浙江大学医学院附属第一医院 骨髓移植中心 黄河

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造血干细胞移植概述

造血干细胞移植历史回顾 1939 年，金制剂诱发再障妇女输注血型相同兄弟的骨髓 19 世纪 50 年代，骨髓移植能保护动物死于致死性放疗 随后，临床对一些终末期血液肿瘤患者进行骨髓移植， 1965 年，第一例异基因骨髓移植获得成功 1960 年以后， HLA 系统的发现及 HLA 配型技术的发展

使骨髓移植进入新阶段 Thomas 因骨髓移植中的创造性贡献获 1990 年诺贝尔奖 目前，全球超过 10 万的病人接受各种造血干细胞移植

造血干细胞移植治疗疾病的机制 以尽可能大的放化疗强度杀灭肿瘤细胞 肿瘤细胞对放化疗有剂量依赖性 放化疗的主要副作用是骨髓抑制 替代 重建造血和免疫功能 免疫机制 移植物抗肿瘤效应（ GVT）

造血干细胞移植的分类移植物类型 免疫学 血缘关系骨髓移植 自体 亲缘外周干细胞移植 同基因 非亲缘脐带血移植 异基因 胎肝细胞移植 异种

病例选择原则

适应症 血液系统恶性肿瘤 CML ALL AML MDS NHL HD MM 血液系统非恶性肿瘤 AA Fanconi 贫血 地中海贫血 PNH 遗传性疾病 重症联合免疫缺陷 先天性代谢异常 实体瘤 乳腺癌 卵巢癌 小细胞肺癌 自身免疫性疾病 SLE 类风湿性关节炎 多发性硬化

造血干细胞移植的术前准备

HLA 配型技术 HLA 是人类主要组织相容性抗原复合物（ MHC） 编码 HLA 的基因位于第 6 条染色体短臂 P21 区，包

含 400 万个碱基，超过 200 个的基因 HLAⅠ类基因（ HLA-A、 B、 C ） HLAⅡ类基因（HLA-DRB1、 DQB1、 DPB1 ）对异基因造血干细胞移植影响最大

HLA 基因具有高度多态性 目前为止，已发现的等位基因： HLA-A125

个， HLA-B260 个， HLA-C225 个， HLA-DRB1225 个、 HLA-DQB140 个

HLA 配型技术和造血干细胞移植 HLA 的血清学配型（ 1998 年前） HLA 的基因学配型（ 1998 年以后） 血清学配型相合的患者仍有 30% 基因学配型不相合 HLA-Ⅰ类基因不合和移植物排斥有关 HLA-Ⅱ类基因不相合和 GVHD 有关多个 HLA-Ⅰ类

位点不相合及 HLA-Ⅰ Ⅱ、 位点都有不合的异基因造血干细胞移植患者长期生存率明显下降

影响急性移植物抗宿主病的发生和严重程度的因素有： 供受者 HLA 相合程度 女性供者 移植物的来源 移植物中 CD34+ 细胞数量

HLA 基因位点相合程度和供者选择 根据患者的疾病类型和疾病阶段选择 对于低危组，常规化疗预期生存时间长的患者，应该选择 HLA 基因位点完全相合的供者

处于疾病进展期的高危组患者，常规化疗预期生存时间很短，对于这些患者，因为原发病带来的风险比移植更大，可以选择 1 个基因位点不合的供者，甚至 1 个抗原位点不合、 2 个基因位点不合的供者

造血干细胞移植的预处理

预处理的目的 最大程度地杀灭白血病细胞及肿瘤细胞（对白血病及

恶性肿瘤而言） 抑制机体的免疫功能以减轻受者对植入造血干细胞的

排斥反应，以利造血干细胞的顺利植入 使受者骨髓龛腾空，以利造血干细胞的“归巢”和植

入

经典预处理方案 Bu 1mg/kg/q6h CY 50mg/kg/d Bu-CY -7,-6,-5,-4d -5,-4,-3,-2d 总剂量 16mg/kg 总剂量 200mg/kg改良 Bu-CY 同上 CY 60mg/kg/d -3,-2d 总剂量 120mg/kgTBI-CY TBI 200cGY， Bid CY60 mg/kg/d -3,-2,-1d -5,-4d 总剂量 12GY 总剂量 120 mg/kg

造血干细胞的采集、处理和输注

一、异基因骨髓移植采髓 麻醉：连硬或全麻 位置：髂后上棘 总量： 10-20ml/kg

有核细胞数： 2-3×108/kg

CD34+ 细胞数： 2×106/kg

CFU-GM： 2×105/kg

异基因骨髓移植 输髓 复核有核细胞数、 CD34+ 细胞数、 CFU-GM

细菌学、病毒学检查 输髓一般在 24 小时内进行 注意监测病人生命体征变化 鱼精蛋白中和肝素

异基因骨髓移植供受者 ABO 血型不相合骨髓的处理 供受者 ABO 血型次要不相合的处理 测定供髓者凝集素效价，以决定是否去除供髓中的血浆 供受者 ABO 血型主要不相合骨髓的处理 去除供髓中的红细胞 重力离心沉降法 血细胞分离机 对受者进行血浆置换 供受者 ABO 血型主次要均不合骨髓的处理 同时采取上述两种方法

