Page 1
Министерство сельского хозяйства Республики Казахстан
Акционерное общество «КазАгроИнновация»
ТОО «КАЗАХСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ»
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по выделению, культивированию и поддержанию вирусов
оспы овец, коз и птицы
Астана 2010
Page 2
2
УДК 616.912:578.821.21
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по выделению, культивированию
и поддержанию вирусов
оспы овец, коз и птицы
Автор: Кутумбетова Л.Б.
Для руководства при проведении научно-исследовательских,
производственных и музейно-коллекционных работ,
а также учебно-познавательных занятий для студентов ветеринарного
и вирусологического профилей.
Издано в рамках программы 056
«Повышение конкурентоспособности сельскохозяйственной продукции»
Рассмотрено и одобрено на заседании научно-технической комиссии АО
«КазАгроИнновация», 2 августа 2010 года.
Page 3
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
В настоящих методических указаниях использованы следующие
обозначения и сокращения:
РКЭ – развивающиеся куриные эмбрионы;
ФКЭ – фибробласты куриных эмбрионов;
РН – реакция нейтрализации;
АП – аллантоисная полость;
АЖ – аллантоисная жидкость;
ХАО – хорион-аллантоисная оболочка;
ПЯ – первичная культура клеток почки ягнят;
ТТ – перевиваемая линия клеток тестикул теленка;
ТЯ-КК49 – культура клеток тестикул ягнят с диплоидным набором
хромосом, поддерживаемая и производимая пересевами;
ПО – перевиваемая линия клеток почки овцы;
ОП – оспа птиц;
ВОП – вирус оспы птиц;
ИД50 – 50%-ая инфицирующая доза;
ЭИД50 – 50%-ая эмбриональная инфицирующая доза;
Gh-91 – перевиваемая культура клеток гонад 3-х дневной козы;
ТЦД50 – 50%-ая тканевая цитопатическая доза;
СПФ – свободные от патогенной микрофлоры;
КРС – крупный рогатый скот;
Игла – питательная среда для выращивания культур клеток, изготовленная
по рецептуре Eagle
Page 4
4
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В настоящих методических указаниях применены следующие термины с
соответствующими определениями:
КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, способные в искусственных условиях in
vitro находиться в функционально активном состоянии.
ВИРУСЫ – автономные генетические структуры, способные
функционировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках
животных, растений, простейших, грибов, бактерий.
СЫВОРОТКА СПЕЦИФИЧЕСКАЯ – сыворотка крови животных,
полученная после иммунизации определенным видом микроорганизма (вируса)
и содержащая антитела специфические микроорганизму который использован
для иммунизации.
ОСВЕЖЕНИЕ – возвращение исходных биологических свойств
микроорганизма путем репродукции или культивирования в чувствительных
биологических моделях (субстратах) после консервирования.
РЕПРОДУКЦИЯ – продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой.
ПАССАЖ – культивирование вируса в культуре ткани, курином эмбрионе
или в организме восприимчивых животных путем последовательного переноса
вируссодержащего материала из одной популяции в другую.
СУБСТРАТ – см. Биологическая модель.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ – культура клеток, развивающийся эмбрион
животных или птицы, животное и птица, чувствительные или восприимчивые к
испытуемому возбудителю болезни (вирусу), которые применяются для
репродукции и размножения микроорганизмов.
ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА– изоляция из источника возбудителя болезни.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ – определение родовой, видовой и типовой
принадлежности вирусов, установление их сходства или различия при
сравнении с уже известными вирусами.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ – размножение клеток вне организма.
КОНСЕРВИРОВАНИЕ – временное приостановление репродуктивности
вирусов, размножения микроорганизмов, в том числе культур клеток, с
сохранением их репродуктивности и жизнеспособности.
ПОДДЕРЖАНИЕ – сохранение репродуктивных свойств вирусов или
жизнеспособности культур клеток или других микроорганизмов в
биологически активном состоянии.
СТАБИЛИЗАТОР – см. Защитная среда.
ЗАЩИТНАЯ СРЕДА – раствор, содержащий в своем составе протективные
по отношению к микроорганизмам (вирусам) компоненты. Защитная среда
применяется для протекции биологической активности и морфологической
структуры микроорганизмов при лиофильной сушке.
ТИТР ВИРУСА – наименьшее количество вирионов, способных проявлять
биологическую активность и выражается в единицах активности:
Page 5
5
бляшкообразующей (БОЕ), инфекционной (ИД50), цитотоксической (ТЦД50),
летальной (ЛД50) и определяется с помощью специальных методик.
ИММУНОГЕННОСТЬ – способность антигена индуцировать гуморальный
и клеточный иммунитет. Зависит от величины частиц, конформации,
конфигурации, химической структуры, степени чужеродности и
восприимчивости организма.
АНТИГЕННОСТЬ – мера антигенного качества. Определяется
способностью антигена вызывать специфический иммунный ответ и
взаимодействовать с продуктами иммунного ответа.
ПАТОГЕННОСТЬ – потенциальная способность вирусов и микробов в
естественных условиях вызывать заболевание.
ВИРУЛЕНТНОСТЬ – количественная характеристика патогенности
возбудителей инфекционных болезней. Выражают условными величинами -
минимальной летальной дозой (МЛД), 50%-й летальной дозой (ЛД50) или 50%-
й инфицирующей дозой (ИД50).
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ – относится к популяции микроорганизмов
(вирусов), с полезными иммунобиологическими свойствами, полученная в
результате направленного воздействия с помощью определенных методов:
пассирование, клонирование или аттенуирование или данное понятие заменяет
слово аттенуированный.
АТТЕНУИРОВАННЫЙ – относится к популяции микроорганизмов
(вирусов), патогенные и вирулентные свойства которых ослаблены или
утрачены в результате направленных воздействий или впоследствии
природной селекции.
ИЗОЛЯТ ВИРУСА – популяция вируса, выделенная из организма хозяина
или переносчика.
ШТАММ ВИРУСА – однородная популяция вируса, происходящая из
одного вириона и у которой изучены биологические свойства.
ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, полученные путем
ферментативного разделения из живой ткани макроорганизма и растущие вне
организма в специальных сосудах с помощью питательных сред до образования
монослоя. Для ее получения чаще используют клетки эмбриональных органов,
обладающих наибольшей потенцией к росту.
ПЕРЕВИВАЕМАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, способные к
размножению в искусственных условиях неопределенно долгое время. Ее
получают из первично-трипсинизированных культур клеток и поддерживают в
лабораторных условиях путем последовательных пересевов (пассажей) с
заменой питательной среды.
ПЕРЕСЕВАЕМАЯ ИЛИ ШТАММОВАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – культура
клеток с диплоидным набором хромосом, обладающая свойствами первичной.
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА – субстраты, поддерживающие
жизнедеятельность различных культур микроорганизмов и клеток. Содержат
неорганические соли, низкомолекулярные синтетические вещества и
сывороточные компоненты.
Page 6
6
ВВЕДЕНИЕ
В природе широко распространены вирусные возбудители болезней,
которые ярко проявляют свое присутствие, вызывая специфические
заболевания среди восприимчивых животных. Для индикации и выделения
вирусов используются специальные средства и методы. Обнаружение
вирусного возбудителя дает возможность ставить соответствующий диагноз на
заболевания. Кроме того, вирусные возбудители сами по себе являются
основным источником для изготовления специфических диагностических и
профилактических препаратов. Используемые для таких целей вирусы в начале
выделяют (изолируют), подвергают идентификации и с помощью специальных
методов получают штаммовые популяции с направленными свойствами.
Штаммы вирусов по своим предназначениям имеют определенные
отличающиеся от других иммунобиологические свойства и распределяются на
основные три группы. Первую группу составляют штаммы вирусов,
предназначенные для референции и их биологические свойства, условно,
считают типичными для данного вида возбудителя. Во вторую группу входят
штаммы, обладающие биологическими свойствами, которые близки к
природным и пригодны для осуществления контроля иммуногенности
вакцинных препаратов. Из таких же штаммов можно готовить
инактивированные вакцины или диагностические препараты. Третью группу
представляют штаммы вирусов, которые претерпели определенные изменения
в условиях самой природы или с помощью исследовательских воздействий и не
обладают патогенностью по отношению к восприимчивым животным и птице,
но имеют иммуногенные свойства. Вирусы этой группы чаще используются в
изготовлении живых видов вакцинных препаратов. Их можно применять также
при получении диагностических средств.
Известно, что популяция микроорганизмов, в том числе вирусов в процессе
репродукции подвержена изменчивости, тогда как технологии изготовления
вакцинных и диагностических препаратов требуют применения вирусных
образцов со стабильными биологическими показателями. Поэтому, для
исключения вероятного изменения необходимых стандартизированных
биологических свойств популяцию штаммов вирусов поддерживают в
условиях, которые не стимулируют такие изменения или стимулируют в
наименьшей степени. К таким условиям относятся консервирование путем
сублимационного высушивания и хранение при температуре минус 20 о
С и
ниже.
В настоящих методических указаниях приведены технологические
приемы, биологические объекты, физико-химические и биологические
параметры, используемые при выделении, культивировании и поддержании, а
также определении биологических параметров вирусов оспы овец, оспы коз и
оспы птицы.
Page 7
7
1 ОБЩАЯ ЧАСТЬ
Работу по подготовке лабораторной посуды, приготовлению культур
клеток и развивающихся куриных эмбрионов, выделению, культивированию и
поддержанию вирусов осуществляют лица, хорошо владеющие техникой
вирусологических исследований, предварительно прошедшие специальное
обучение, получившие инструктаж и владеющие техникой по получению
данного препарата.
Место проведения работ (лаборатория) должно располагать боксовыми
помещениями для раздельного проведения технологических манипуляций по
стерильной фильтрации питательных сред и растворов, получению культур
клеток и развивающихся куриных эмбрионов, выделению, культивированию,
консервированию и освежению вирусов. В боксах, используемых для
приготовления культур клеток и работы с вирусами, необходимо соблюдать
идеальную чистоту. Стены предбоксников и боксов должны быть облицованы
плиткой, а пол и потолок – иметь гладкую поверхность. Боксы оборудуются
бактерицидными лампами и принудительной вентиляцией с целью создания в
них более высокого давления воздуха по сравнению с другими помещениями.
Лабораторное помещение, в котором расположены боксы, должно быть
обеспечено также водопроводной и дистиллированной водой, паром, воздухом
с положительным и отрицательным давлением, углекислотой и азотом.
