Матузенко Светлана

Изучение влияния метки Изучение влияния метки коллоидного золота на способность коллоидного золота на способность

антител взаимодействовать с антител взаимодействовать с вирусом на примере Х-вируса вирусом на примере Х-вируса

картофеля (ХВК) и вируса табачной картофеля (ХВК) и вируса табачной мозаики (ВТМ)мозаики (ВТМ)

Матузенко СветланаМатузенко Светлана

Работа проводилась в Институте Работа проводилась в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, в биохимии им. А.Н. Баха РАН, в

лаборатории иммунобиохимии.лаборатории иммунобиохимии.

Научный руководитель: Сафенкова Научный руководитель: Сафенкова Ирина ВикторовнаИрина Викторовна

Москва, 2009 г.Москва, 2009 г.

ЦельюЦелью исследования было исследования было изучение влияния метки изучение влияния метки коллоидного золота на коллоидного золота на способность антител способность антител

взаимодействовать с вирусом на взаимодействовать с вирусом на примере Х-вируса картофеля (ХВК) примере Х-вируса картофеля (ХВК) и вируса табачной мозаики (ВТМ).и вируса табачной мозаики (ВТМ).

Задачи:Задачи:

Изучить взаимодействие вирусов с Изучить взаимодействие вирусов с нативными препаратами антител.нативными препаратами антител.

Изучить взаимодействие вирусов и Изучить взаимодействие вирусов и конъюгатов антител с коллоидным конъюгатов антител с коллоидным золотом.золотом.

Охарактеризовать изменения Охарактеризовать изменения взаимодействия антител с взаимодействия антител с вирусами при их иммобилизации вирусами при их иммобилизации на поверхности коллоидного на поверхности коллоидного золота.золота.

ГипотезаГипотеза

Иммобилизация антител на Иммобилизация антител на коллоидном золоте происходит коллоидном золоте происходит преимущественно по участкам преимущественно по участкам их поверхностей, не входящим их поверхностей, не входящим в антиген-связывающие сайты.в антиген-связывающие сайты.

Поэтому антитела при Поэтому антитела при иммобилизациииммобилизации

не теряютне теряют

функциональности.функциональности.

Общий план строения антител: 1) Fab; 2) Fc; 3) тяжелая цепь; 4) легкая цепь; 5) антиген-связывающий участок; 6) шарнирный участок

В работе использовалисьВ работе использовались Х-вирус картофеля Х-вирус картофеля

(ХВК) (ХВК) Вирус табачной Вирус табачной

мозаики (ВТМ)мозаики (ВТМ) Моноклональные Моноклональные

антитела против ХВК и антитела против ХВК и ВТМВТМ

Коллоидное золото Коллоидное золото Конъюгат коллоидного Конъюгат коллоидного

золота с антителами золота с антителами Конъюгат антивидовых Конъюгат антивидовых

антител с антител с пероксидазой хрена. пероксидазой хрена.

Метод Метод иммуноферментного иммуноферментного анализа (ИФА)анализа (ИФА)

Метод электронной Метод электронной микроскопии микроскопии

Метод атомно-силовой Метод атомно-силовой микроскопиимикроскопии

Метод иммуно-Метод иммуно-хроматографического хроматографического анализа. анализа.

Проверка взаимодействия Проверка взаимодействия немодифицированных антител с немодифицированных антител с

вирусами с помощью вирусами с помощью иммуноферментного анализа (ИФА)иммуноферментного анализа (ИФА)

Схематическое изображение образования иммунных комплексов при проведении ИФА: 1 – лунка, 2 – вирус, 3 – конъюгат антитела с

пероксидазой хрена, 4 – антитело

Фотография микропланшета

Концентрационная зависимость Концентрационная зависимость взаимодействия антител с взаимодействия антител с

иммобилизованным ВТМ в системе ИФАиммобилизованным ВТМ в системе ИФА

Выводы по ИФА взаимодействия Выводы по ИФА взаимодействия моноклональных антител с ВТМмоноклональных антител с ВТМ

Количество иммунных комплексов, Количество иммунных комплексов, регистрируемых методом ИФА, регистрируемых методом ИФА, зависит от концентрации и антител и зависит от концентрации и антител и вируса, что позволяет проводить вируса, что позволяет проводить выбор антител, наиболее эффективно выбор антител, наиболее эффективно взаимодействующих с вирусом.взаимодействующих с вирусом.

Из трех охарактеризованных антител Из трех охарактеризованных антител против ВТМ для дальнейшей работы против ВТМ для дальнейшей работы было выбрано 3было выбрано 3G11G11, связывание , связывание которого регистрируется в которого регистрируется в концентрации до 20 нг/мл.концентрации до 20 нг/мл.

Получение и характеристика Получение и характеристика коллоидного золотаколлоидного золота

Гистограмма распределения частиц по диаметру

Электронно-микроскопическая фотография препарата коллоидного золота

3D-изображение препарата коллоидного золота(атомно-силовая микроскопия)

Получение конъюгатов Получение конъюгатов коллоидного золота с антителами.коллоидного золота с антителами.