二、异基因外周血造血干细胞的动员和分离 动员方案 G-CSF:10μg/kg/d 采集时间：应用 G-CSF 后 4-5 天 采集仪器：血细胞分离机 采集细胞数要求 有核细胞数 >6-8×108/kg

CD34+ 细胞数 >2×106/kg

CFU-GM>2×105/kg

三、自体外周血干细胞移植的动员、分离和净化 动员方案 化疗 +G-CSF 采集时间、仪器、采集细胞要求同异基因外周血干细胞

移植 冻存 净化 CD34+ 细胞分选 单克隆抗体，如美罗华（抗 CD20）

药物，如 4-HC

四、脐血采集、处理和保存 脐血来自正常足月分娩胎儿的脐带和胎盘 分离脐血单个核细胞 加适量冻存保护剂 计算机程控速率（ 1 /℃ min) 降至 -80℃ 置 -196℃液氮长期保存

造血重建的植入证据

造血重建的植入证据的常规方法

红细胞抗原 ABO、 Rh 等血型抗原 白细胞抗原 HLA-ⅠⅡⅢ 类抗原 红细胞和白细胞同功酶 免疫球蛋白 同种异型免疫球蛋白谱测定 细胞遗传学分析 供受者性别不同可行性染色体检测

造血重建的植入证据的分子遗传学分析 限制性片段长度多态性分析（ RFLP）

PCR指纹图 特异的分子探针杂交 短串联重复序列多态性分析——目前最先进最可靠的造

血干细胞移植植入检测方法

造血干细胞移植并发症的预防及治疗

造血干细胞移植的主要并发症 感染 出血性膀胱炎 肝静脉闭塞症 (VOD)

移植物抗宿主病（ GVHD）

aGVHD

cGVHD

植入失败

全环境保护（ total environment protection， TEP） 目的 尽量减少患者体内致病菌的负荷，以使 BMT 中感染的

发生率降到最低程度 措施 口服不吸收抗生素 皮肤清洁消毒和眼、鼻、耳、口腔、脐、阴道等部位 的消毒

进无菌饮食 住空气层流病房（ LAFR）

各种病原体感染的防治 病毒感染的防治 更昔洛韦或无环鸟苷，大剂量免疫球蛋白 CMV引起的间质性肺炎：更昔洛韦加免疫球蛋白 细菌感染的防治 预防性应用抗生素 集落剌激因子促进粒细胞恢复 治疗：联合足量应用广谱抗生素，根据细菌培养药敏结果调整抗生素 霉菌感染的防治 氟康唑或制霉菌素片 治疗：二性霉素 B 、大扶康

巨细胞病毒（ CMV ）感染的防治 巨细胞病毒感染是异基因骨髓移植病人死亡的主要原因之一 CMV感染的临床症状缺乏特异性，诊断主要依靠实验室检查 实验室检查

– 找包涵体和组织培养– CMV 抗体– 定性 PCR方法检测 CMV-DNA– CMV-PP65 抗原测定

治疗– 更昔洛韦– 磷甲酸钠

肝静脉阻塞病（ VOD）

定义– 肝内小静脉阻塞肝细胞和肝血管损伤而致的移植相关并发症– 发生率 4-53%

发病机制– 谷胱甘肽的清除– 炎症介质– 凝血机制– 纤溶机制

临床表现– 黄疸– 肝脏疼痛性肿大– 进行性腹水和体重增加

肝小静脉闭塞病的危险因素有： 高强度预处理； 肝功能异常； 活动性肝炎；

肝静脉阻塞病（ VOD）

预防– 避免在 ALT升高的基础上行 BMT– 肝素– 前列腺素– 熊去氧胆酸 – 谷胱甘肽前体 N-乙酰谷氨酸 左旋谷酰胺

治疗– 加强护肝治疗– 严格控制液体入量– 适当利尿– 白蛋白提高胶体渗透压

GVHD 概述 发生率及后果

– HLA 相合的亲缘异基因造血干细胞移植 30%-60%

– HLA 相合的无关供者异基因造血干细胞移植 :40%-90%

– 与 aGVHD直接或间接有关的移植相关死亡率高达 50%

– 在长期存活的病人中，仍有 60%-80% 发生 cGVHD

分类– 移植后 100 天内发生的 GVHD称 aGVHD

– 移植后 100 天后发生的 GVHD称 cGVHD

造血干细胞移植中预处理相关毒性导致的晚期并发症有： 儿童生长缓慢； 淋巴细胞增殖性疾病； 白内障； 继发肿瘤；

aGVHD 的预防 增加 HLA 配型的精确程度 药物 经典方法 :CsA+MTX

GVHD预防的新药 :MMF, FK-506, ATG T 细胞去除术 体外去 T,如 :CD34+ 细胞纯化 体内去 T,如 : 自杀基因导入 选择性去 T,如去除 CD8+亚群 共刺激通路阻滞