Персонал, работающий в боксах, должен иметь специальные комнаты для
переодевания и стерильную спецодежду (халаты, комбинезоны,
косынку/колпак) и тапочки. Лица, не имеющие отношения к процессам,
описанных в данных методических указаниях, на посещение место работы с
целью инспекции, обеспечиваются спецодеждой и тапочками. В лабораторных
помещениях, используемых для выделения, культивирования и поддержания
вируса оспы, работа с другими вирусами и микроорганизмами запрещается.
При работе с биологическими объектами соблюдают специальный
санитарный режим. Работу с культурами клеток и тканей, развивающимися
куриными эмбрионами и вирусами производят в стерильных условиях, поэтому
поддержанию чистоты и стерильности боксовых помещений предъявляются
повышенные требования. Перед началом работы, в обеденный перерыв и в
конце рабочего дня необходимо обязательно включать бактерицидные лампы
на 30 минут. При появлении массовых проростов в культуре клеток
бактериальной и грибковой микрофлоры бактерицидные лампы включают на
ночь в течение 2-3 дней подряд. Входить в бокс разрешается только в
специально предназначенной для этой цели одежде и обуви. Халаты, чепчики и
маски предварительно стерилизуют автоклавированием. Работа в боксе
проводится у пламени спиртовки или газовой горелки.
Резиновые пробки флаконов, бутылей матрасов с растворами, средами,
сывороткой или культурой клеток протирают тампонами, смоченными
спиртом, и фламбируют над пламенем спиртовки. Во время работы
своевременно убирают раздельно «стерильную и загрязненную» вирусом
посуду в специальные контейнеры. Обезвреживание посуды осуществляют
Page 8
8
автоклавированием при 2,0 кг/см2 в течение 2 часов. В конце рабочего дня
проводят влажную уборку полов, стола, стульев и поверхности других
предметов 1,5-2,0% раствором хлорамина. Один раз в неделю проводят
санитарный день, во время которого моют полы, стены и окна с последующим
4-5-часовым облучением боксов ультрафиолетовыми лучами.
2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Подготовка лабораторной посуды и резиновых изделий
В процессе приготовления культур клеток, выделения, культивирования и
поддержания вирусов используют бутыли, колбы, матрасы, пипетки, пробирки,
флаконы, воронки, резиновые пробки и трубки. Лабораторная посуда и
резиновые изделия должны быть тщательно вымыты и простерилизованы. В
качестве моющих средств применяют тринатрийфосфат, моющий порошок,
кальцинированную и двууглекислую соду, соляную и серную кислоты.
Стеклянную посуду (новую) ополаскивают в водопроводной воде,
заливают на 24 часа 25-30%-ым раствором серной кислоты (ГОСТ 4204-77),
ополаскивают 10 раз в водопроводной воде и помещают в ванну с моющим
раствором (150 г тринатрийфосфата на 100 л дистиллированной воды),
подогретым до 50-600С и моют с помощью ершей. Затем тщательно промывают
дистиллированной водой до полного удаления пены со стенок посуды,
помещают на 1-2 мин в 1%-ый раствор соляной кислоты (ГОСТ 3118-77) для
нейтрализации щелочи или 3-4 раза ополаскивают в этом же растворе и вновь
ополаскивают в 4-х сменах деминерализованной воды. Показателем того, что
посуда вымыта хорошо, является равномерное стекание со всей поверхности
сосудов и отсутствие капель воды на стенках. Если после ополаскивания
посуды видны капли на стенках, ее моют повторно по той же методике. При
этом обращают особое внимание на чистоту ванн, в которых моется и
ополаскивается посуда. Ванны и тазы должны быть обезжирены
кальцинированной содой или хромовой смесью. Вымытую посуду
устанавливают вниз горлышками, затем сушат в сухожаровом шкафу. Посуду,
бывшую в употреблении и не загрязненную парафином, воском или жиром,
ополаскивают холодной водой, моют по той же методике.
Посуду, загрязненную жиром, сначала необходимо прокипятить в растворе
тринатрийфосфата, затем промыть горячей водопроводной водой и вымыть, как
указано выше. Если при этом посуда остается «жирной», ее следует
дополнительно обработать серной кислотой и тщательно прополоскать
водопроводной водой, а затем в 3-х сменах деминерализованной воды. Пипетки
после работы, до мойки хранят в банке с деминерализованной водой, затем
обрабатывают серной кислотой, тщательно промывают сначала проточной
водопроводной, затем деминерализованной водой и высушивают в сушильном
шкафу. Высушенную стеклянную посуду монтируют и стерилизуют в
сушильном шкафу при температуре 1800С в течение 2-х часов. Контролем
стерильности посуды является почернение сахарозы, которую кладут на все
Page 9
9
полки, где размещена посуда. Горячую посуду выгружать из сушильного
шкафа не рекомендуется, так как она при быстром остывании вне сушильного
шкафа отпотевает и в нее всасывается нестерильный воздух.
Новые, не бывшие в употреблении, резиновые трубки и пробки кипятят в
течение 30 минут двукратно в 5%-ом растворе двууглекислой соды (ГОСТ
2156-76). После каждого кипячения их тщательно отмывают водопроводной
водой до полного просветления промывной жидкости. После этого резиновые
пробки и трубки кипятят 10-15 минут в 2%-ом растворе соляной кислоты. Затем
промывают водопроводной и деминерализованной водой, кипятят 30 минут в
деминерализованной воде, промывают свежей деминерализованной водой,
высушивают на воздухе, монтируют, стерилизуют автоклавированием 2 часа
при 2 кг/см2. Не рекомендуется проводить одновременную обработку черных
резиновых пробок и резиновых трубок. Резиновые пробки и трубки, бывшие в
употреблении, промывают водопроводной, а затем деминерализованной водой,
кипятят 10 минут в деминерализованной воде, монтируют и стерилизуют
автоклавированием 2 часа при 2 кг/см2.
2.2 Приготовление солевых растворов, питательных и защитных сред.
2.2.1 Общие положения.
Для приготовления солевых растворов и питательных сред используют
деминерализованную воду, полученную на ионообменных установках.
Удельное сопротивление воды должно быть не менее 15х106 Ом и рН 5,7-7,0.
Допускается изготовление сред и растворов на дважды или трижды
дистиллированной воде. Воду получают в день приготовления растворов или
накануне. В последнем случае воду хранят в герметически закрытых емкостях
из нержавеющей стали или бутылях.
Среды и растворы готовят из солей квалификации «химически чистые» или
«чистые» для анализа. Соли растворяют в строгой последовательности,
указанной в прописях. Последующую соль добавляют только после полного
растворения предыдущей. Химические реактивы обязательно высушивают.
Параметры условий высушивания неорганических солей указаны в таблице 1.
Таблица 1 – Температурно-временной режим сушки неорганических солей.
№№
п/п
Формула соли
до высушивания
Температура сушки, 0С Формула соли
после
высушивания
Примеча-
ние 37 50 80 180
1 NaCl
-
5-8
суток
-
-
NaCl
- 2 KCl KCl
3 KH2PO4 KH2PO4
4 NaH2PO42H2O - 8-12
суток
- - NaH2PO4 или
NaH2PO4H2O
Темп. не
выше 500С
5 Na2HPO4 12H2O 15-18
суток
15-18
суток
- - Na2HPO4 2H2O или
Na2HPO4H2O
-
Page 10
10
Для стерилизации питательных сред и растворов используют пластины
«СФ» или ЕКS-2, смонтированные на фильтре Сальникова. Рабочее давление
воздуха в системе 0,3-0,5 кг/см2. Пластины предварительно промывают
деминерализованной или бидистиллированной водой из расчета 2,0 л на одну
пластину. Первую порцию растворов в количестве 0,5-1,0 л на одну
фильтровальную пластину не используют. Нагрузка на одну пластину СФ до 10
л раствора, на пластину ЕКS-2 – до 30 л.
Готовые питательные среды, солевые растворы и сыворотку крови
крупного рогатого скота контролируют на стерильность согласно ГОСТ 28085.
Среды и растворы каждой серии выдерживают 5 суток при температуре 370С и
14 суток при комнатной температуре. При необходимости серию
расфасовывают в мелкую посуду и выдерживают дополнительно 14 суток при
комнатной температуре. Среды и растворы должны быть стерильными,
прозрачными, не иметь осадка. Растворы и среды, содержащие индикатор
феноловый красный, должны быть красно-оранжевого цвета. Среды с наличием
бактериального и грибкового загрязнения утилизируют.
Ростовые свойства питательных сред и сыворотки крови крупного рогатого
скота проверяют путем сравнения с заведомо качественными образцами сред и
сыворотки. Смесь заведомо известных сред и сыворотки с вновь
приготовленными используют для выращивания культур клеток. Среда Игла с
10% сыворотки крови должна обеспечить образование сплошного монослоя
клеток куриных эмбрионов в матрасах через 48 часов при посевной дозе 200
000 клеток/мл. Если в матрасах обнаруживается недостаточный рост культуры
и очаги дегенерации клеток, то проводят повторное испытание. При получении
отрицательных показателей серию среды бракуют.
2.2.2 Приготовление 10-кратного основного раствора Хенкса.
Вначале готовят отдельно раствор А по прописи, приведенной в таблице 2,
а затем раствор Б по прописи, указанной в таблице 3.
Таблица 2 - Пропись раствора А.
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий хлористый (NaCl) 80,0 4233-77 хч
Калий хлористый (КCl) 4,0 4234-77 хч
Магний сернокислый (MgSO4) 1,0 4523-77 хч
Магний хлористый (MgCl) 1,0 4209-77 хч
Кальций хлористый (CaCl2 6H2O)* 1,4 4151-77 хч
Примечание: * - навеску кальция хлористого берут в пересчете на безводный
Готовят точный 40%-ый раствор CaCl2 6H2O (плотность dn20
- 1,3957) и
20%-ый раствор MgCl2 6H2O (плотность dn20
- 1,175). Необходимую
количественную навеску каждой соли растворяют в 30-50 мл воды и
небольшими порциями добавляют к раствору остальных солей. Полученный
раствор А доводят водой до 500 мл.
Таблица 3 - Пропись раствора Б.
