ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA-ΠΩΣ ΚΑΙ ΓΙΑΤΙ

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA

ΕΚΦΕ ΑΜΠΕΛΟΚΗΠΩΝΦΕΒΡΟΥΑΡΙΟΣ 2016

ΦΡΑΝΤΖΕΣΚΑ ΤΣΟΡΤΕΚΗΓΕΩΠΟΝΟΣ – ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΓΡΑΦΟΣ

ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟΣ ΠΕ14.04

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA …. Η ΚΑΛΥΤΕΡΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΜΕ ΕΥΚΟΛΟ

ΤΡΟΠΟ ΑΠΟ ΦΥΤΙΚΟ ΙΣΤΟ….

ΔΗΜΟΦΙΛΗ ΧΡΗΣΗ ΕΧΟΥΝ ΤΑ ΦΥΛΛΑ, Η ΜΠΑΝΑΝΑ, ΤΟ

ΑΚΤΙΝΙΔΙΟ ΚΑΙ Η ΦΡΑΟΥΛΑ

….. Η ΑΠΟ ΖΩΪΚΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ ……

…. ΟΠΟΤΕ ΣΥΝΗΘΕΣΤΕΡΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΜΕ ΤΟ ΑΙΜΑ, ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΟΜΑΤΙΚΗΣ ΚΟΙΛΟΤΗΤΑΣ …….

….. Ή ΜΙΚΡΟ ΤΜΗΜΑ ΖΩΪΚΟΥ ΙΣΤΟΥ Π.Χ. ΤΕΜΑΧΙΟ ΨΑΡΙΟΥ Ή ΤΜΗΜΑ ΕΝΤΟΜΟΥ ΟΠΟΥ Π.Χ. ΕΝΑ ΠΟΔΑΡΑΚΙ ΓΡΥΛΛΟΥ ΕΙΝΑΙ ΑΡΚΕΤΟ.

ΑΥΤΗ ΕΙΝΑΙ ΜΙΑ ΙΣΤΟΣΕΛΙΔΑ ΕΝΟΣ ΕΙΚΟΝΙΚΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΓΙΑ ΝΑ ΚΑΝΟΥΜΕ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA ΑΠΟ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΟΜΑΤΟΣ

DNA Extractionhttp://learn.genetics.utah.edu/co

ntent/labs/extraction/

ΕΜΕΙΣ ΠΡΟΤΙΜΗΣΑΜΕ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΑΠΟ ΦΥΤΙΚΟ ΙΣΤΟ…….

….ΜΕ ΥΛΙΚΟ ΤΗ ΜΠΑΝΑΝΑ.

Ανθεκτικότητα κυτταρίνης: Κυτταρίνη αχύρου σίτου που υφίσταται κατεργασία προς αποδιάταξη

ΟΙ ΦΥΤΙΚΟΙ ΙΣΤΟΙ ΛΟΓΩ ΤΗΣ ΥΠΑΡΞΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΤΟΙΧΩΜΑΤΩΝ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΥΠΟΣΤΟΥΝ ΚΑΤ΄ΑΡΧΗΝ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΚΑΤΑΠΟΝΗΣΗ ΓΙΑ ΝΑ ΒΟΗΘΗΣΟΥΜΕ ΝΑ ΣΠΑΣΟΥΝ ΚΑΙ ΝΑ ΑΠΕΛΕΥΘΕΡΩΘΕΙ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ.

ΚΑΤΙ ΤΕΤΟΙΟ ΣΤΟΥΣ ΖΩΪΚΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΟ.

