第三节 紫外 - 可见分光光度计

第三节 紫外 - 可见分光光度计

紫外 - 可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池、检测器及显示器五部分组成。

一、仪器基本组成

光源

单色器

吸收池

检测器

显示器

图 分光光度计结构方框示意图

（一）光源 对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。

1. 钨及碘钨灯： 340~2500 nm ，多用在可见光区；

2. 氢灯和氘灯： 160~375nm ，多用在紫外区。

激光光源 近年也有用氩离子激光器或可调谐染料激光器发射的激光作光源，这种激光光源单色性好，光强度大，稳定性好。

一、仪器基本组成

一、仪器基本组成（二）单色器 (Monochromator) 单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色

光的光学装置。 其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长

在紫外可见区域内任意可调。

（二）单色器（二）单色器 (Monochromator)(Monochromator) 由入射狭缝（ 2 ）、出射狭缝（ 5 ）、准直镜（ 3

）、色散元件（ 4 ）等组成。 能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。

1

2

345

6

图 单色器光路示意图1. 复合光 2. 入射狭缝 3. 聚焦和准直镜4. 色散元件 5. 出射狭缝 6. 单色光

一、仪器基本组成（三）吸收池（ Cell ， Container ）： 用于盛放样品。石英 适于紫外区和可见光区玻璃 只适于可见光区有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。 为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全

垂直于光束方向。 盛放参比溶液和样品溶液的一组吸收池要挑选配对。

即有相同的厚度和透光性能。

一、仪器基本组成（四）检测器 检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液

后光强度变化的一种装置。 常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。 硒光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流

计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中。

光电管（真空光电二极管）在紫外 - 可见分光光度计上应用较为广泛。

光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高 200 倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。

( 四 ) 检测器在光谱分析中，光电池、光电管和光电倍

增管属于单道光子检测器；光学多道检测器有光二极管阵列检测器、

电荷偶合阵列检测器。

( 四 ) 检测器光二极管阵列检测器（ photo-diodear

ray detetor ） 近年来采用光二极管阵列检测器的仪器逐渐

增多，光二极管阵列是在晶体硅上紧密排列一系列（几百个）光二极检测管，将其放在单色器的聚焦面处，每一个光二极管相当于一个单色器的出射狭缝，可同时测量不同波长的光谱线强度。两个光二极管中心距离的波长单位称为采样间隔。光二极管数目越多，分辨率越高。通过计算机控制，采用同时并行的数据采集方法，在不到一秒钟的时间内，可检测到仪器整个波长范围内的全部数据，获得全光光谱。

（四）检测器电荷偶合阵列检测器（ charge-couple

d device array detector ， CCD ）具有更先进、更理想的检测性能，已开

始在高档光谱仪器中使用。

一、仪器基本组成（五）显示器（信号指示系统） 它的作用是放大信号并以适当方式指示

或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。

二、紫外可见光度计仪器

分光光度计分为单波长和双波长仪器。1. 单波长单光束分光光度计 2. 单波长双光束分光光度计3. 双波长分光光度计4. 多通道分光光度计

二、紫外可见光度计仪器1. 单波长单光束分光光度计 经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比

溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。

721型分光光度计是简单的单波长、单光束可见分光光度计。

光源 单色器

样品池

参比池 检测器

二、紫外可见光度计仪器

单波长双光束分光光度计光路示意图

单色器调制马达

检测器样品吸收池

参比吸收池

光源

2. 单波长双光束分光光度计

经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。

SS I

IA 0lg

RR I

IA 0lg

S

R

RSRS I

I

I

I

I

IAAA lglglg 00

二、紫外可见光度计仪器2. 单波长双光束分光光度计

二、紫外可见光度计仪器2. 单波长双光束分光光度计

双光束优点 吸光度的大小不受入射光强度的影响，可以减少或消除因光源强度不稳定而引入的误差，这正是双光束分光光度计的优点所在。

3. 双波长分光光度计

光源 检测器单色器

单色器

切光器 吸收池

双波长分光光度计示意图

通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差 A 。

λ1

λ2

λ1λ2

3. 双波长分光光度计

AB1 和 AB2 分别为在 1 和 2 处的背景吸收，当 1 和 2 相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得

• 这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光光差成正比。

11

1

1

0lg BAbcI

IA

22

2

2

0lg BAbcI

IA

bcAAI

IA )(lg

1212

2

1

3. 双波长分光光度计

特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液 (消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差 ) 、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。