Page 11
11
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий фосфорнокислый
однозамещенный (NaH2PO4 2H2O)
0,75
245-76
Хч
Натрий фосфорнокислый двузамещенный
(Na2HPO4 12H2O)
1,5
4172-76
Хч
Калий фосфорнокислый однозамещенный
(КH2PO4)
0,6
4198-75
Хч
Глюкоза кристаллическая гидратная 10,0 975-75 Хч
Феноловый красный 0,2 ГФХ с. 829
Фенол сульфофталеина аммонийная соль
0,2
МРТУ 6-09-
1647-64
Хч
Конечный объем раствора Б доводят до 460 мл. Затем к раствору Б при
непрерывном перемешивании добавляют раствор А и после этого 20 мл 1%-го
раствора фенолового красного. Полученный основной раствор Хенкса
фильтруют через бумажный или ватно-марлевый фильтр и стерилизуют
фильтрацией через пластины «СФ» или ЕКS-2. Основной раствор Хенкса
хранят при температуре 40С в течение 6 месяцев.
2.2.3 Приготовление рабочего раствора Хенкса.
К одному литру основного раствора Хенкса добавляют 9 л
деминерализованной воды. Доводят рН до 7,2-7,4 с помощью 7,5%-ым
раствором двууглекислого натрия (NaHCO3, ГОСТ 2156-76). Стерилизуют
раствор фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2 и хранят при
комнатной температуре (18-200С) 3 месяца, без двууглекислого натрия – 6
месяцев. Рабочий раствор Хенкса без добавления хлористого кальция (CaCl2
6H2O) стерилизуют автоклавированием при 0,7 кг/см2 в течение 40 мин. После
автоклавирования в стерильных условиях устанавливают рН (7,2-7,4) 7,5%-ым
раствором двууглекислого натрия. Срок годности – 3 месяца.
2.2.4 Приготовление 7,5%-го раствора двууглекислого натрия.
Раствор двууглекислого натрия применяют для установки рН солевых
растворов и питательных сред. Навеску соды засыпают в бутыль, заливают
соответствующим количеством деминерализованной воды, закрывают пробкой
и помещают в термостат (37+0,50С) на 2-3 суток. После полного растворения
соды раствор стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2.
Стерильный раствор соды расфасовывают во флаконы, плотно закрывают
резиновыми пробками и хранят при температуре 4-60С в течение месяца.
2.2.5 Приготовление 20%-го раствора фосфатно-кислого однозамещенного
калия.
Раствор применяют для подкисления растворов и питательных сред. Для
его приготовления в 1 л деминерализованной воды растворяют 200 г КН2РО4
(ГОСТ 4198-75, хч) и стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или
ЕКS-2.
2.2.6 Приготовление 0,25%-го раствора трипсина.
Для трипсинизации ткани используют 0,25%-ый раствор трипсина
«Дифко» или другого производства с равными ферментативными свойствами в
Page 12
12
солевом буферном растворе без ионов Са+ и Mg
+. Состав этого солевого
буферного раствора приведен в таблице 4.
Таблица 4 - Пропись компонентов 0,25%-го раствора трипсина.
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий хлористый (NaCl) 8,0 4233-77 Хч
Калий хлористый (КCl) 0,2 4234-77 Хч
Натрий фосфорнокислый
двузамещенный (Na2HPO4 2H2O)
1,447
4172-76
Xч
Калий фосфорнокислый
однозамещенный (КH2PO4)
0,2
4198-75
Хч
Деминерализованная вода до 1 л
Навеску трипсина 2,5 г предварительно растворяют в небольшом объеме
воды (100-150 мл), перемешивают и ставят на ночь в холодильник. Критерием
растворения трипсина служит хорошая видимость контуров предметов через
бутыль с раствором. Растворенный трипсин при помешивании добавляют в
колбу. Полученный раствор доводят водой до 1 л. К общей смеси добавляют
пенициллин и стрептомицин по 100 000 ЕД. (антибиотики растворяют в
небольшом объеме раствора и наливают в колбу). Добавлением 1N раствора
едкого натрия – NaOH (ГОСТ 4328-77) устанавливают рН раствора, который до
фильтрации должен быть в пределах 7,2-7,3, после фильтрации 7,4-7,5.
Полученный раствор стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ»
или ЕКS-2. Готовый раствор трипсина хранят в герметически закрытых
бутылях при температуре 4-6 о
С не более 1 месяца, в замороженном виде при
температуре минус 30 оС
до 1 года.
2.2.7 Приготовление 0,5%-го гидролизата лактальбумина.
Гидролизат лактальбумина в концентрации 0,5% растворяют на растворе
Хенкса и используют в качестве питательной среды для выращивания культур
клеток ПЯ, ТЯ-КК49, ФКЭ. Среду готовят по прописи, указанной в таблице 5.
Таблица 5 - Пропись компонентов для приготовления 0,5%-го раствора
гидролизата лактальбумина.
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий хлористый (NaCl) 8,0 4233-77 Хч
Калий хлористый (КCl) 0,4 4234-77 Хч
Магний сернокислый (MgSO46Н2О)
или
Магний сернокислый безводный
0,1
0,053
4523-77
-
Хч
-
Магний хлористый (МgCl26Н2О) или
Магний хлористый безводный
0,1
0,47
4209-77
-
Хч
хч
Натрий фосфорнокислый
двузамещенный (Na2HPO4 12H2O)
0,075
4172-76
Хч
Page 13
13
Калий фосфорнокислый
однозамещенный (КH2PO4)
0,06
4198-75
Хч
Глюкоза кристаллическая гидратная 1,0 975-75 Хч
Кальций хлористый безводный (СаСl2)
0.2
4460-77
Хч
Феноловый красный 0,02 ГФХ с.829 Хч
Натрий двууглекислый (NaHCO3) 2156-76 Хч
Гидролизат лактальбумина 5
Пенициллин 100 тыс. ед. ГФХ с.521
Стрептомицин 100 тыс. ед. ГФХ с. 636
Вода деминерализованная до 1л.
Порядок растворения компонентов:
Раствор 1: натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый,
глюкоза.
Раствор 2: натрий фосфорнокислый однозамещенный растворять в воде,
нагретой до температуры 90 оС.
Раствор 3: гидролизат лактальбумина растворять в воде, нагретой до 90 о
С,
или автоклавировать при 0,7 кг/см2 в течение 10 минут.
Раствор 4: хлористый кальций, тщательно перемешивать.
Раствор 5: феноловый красный.
Раствор 6: натрий двууглекислый.
Газирование среды углекислым газом, подвести рН среды до 7,0-7,2.
Раствор 7: антибиотики.
Смешать растворы и стерилизовать фильтрованием через пластины «СФ»
или ЕКS-2. Среду хранят 3 месяца в герметически закрытых бутылях при
температуре 4-6 о
С.
2.2.8 Приготовление питательной среды по рецептуре Игла
Таблица 6 - Пропись компонентов для приготовления питательной среды по
рецептуре Игла.
Компоненты Состав (мг в 1000,0
мл раствора) для L-
клеток
Состав (мг в 1000,0 мл
раствора) для HeLa-
клеток
л-аргинин 17,4 17,7
л-цистин 4,8 12,0
л-гистидин
3,1
7,8
л-изолейцин 26,2 26,2
л-лейцина 13,1
26,2
л-лизин 14,6
29,2
л-метионин 7,5 7,5
Page 14
14
л-фенилаланин 8,3 16,5
л-треонин 11,9 23,8
л-триптофан 2,0 4,1
л-тирозин 18,1 18,1
л-валин 11,7 23,4
биотин 0,24 0,24
холин 0,12 0,12
холина-хлорид 0,14 0,14
витамин В12 (птероилглютаминовая
кислота)
0,44 0,44
никотинамид 0,12 0,12
пантотеновая кислота 0,22 0,22
пантотенат кальция 0,48 0,48
пиридоксаль (пиридоксин хлоргидрат) 0,20 0,20
тиамин-хлоргидрат 0,34 0,34
рибофлавин 0,04 0,04
хлористый натрий 5850,0 5850,0
хлористый калий 373,0 373,0
фосфат натрия однозамещенный
(NaH2PO4*1H2O)
138,0 138,0
кальций хлористый 111,0 111,0
двууглекислый натрий (NaHCO3) 1680,0 1680,0
магний хлористый (MgCl2*6H2O) 102,0 102,0
глюкоза 900,0 900,0
л-глютамин 146,2-292,3 146,2-292,3
пенициллин 50,0 50,0
стрептомицин 50,0 50,0
фенол красный 5,0 5,0
вода до 1000,0 до 1000,0
Раствор 1. В 500 мл воды, нагретой приблизительно до 80 о
С, помешивая,
растворяют указанные выше количества аминокислот, после чего добавляют л-
глютамин и фенол-красный.
Раствор 2. В 100,0 мл воды растворяют неорганические соли, за
исключением двууглекислого натрия (NaHCO3), смешивают с предыдущим
раствором неорганических солей и добавляют биотин и птероилглютаминовую
кислоту (витамин В12).
Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют все витамины, кроме биотина и
птероилглютаминовой кислоты, и антибиотики – пенициллин и стрептомицин.
Все растворы стерилизуют фильтрованием через стеклянный фильтр-нутч
(Шотт, Иена, Германия) либо через асбестоцеллюлозные пластины Зейтца или
отечественные пластины СФ (стерилизующий фильтр) после предварительного
промывания водой, а затем – приготовленным раствором.
500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 мл раствора 3 смешивают и
доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1мг инозита на1 л.
2.2.9 Получение сыворотки крови крупного рогатого скота.
Page 15
15
В условиях относительной стерильности от клинически здоровых
животных 2-3 –летнего возраста берут кровь из яремной вены. Через
стерильный резиновый шланг кровь подается по стенке в бутыли вместимостью
10 л. В каждую бутыль берут до 5 л крови. Для полного отделения сыворотки
кровь выдерживают 48-72 часа при температуре 25 оС. Прозрачную сыворотку
отсасывают в бутыли через сифонное устройство и стерилизуют через
пластины «СФ» или ЕКS-2. Сыворотку проверяют на стерильность и ростовые
свойства. Допускается использование сыворотки без консерванта, выпускаемой
мясокомбинатами. Сыворотку хранят при температуре 4-6 о
С в течение 6
месяцев. Сыворотка, имеющая хлопьевидный осадок фибрина, пригодна для
работы с культурами клеток и тканей.
2.2.10 Приготовление 0,01%-го раствора бромкрезола.
Для приготовления раствора в мерную посуду вносят 0,1 г
бромкрезолового красного и его растворяют в 100 мл 96о спирта ректификата.
