mayor presupuesto al IBIG ya que es
fundamental ampliar el laboratorio e implementarlo con el material necesario
para poder recibir mayor cantidad de alumnos de todas las carreras.
Los estudiantes de la Facultad de Agronomía deberían tener mayor y mejor
preparación en áreas de la genética y biotecnología, para ser competitivos en la
ciencia y en la empresa.
Se recomienda a la facultad de Agronomía de la UNCP crear la cátedra de
Biotecnología Agraria para actualizar científicamente la carrera de Agronomía
en la Región Central.
44
VII. BIBLIOGRAFÍA
BEREZOV T.T, Korovkin B.F: “Chemistry of Proteins”. En Biochemistry, 1ª ED.
Mir Publishers Moscow Moscú, Rusia, 1992. pp. 19 – 64
CARLSON, S. (1998). Deshilando el tejido de la vida. Investigación y Ciencia. 266, 84-85
LEHNINGER, A. L. Principios de bioquímica. Barcelona: Ed. Omega, 2ª ed.,
1993.
GONZÁLEZ DE BUITRAGO JM, Arilla E, Rodríguez-Segade M, Sánchez A:
Alteraciones de la digestión de proteínas y de la absorción y metabolismo de
losaminoácidos. Bioquímica Clínica, 1ª ED.McGraw-Hill Interamericana, Madrid,
España, 1998.181–190.
MURRAY, Robert K. MAYES, Peter A. GRANNER, Daryl K. Bioquímica de
Harper.13 edición. Ed. el manual moderno. México. DF. 1993. Pág. 19-20
“Recuento de bacterias”, Proyecto Prácticas online de microbiología para
farmacéuticos, Universidad de Granada, 2010 en:
http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/recuento-de-bacterias-
viables/recuento-text
http://www.oas.org/dsd/publications/classifications/
Armoniz.EstandaresAguaPotable.pdf
http://www.ipb.csic.es/servicios/Microscopia/uploads/3/6/2/2/3622788/
microscopia_a_grandes_rasgos.pdf
45
VIII. ANEXOS
Equipo del IBIG
DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES EN AGUA POTABLE DE LA UNCP
Placas esterilizándose en estufa Muestras de agua potable
46
Medio de cultivo dispensándose en placas Petri Cámara de flujo laminar
Diluciones de agua muestreada Dilución de agua añadida al medio de cultivo
47
RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS
Grupo trabajando en laboratorio Muestra de clara de huevo
Reacción xantoproteica de albúmina Reacciones de proteínas
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