4. 多通道分光光度计

使用光二极管阵列检测器

特点： 具有多路优点，信噪比高，测量快速，整个光谱的记录时间仅需 1s 左右。可检测到仪器整个波长范围内的全部数据，获得全光光谱。

第四节 紫外－可见吸收光谱法的应用

一、定性分析

二、定量分析

三、平衡常数测定

第四节 紫外－可见吸收光谱法的应用

一、定性分析不同的物质分子有不同的紫外－可见吸收

光谱，吸收光谱上的一些特征吸收，包括最大吸收波长（ max）、最小吸收波长（ min ）、肩峰（ sh ）、末端吸收、吸光系数、吸光度比等是定性鉴别的常用特征参数。通常可通过比较这些参数进行定性鉴别。

用分光光度计进行定性鉴别时，要求样品是纯物质，而且对仪器的性能要求较高，须经过校正。

（一）定性鉴定 用紫外－可见吸收光谱及特征参数进行定性鉴

别时，给出的仅是官能团的信息，有一定的局限性。当两种纯化合物的吸收光谱有明显差别时，可以肯定两者不是同一化合物。但当两种纯化合物的吸收光谱完全相同时，只能得出两化合物含有相同的官能团，有可能是同一物质，但不能以此确定是同一物质，必须结合其它的定性手段才能进一步确证。

一、定性分析

max1%1cm λ , E常用的定性参数： ε

一、定性分析（二）纯度检测相同的物质应有相同的紫外－可见吸收光

谱。纯化合物的吸收光谱与其含有杂质时的吸收光谱有差别时，可用紫外－可见分光光度法检查杂质。杂质检测的灵敏度取决于待测物与杂质两者之间吸光系数的差异程度。例如，乙醇中可能含有少量苯，苯的 max为 256 nm ，而乙醇在此波长处几乎无吸收，乙醇中含苯量达 0.001%就能从光谱中检测出来。

二、定量分析

1. 标准曲线法 配制一系列不同浓度的标准溶液，

选择合适的参比溶液，在相同条件下分别测定各标准溶液的吸光度。以吸光度 A为纵坐标，浓度为横坐标，绘制 A － c曲线，即为标准曲线（ standard curve ），或称工作曲线（working cure ）。

或进行线性回归，求出回归方程，绘出回归直线以代替标准曲线。

图 标准曲线

（一）单组分样品的定量分析方法（一）单组分样品的定量分析方法

A

ccx

Ax

2. 直接比较法在相同条件下，制备标准溶液和样品溶液，分别测定两者的吸光度 As 和 Ax ， A=Kc, 按下式计算样品溶液中待测组分的浓度 cx 。

这种方法比较简便，适合个别样品的测定，但要求样品溶液与标准溶液的浓度相近，且在标准曲线的线性范围之内，标准曲线经过原点，这样才可获得准确的测定结果。

S

xSx A

Acc

（一）单组分样品的定量分析方法（一）单组分样品的定量分析方法

（二）多组分样品的定量分析方法 1. 解线性方程组法 由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。

设试样中有两组份 X 和 Y ，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：

图 a) ： X,Y 组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，可以按两个单一组份处理。图 b) 和 c) ： X,Y 相互干扰，此时可通过解联立方程组求得 X 和 Y 的浓度：其中， X,Y 组份在波长 1 和 2 处的摩尔吸光系数 可由已知浓度的 X, Y 纯溶液测得。解方程组可求得 cx 及 cy 。

yy

xxyx

yy

xxyx

bcbcA

bcbcA

222

111

（二）多组分定量方法 1. 解线性方程组法

（二）多组分定量方法

2. 2. 等吸收双波长测量法等吸收双波长测量法 其方法是：先把一种组分的吸收设法消去，测定另一组分的浓度。

测定 a 组分时，选择 a 组分的最大吸收波长作测定波长 2 ，由 A 的峰顶 2 向横坐标作垂线与b 吸收曲线的一侧相交，从相交点作横坐标的平行线与b 吸收曲线的另一侧相交，交点所对应的波长为参比波长 1。