Полученный раствор доводят деминерализованной водой до 1000 мл. Раствор
хранят при температуре 18-25 о
С не более 1 месяца. Используют раствор для
проверки качества мойки и ополаскивания стеклянной посуды. В чистую
посуду добавляют 2-3 мл 0,01%-го раствора бромкрезола. Изменение цвета от
желтого к синему свидетельствует о низком качестве мойки (желтый-хорошая
мойка, синий-плохая).
2.2.11 Приготовление защитной среды для лиофилизации вируса.
В качестве защитной среды для вируса оспы при сублимационном
высушивании используют среду, состоящую из пептона или гидролизата
лактальбумина, сахарозы и желатина. Допускается использование в этих же
целях обезжиренного молока коров.
Защитную среду, состоящую из пептона или гидролизата лактальбумина,
сахарозы и желатина готовят следующим образом:
- для получения 12 л среды растворяют 2 кг пептона (ГОСТ 13805-76) или
столько же сухого гидролизата лактальбумина и 2 кг сахарозы (ТУ6-092293-77)
в 10 л калийфосфатного буферного раствора (52,8 г К2НРО4 и 10,9 г КН2РО4 на
10 л дистиллированной воды, используют соли предварительно
перекристализованные и высушенные), а также 0,2 кг желатина в 0,5 л
дистиллированной воды;
- растворение производят при нагревании до 70-800С и перемешивают до
полного растворения сахарозы;
- после растворения жидкости смешивают, охлаждают до комнатной
температуры и отделяют осадок в виде крупных, рыхлых серо-белых хлопьев,
пропуская раствор через ватно-марлевый фильтр;
- рН среды должен быть в пределах 6,8-7,2;
- затем среду стерилизуют фильтрацией через пластины типа ЕКS-2,
подавая жидкость на фильтр при избыточном давлении или «самотеком»,
пропускная способность одной пластины – 8 л жидкости;
- суммарные потери при фильтрации составляют 1,5-2,0 л на 12 л
первоначального объема среды. Стерилизующую фильтрацию среды проводят
в день ее изготовления.
Page 16
16
Плотность среды после стерилизующей фильтрации должна быть не ниже
1,07 г/мл определяют с помощью ареометра (ГОСТ 18481-81Е).
Приготовленную защитную среду стерильно расфасовывают в стерильные
бутыли на 3-5-10 л, хранят при температуре 2-6 оС не более 30 суток и
используют для стабилизации вируса после получения положительных
результатов о ее стерильности.
Стерильность образцов защитной среды определяют по ГОСТ 28085.
Для приготовления защитной среды из молока берут свежее коровье
молоко, обезжиривают его сепарированием, фасуют в стеклянные колбы или
флаконы высотой столба жидкости (обрата) не выше 10 см, сосуды с
обезжиренным молоком закрывают ватно-марлевыми пробками и подвергают
двукратному автоклавированию текучим паром при 0,5 кг/см2 в течение 30 мин
с интервалом в 18-24 час.
Стерилизованное обезжиренное молоко проверяют на стерильность и
хранят до использования не более 10 сут.
2.3 Приготовление субстратов репродукции вирусов оспы.
В качестве субстрата для репродукции вируса оспы птицы используют 10-
12-суточные развивающиеся куриные эмбрионы и культуру фибробластов
развивающихся куриных эмбрионов, а для вирусов оспы овец и оспы коз –
культуру первичных клеток ПЯ, пересеваемых ТЯ-КК49 и перевиваемых линий
ПО и ТТ.
2.3.1 Приготовление развивающихся куриных эмбрионов.
Для получения развивающихся куриных эмбрионов закладывают на
инкубацию СПФ яйца кур, не имеющих трещин и загрязнений. Инкубацию яиц
проводят в течение 10-12 суток при температуре 37,5-38,00С в специальных
инкубаторах для вывода цыплят с обеспечением в камере влажности воздуха не
менее чем 60% и периодической вентиляции, а также переворачивания яиц на
полках. Для определения наличия и развития эмбрионов яйца овоскопируют на
5-7 сутки инкубации. Яйца без эмбрионов выбраковывают, а эмбрионы с
наличием кровеносных сосудов инкубируют до 10-12 суточного возраста и
используют в эти сроки для репродукции вируса или приготовления культуры
фибробластов.
2.3.2 Приготовление фибробластов куриных эмбрионов.
Для приготовления культуры фибробластов отбирают хорошо развитые
подвижные 10-11-суточные эмбрионы кур. Яйца с погибшими эмбрионами и не
оплодотворенные утилизируют. Отобранные для трипсинизации
инкубационные яйца с эмбрионами укладывают в специальные лотки пугой
вверх, двукратно, на 2-3 секунды погружают в 2%-ый раствор йодистого калия
на 960 этиловом спирте и подают в бокс.
В боксе поверхность яиц прожигают спиртом, а по окружности пуги
прожигают при помощи «устройства для электротермического вскрытия
эмбрионов птиц». Затем стерильным пинцетом снимают скорлупу, разрывают
хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), извлекают эмбрионы и помещают их
Page 17
17
по 50-60 или 100-120 штук в 2-х литровую колбу Эрленмейера, где трижды
отмывают рабочим раствором Хенкса (рН 7,2-7,4) с антибиотиками (по 100 ЕД
пенициллина и 100 мкг стрептомицина на 1 мл раствора). Затем эмбрионы
размельчают ножницами, заливают 0,25%-ым раствором трипсина, подогретого
до температуры 370С (в среднем по 75 мл трипсина на 8-10 куриных
эмбрионов), опускают в колбу с размельченными эмбрионами стерильный
магнитик, ставят колбу с содержимым на магнитную мешалку и проводят
трипсинизацию со средней скоростью вращения магнитика в течение 7-8 мин.
После чего суспензию клеток сливают через 4-х слойный марлевый фильтр во
флаконы. Во взвесь клеток добавляют 2-3% сыворотки крови крупного
рогатого скота и осаждают их центрифугированием при 1000 об/мин в течение
10 минут. Осадок ресуспендируют в питательной среде и диспергированные
клетки фильтруют через 4 слоя стерильной марли.
В камере Горяева под малым увеличением микроскопа (10х20)
подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток в полученной
трипсинизацией суспензии.
Для выращивания монослойной культуры клеток фибробластов эмбрионов
используют суспензию, содержащую 90-95% жизнеспособных клеток. Процент
жизнеспособных клеток определяют по формуле: у = х/с ,100, где:
Х – количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии (неокрашенные);
С – общее число (окрашенных и не окрашенных) клеток в 1 мл суспензии.
Для подсчета клеток пипеткой отбирают по 0,2 мл суспензии и сливают ее
в пробирку. В эту же пробирку вносят 0,8 мл краски (0,2%-ый раствор
трипанового синего на физиологическом растворе) и получают разведение
суспензии клеток в 5 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают,
выдерживают 5 мин + 30 сек при температуре 37+0,50С и заполняют камеру
Горяева. Подсчитывают живые (неокрашенные клетки). Конгломераты считают
за одну клетку. Подсчет производят в 25 больших квадратах камеры.
Полученное количество клеток умножают на 5 (степень разведения суспензии
краской) и умножают на 10 000 (величина постоянная). Полученное
произведение означает общее количество клеток в 1 мл суспензии. Например, в
25 больших квадратах камеры Горяева насчитывается 100 клеток.
Следовательно, 100 х 5 х 10 000 = 5 000 000 клеток в 1 мл суспензии.
Для засева культуры клеток в матрасы вместимостью 1,5 л концентрация
клеток в суспензии должна быть 200-300 тыс. клеток в 1 мл, следовательно,
необходимо данный объем всей клеточной суспензии развести в 25 или 16 раз
питательной средой.
Для выращивания культуры клеток роллерным методом концентрация
клеток в суспензии должна быть 700-800 тыс. кл/мл.
Для получения культуры клеток, необходимой в определении числовых
значений вирусов, суспензию клеток высевают в пенициллиновые флаконы в
концентрациях 200-400 тыс. кл/мл.
Суспензию клеток разводят до необходимой концентрации питательной
средой с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота. В общий объем
суспензии вносят по 1000 ЕД пенициллина и 1000 мкг стрептомицина на 1 л и
Page 18
18
разливают суспензию по 180-200 мл в матрасы вместимостью 1,5 л или по 450-
500 мл в 5-литровые бутыли. Разлив суспензии производят в стерильном боксе
над пламенем горелки. Матрасы и бутыли плотно закрывают резиновыми
пробками. Матрасы размещают горизонтально, а бутыли – на роллерные
установки и инкубируют при температуре 37+0,50С в течение 24-48 часов.
Скорость вращения бутыли на роллерном аппарате устанавливают в пределах
10-15 оборотов в час. Через 24-48 часов все матрасы и бутыли с культурой
клеток просматривают под малым увеличением микроскопа и визуально.
Макроскопически – среда в матрасах и бутылях должна быть прозрачной.
Микроскопически – клетки должны покрывать всю поверхность стенки сосуда
сплошным слоем.
2.3.3 Приготовление первичной культуры клеток почек ягнят.
Для приготовления первичной культуры клеток ПЯ используют ягнят
доноров 1-2 месячного возраста, полученных от здоровых овцематок
благополучной по инфекционным заболеваниям отары.
Ягнят убивают, выпуская кровь из яремной вены и сонной артерии,
отделяют шкуру препарированием, вскрывают брюшную полость и открывают
доступ к почкам, раздвигая органы вскрытой полости.
Для убоя и вскрытия полости брюшины, а также других режущих
манипуляций используют остро заточный нож или скальпель.
С помощью карцанга и пинцета, не травмируя наружную оболочку, почки
освобождают от жирового слоя, фиксируют орган карцангом, захватывая
оболочку вместе с мочеточниками и сосудами, отделяют из туши, отрезая
ножом или ножницами. Почки переносят поочередно в эмалированный
металлический лоток, в который заранее наливают этиловый спирт ректификат.
Почку погружают в спирт на 2-3 секунды, захватив за сосуды, извлекают ее из
спирта и сразу же поджигают. В состоянии горения спирта почки быстро
переносят в банку с широким горлом, в которую заранее налит раствор Хенкса
с антибиотиками в дозе 200 ЕД/мл пенициллина и 200 мг/мл стрептомицина.
Банку закрывают стерильной крышкой и переносят в бокс в специальном биксе.