ΤΑ ΦΥΤΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΕΚΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟ ΝΑ ΤΑ ΒΑΛΟΥΜΕ ΣΤΟ ΜΠΛΕΝΤΕΡ Ή ΣΤΟ ΓΟΥΔΑΚΙ ΓΙΑ ΝΑ ΤΑ ΛΕΙΩΣΟΥΜΕ, ΜΠΟΡΟΥΜΕ ΝΑ ΤΑ ΠΙΕΣΟΥΜΕ ΜΕΣΑ ΣΕ ΜΙΑ ΣΑΚΟΥΛΑ ΜΕ ΤΟ ΧΕΡΙ Ή ΑΠΛΑ ΝΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΟΥΜΕ ΕΝΑ ΠΗΡΟΥΝΙ, ΚΟΥΤΑΛΙ Ή ΤΟ ΜΑΧΑΙΡΙ ΠΟΥ ΚΟΨΑΜΕ ΤΗΝ ΑΡΧΙΚΗ ΠΟΣΟΤΗΤΑ.

ΓΙΑ ΑΥΣΤΗΡΑ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ…

ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΟ

ΣΥΣΚΕΥΗ ΑΝΑΚΙΝΗΣΗΣ

ΥΔΑΤΟΛΟΥΤΡΟ

ΣΩΛΗΝΕΣΠΙΠΕΤΤΕΣeppendorfs

… ΑΛΛΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΑΠΟ ΕΝΑ ΕΜΠΟΡΙΚΟ “KIT”

ΠΡΩΤΕΪΝΑΣΗ,ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΛΥΣΗΣ, ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΕΚΠΛΥΣΗΣ, ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΕΝΑΙΩΡΗΣΗΣ, ΑΙΘΑΝΟΛΗ 96 ΒΑΘΜΩΝ.

ΓΙΑ ΤΙΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΣΧΟΛΙΚΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΚΑΙ ΜΑΛΙΣΤΑ ΓΙΑ ΝΑ ΔΟΥΜΕ

ΑΠΛΩΣ ΤΑ ΝΟΥΚΛΕΪΚΑ ΣΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ- ΑΝ ΕΙΜΑΣΤΕ ΤΥΧΕΡΟΙ- ΧΡΕΙΑΖΟΜΑΣΤΕ ….

ΚΑΤ΄ΑΡΧΗΝ ΤΟΥΣ ΜΑΘΗΤΕΣ ΜΑΣ ΜΕ ΔΙΑΘΕΣΗ ΚΑΙ ΜΙΑ ΜΠΑΝΑΝΑ, ΑΠΟ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΘΑ ΑΠΟΚΟΨΟΥΜΕ ΜΕ ΠΛΑΣΤΙΚΟ ΜΑΧΑΙΡΑΚΙ ΤΜΗΜΑ ΠΕΡΙΠΟΥ 3 cm-EINAI ΑΡΚΕΤΟ ΚΑΙ ΔΙΝΕΙ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΓΙΑ ΠΑΝΩ ΑΠΟ 25 ΦΡΕΣΚΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ.

ΜΙΑ ΜΕΤΑΛΛΙΚΗ ΒΑΣΗ ΜΕ ΚΡΙΚΟ

ΓΥΑΛΙΝΟ ΧΩΝΙ

ΦΙΛΤΡΑ ΚΑΦΕ

ΑΛΑΤΙ

ΕΠΙΣΗΣ …..

ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΟ ΜΕ ΜΠΛΕ ΚΑΙ ΠΡΑΣΙΝΟΥΣ ΚΟΚΚΟΥΣ ΔΗΛ. ΕΝΖΥΜΑ

ΠΑΓΩΜΕΝΗ ΑΛΚΟΟΛΗ

ΔΟΧΕΙΑ ΖΕΣΕΩΣ

…. ΚΑΙ ΛΙΓΟ ΜΙΚΡΟΕΞΟΠΛΙΣΜΟ ΑΚΟΜΗΟΓΚΟΜΕΤΡΙΚΑ ΔΟΧΕΙΑ ΖΕΣΕΩΣ…….Ή ΟΓΚΟΜΕΤΡΙΚΟ ΚΥΛΙΝΔΡΟ (ΚΑΙ ΜΕ ΤΟ ΜΑΤΙ ΓΙΝΕΤΑΙ!)ΔΟΚΙΜΑΣΤΙΚΟΥΣ

ΣΩΛΗΝΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΛΛΙΚΗ ΒΑΣΗ ΓΙ΄ΑΥΤΟΥΣ -ΑΝ ΤΟΥΣ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΣΟΥΜΕ (ΓΙΝΕΤΑΙ ΚΑΙ ΜΕ ΤΑ ΔΟΧΕΙΑ ΖΕΣΕΩΣ)

1-2 ΠΛΑΣΤΙΚΑ ΚΟΥΤΑΛΑΚΙΑ

ΚΑΘΑΡΙΖΟΥΜΕ ΚΑΙ ΠΟΛΤΟΠΟΙΟΥΜΕ ΤΗ ΜΠΑΝΑΝΑ ΣΕ ΝΕΡΟ, ΜΕ ΟΠΟΙΟ ΤΡΟΠΟ ΔΙΑΛΕΞΟΥΜΕ

ΓΙΑ ΤΕΜΑΧΙΟ ΜΠΑΝΑΝΑΣ 3cm, 20ml νερό ή μέχρι να καλυφθεί η μπανάνα

¼ ΚΟΥΤΑΛΑΚΙ ΤΟ ΓΛΥΚΟΥ ΑΛΑΤΙ ΚΑΙ ½ ΚΟΥΤΑΛΑΚΙ ΤΟΥ ΓΛΥΚΟΥ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΟ ΣΕ 20ml ΝΕΡΟ

ΓΙΑΤΙ ΡΙΧΝΩ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΟ;

ΡΥΠΟΣ ΠΕΡΙΚΥΚΛΩΜΕΝΟΣ ΑΠΟ ΜΙΚΥΛΛΙΟ

ΠΩΣ ΔΙΕΥΘΕΤΟΥΝΤΑΙ ΤΑ ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΑ ΣΤΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ:

ΑΛΛΑ ΕΧΟΥΜΕ ΚΑΙ ΤΙΣ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ

Διαλυτοποίηση ενσωματωμένων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών με απορρυπαντικά.

ΤΟ ΠΙΟ ΑΥΣΤΗΡΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΡΟΒΛΕΠΕΙ ΤΗΝ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΠΕΨΙΝΗΣ. ΓΙΑΤΙ

ΠΡΟΣΘΕΤΩ ΠΕΨΙΝΗ;ΓΙΑ ΝΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΟΥΜΕ ΤΑ ΝΟΥΚΛΕΪΚΑ

ΟΞΕΑ ΑΠΟ ΤΙΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ, ΜΕ ΤΙΣ ΟΠΟΙΕΣ ΕΙΝΑΙ ΣΥΝΔΕΔΕΜΕΝΟ.

Αλληλεπιδράσεις DNA-πρωτεΐνης, που υπάρχουν στη ραχοκοκκαλιά σακχάρου-φωσφορικού (δεσμοί υδρογόνου). Συμβάλλουν ΚΑΙ σε δομικές αλλαγές σε αυτές τις περιοχές του DNA (dislocation DNA).

Συνδεδεμένο είναι και το RNA με πρωτεΐνες όπως στα ριβοσώματα

Τι είναι η πεψίνη:

Η πεψίνη είναι ένα ένζυμο που εκκρίνεται σε αδρανή μορφή γνωστή ως πεψιγόνο από τους αδένες του στομάχου των σπονδυλωτών.

Το πεψιγόνο μέσα σε όξινο περιβάλλον δραστηριοποιείται σε πεψίνη όπου και διασπά τις πρωτεΐνες σε μικρότερες αλυσίδες πολυπεπτιδίων, οι οποίες στη συνέχεια διασπώνται από τις πεπτιδάσες.

ΑΝΤΙ ΓΙΑ ΠΕΨΙΝΗ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩ ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΑ:

περιέχουν ειδικά ένζυμα, που αφαιρούν ειδικούς λεκέδες. Συνήθως υπάρχουν τέσσερις τύποι ενζύμων στα απορρυπαντικά:

- Τα ένζυμα πρωτεάσης- Τα ένζυμα λιπάσης- Τα ένζυμα αμυλάσης- Τα ένζυμα κυτταρινάσηςΕναλλακτικά μπορώ να

χρησιμοποιήσω υγρό φακών επαφής.

ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΟΥ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΗ ΦΑΣΗ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΜΙΓΜΑ ΦΑΙΝΟΛΗΣ/ΧΛΩΡΟΦΟΡΜΙΟΥ, ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΌΜΩΣ ΕΙΝΑΙ ΠΟΛΥ ΕΠΙΚΙΝΔΥΝΟ.

ΦΑΙΝΟΛΗ ΧΛΩΡΟΦΟΡΜΙΟ

ΧΛΩΡΟΦΟΡΜΙΟ:Οξείδωση. Υπόκειται σε βραδεία οξείδωση

από το ατμοσφαιρικό οξυγόνο παρέχοντας το τοξικότατο φωσγένιο (phosgene), γνωστό πολεμικό αέριο, σύμφωνα με την αντίδραση:

Ίχνη φωσγενίου καθιστούν το χλωροφόρμιο ακατάλληλο για χορήγηση αναισθησίας, αλλά ακόμη και ως διαλύτη, αφού το φωσγένιο είναι εξαιρετικά δραστική ένωση και μπορεί να αντιδράσει με τις διαλυμένες ή εκχυλιζόμενες ενώσεις. Χαρακτηριστικά, αναφέρεται πως πολλά πειράματα απομόνωσης DNA θα πρέπει να έχουν αποτύχει εξαιτίας χλωροφορμίου μολυσμένου με φωσγένιο.

Ένας διαλύτης φαινόλης, χλωροφορμίου και (ισοαμυλικής) αλκοόλης σε αναλογία 25:24:1 χρησιμοποιείται για τη διάλυση μη-νουκλεϊκών οξέων βιομορίων σε εκχυλίσεις DNA και RNA.

Συνήθως στο χλωροφόρμιο προστίθεται ποσότητα αιθανόλης (περίπου 0,5-2%) ως σταθεροποιητής (stabilizer). Η αιθανόλη δεσμεύει το φωσγένιο προς τον μη τοξικό ανθρακικό διαιθυλεστέρα (diethylcarbonate) σύμφωνα με την αντίδραση:

CΟCl2  +  2 C2H5OH       (C2H5O)2CO  +  2 HCl

Η ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΤΩΝ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ

Τα νουκλεϊκά οξέα ΚΑΤ΄ΑΡΧΗΝ είναι ευδιάλυτα στο νερό επειδή έχουν γύρω τους τα αρνητικά φορτία των φωσφορικών ριζών και τα μόρια του νερού είναι πολικά. Έτσι αλληλεπιδρούν με ηλεκτροστατικές δυνάμεις.

Ως εκ τούτου πολικά μόρια μπορούν χαρακτηρισθούν ως υδρόφιλα και μη πολικά, ως υδρόφοβα.

Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΑΛΑΤΟΣ ΣΤΗΝ ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΜΕΣΑ ΣΤΗΝ ΑΙΘΑΝΟΛΗ

Πίσω στο πρωτόκολλο: Ο ρόλος του άλατος σύμφωνα με το πρωτόκολλο είναι να εξουδετερώσει τα αρνητικά φορτία, στα οποία προαναφερθήκαμε. Κοινώς χρησιμοποιούμενο αλάτι είναι το οξικό νάτριο (ή το χλωριούχο νάτριο) . Στο διάλυμα, το οξικό νάτριο διίσταται σε Na+ και [CH3COO]-. Τα θετικά ιόντα Na+ εξουδετερώνουν τα αρνητικά φορτία των PO3- ομάδων ελαττώνοντας δραστικά τον υδροφιλικό χαρακτήρα των νουκλεϊκών οξέων.

Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ

Η ηλεκτροστατική έλξη μεταξύ Na+ και PO3- στο διάλυμα υπαγορεύεται από τον Νόμο του Coulomb, ο οποίος επηρεάζται από τη διηλεκτρική σταθερά του διαλύματος. Το νερό έχει υψηλή διηλεκτρική σταθερά, που καθιστά δύσκολη την προσέγγιση Na+ και PO3-.