2. 2. 等吸收双波长测量法等吸收双波长测量法 测定波长 2

参比波长 1

选择两波长应符合的条件：（ 1 ）干扰组分在该两波长处的吸光度相同

（ 2 ）被测组分在该两波长处的吸光度差（△A ）要足够大

图 等吸收双波长测定法示意图（ 1 ）消去 a ，测定 b （ 2 ）消去b，测定 a

a ba b

λ2 λ1λ2λ1

2. 2. 等吸收双波长测量法等吸收双波长测量法

在 2 和 1处分别测量吸光度 baA 1

baA 2

bcAAA

AA

AAAA

AAA

aaaa

bb

baba

ba

)( 1212

12

1122

12

＝

＝

bb

aababa bcbcAAA 11111

bb

aababa bcbcAAA 22222

然后相减

由于 b 组份在两波长处的吸光度相等，

3. 系数倍率法

λ

A ab

λ

A a

b

λ

A ab

情况同等吸收双波长测量法等吸收双波长测量法。但其中一干扰组份 b 在测量波长范围内无吸收峰时，或者说没有等吸收点时可采用该法。

具体做法：同前法可得到下式，

3. 系数倍率法

ba AAA 111

ba AAA 222

baba AKAKAKAKS

AKAKS

11112222

1122

两式分别乘以常数Ｋ 1 、Ｋ２并相减，

3. 系数倍率法调节信号放大器，使干扰组分 b在波长 2 和 1处的信

号相等，由此得系数倍率 K，

因此，差示信号 S 只与 ca 有关，从而求出 ca 。同

样可求出 cb 。

aλ11

aλ22

bλ11

bλ22

bλ1

bλ2

2

1

AKAKS

AKAK

A

A

K

KK

4. 导数光谱法导数光谱法又称微分光谱法，也

是一种消除光谱干扰的方法。导数光谱峰形尖锐、信息量大，

灵敏度高，分辨率好，而且通过选择适宜的波长和求导条件，可消除背景吸收、杂质和共存物的干扰。

在导数光谱中，导数信号与浓度成正比。

零阶

一阶

二阶

三阶

四阶

图 各阶导数光谱图 —ddA / —22 / dAd

—33 / dAd —44 / dAd

弱酸离解常数的测定设有一元弱酸HB，其离解反应如下：

若测出 [B-]和 [HB]，即可求出 Ka 。 [HB]

][BlgPHPK

[HB]