В боксе, строго соблюдая все правила асептики, почки переносят на
стерильный металлический с эмалированной поверхностью лоток или на чашку
Петри. Почки освобождают от наружной оболочки с помощью стерильных
ножниц, пинцетов и карцанга. Ополаскивают раствором Хенкса с
антибиотиками, удаляют ножницами корковый слой, а мозговой - помещают в
стерильную банку с широким горлом, в которой его тщательно размельчают на
мелкую гомогенную массу с размером частиц 2-4 мм. Размельченную массу
заливают раствором Хенкса (рН 7,2-7,4) с антибиотиками и прополаскивают
двух-трех кратно. Кусочки ткани почечного органа переносят в плоскодонную
колбу и заливают их 0,25%-ым раствором трипсина, подогретого до
температуры 370С (в среднем по 75 мл трипсина на тканевую массу одной
почки). В колбу с размельченными почками опускают стерильную магнитную
палочку, ставят колбу с содержимым на магнитную мешалку и проводят
трипсинизацию в течение 7-8 мин со средней скоростью вращения магнитика,
которая не допускает образования пены. По истечению времени трипсинизации
Page 19
19
суспензию клеток сливают через 4-х слойный марлевый фильтр во флаконы.
Оставшиеся кусочки ткани почек повторно заливают раствором трипсина и
повторяют трипсинизацию в тех же режимах и продолжительности времени.
Трипсинизацию тканей повторяют трех и более кратно, до полного истощения
тканей от клеток. Во взвесь клеток добавляют 2-3% сыворотки крови крупного
рогатого скота и осаждают их центрифугированием при 1000 об/мин в течение
10 минут. Осадок ресуспендируют в питательной среде и диспергированные
клетки фильтруют через 4 слоя стерильной марли.
В камере Горяева под малым увеличением микроскопа (10х20)
подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток в полученной
трипсинизацией суспензии.
Для выращивания монослойной культуры клеток почек ягнят используют
суспензию, содержащую 90-95% жизнеспособных клеток. Процент
жизнеспособных клеток определяют по формуле: у = х/с ,100, где:
х – количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии (неокрашенные);
с – общее число (окрашенных и не окрашенных) клеток в 1 мл суспензии.
Для подсчета клеток пипеткой отбирают по 0,2 мл суспензии и сливают ее
в пробирку. В эту же пробирку вносят 0,8 мл краски (0,2%-ый раствор
трипанового синего на физиологическом растворе) и получают разведение
суспензии клеток в 5 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают,
выдерживают 5 мин + 30 сек при температуре 37+0,50С и заполняют камеру
Горяева. Подсчитывают живые (неокрашенные клетки). Конгломераты считают
за одну клетку. Подсчет производят в 25 больших квадратах камеры.
Полученное количество клеток умножают на 5 (степень разведения суспензии
краской) и умножают на 10 000 (величина постоянная). Полученное
произведение означает общее количество клеток в 1 мл суспензии. Например, в
25 больших квадратах камеры Горяева насчитывается 100 клеток.
Следовательно, 100 х 5 х 10 000 = 5 000 000 клеток в 1 мл суспензии.
Для засева культуры клеток в матрасы вместимостью 1,5 л концентрация
клеток в суспензии должна быть 200-300 тыс. клеток в 1 мл, следовательно,
необходимо данный объем всей клеточной суспензии развести в 25 или 16 раз
питательной средой.
Для выращивания культуры клеток роллерным методом концентрация
клеток в суспензии должна быть 700-800 тыс. кл/мл.
Для получения культуры клеток, необходимой в определении числовых
значений вирусов, суспензию клеток высевают в пенициллиновые флаконы в
концентрациях 200-400 тыс. кл/мл.
Суспензию клеток разводят до необходимой концентрации питательной
средой с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота. В общий объем
суспензии вносят по 1000 ЕД пенициллина и 1000 мкг стрептомицина на 1 л и
разливают суспензию по 180-200 мл в матрасы вместимостью 1,5 л или по 450-
500 мл в 5-литровые бутыли и по 1,0 мл в пенициллиновые флаконы. Разлив
суспензии производят в стерильном боксе над пламенем горелки. Матрасы и
бутыли плотно закрывают резиновыми пробками. Матрасы и пенициллиновые
флаконы размещают горизонтально, а бутыли – горизонтально в роллерные
Page 20
20
аппараты и инкубируют при температуре 37+0,50С в течение 24-72 часов.
Скорость вращения бутыли в роллерном аппарате устанавливают в пределах
10-15 оборотов в час. Через каждые 24 часа все матрасы и бутыли с культурой
клеток просматривают визуально и под малым увеличением микроскопа.
Макроскопически – среда в матрасах и бутылях должна быть прозрачной.
Микроскопически – клетки должны покрывать всю поверхность стенки сосуда
сплошным слоем.
2.3.4 Приготовление пересеваемых клеток ТЯ-КК49.
Культуру клеток ТЯ-КК49 поддерживают непрерывными пассажами или в
замороженном состоянии в жидком азоте при температуре минус 196 оС.
Для сохранения клеток в жидком азоте клетки концентрируют до
концентрации 5х106 кл./см
3, помещают в специальную защитную среду,
состоящую из диметилсульфоксида – 20%, питательной среды ИГЛА – 60% и
сыворотки крови крупного рогатого скота (фетальной или телячьей) – 20%, и
разливают в ампулы по 5 см3. Ампулы с клетками закрывают специальными
крышками или запаивают. Ампулы с клетками замораживают, вначале до
температуры минус 70 оС со скоростью охлаждения 1
оС/мин, а затем переносят
в жидкий азот в специальных металлических стаканах. Замороженные таким
образом клетки в ампулах или пробирках хранят в течение нескольких лет,
постоянно пополняя жидким азотом камеру сосуда Дъюара, где содержатся
ампулы с клетками.
Для приготовления монослойной культуры клеток, суспензию клеток в
ампулах, хранящуюся в жидком азоте, вынимают и размораживают, помещая в
воду с температурой 40 оС. Ампулу асептически вскрывают, содержимое
переносят в матрас с питательной средой, подсчитывают количество
жизнеспособных клеток, и помещают для культивирования в термостат с
температурой нагрева 37-38 о
С. Количество жизнеспособных клеток должно
быть не менее 80%. Для восстановления исходных цитологических свойств
культуры клеток проводят 2-3 освежающих пассажа. В связи с этим посеянные
клетки выдерживают до образования монослоя на поверхности матраса, затем
ее пересевают двукратным индексом и дожидаются образования полной
монослойной культуры клеток. В следующей генерации культуру клеток
пересевают четырех кратным индексом, и после получения монослоя, культуру
клеток используют для производства и репродукции вируса.
Для поддержания клеток в растущем состоянии их культивируют в
матрасах при температуре 37-38 оС с индексом пересева 6-8, высевая в каждой
генерации по 100 тыс. кл./см3. Такая методика дает возможность более
длительному образованию монослоя и сравнительно длительному сохранению
клеток без пересева. Для культивирования клеток ТЯ-КК49 используют
питательную среду ИГЛА-МЕМ с содержанием 10% сыворотки крови крупного
рогатого скота и температуру инкубации 37-38 оС. Культуру клеток
поддерживают в той же среде, но с содержанием 5% и менее сыворотки крови
того же вида животного.
Page 21
21
Клетки ТЯ-КК49 выращивают в матрасах и круговых сосудах различной
емкости, биологических пробирках и пенициллиновых флаконах. Культуру
клеток, выращенную в пробирках и пенициллиновых флаконах, используют для
первичного выделения вируса из патологических материалов, титрования
вируса и постановки реакции нейтрализации, а культуру клеток, выращенную в
матрасах и сосудах – для продукции биологической массы вируса.
2.3.5 Приготовление перевиваемых клеток ПО и ТТ.
Культуру клеток линий ПО и ТТ поддерживают также как и культуру
клеток ТЯ-КК49 непрерывными пассажами или в замороженном состоянии в
жидком азоте при температуре минус 196 оС. Методики их приготовления,
хранения и поддержания такая же, как и при использовании пересеваемых
клеток ТЯ-КК49 (п.п.2.3.4).
2.4 Подбор и подготовка экспериментальных животных.
Работы по выделению, идентификации и установлению биологических
свойств вирусов оспы животных и птицы требуют использования
экспериментальных животных и птицы. Такие животные и птица должны
отвечать требованиям, которые предусматривают использования животных и
птицы, свободных от возбудителей инфекционных заболеваний, имеющих
упитанность не ниже средней и интактных (не иммунных против оспы) от
возбудителей оспы и не содержащих в организме специфических антител
против вирусов оспы.
В экспериментальных работах с вирусом оспы овец используются овцы
различного возраста, а вирусом оспы коз – козы, также различного возраста.
Предпочтителен возраст этих животных от 6 месяцев до 2-х лет. Для работы с
вирусом оспы птицы используются молодые куры в возрасте 2-5 месяцев.
2.5 Выделение, идентификация и культивирование вирусов оспы.
2.5.1 Выделение, идентификация и культивирование вируса оспы овец.
Для выделения вируса оспы овец используют патологический материал,
собранный от больных и павших овец с клиническими признаками,
характерными для оспенной болезни. Такими признаками являются узелковые
поражения кожи, которые проявляются в виде розеолы, папулы, пустулы и
везикулы. Узелковые образования или экссудативное содержимое папул
собирают в стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают
двукратному замораживанию и размораживанию при температурных значениях
минус 40оС и плюс 20-25
оС. Из узелковых образований кожи готовят 20%
суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия хлорида,
растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла. Гомогенат
очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин.
В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200 ЕД/см3
пенициллина, 200 мг/см3 стрептомицина и 50 мг/см
3 нистатина, выдерживают
при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для выделения вируса
Page 22
22
заражением соответствующей чувствительной биологической модели. Такими
объектами для выделения вируса оспы овец служат овцы, подобранные
согласно требованиям п.п. 2.4., культура клеток ПЯ, ТЯ-КК49, ПО и ТТ.
При использовании для биологической пробы овец, суспензию
испытуемого патологического материала вводят этим животным внутрикожно в
бесшерстный участок кожи в дозе 0,5 см3. За зараженными животными ведут
клиническое наблюдение в течение не менее 17 суток с ежедневным
измерением температуры тела. В случае наличия вируса оспы овец у
зараженных животных через 3-7 суток проявляется гипертермия и кожные
поражения в виде папулезно-пустулезных образований в месте инокуляции
исследуемого патологического материала. Через 3-5 суток после проявления
гипертермии и кожных поражений в месте введения патологического
материала, в различных участках тела образуются вторичные кожные оспенные
узелки, которые свидетельствуют о генерализации оспенного процесса. В
качестве источника вируса служат оспенные узелки кожи, в которых обычно
накапливается вирус в титре до 106,5
ИД50/0,5см3.