Диализ антителДиализ антител Определение Определение

концентрации антител концентрации антител по оптической по оптической плотности при длине плотности при длине волны 280 нмволны 280 нм

Определение Определение оптимальной оптимальной концентрации антител концентрации антител для получения для получения стабильных стабильных неагрегирующих неагрегирующих конъюгатов с КЗконъюгатов с КЗ

Синтез конъюгатовСинтез конъюгатов Спектрофотометри-Спектрофотометри-

ческая характеристика ческая характеристика конъюгатаконъюгата

Схематическое изображение конъюгата коллоидного золота (2) с антителами (1)

Проверка работы конъюгата с помощью Проверка работы конъюгата с помощью иммунохроматографического анализаиммунохроматографического анализа

Проверка взаимодействия Проверка взаимодействия вирусов и конъюгатов антител вирусов и конъюгатов антител

методом ИФАметодом ИФА Схематическое Схематическое

изображение изображение образования иммунных образования иммунных комплексов: 1 – лунка, 2 комплексов: 1 – лунка, 2 – вирус, 3 – антитела, 4 – – вирус, 3 – антитела, 4 – частица коллоидного частица коллоидного золота, 5 – конъюгат золота, 5 – конъюгат антивидовых антител с антивидовых антител с пероксидазой хрена.пероксидазой хрена.

ИФА взаимодействия ВТМ и ИФА взаимодействия ВТМ и немодифицированных немодифицированных

антителантител

ИФА взаимодействия ИФА взаимодействия ВТМ и конъюгатов ВТМ и конъюгатов

коллоидного золота с коллоидного золота с антителамиантителами

Сравнение взаимодействия с ВТМ немодифицированных

антител и конъюгатов коллоидного золота с антителами

ВыводВывод

Антитела, специфичные к вирусам (ХВК Антитела, специфичные к вирусам (ХВК и ВТМ), не теряют функциональности и ВТМ), не теряют функциональности при иммобилизации на частицах при иммобилизации на частицах коллоидного золота. При этом уровень коллоидного золота. При этом уровень связывания в системе ИФА выше для связывания в системе ИФА выше для конъюгированных с коллоидным конъюгированных с коллоидным золотом антител, чем для золотом антител, чем для немодифицированных антител в той же немодифицированных антител в той же концентрации. Таким образом, наша концентрации. Таким образом, наша гипотеза полностью подтвердилась.гипотеза полностью подтвердилась.

Используемая литератураИспользуемая литература Вершигора А.Е. Общая иммунология. // К.: Выща шк. 1989. С. 101.Вершигора А.Е. Общая иммунология. // К.: Выща шк. 1989. С. 101. Галактионов В.Г. Иммунология. // М.: Нива России. 2000. С. 48-74.Галактионов В.Г. Иммунология. // М.: Нива России. 2000. С. 48-74. Feinstein A., Rove A.J. Molecular mechanism of formation of an antigen-Feinstein A., Rove A.J. Molecular mechanism of formation of an antigen-

antibody complex. // Nature. antibody complex. // Nature. 1965. 1965. VV. 4967. . 4967. PP. 147-149.. 147-149. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и

практика иммуноферментного анализа. // М.: Высш. шк. 1991. С. 20-практика иммуноферментного анализа. // М.: Высш. шк. 1991. С. 20-25.25.

Антитела. Ред. Кэтти Д., М.: Мир. 1991. ТАнтитела. Ред. Кэтти Д., М.: Мир. 1991. Т. 1. . 1. СС. . 11-30,11-30, 39, 39, 105-111105-111.. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и

применение. Пер. с англ.- М.: Мир, 2002. С. 210-222применение. Пер. с англ.- М.: Мир, 2002. С. 210-222 Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул

электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983. С. 124-127.радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983. С. 124-127.

Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Романенко О.Г., Титова Н.А., Трубачева Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Романенко О.Г., Титова Н.А., Трубачева Ж.Н., Чередникова Т.В., Еремин С.А. Твердофазные методы Ж.Н., Чередникова Т.В., Еремин С.А. Твердофазные методы иммуноферментного определения гербицидов симазина и атразина. иммуноферментного определения гербицидов симазина и атразина. Прикладная биохимия и микробиологияПрикладная биохимия и микробиология.. 1995 1995 т. 31, N 1, сс. 134-139т. 31, N 1, сс. 134-139..

БлагодарностиБлагодарности

Я благодарю сотрудников Я благодарю сотрудников лаборатории иммунобиохимии лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха, Института биохимии им. А.Н. Баха, в частности моего научного в частности моего научного руководителя, Ирину Викторовну руководителя, Ирину Викторовну Сафенкову, за помощь в работе, а Сафенкову, за помощь в работе, а так же Сергея Менделевича так же Сергея Менделевича Глаголева за организацию Глаголева за организацию биопрактики.биопрактики.