血液 DNA 提取及 PCR 扩增

分子流行病学实验

经典 DNA提取法1.在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆，溶解胞、核膜。

2.去垢剂（ SDS）与蛋白酶消化蛋白，分离DNA。

3.有机溶剂（酚与氯仿）去除蛋白，萃取DNA。

4.乙醇与盐类沉淀 DNA。

1.样品处理：分离细胞，低渗盐水（ 0.2%）或细胞悬浮液。（ 10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml 胰RNA酶 ,0.5%SDS）。

2.消 化： TNE缓冲液 （ 15mmol/L Tris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA, 5mmol/L NaCl） 4ml， 10%SDS0.45 ml ， 10mg/ml蛋白酶 K （终浓度， 100μg/ml），混匀， 50 3h℃ ， 45℃ 过夜。

3.DNA 分离：等体积饱和酚；等体积饱和酚 / 氯仿 / 异戊醇（ 25/24/1）；氯仿 / 异戊醇（ 24/1）。 500r/min,10min。

4.沉淀 DNA： 1/10体积 3mol/L NaAc， 2 倍无水乙醇 -70%乙醇。离心，挥干。可加醋酸钠（终浓度： 0.3mol/L）并低温。10-20分钟。

5.溶解 DNA：适量 TE（ 10mmol/L Tris-HClpH8.0,1mmol/LEDTA ） , 长时间。

1.Chelex-100提取 DNA基本成分：含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯 - 二乙基苯 共聚

物。基本方法：沉淀细胞； 5%试剂 200μl； 56 0.5h℃ 以上；

100 8min℃ ；剧烈震荡；离心上清。注意：离心彻底。2.硅珠法提取 DNA基本成分： GuSCN（硫氰酸胍，蛋白变性），二氧化硅（硅珠，

核酸吸附）。基本方法：血液（ 1-4μl） TES（ 100μl） SDS（ 20μl）煮沸

5min； 300μl GuSCN溶液与 20μl硅珠液保温 15 min；离心后加 GuSCN溶液；离心加乙醇漂洗； TES56 10 min℃ 离心取上清。

3.直接煮沸法 100 10min℃

1.如消化不完全，可用 TNE溶解后再重提。2.消化时间宜长不宜短。3.操作轻柔。4.混匀要充分。5.挥干不宜过度。

1.凝胶电泳半定量分析法：参照标准分析。2.分光光度计分析基本原理： 260nm波长为核酸吸收峰， 1OD值为50μg/μl双链核酸（ 40μg/μl单链核酸），根据OD值可计算 DNA含量。

计算方法： DNA浓度（ μg/μl） =OD×50×稀释倍数 ÷1000

例： 40倍稀释液， OD值为 1.7 DNA浓度 =1.7×50×40÷1000=3.4μg/μl 280nm波长为蛋白吸收峰， 260/280比检测核酸纯

度。 1.6-1.8（八） DNA纯化

聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction ， PCR）：在模板DNA 和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下，由一对特异性引物限定的靶 DNA片段，经DNA聚合酶催化的体外合成过程。 100万倍，由数 pg- 数 μg。

1.变性（ denaturation） : 在加热的条件下（ 94℃ 左右），模板 DNA配对碱基间氢键断裂，DNA双链变成单链。

2.退火 / 复性（ annealing）：在降温的条件下（ 55 -62℃ ℃ ），引物与其互补的模板 DNA片段（靶片段的側翼序列）结合形成杂交双链。

3.延伸（ extension）：在合适的温度下（ 68 -72℃ ℃ ），经 DNA聚合酶催化 4 种脱氧核苷酸，由引物的 3ˊ 端为起始点，从 5ˊ 向 3ˊ 端延伸，合成新的与 DNA 靶片段互补的 DNA链。

每反应一个循环，靶 DNA片段数量增加一倍，并以指数的量堆积，经 30余次循环，产物量可达到2×105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作为模板。

标准体系为 50-100μl，常用 20μl。 DNA模板 10-50ng DNA聚合酶 0.5-1.0U 一对引物 0.1-0.5μmol/L 4 种脱氧核苷酸 40μmol/L 缓冲液 反应条件： 95 4-5min,94 50s/55 -℃ ℃ ℃62 30-60s/72 30-60s,30℃ ℃ 各循环后72 5-10min℃ 。

1. 熟练掌握从外周血快速提取基因组 DNA 的方法；

2. 理解 PCR 的原理，了解 PCR 操作过程；3. 熟悉琼脂糖凝胶电泳的实验过程。

KI0.9%NaCl异丙醇乙醇Eppendorf 管微量加样器等

外周血基因组DNA的提取　1 、取抗凝血 100μl2 、加无菌重蒸水 500μl ； 10 000r/ 分钟离心 3 分钟3 、加 20μl 5mol/L KI ，旋涡振荡 30 秒 ;4 、 0.9%NaCl 100μl, 振荡 30 秒； 10 000r/ 分钟离心

5 分钟5 、吸上清 100μl 加异丙醇 100μl ，轻轻混匀， 10

000r/ 分钟离心 5 分钟6 、加冷无水乙醇 500μl ， 10 000r/ 分钟离心 5 分钟7 、弃去无水乙醇，自然干燥； 50μl 无菌重蒸水，混匀

溶解备用。

（ 1 ）制作 PCR 反应 MIX（ 2 ） PCR 循环扩增程序： 94℃ 30s → 65

℃ 30s → 72℃ 60s ，循环 35 次，最后在72℃ 保温 10min 。

（ 3 ）结束反应， PCR 产物放置于 4℃ 待电泳检测或 -20℃ 长期保存。

（ 4 ） PCR 的电泳检测：直接取 10μl 电泳检测。

取 10μl 的 PCR 产物与 DNA Ladder Marker 进行琼脂糖凝胶电泳分析，分析结果采用紫外灯照相。