При использовании для выделения вируса культуры клеток, суспензию
испытуемого патологического материала вводят на монослой клеток в
пробирках или пенициллиновых флаконах в дозе 0,1 см3. Зараженные клетки
выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 мин, затем инокулят
сливают, монослой несколько кратно промывают раствором Хенкса,
содержащим антибиотики, вносят поддерживающую среду и культивируют при
температуре 37-38 оС в течение 10-12 суток. В течение указанного срока
ежедневно проводят микроскопию монослоя с целью выявления признаков
наличия оспенного вируса. О присутствии вируса свидетельствует
цитопатогенное действие, которое проявляется в монослое клеток с 4-7 суток
после инокуляции суспензии испытуемого патологического материала.
Цитопатогенное действие характеризуется округлением клеток,
формированием ими гроздевидных образований в монослое, в последующем -
разрывов между клетками, приводящих к полной деструкции монослоя клеток.
Цитопатогенное действие вируса оспы овец примерно одинаково
проявляется во всех чувствительных культурах клеток и накапливается в них от
105,0
до 107,5
ТЦД50/см3.
В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса культуру клеток в
пробирках или флаконах подвергают двукратному замораживанию и
размораживанию, полученную культуральную суспензию вносят на монослой
свежей аналогичного вида культуры клеток. Также как и при заражении
патологическим материалом, свежую культуру клеток, инокулированную
исследуемой культуральной суспензией, выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 минут, инокулят заменяют на поддерживающую питательную
среду и продолжают культивирование при той же температуре до проявления
цитопатогенного действия. В случае отсутствия ЦПД и на втором пассаже
проводят аналогическим образом третий пассаж. Отсутствие ЦПД на третьем
«слепом» пассаже принимают за отсутствие репродуктивного вируса в
исследуемом образце патологического материала. При наличии
Page 23
23
цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус выделенным и
проводят его идентификацию.
Идентификацию выделенного вируса проводят с помощью реакции
нейтрализации, поставленной на животных или в культуре клеток. Для этого
выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных соотношениях
смешивают со специфической на вирус оспы овец сывороткой, полученную
смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС и ею
инокулируют одну из культур клеток чувствительных к вирусу оспы овец или
овец, не иммунных к оспе. Параллельно вирусом в указанной дозе, но без
добавления сыворотки заражают культуру клеток и овец. За зараженной и
контрольной культурами клеток и овцами ведут ежедневное наблюдение,
выявляя цитопатогенное действие или кожные узелковые поражения.
Наблюдение за монослоем зараженной культуры клеток продолжают в течение
12 суток, а за овцами – 14 суток.
Вирус считают идентифицированным как вирус оспы овец в случае
отсутствия ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у животных,
зараженных смесью испытуемого вируса со специфической сывороткой на
вирус оспы овец, при развитии ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у
овец, инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической
сыворотки на вирус оспы овец.
Культивирование вируса оспы овец, в зависимости от его биологических
свойств и предназначения, проводят в организме овец и чувствительной
культуре клеток. Патогенные штаммы вируса оспы овец культивируют в
организме молодых интактных овец, а модифицированные - в одной из
чувствительных культур клеток.
Вирулентные штаммы вируса оспы овец, предназначенные для проверки
иммуногенности вакцинных препаратов, культивируют в организме овцы. Для
этого, вирус вводят овцам внутрикожно в дозе 0,5 см3
и наблюдают за
развитием кожного оспенного поражения. На 5-6 сутки на месте введения
возбудителя формируется отечность с покраснением, который в последующем
приобретает темно-красную окраску. За день до появления отека кожи у овцы
повышается температура тела. Для получения биомассы вирулентного вируса
на 6-7 сутки, в зависимости от развития местного воспаления и температуры
тела, животное убивают, участок воспаленной кожи срезают, которую очищают
от механических примесей, дезинфицируют этиловым спиртом и подвергают
гомогенизации растиранием в ступке в смеси с песком нейтрального стекла.
Гомогенат разводят до 20% физиологическим раствором хлорида натрия с рН
7,2-7,4, центрифугируют при 3000 g в течение 30 минут, осадок удаляют, а
оставшуюся жидкость используют в качестве вируссодержащего материала.
Модифицированные штаммы вируса, предназначенные для приготовления
живых вакцин культивируют в культуре первичных клеток, полученных из
почечной и тестикулярной клеток ягнят, а штамм «КазНИВИ» - в пересеваемой
культуре клеток ТЯ-КК49 и линии ПО. Для этого готовят монослойную
культуру клеток соответствующего вида, высевая клетки в концентрации 200-
300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-800 тыс. клеток/см
3 - в круговые сосуды,
Page 24
24
заражают их модифицированным вакцинным штаммом вируса в дозе 0,05-0,1
ТЦД50/кл, которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до
развития цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя.
Цитопатогенное действие вируса в таких культурах клеток проявляется на 3-4
сутки, а на 6-7 сутки вирусному поражению подвергается максимальное
количество клеток монослоя культуры. В сосудах с культурой клеток, в сроки
заражения вирусом и проявления ЦПД, заменяют питательную среду
поддерживающей. В момент максимального развития ЦПД, но без деструкции
монослоя культуры клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают
замораживанию. Культуральную суспензию после размораживания и
определения в ней титра вируса используют в качестве вирусной биомассы для
изготовления вакцинного препарата.
2.5.2 Выделение, идентификация и культивирование вируса оспы коз.
Для выделения вируса оспы коз используют патологический материал,
собранный от больных и павших коз с клиническими признаками,
характерными для оспенной болезни. Такими признаками являются узелковые
поражения кожи, которые проявляются в виде розеолы, папулы, пустулы и
везикулы. Узелковые образования или экссудативное содержимое папул
собирают в стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают
двукратному замораживанию и размораживанию при температурных значениях
минус 40оС и плюс 20-25
оС. Из узелковых образований кожи готовят 20%
суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия хлорида,
растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла. Гомогенат
очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин.
В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200 ЕД/см3
пенициллина, 200 мг/см3 стрептомицина и 50 мг/см
3 нистатина, выдерживают
при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для выделения вируса
заражением соответствующей чувствительной биологической модели. Такими
объектами для выделения вируса оспы коз служат козы, подобранные согласно
требованиям п.п. 2.4., культура клеток ПЯ, ТЯ-КК49.
При использовании для биологической пробы коз, суспензию испытуемого
патологического материала вводят этим животным внутрикожно в
бесшерстный участок кожи в дозе 0,5 см3. За зараженными животными ведут
клиническое наблюдение в течение не менее 14 суток с ежедневным
измерением температуры тела. В случае наличия вируса оспы коз у
зараженных животных через 3-7 суток проявляется гипертермия и кожные
поражения в виде папулезно-пустулезных образований в месте инокуляции
исследуемого патологического материала. Через 3-5 суток после проявления
гипертермии и кожных поражений в месте введения патологического
материала, в различных участках тела образуются вторичные кожные оспенные
узелки, которые свидетельствуют о генерализации оспенного процесса. В
качестве источника вируса служат оспенные узелки кожи, в которых обычно
накапливается вирус в титре до 107,25
ИД50/0,5см3.
При использовании для выделения вируса культуры клеток, суспензию
испытуемого патологического материала вводят на монослой клеток в
Page 25
25
пробирках или пенициллиновых флаконах в дозе 0,1 см3. Зараженные клетки
выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 мин, затем инокулят
сливают, монослой несколько кратно промывают раствором Хенкса,
содержащим антибиотики, вносят поддерживающую среду и культивируют при
температуре 37-38 оС в течение 10-12 суток. В течение указанного срока
ежедневно проводят микроскопию монослоя с целью выявления признаков
наличия оспенного вируса. О присутствии вируса свидетельствует
цитопатогенное действие, которое проявляется в монослое клеток с 4-7 суток
после инокуляции суспензии испытуемого патологического материала.
Цитопатогенное действие характеризуется округлением клеток,
формированием ими гроздевидных образований в монослое, в последующем -
разрывов между клетками, приводящих к полной деструкции монослоя клеток.
Цитопатогенное действие вируса оспы коз примерно одинаково
проявляется во всех чувствительных культурах клеток и накапливается в них от
105,0
до 106,25
ТЦД50/см3.
В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса культуру клеток в
пробирках или флаконах подвергают двукратному замораживанию и
размораживанию, полученную культуральную суспензию вносят на монослой
свежей аналогичного вида культуры клеток. Также как и при заражении
суспензией патологического материала, свежую культуру клеток,
инокулированную исследуемой культуральной суспензией, выдерживают при
температуре 37-38 оС в течение 60 минут, инокулят заменяют на
поддерживающую питательную среду и продолжают культивирование при той
же температуре до проявления цитопатогенного действия. В случае отсутствия
ЦПД и на втором пассаже проводят аналогическим образом третий пассаж.
Отсутствие ЦПД на третьем «слепом» пассаже принимают за отсутствие
репродуктивного вируса в исследуемом образце патологического материала.
При наличии цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус
выделенным и проводят его идентификацию.
Идентификацию выделенного вируса проводят с помощью реакции
нейтрализации, поставленной на животных или в культуре клеток. Для этого
выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных соотношениях
смешивают со специфической на вирус оспы коз сывороткой, полученную
смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС и ею
инокулируют одну из культур клеток чувствительных к вирусу оспы коз или
коз, не иммунных к оспе. Параллельно вирусом в указанной дозе, но без
добавления сыворотки заражают культуру клеток и коз. За зараженной и
контрольной культурами клеток и козами ведут ежедневное наблюдение,
выявляя цитопатогенное действие или кожные узелковые поражения.
Наблюдение за монослоем зараженной культуры клеток продолжают в течение
12 суток, а за козами – 14 суток.
Вирус считают идентифицированным как вирус оспы коз в случае
отсутствия ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у животных,
зараженных смесью испытуемого вируса со специфической сывороткой на
вирус оспы коз, при развитии ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у коз,
Page 26
26
инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической
сыворотки на вирус оспы коз.
Культивирование вируса оспы коз, в зависимости от его биологических
свойств и предназначения, проводят в организме коз и чувствительной
культуре клеток. Патогенные штаммы вируса оспы коз культивируют в
организме молодых интактных коз, а модифицированные - в одной из
чувствительных культур клеток.