]][B[HK

BHHB

a

a

三、平衡常数测定

弱酸离解常数的测定

测定时，配制三份不同 pH值的溶液。一份为强碱性，一份为强酸性，分别在 B- 和HB的最大吸收波长处测定吸光度，求出各自的摩尔吸光系数。

第三份为已知 pH值的缓冲溶液，分别在B- 和 HB的最大吸收波长处测得总吸光度，解联立方程求得 [B-] 和 [HB] ，然后按前式求出 pKa 或 Ka 。

三、平衡常数测定例题，用分光光度法测定以下反应的平衡常数：

22

22 ZnL2LZn

无吸收在和

，的

480nmLZn

1.00cmb 0nm48λ ZnL-22

max-2

2

配位剂的量至少比Zn2+ 大 5 倍，此时的吸光度仅决定于 Zn2+ 的摩尔浓度。

mol/L)(

0.540A100.5c ;102.30 c

0.690A1060.8c ;102.30 c4

L

4

Zn

3

L

4

Zn

22

22

浓度单位

＝＝

＝＝－

－

三、平衡常数测定

解：配位剂的量至少比 Zn2+大 5 倍，此时的吸光度仅决定于 Zn2+的摩尔浓度。

)Lmol(L1000.31030.200.1

690.0A

0.690A1060.8c ;102.30c

1134

3

L

4

Zn 22

bc＝

＝＝ －

0.540A100.5c ;102.30 c 4

L

4

Zn 22 ＝＝ －

无吸收在和

，的

480nmLZn

1.00cmb 0nm48λ ZnL-22

max-2

2

由吸光度 0.540的溶液计算平衡时 各离子的浓度

22

22 ZnLLZn ，，

54－4－2

22

2Zn

43

22

105.00＝101.80－102.30＝Zn

ZnLZnc

(mol/L)101.801.00103.00

0.540

εb

A][ZnL

－

8245

4

222

-22

44－4－2

22

2

L

101.84)10(1.40105.00

101.80

LZn

ZnLK

mol/L101.40＝101.802－105.00＝L

ZnL2Lc 2

第五节 分光光度法分析条件的选择第五节 分光光度法分析条件的选择

一、测量条件的选择 波长、狭缝宽度、吸光度读数

范围、参比溶液二、反应条件的选择1. 显色剂用量 2. 溶液的酸度 3. 显色时间 4. 温度 5. 溶剂三、共存离子的影响及消除

一、测量条件 的选择

第五节 分光光度法分析条件的选择第五节 分光光度法分析条件的选择

（一）波长的选择 通常，选 λmax 作为分析波长，灵敏度高，而且在 λmax 附近吸光度随波长变化小，测定误差也小。 当最大吸收波长处有干扰或最强吸收峰的峰形尖锐时，为减少谱带宽度对测定的影响、消除干扰，常选用吸收峰稍低、峰形较平坦的次强峰或肩峰的波长进行测定，以减小对比尔定律的偏离。 根据“吸收大，干扰小”的原则来选择分析波长。

（二）狭缝宽度的选择（二）狭缝宽度的选择 狭缝宽度增大，入射光单色性变差，测定

的灵敏度下降，工作曲线偏离比尔定律，吸收光谱的精细结构消失。

狭缝宽度过小，光通量减小，则须增大检测信号的放大倍数，但同时也放大了噪声，影响测定的准确度。

合适的狭缝宽度，应以吸光度不再减小时的最大狭缝宽度为标准。

（三）吸光度读数范围的选择（三）吸光度读数范围的选择 仪器的透光率测量误差（△T）

来源于仪器的噪声，它取决于仪器的精度，不同精度的分光光度计有不同的△T （ 1%～0.01%）。

分析结果的相对误差 由于透光率与样品浓度的非线性关系－ lgT=abc （

对数关系），因而在不同的透光率范围，这一恒定误差所引起的分析结果的相对误差 （ ） 是不同的。由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。

cc /

cc /

（三）吸光度读数范围的选择（三）吸光度读数范围的选择分析结果相对误差与透光率测量误差可

由朗伯－比尔定律导出：

对上式微分，得待测溶液分析结果的相对误差（ ）与透光率测量误差 的关系为：

ab

T

ab

Ac

lg

T

T

Tc

c

lg

434.0

cc / T

（三）吸光度读数范围的选择（三）吸光度读数范围的选择透光率 T的刻度是均匀的，△T(绝对误差 )与T本身大小无关，对于一台仪器， △T是常数，一般在 0.002～ 0.01之间。 △T确定时， 是 T的函数，如下图所示。

T

T

Tc

c

lg

434.0

cc /

（三）吸光度读数范围的选择（三）吸光度读数范围的选择当透光率 T在 65%～ 15%（ A=0.20 ～ 0.8）的范围内，测定结果的相对误差（ ）较小，

透光率 T为 36.8%（吸光度 A为 0.434 ）时，测定结果的相对误差最小。

图 测定结果相对误差与透光率（吸光度）的关系

cc /

△

（三）吸光度读数范围的选择光度误差 这种在不同的吸光度范围内，引

入的不同程度的浓度相对误差称为光度误差。

吸光度 A在 0.20 ～ 0.80 范围（ T在 65%～ 15%），误差较小。

在实际工作中，可通过稀释溶液、改变吸收池的厚度使吸光度值在所要求的范围内。

T

T

Tc

c

lg

434.0

（四）参比溶液的选择（四）参比溶液的选择 测量样品溶液的吸光度之前，需用参比溶液（ reference solution ）或称空白溶液（blank solution ）调节吸光度零点 A＝ 0 （ T＝ 100 ％），