aGVHD 的治疗 甲基强的松龙 调整 CsA 剂量，使其血药浓度维持在较高水平 全环境保护 抗感染治疗 支持治疗 二线药物： MMF 、 ATG 、抗 CD3单抗、 FK-506

植入失败的诊断 植入失败分原发植入失败和继发植入失败两种 原发植入失败 在移植后存活超过 28 天的病人在死亡时或第二次移植

前，不能达到中性粒细胞绝对值 >0.5×109/L。

继发植入失败 植入后，中性粒细胞绝对值又降到 0.5×109 /L以下

植入失败的影响因素 HLA 位点 移植物造血干细胞的质和量 移植物去 T细胞 造血微环境 预处理方案 移植前多次输血 骨髓纤维化，脾肿大影响归巢 移植并发症： CMV， EBV，GVHD

植入失败的发病机制 预防措施造血干细胞质和量 增加造血干细胞的数量

尽量减少造血干细胞体外的冻存和净化，避免不必要的损失自体移植前减少化疗的次数移植后细胞因子的应用

骨髓微环境 间质干细胞移植，重建造血微环境免疫因素 增加预处理方案的免疫抑制程度

增加HLA配型的精确程度移植前尽量避免不必要的输血尽量不用去T细胞移植

造血干细胞移植植入失败的预防

植入失败的治疗 细胞因子 GM-CSF

G-CSF

二次移植 自体移植 异基因移植

自体造血干细胞移植

自体造血干细胞移植的优缺点有： 并发症少； 技术难度和费用低； 复发率高

自体造血干细胞移植后复发的根源是： 无 GVL 效应； 移植物中可能含有肿瘤细胞； 预处理不能有效杀灭体内残留肿瘤细胞；

HLA单倍体相合造血干细胞移植

移植成功的障碍 目前或潜在的解决方案植入失败 大剂量CD34+细胞移植

增强预处理方案的免疫抑制作用严重的GVHD T细胞去除

共刺激通路阻滞免疫重建延迟 过继细胞免疫治疗

非异基因活性细胞毒性T细胞的运用GVL的下降 NK细胞的异基因活性（KIR表型不相合）

HLA单倍体相合造血干细胞移植的成功障碍及解决方案

克服 HLA单倍体相合造血干细胞移植障碍的主要方法：大剂量 CD34+ 细胞移植 大剂量 CD34+ 细胞移植的理论基础 大剂量造血干细胞移植物中具有“否决”细胞（ veto

cell） , “否决”作用即能破坏特异性针对自身 MHC-I 类抗原的细胞毒性 T细胞前体细胞（ CTL-p）

增加移植物中造血干细胞量，可加强与宿主体内残存干细胞竞争力，从而有利于移植物植活

大剂量造血干细胞可诱导宿主对移植物的免疫耐受

HLA单倍体相合造血干细胞移植的评价 单倍体骨髓移植对于未能找到HLA 相合的同胞供者的

病人而言是一个可行的选择 尽管临床经验有限，最近的数据还是令人鼓舞的 大剂量 CD34+ 细胞可使移植物快速植入，在一些 T 细

胞去除的移植中， NK介导的 GVL 效应可能存在，使复发率下降

移植后感染并发症仍是单倍体造血干细胞移植尚未克服的主要的障碍，最有希望的是过继细胞免疫治疗

减低剂量造血干细胞移植

减低剂量预处理的提出以往 移植前超大剂量放化疗对预防移植物排斥是必需的 移植前高强度放化疗使造血干细胞移植仅限年龄较轻，

一般情况较好的患者最近 高效免疫抑制剂氟哒拉宾（ fludarabine) 的使用 GVT 机理研究的加深 许多研究者开始探索强度较弱预处理方案

减低剂量预处理方案的适应症 --ASH

NST 病例选择的总原则 移植物抗肿瘤效应敏感的肿瘤 必须在原发病进展前产生 GVL 效应 NST 病例选择 处于缓解期的高危 AML

惰性肿瘤： CML慢性期、低度恶性淋巴瘤 不适合 NST 的病例 原发病进展迅速，如：难治性急性白血病、 CML 急变 对GVL 不敏感，如： ALL 、高度恶性淋巴瘤