Вирулентные штаммы вируса оспы коз, предназначенные для проверки
иммуногенности вакцинных препаратов, культивируют в организме козы. Для
этого, вирус вводят козам внутрикожно в дозе 0,5 см3
и наблюдают за
развитием кожного оспенного поражения. На 5-6 сутки на месте введения
возбудителя формируется отечность с покраснением, который в последующем
приобретает темно-красную окраску. За день до появления отека кожи у коз
повышается температура тела. Для получения биомассы вирулентного вируса
на 6-7 сутки, в зависимости от развития местного воспаления и температуры
тела, животное убивают, участок воспаленной кожи срезают, которую очищают
от механических примесей, дезинфицируют этиловым спиртом и подвергают
гомогенизации растиранием в ступке в смеси с песком нейтрального стекла.
Гомогенат разводят до 20% физиологическим раствором хлорида натрия с рН
7,2-7,4, центрифугируют при 3000 g в течение 30 минут, осадок удаляют, а
оставшуюся жидкость используют в качестве вируссодержащего материала.
Модифицированные штаммы вируса, предназначенные для приготовления
живых вакцин культивируют в культуре первичных клеток, полученных из
почечной и тестикулярной клеток ягнят, а штамм «ГК-35» - в пересеваемой
культуре клеток ТЯ-КК49 и линии ПО. Для этого готовят монослойную
культуру клеток соответствующего вида, высевая клетки в концентрации 200-
300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-800 тыс. клеток/см
3 - в круговые сосуды,
заражают их модифицированным вакцинным штаммом вируса в дозе 0,05-0,1
ТЦД50/кл, которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до
развития цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя.
Цитопатогенное действие вируса в таких культурах клеток проявляется на 3-4
сутки, а на 6-7 сутки вирусному поражению подвергается максимальное
количество клеток монослоя культуры. В сосудах с культурой клеток, в сроки
заражения вирусом и проявления ЦПД, заменяют питательную среду
поддерживающей. В момент максимального развития ЦПД, но без деструкции
монослоя культуры клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают
замораживанию. Культуральную суспензию после размораживания и
определения в ней титра вируса используют в качестве вирусной биомассы для
изготовления вакцинного препарата.
2.5.3 Выделение, идентификация и культивирование вируса оспы птицы.
Для выделения вируса оспы птицы используют патологический материал,
собранный от больных и павших кур с клиническими признаками,
характерными для оспенной болезни. Такими признаками являются узелковые
поражения гребешков, сережек и кожи. Узелковые образования собирают в
стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают двукратному
Page 27
27
замораживанию и размораживанию при температурных значениях минус 40оС
и плюс 20-25 оС. Из узелковых образований гребешков, сережек и кожи готовят
20% суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия
хлорида, растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла.
Гомогенат очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в
течение 30 мин. В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200
ЕД/см3 пенициллина, 200 мг/см
3 стрептомицина и 50 мг/см
3 нистатина,
выдерживают при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для
выделения вируса заражением соответствующей чувствительной
биологической модели. Такими объектами для выделения вируса оспы птицы
служат цыплята старше 2-х месяцев и РКЭ, подобранные согласно требованиям
п.п. 2.4., а также культура клеток ФКЭ.
При использовании для биологической пробы кур, суспензию испытуемого
патологического материала вводят птице в дозе 0,01 см3
внутрикожно путем
прокола перепонки крыла двуигольным инъектором. За зараженными
цыплятами ведут клиническое наблюдение в течение не менее 14. В случае
наличия вируса оспы кур у зараженных цыплят через 7-9 суток проявляются
кожные поражения в виде узелковых образований в месте инокуляции
исследуемого патологического материала. Через 3-5 суток после проявления
кожных поражений в месте введения патологического материала, в различных
участках тела образуются вторичные кожные оспенные узелки и
дифтеритические наложения в гортани, которые свидетельствуют о
генерализации оспенного процесса. В качестве источника вируса служат
оспенные узелки кожи.
При использовании для выделения вируса РКЭ, суспензию испытуемого
патологического материала наносят на ХАО в дозе 0,1-0,2 см3. Для этого на
скорлупе со стороны пуги проделывают отверстие диаметром 3-4 мм,
инъекционной иглой обнажают ХАО, удаляя подскорлупную оболочку. На
вскрытую ХАО наносят заражающий исследуемый материал. Зараженные
таким образом РКЭ инкубируют при температуре 37-38 оС в течение 7 суток
определяя ежедневно состояние эмбрионов овоскопированием. Эмбрионы,
погибшие, начиная с 3-х суток после заражения, и выжившие в течение срока
инкубирования охлаждают при температуре 4-8 оС. В асептических условиях
вскрывают охлажденные эмбрионы, собирают хорион-аллантоисную оболочку,
определяют в них наличие оспенных узелков и замораживают при температуре
минус 40 оС. Вместе с ХАО собирают АЖ. Замороженные, имеющие оспенные
узелки ХАО размораживают, готовят из нее 20% гомогенат растиранием в
ступке с песком нейтрального стекла на забуференном физиологическом
растворе хлорида натрия и АЖ. Полученная таким образом суспензия ХАО на
АЖ и ЗФР, используется в качестве вирусной биомассы.
При использовании для выделения вируса культуры клеток, суспензию
испытуемого патологического материала вводят на монослой клеток в
пробирках или пенициллиновых флаконах в дозе 0,1 см3. Зараженные клетки
выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 мин, затем инокулят
сливают, монослой несколько кратно промывают раствором Хенкса,
Page 28
28
содержащим антибиотики, вносят поддерживающую среду и культивируют при
температуре 37-38 оС в течение 5-7 суток. В течение указанного срока
ежедневно проводят микроскопию монослоя с целью выявления признаков
наличия оспенного вируса. О присутствии вируса свидетельствует
цитопатогенное действие, которое проявляется в монослое клеток с 4-5 суток
после инокуляции суспензии испытуемого патологического материала.
Цитопатогенное действие характеризуется округлением клеток,
формированием ими очаговых образований в монослое, в последующем -
разрывов между клетками, приводящих к деструкции монослоя клеток. Вирус
оспы птицы накапливается в ФКЭ в титрах до 107,5
ТЦД50/см3 и выше.
В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса в монослое
культуры клеток при первичном заражении, проводят дополнительно два
«слепых» пассажа с использованием свежей культуры клеток ФКЭ, так же как и
при выделении вирусов оспы овец и оспы коз. Отсутствие ЦПД на третьем
«слепом» пассаже принимают за отсутствие репродуктивного вируса в
исследуемом образце патологического материала. При наличии
цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус выделенным и
проводят его идентификацию.
Идентификацию выделенного вируса проводят с помощью реакции
нейтрализации, поставленной на цыплятах или РКЭ или в культуре клеток
ФКЭ. Для этого выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных
соотношениях смешивают со специфической на вирус оспы птицы сывороткой,
полученную смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС
и ею инокулируют одну из чувствительных биологических субстратов.
Параллельно вирусом в указанной дозе, но без добавления сыворотки заражают
цыплят или РКЭ или ФКЭ. За зараженными цыплятами ведут клиническое
наблюдение в течение 12 суток, состояние РКЭ определяют овоскопированием
в течение 7 суток, монослой ФКЭ микроскопируют в течение 6-7 суток.
Вирус считают идентифицированным как вирус оспы птицы в случае
отсутствия оспенных бляшек на ХАО РКЭ, ЦПД в культуре клеток ФКЭ и
оспенных узелков у цыплят, зараженных смесью испытуемого вируса со
специфической сывороткой на вирус оспы кур, при развитии оспенных бляшек
на ХАО РКЭ, наличии ЦПД в культуре клеток ФКЭ и оспенных узелков у
цыплят, инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической
сыворотки на вирус оспы кур.
Культивирование вируса оспы кур, в зависимости от его биологических
свойств и предназначения, проводят в РКЭ и культуре клеток ФКЭ. Патогенные
штаммы вируса оспы кур культивируют в РКЭ, а модифицированные - в РКЭ и
ФКЭ.
Вирулентные штаммы вируса оспы кур, предназначенные для проверки
иммуногенности вакцинных препаратов, культивируют в РКЭ. Для этого, вирус
вводят в АП РКЭ в дозе 0,3 см3
и инкубируют эмбрионы при температуре 37-38 оС в течение 7 суток. Зараженные эмбрионы ежедневно овоскопируют,
погибшие после 72 ч и выжившие после 7 суток охлаждают при температуре 4-
8 оС. Охлажденные РКЭ асептически вскрывают, собирают ХАО с оспенными
Page 29
29
бляшками и АЖ. Готовят 20% суспензию ХАО на АЖ и ЗФР путем растирания
в ступке с помощью песка нейтрального стекла. Суспензию очищают
центрифугированием при 3000 g в течение 30 минут. Осадок удаляют, а
оставшуюся жидкость используют в качестве вирусной массы.
Модифицированные штаммы вируса, предназначенные для приготовления
живых вакцин, культивируют в РКЭ или культуре клеток ФКЭ, а штамм «КП-
4» - в культуре клеток ФКЭ. Для этого готовят монослойную культуру клеток
ФКЭ, высевая клетки в концентрации 200-300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-
700 тыс. клеток/см3 - в круговые сосуды, или готовят суспензию клеток в
концентрации 1000-1200 тыс. клеток/см3 для культивирования в суспензионном
ферментере. Монослойную культуру клеток в матрасах и круговых сосудах, а
также суспензию клеток в ферментере заражают модифицированным
вакцинным штаммом «КП-4» вируса оспы птицы в дозе 0,05-0,1 ТЦД50/кл,
которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до развития
цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя и дегенерации
более 90% клеток в суспензии, культивируемой в реакторе. Цитопатогенное
действие вируса в монослойной культуре клеток проявляется на 3-4 сутки, а на
5-6 сутки дегенеративному изменению подвергается максимальное количество
клеток монослоя культуры. В сосудах с культурой клеток, в сроки заражения
вирусом и проявления ЦПД, заменяют питательную среду поддерживающей. В
момент максимального развития ЦПД, но без деструкции монослоя культуры
клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают замораживанию.
Культуральную суспензию, инкубированную с вирусом в состоянии суспензии
подвергают замораживанию при остаточном количестве живых клеток не более
20%. Культуральную суспензию после размораживания и определения в ней
титра вируса используют в качестве вирусной биомассы для изготовления
вакцинного препарата. Модифицированный штамм «КП-4» вируса оспы кур
накапливается в ФКЭ в титрах 107,5
-109,0
ТЦД50/см3.
