实验十 ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶中的分离

实验十 ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶中的分离

DNA fragment recovery from the agrose gel

一．实验目的及背景 在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的

片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列， 分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开， 这就需要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ， 以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等 .

从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法

现在常用的技术有： 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 ＤＥＡＥ滤膜插片法等 其中电洗脱法，经济节省，操作方便， 对Ｄ

ＮＡ的回收效果好。

低熔点琼脂糖凝胶法

65oC 琼脂糖凝胶熔点

低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体

ＤＥＡＥ滤膜插片法 High efficient DNA high quality for microinjection <5kb fragment 100ng DNA fragment 10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes 0.5 mol/L NaOH 5 minutes 低盐缓冲液 50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L

EDTA(pH8.0)

高盐缓冲液 50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)

电洗脱法基本原理 将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切

割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入透析袋中， 由于ＤＮＡ分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。

取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液， 进一步用酚、氯仿抽提纯化。

二．实验试剂及仪器

NaHCO3 2% EDTA-Na2 0.01M TBE 电泳液10.8g Tris 碱0.93g EDTA

5.5g 硼酸 调 pH8.2 定容 1000ml

琼脂糖 透析袋 ＴＥ 酚 氯仿 乙醇

三、实验方法

一、透析袋的处理： １．切取适当长度适析袋。 ２．在２％ NaHCO3 1mM EDTA 溶液中

煮沸１０分钟。 ３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净

透析袋。

二、电洗脱

１．在长波紫外灯下（３００－３６０ nm ）将含目标ＤＮＡ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。

２．向透析袋内加入２ ml 电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡。

３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行）， 加入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７ mm ）。

４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全部移出凝胶。

５．改变电场方向继续通电１分钟。 ６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５ ml Eppendorf 管中。

７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去ＥＢ。

８．在台式离心机上最高速２分钟。 ９．吸去上层，正丁醇溶液。 １０．重复７，８，９二次。 １１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚

氯仿（２个）抽提２次。 １２．上清转入另一 Eppendorf 管中加入

1/10 倍体积 3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于２０℃过夜。

１３． 12000g ， 4℃ 下离心１０分钟，得ＤＮＡ沉淀。

１４．弃上清，加入７０％乙醇洗涤２次后弃干乙醇。

１５．加入５０ μl ＴＥ溶解ＤＮＡ。 １６．取１０ μl ＤＮＡ溶液加入 2μl Loading

buffer 于０．８％琼脂糖上， ４０伏电泳，３小时。 １７．在紫外透射仪上观察结果。 １８．测定ＤＮＡ溶液 OD260,OD280值。

结果与分析

１．计算ＤＮＡ回收效率，判断ＤＮＡ纯度。

２．记录电泳结果 问题与讨论： １．电洗脱过程后，为什么要反向电泳１

分钟？ ２．电洗脱后的ＤＮＡ如何去除ＥＢ？

玻璃奶法快速纯化回收 DNA片段

本方法有多种用途，主要包括： 从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片段； 从 DNA 反应物中纯化目的 DNA 片段，如回收纯化 PCR产

物、酶切连接反应中的 DNA 片段； 从探针制备反应物中去除未标记上的核苷酸以及小的 DNA

片段（比如引物）； DNA浓缩、去盐及去除杂质。 本试剂盒的主要成分“基因纯”试剂是无毒、无味、无腐蚀

作用的白色颗粒，能专一性结合 0.2kb 到 50kb 大小的 DNA（双链或单链，线性、环状或超螺旋），不结合 RNA 、蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有机或无机物。

使用本法回收 DNA 片段有以下优点：

高纯度：回收的 DNA 片段基本上不含 RNA 、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等；

简便：所需主要仪器是一架台式离心机； 快速：整个回收过程只需半个小时； 高效：回收得率达到 70% 以上； 多用途：可以同时作胶回收、 PCR产物回

收、 DNA 片段及探针的纯化浓缩等； 安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。

二、试剂盒组成

1 ．碘化钠溶液： 50ml 2 ． DNA 洗涤液（ 20 倍浓缩液）： 10ml 3 ．“基因纯”试剂： 1ml 4 ．超纯水： 1ml 使用前，将 DNA 洗涤浓缩液（ 10ml ）倒入

一玻璃瓶中，加 140ml 无水乙醇及 50ml蒸馏水（由使用者自配），混匀后置于 -20℃冰箱中，其余溶液置于 4℃冰箱。

三、操作步骤

从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA片段a. 常规 DNA 电泳。按常规方法用溴化乙锭（ EB ）染

色 DNA ，而后将欲分离的 DNA 带从胶上切割下来，置于一 1.5ml 离心管中。

b. 称出凝胶带的重量，加入三倍量（ V/W ）的碘化钠溶液。（如 0.1g 凝胶中加入 0.3ml碘化钠溶液）。

c. 置于 55℃ 水浴 5-10 分钟，直至凝胶完全溶化。d. 加入 20ul充分混匀的“基因纯”试剂（建议使用前

用漩涡振荡器振荡 3 分钟），室温放置 5 分钟（期间不时将管子颠倒几次以混匀）。

e. 离心 10秒（ 10,000rpm ），倒去上清液。f. 加 0.8ml刚从冰箱中取出的 DNA 洗涤液，充分摇匀，

离心 10秒，去上清。g. 重复步骤 f两次（共洗涤三次）。h. 用吸水纸仔细将管壁上及管底残留的洗涤液吸干。i. 加入 20ul超纯水，混匀后置于 55℃ 水浴 5 分钟。j. 离心 3 分钟，将上清液小心吸至另一个离心管，即为

纯化的 DNA 。可直接用于酶切、亚克隆、 PCR 、标记、探针制备、序列测定、细胞转染等。

注意事项：

溴化乙锭染色后的 DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。

DNA 洗涤液应保持在低温，否则可能使 DNA 从“基因纯”试剂上脱落而导致回收率降低。

步骤 h是另一关键，管壁和管底残留的洗涤液若不完全除去，可能导致“基因纯”试剂上结合的 DNA无法由蒸馏水洗脱。

PCR反应物中纯化目的 DNA片段

PCR 反应完毕后，加蒸馏水至 100ul （最后体积）。

加入 300ul碘化钠溶液，混匀。以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片

段”中步骤 d 到 j相同。

从探针制备反应中除去未标记上的核苷酸及小的 DNA片段

探针制备反应完毕后，加蒸馏水至 100ul （最后体积）。

加入 300ul碘化钠溶液，混匀。以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片

段”中步骤 d 到 j相同。

DNA浓缩，去盐及去除杂质

加入 3 倍量的碘化钠溶液于样品 DNA 溶液中（若 DNA为固态，则先将之溶于适量水或 TE 中，再加 3 倍体积的碘化钠溶液）。

加 20ul或更多的“基因纯”试剂（每 ul该试剂可吸附 0.3ugDNA ，操作者可根据这一指标自行决定“基因纯”试剂的用量，但不应少于 10ul ）。

以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片段”中步骤 d 到 j相同。