液液液液液液液 液液液液液液液 -
Jan 27, 2016
液相色谱新进展 -超高效液相色谱
Waters 公司的 UPLC: Ultra Performance Liquid
Chromatography ( 超高效液相色谱)
Agilent 公司的 RRLC: Rapid Resolution Liquid
Chromatography (快速高分离度液相色谱)
一、定义:
用细粒径填料( sub-2μm) 、细内径柱子获得柱效高达(100,000-300,000/m) 的液相色谱技术,简称超高效液相色谱
为什么关注小颗粒色谱填料?根据 Van Deemter 方程 H=A+B/v+Cv
颗粒度越小, HETP 越低,柱效越高,分离度越好
对于小颗粒,通过高流速获得高分离速度
对于小颗粒,提高流速时HETP 不会提高-提高分离速度
二、基本原理二、基本原理
节约时间 节约溶剂 超高灵敏度 超高分离度缺点: 高压力 Agilent RRLC 约 450bar
Waters UPLC 约 700bar
优点:
三、优缺点:三、优缺点:
4.4
61
4.6
91
8.0
80
8.1
89
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
分钟1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
分钟0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00
Rg1
Re
Rb1
西洋参成分的分离比对
HPLC
UPLC
4.6×250mm , 5μm
2.1×50mm , 1.7μm
1 、提高分离速度
小颗粒填料的速度优势
分离度 RS L/ d∝ p ,即保持 L/ dp ,同比缩短柱长 , 以提高分离速度
提高流速-小颗粒填料的保持柱效,不降低分离度
提高速度的辅助手段温度
不同色谱柱和温度的分离速度比对
2 、提高分离度和灵敏度 提高 L/ dp ( dp 变小)-提高柱效-提高分离度 对于 4.6×150mm , 5μm 色谱柱, L/ dp = 30
对于 4.6×150mm , 1.8μm 色谱柱, L/ dp = 83.3
- 改善分离度,保持分离速度 对于 4.6×100mm , 1.8μm 色谱柱, L/ dp = 55.6
- 改善分离度,提高速度
分离度:颗粒对药物杂质分离的影响
改善分离度和灵敏度
四、应用实例:西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪)
1 、分离目标化合物: 根据中国药典( 2005 年版)确定分离人参皂苷 Rg1 、 Re 与 Rb1 ,结构如下:
2 、药典色谱条件样品:西洋参提取液
仪器: Agilent 1100 高效液相色谱系统流动相:以乙腈为流动相 A ,以 0.1 %磷酸为流动相 B ,按下表进行梯度洗脱
四、应用实例:西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪)
时间(分钟) 流动相 A(%) 流动相 B(%)
0~25 19→ 20 81→ 80
25~60 20→ 40 80→ 60
60~90 40→ 55 60→ 45
90~100 55→ 60 45→ 40
色谱柱: ZORBAX SB C18 4.6×150 mm , 5μm柱温: 40 ºC 流速: 1.0 mL/min 检测波长: 203 nm 进样量: 5μL
四、应用实例:西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪)
HPLC 色谱柱规格 : 4.6 x150 mm , 5μm , (L/dp=30) 。
根据 L/dp 值初步确定 RRLC 色谱柱规格: 4.6 x 50mm , 1.8μm , (L/dp≈28 )
故可以获得相近的分离效率,但分离速度大大提高,并且可以改善灵敏度。
3 、色谱柱的选择:
四、应用实例:西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪)
4 、方法转换的初步参数确定在 Method Translator 相应栏目中输入原始 HPLC 条件,包括 HPLC 色谱柱规格、进样量、流速、梯度表等参数,并选择 RRLC 色谱柱的规格,即可获得根据洗脱柱体积相同原则折算而得的 RRLC 分离的初步参数。
五、方法优化:
由于人参皂苷 Rg1 、 Re 未达到基线分离,可通过温度进一步优化分离
四、应用实例:西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪)
应用实例:西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪)6 、 RRLC 色谱条件确定:
RRLC 色谱条件:Agilent 1200 高分离度快速液相色谱 (RRLC) ,色谱柱: ZORBAX SB C18 4.6x50mm, 1.8um流动相: A: 0.1% H3PO4 , B: 乙腈, 梯度分离柱温: 25ºC 流速: 2mL/min 检测波长: 203nm 进样量: 5μL
四、应用实例:西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪)
7 、西洋参分析: HPLC 与 RRLC 分离色谱图比较
在 RRLC 系统上可以实现 HPLC 分离 , 此外还可以大幅度缩短分析时间,降低溶剂消耗,大大提高工作效率。
与 HPLC 相比,在保持相同进样量的前提下,使用小颗粒填料的 RRLC 可以显著改善分离灵敏度。
温度对 RRLC 分离影响较大,可通过调节温度改善分离度,或加快分离速度,节约时间
四、应用实例:西洋参的液相色谱分析 (Agilent 液相色谱仪)
8 、结论
五、展望及结语 填料粒径进一步减小增大柱效,进一步提高灵敏度和通量。 提高温度(流动相的粘度和温度成正比,适当的提高温度
可进一步降低压力,同时温度升高有利于传质、加快吸附脱附平衡均可以带来柱效的进一步提高。但要注意安全性。)
总之,随着商品仪器的应用及逐渐推广,超高效液相色谱将成为复杂样品分析的一个强有力的工具。