Η Αιθανόλη έχει πολύ μικρότερη διηλεκτρική σταθερά, διευκολύνοντας την αλληλεπίδραση Na+ και PO3-, καθιστώντας τα νουκλεϊκά οξέα πολύ λιγότερο υδρόφιλα. Έτσι τα «σπρώχνει» εκτός διαλύματος.

ΓΙΑΤΙ Η ΑΙΘΑΝΟΛΗ ΕΙΝΑΙ ΚΡΥΑ

Χαμηλή θερμοκρασία του μίγματος «νουκλεϊκά οξέα/άλας/αιθανόλη» ( -20 or -80C°) καταγράφεται και ζητείται από όλα τα πρωτόκολλα. Εν τούτοις, κατά τον Maniatis et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Edition), ΔΕΝ απαιτείται, διότι τα νουκλεϊκά στη χαμηλή συγκέντρωση των 20ng/mL θα καθιζήσουν αν παραμείνουν 15-30 λεπτά στους 0-4C°.

Η πλύση με αιθανόλη 70% Με αυτό τον τρόπο απομακρύνεται η παραμένουσα

ποσότητα αλατιού από το πήγμα πλέον του DNA.

Αιθυλική αλκοόλη Πυκνότητα 789 kg/m³ Νερό: Πυκνότητα: 1.000 kg/m³

Η αλκοόλη που προσθέσαμε δημιουργεί ένα «σύννεφο» γύρω από τα νουκλεϊκά οξέα απομακρύνοντας τα μόρια του νερού (θόλωμα).

Επίσης αέρας απελευθερώνεται καθώς ζεσταίνεται η αλκοόλη. Αυτό δημιουργεί τις φυσαλίδες που βλέπουμε να ανεβαίνουν.

DNA από φράουλα ταξιδεύει προς το επάνω μέρος του δοκιμαστικού σωλήνα

Το ταξείδι του DNA της μπανάνας στο δικό μας εργαστήριο.

Φτιάξαμε φρέσκα παρασκευάσματα DNA μπανάνας για παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο. Την επόμενη ημέρα το DNA συμπυκνώνεται και είναι πιο πιθανό να γίνει ορατό.

ΧΡΩΣΗ: ΚΥΑΝΟΥΝ ΤΟΥ ΜΕΘΥΛΕΝΙΟΥ

Η ΤΕΛΙΚΗ ΕΥΚΟΛΗ ΣΥΝΤΑΓΗ2-3 cm μπανάνας πολτοποιούνται …

σε 15-20ml απιονισμένο νερόΣε 15-20ml νερό ρίχνω ¼ κουταλιάς

του γλυκού αλάτι και ½ κουταλιάς του γλυκού απορρυπαντικό με ένζυμα. Ανακατεύουμε χωρίς να γίνει αφρός.

Αναμιγνύουμε το μίγμα χυμού με το μίγμα αλατιού-απορρυπαντικού. Ανακατεύουμε χωρίς να γίνει αφρός .

Βάζουμε το φίλτρο καφέ στο χωνί και το υγραίνουμε. Πετάμε το πλεονάζον νερό.

Ρίχνουμε το νέο μίγμα στο χωνί και συλλέγουμε το φιλτραρισμένο χυμό.

Η ΤΕΛΙΚΗ ΕΥΚΟΛΗ ΣΥΝΤΑΓΗΡίχνουμε –αν χρειάζεται- νερό για να γίνει το διάλυμα αραιό.

Προσθέτουμε παγωμένη αλκοόλη στο τοίχωμα του σωλήνα.

Αφήνουμε το διάλυμα να ηρεμήσει. Παρατηρούμε θόλωμα στη μεσόφαση.

Για παραλαβή μεγαλύτερης ποσότητας ρίχνω λίγο διάλυμα NaCl.

Συλλέγω τα νουκλεϊκά οξέα πχ με καλαμάκι για σουβλάκι και τα τοποθετώ σε αλκοόλη καλύτερα 70 βαθμών.

Όλα καλά; Καμιά ερώτηση;;;