其作用是消除干扰 不仅能抵消吸收池和溶剂对入射光的影响，还可以抵消溶液中其它共存组分（包括显色剂、基体成分、辅助试剂等）在测定波长处产生吸收所引起的干扰。

所以，分析中应视样品溶液的性质选择合适的参比溶液。

（四）参比溶液的选择（四）参比溶液的选择 1. 溶剂参比当样品溶液中只有待测物质在测定波长下

有吸收，其它共存物质均无吸收时，采用溶剂（通常为蒸馏水）作为参比溶液。

2．试剂参比 当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收

时，采用试剂作参比（不加待测物），相当于标准曲线系列的零（ 0 ）管

许多显色反应需采用试剂参比。

（四）参比溶液的选择（四）参比溶液的选择

3. 样品参比如试样基体在测定波长处有吸收，但不与

显色剂反应时，可以试样作参比（不能加显色剂）

如用硫氰酸盐为显色剂测钼时，取不加硫氰酸盐的样品溶液作参比，可消除共存Cr3+、 Ni2+、 Cu2+等有色离子的干扰。

（四）参比溶液的选择（四）参比溶液的选择 4. 平行操作参比用不含待测组分的样品，按照与样品测定

相同的条件与样品平行操作，以此为参比溶液进行测定，称为平行操作参比。

例如在临床检验中，正常人的血液、尿液等不含待测组分的样品按相同的条件平行操作，所得的溶液即是平行操作参比。

二、反应条件的选择 当待测组分在紫外－可见光区无吸收时，

可通过适当的方式，将其转化为能吸收可见光的物质，用可见分光光度法进行间接测定。

能与无色物质反应生成有色物质的试剂称为显色剂，生成有色物质的反应称为显色反应，如下所示：

显色反应待测组分

nn MR R M

显色剂 有色化合物

二、反应条件的选择 显色剂选择原则：1. 灵敏度高， εmax 较大2. 显色反应产物的组成恒定3. 显色反应有较高的选择性4. 显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差

大，“反衬度”在 60 nm 以上 5. 显色产物稳定

二、反应条件的选择 1. 显色剂用量 显色剂的用量应适当过量并且定量。显色剂最佳用量

一般通过实验确定。绘制吸光度－显色剂用量曲线（A － V ），在曲线的平直部分所对应的显色剂用量V （ml ）范围内选择一－确定浓度即可。

图 吸光度与显色剂加入量的关系

二、反应条件的选择 2. 溶液的酸度 溶液的酸度对显色反应的影响是多方面的（ 1 ）对待测组分的存在形式的影响（如Fe3+、 Al

3+、 Th4+ 在较高 pH下水解）（ 2 ）对显色剂的存在形式的影响（显色剂本身具

有酸碱指示剂的性质，在不同的酸度下具有不同的颜色 ）

（ 3 ）对配合物组成的影响（ 4 ）对显色反应的影响（有机显色剂本身是弱酸） RH RHn

MRnMn+

2. 溶液的酸度适宜的酸度可通过在不同的 pH条件下

显色，分别测定吸光度 A ，作 A － pH图来选择。

如图所示，曲线的平坦部分所对应的 pH范围就是适宜的酸度范围。可用缓冲溶液来控制溶液的酸度。

图 A － pH 曲线

3. 显色时间 适宜测定时间的确定，是在加入显色剂后，

于不同时间 t 测定吸光度 A ，绘制 A － t（min ）曲线，曲线的平直部分所对应的t 范围就是适宜的测定时间范围，此时测定溶液的吸光度有良好的重现性。

4. 温度大多数显色反应都可在室温下进行，温

度的变化对测定的结果影响不大。但有些显色反应速度慢，需加热才能迅速完成，而有些反应产物在加热条件下会发生分解。因此，对需加热完成的显色反应，应通过绘制 A—t （℃）曲线来选择适宜的显色反应温度。

5. 溶剂溶剂可影响物质对光的吸收，使之呈现

不同的颜色。例如苦味酸在水溶液中呈黄色，在氯仿中几乎无色，有些显色反应产物的稳定性也与溶剂有关。因此，显色反应体系一般应注明溶剂。

三、 共存离子的影响及消除 溶液中的共存物质对被测组分的干扰主要有

以下几种情况：共存物质本身有颜色干扰测定，共存物质与显色剂发生反应生成有色物干扰

测定，共存物质与被测组分发生反应使被测组分浓

度改变等。

三、 共存离子的影响及消除消除干扰的方法通常有：① 选择无干扰的测定波长；② 采用双波长的方法； ③ 选择合适的参比溶液；④ 通过调节溶液的酸度，使共存离子不与显色剂发生反应；

⑤ 加入氧化还原剂改变其价态；⑥ 加入配合剂将其掩蔽等。 如果以上方法都不能消除干扰时，则需要进行

分离。

三、 共存离子的影响及消除控制酸度： 配合物稳定性与 pH有关，可以通过控制酸度提高反应选择性，副反应减少，而主反应进行完全。如在 0.5mol/L H2SO4介质中，双硫腙与 Hg2+生成稳定有色配合物，而与 Pb2+ 、 Cu2+ 、 Ni2+、 Cd2+等离子生成的有色物不稳定。

习题光学分析法导论 p223 第 8题 (交 )紫外可见吸收光谱 p3066 、 7 、 8 、 19 （要求交作业）

1 、 2 、 4 、 9 、 10 （思考题，不用交）