减低剂量造血干细胞移植 ----- 小结 能保证供者造血干细胞的植入，产生 GVL 效应 对 GVL敏感的肿瘤是一种潜在的、有效的治疗方法 降低了预处理方案相关死亡率，为年龄较大的病人、难以耐受强烈预处理的病人提供了异基因造血干细胞移植的机会

GVHD 发生率较高（ 50%左右），复发仍是主要问题

减低剂量造血干细胞移植 -----未来展望 如何在减轻 GVHD 基础上加强 GVL 效应，进一步提

高非去髓性造血细胞移植的疗效 进一步确定非去髓性造血干细胞移植的适应症 多中心的临床对照试验对传统预处理方案和减低剂量预处理方案的造 血干细胞移植的疗效进行比较

GVL和 GVHD 的分离的新策略

过继性 T 细胞治疗的提出 DLI 可使部分患者获 CR ，进一步证明了 GVL 效应

的巨大潜力 CMV、 HIV、 EBV 、黑色素瘤抗原特异性 T 细胞输

注的临床试验已证实其安全性和有效性 已经建立过继 T 细胞治疗的原则 目前主要问题是有效分离抗肿瘤、抗宿主反应的抗原

过继输注 T 细胞的靶抗原

次要组织相容性抗原（ mHAg)

肿瘤特异性抗原(PR3 WT-1)

mHAg 的初步研究 Riddell 等对 38 个以前从来未报道的 mHAg 的特征进行了研究，发现有的 mHAg仅在造血组织中表达

从异基因造血干细胞患者体内分离 CD8+mHAg特异性 T

细胞克隆 T 细胞克隆溶解患者造血系统来源的细胞，而不溶解患

者的纤维母细胞

mHAg 的初步研究 Mutis 等进行了mHAgs特异性 T 细胞输注的临床研究 研究对象：异基因造血干细胞移植后复发的白血病患

者 分离并过继输注供者 mHAgs特异性 T 细胞 T 细胞克隆都转染了单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷酸自

杀基因 初步的结果显示接受这种治疗的患者获 CR ，而不增加 GVHD 的发生率

肿瘤特异性抗原 mHAg 的使用仅限于异基因造血干细胞移植的患者

一个可供选择的方法是鉴别和肿瘤表型相关的抗原，作为 T 细胞治疗的靶目标

肿瘤特异性抗原 ---蛋白激酶 3（ PR3）

PR3 是一种中性的丝氨酸蛋白激酶，主要在髓系分化的早幼粒阶段表达

PR3在白血病祖细胞（特别是 CML ）上表达，而在正常造血干细胞不表达

PR3特异性 CD8+CTL 选择性溶解白血病原始细胞，但对正常细胞无明显影响

PR3特异性 CD8+CTL在正常人及未经治疗的 CML 患者外周血上检测不到，在异基因造血干细胞移植或 α- 干扰素治疗的患者中能检测到，提示这些细胞在抗肿瘤免疫中起重要作用

肿瘤特异性抗原 ---Wilms 瘤抑制物（WT-1） 一种锌指转录因子，开始是作为一种肿瘤抑制基因在儿童Wilms 瘤患者中发现

WT1在大多数成人白血病细胞（包括AML、 CML、 ALL ）过分表达， WT1 高表达和预后不良有关

白血病细胞 WT-1表达比正常 CD34+ 细胞高 10至 100倍以上

WT-1特异性 CD8+CTLs溶解 CD34+白血病细胞而对正常 CD34+ 细胞无影响

NK 细胞异基因活性在 GVL 中的作用 供者 T 细胞的重要作用

– 促进植入– 清除肿瘤细胞（ GVL 效应）– 促进免疫重建– 介导 GVHD 效应的主要细胞 ]

去除移植物中的 T 细胞可明显减少 GVHD 的发生，但是，植入失败的发生率明显增加，免疫重建延迟，白血病复发率增加 最近， Ruggeri 等在 HLA单倍体相合造血干细胞移植的研究中发现 NK 细胞的异基因活性在 GVL 中发挥重要作用

NK 细胞异基因活性在 GVL 中的作用 NK 细胞受体 KIR

– KIR（ killer immunoglobulin – like receptor) 杀伤细胞免疫球蛋白样受体

– KIR识别经典的 HLA-Ⅰ 类分子– 在异基因造血干细胞移植过程中，当供受者之间 KIR

不相合时，供者产生异基因反应性 NK 细胞克隆，发挥GVL 效应

NK 细胞的异基因反应性能产生显著的 GVL 效应，并能预防植入失败、 GVHD 的发生

其对 AML 患者的影响尤为显著， 5 年生存率– 有 NK 细胞异基因活性： 60%

– 无 NK 细胞异基因活性： 5%

KIR 不相合在 ALL GVL 效应中无明显作用

NK 细胞异基因活性在 GVL 中的作用 -- 小结