2.6 Консервирование и хранение вирусов оспы животных и птицы.
Для консервации отбирают вирусную суспензию, свободную от
бактериального и грибкового загрязнения с биологической активностью не
ниже 105,5
ТЦД50/см3 оспы овец и оспы коз и 10
7,5 ТЦД50/см
3 вируса оспы птицы, в
которую добавляют пенициллин в дозе 100-200 ЕД/мл и стрептомицин - 100-
200 мкг/мл. Вирусную массу, не зависимо от вида, смешивают со стерильной
стабилизирующей защитной средой в равных объемных соотношениях. Смесь
тщательно перемешивают. Вируссодержащую суспензию разливают с
соблюдением правил асептики, в зависимости от потребности, по 1,0 см3
или
2,0 см3
или 4,0 см3 в стерильные ампулы по ОСТ 64-2-180-85 или флаконы по
ТУ 64-2-100-78. Ампулы/флаконы с жидкой вирусной суспензией немедленно
закрывают стерильной двухслойной марлевой салфеткой или стерильной
гигроскопической ватой. Вирусный материал в ампулах/флаконах
замораживают столбиком в низкотемпературных холодильных установках при
Page 30
30
температуре минус 45-500С и выдерживают при этом температурном режиме в
течение 8-10 часов.
Камеру сублимационной установки дезинфицируют (фламбируют),
охлаждают конденсор установки до температуры минус 45-500С, быстро
загружают замороженную в ампулах/флаконах вирусную суспензию со
стабилизатором в сушильные вакуум-камеры (в течение 2-3 мин), не допуская
оттаивания биопрепарата в фасовках, и герметично закрывают крышку (дверь)
камеры. Включают вакуум-насос и в течение 15-20 минут создают вакуум до
100 микрон, который выдерживают на протяжении всего периода сушки.
Через 1-3 часа после загрузки вируса, в вакуум сушильном аппарате включают
медленный подогрев полок с повышением температуры биопрепарата на 1-20С
в час. Общая продолжительность сушки вируса около 36-48 часов, в том числе
первый период сушки (сублимация) составляет около 18-30 часов. Плюсовая
температура в вируссодержащем материале не должна превышать 250С.
Контроль над процессом сушки ведут по температурным данным биопрепарата
и давлению в сушильной камере.
После окончания высушивания в камеру впускают стерильный воздух,
пока давление в ней не уровняется с наружным.
Открыв камеру, ампулы/флаконы быстро перекладывают в вакуум-камеры,
в которых вирус содержат под вакуумом в 200-250 микрон до момента запайки
ампул и перекрытия флаконов.
Ампулы с сухим вирусом герметически запаивают в день разгрузки
аппарата на вакуумных коллекторах при вакууме не более 250 микрон (при
остаточном давлении в пределах 0,1-0,25 мм рт.ст.), а флаконы герметизируют
под аналогичным вакуумом резиновыми пробками и закатывают
алюминиевыми колпачками (ОСТ 64-009-86).
Наличие вакуума в ампулах/флаконах проверяют вакуумным
трансформатором типа Тесла или прибором Д/Арсенваля. При отсутствии
светящегося разряда или разряда с фиолетовым свечением в форме тонкого
шнура (признак отсутствия вакуума или низкий вакуум) такую ампулу или
флакон выбраковывают и уничтожают кипячением или автоклавированием.
Допускается ампулы/флаконы с вирусом герметизировать без создания в
них вакуума. При этом ампулы/флаконы заполняют инертным стерильным
газом.
Датой изготовления сухого образца вируса считается день окончания
лиофилизации.
Высушенные образцы вирусов в ампулах или флаконах, после
паспортизации биологических параметров, этикируют и хранят в опечатанных
металлических контейнерах при температуре минус 40 оС.
2.7 Освежение вирусов оспы животных и птицы.
Вирулентные штаммы вируса оспы овец и оспы коз, а также вируса оспы
птицы, консервированные лиофильной сушкой в ампулах или флаконах,
освежают на овцах, козах и РКЭ, соответственно, по той же методике, которая
Page 31
31
описана в п.п. 2.5.1, 2.5.2, 2.5.3. При этом в качестве заражающего вирусного
материала, вместо суспензии патологического материала, применяют сухое
содержимое ампул или флаконов, представленное для освежения. Вирусы
второго или третьего пассажа с достаточными титрами и стерильные по
отношению бактерий и грибков используются как освеженные.
Модифицированные штаммы вирусов оспы овец и оспы коз освежают
репродукцией в культуре клеток ТЯ-КК49 или ПЯ. Для этого флаконы с
высушенными образцами вирусов, хранившиеся при минусовой температуре,
асептически вскрывают, растворяют с помощью раствора Хенкса и разводят
десятикратно этим же раствором. Полученным разведением каждого вида
вируса заражают культуру клеток в 2-3 матрасах, предварительно удалив
ростовую питательную среду. Зараженную культуру клеток инкубируют в
течение 1-2 ч при температуре 37-38 оС, сливают инокулят, наливают, свежую
поддерживающую питательную среду, содержащую 5% сыворотки крови
крупного рогатого скота, и продолжают инкубацию при той же температуре.
Наличие и репродукцию вирусов контролируют микроскопией монослоя
культуры клеток и определяют по цитопатогенному воздействию. Развитие
ЦПД принимается за наличие продуктивного вируса. В момент развития ЦПД
вируса на сравнительно максимальной площади монослоя клеток, который
наступает обычно на 5-7 сутки после заражения, матрасы с культурой клеток,
пораженной вирусом, замораживают при температуре минус 20-40 оС. Не менее
чем, через 12 ч замороженное содержимое матрасов размораживают при
комнатной температуре и проводят дополнительно еще один-два пассажа в
свежей культуре клеток, до стабилизации скорости репродукции и
концентрации вируса в единице объема. Полученный таким образом
культуральный вирус с титром цитопатогенности не менее 105,5
ТЦД50/см3,
считается освеженным и используется в дальнейшем для получения активной
биомассы вируса или для закладки свежей партии вируса на продолжительный
срок хранения.
Для освежения модифицированного штамма вируса оспы кур, высушенный
его образец, растворяют в растворе Хенкса или физиологическом растворе
хлорида натрия, разводят этим же раствором десятикратно, которым заражают
первичную культуру клеток ФКЭ. Для этого из матраса и кругового сосуда, со
сформированным монослоем клеток, сливают ростовую среду и вносят
разведенный вирус в объеме 3-5 см3. Один или два матраса или сосуда с
культурой клеток оставляют не зараженными для контроля. Адсорбция вируса
проводится в течение 1 часа при температуре 37+0,50С. После завершения
времени адсорбции вируса, в матрасы или сосуды добавляют поддерживающую
среду. Одновременно меняют среду и в контрольных сосудах с незараженной
культурой клеток. В поддерживающую культуральную среду добавляют
антибиотики из расчета по 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина на
100 мл среды. Зараженную культуру клеток инкубируют при температуре 37-38 оС ежедневно микроскопируя монослой на наличие, характер и интенсивность
развития ЦПД. На 3-4 сутки после заражения в монослое клеток проявляется
ЦПД, которое в течение последующих 2-3 суток развивается в 80% площади
Page 32
32
монослоя. Культуру клеток с такой интенсивностью развития ЦПД
замораживают при температуре минус 40 оС в течение не менее 3 ч, затем
размораживают, устанавливают стерильность и титр вируса. Полученную
культуральную суспензию используют в качестве вирусной биомассы для
дальнейшего пассирования в свежей партии культуры клеток. Вирус
модифицированного штамма «КП-4» второго или третьего пассажей с титром
от 107,5
ТЦД50/см3 используется как освеженный.
2.8 Определение биологической активности (титра) вирусов оспы.
Инфекционную активность вирусов оспы овец, оспы коз и оспы птицы
определяют титрованием в соответствующей чувствительной монослойной
культуре клеток. Вирусы оспы овец и оспы коз титруют в культурах клеток ПЯ,
ТЯ-КК49 или ПО, ТТ, вирус оспы птицы – в ФКЭ, выращенных в
пенициллиновых флаконах или пробирках и РКЭ.
Для титрования содержимое трех ампул/флаконов с сухим вирусом
разводят стерильной поддерживающей питательной средой до первоначального
объема вируса перед сушкой, объединяют и из средней пробы готовят на той
же среде 10-кратные разведения от 10-1
до 10-9
.
При использовании для титрования культур клеток каждое разведение
вируса вносят в 4 флакона/пробирки с монослойной культурой клеток в дозе по
1,0 см3, предварительно удалив ростовую питательную среду из них, и
культивируют при температуре 37+0,5оС. Зараженную культуру клеток
микроскопируют ежедневно. Поддерживающую питательную среду во
флаконах с культурой клеток заменяют через каждые 48 ч.
Результаты титрования учитывают при каждой микроскопии по наличию
цитопатогенных изменении в культуре клеток. ЦПИ характеризуется
образованием видоизмененных (округлых, интенсивно преломляющих свет)
клеток, располагающихся одиночно или группами в виде виноградных
гроздьев, подвергающихся в последующем деструкции.
Результаты титрования вирусов оспы овец и коз устанавливают по данным
микроскопии, проведенных до 12 суток, а вируса оспы кур – до 7 суток. Титр
вирусов в культурах клеток определяют в ТЦД50.
При использовании для титрования овец и коз каждое разведение вируса
вводят внутрикожно в дозе 0,5 см3 в 4 точки на выбритую поверхность кожи
туловища и ведут за животными клиническое наблюдение в течение 7 суток,
регистрируя изменения в месте инокуляции испытуемого вируса.
На 5-7 сутки после титрования в месте введения вируса формируются
очаги тканевого отека с гиперемией, по которым проводится расчет титра
возбудителя. Вторичные оспенные узлы, которые появляются после 7 дня, не
учитываются. Титр вируса определяют в ИД50
При использовании для титрования цыплят каждое разведение вируса
вводят внутрикожно в дозе 0,01 см3 в одну точку перепонки крыла с помощью
Page 33
33
двуигольного инъектора путем прокола. На каждое разведение используют 4-6
цыплят.
Учет результатов титрования проводят на 7-9 сутки после титрования по
сформированным оспенным узелкам в месте прокола крыла. Титр вируса
определяют в ИД50.
При использовании для титрования РКЭ каждое разведение вируса наносят
на ХАО 4-6 РКЭ в дозе по 0,2 см3.
Учет результатов титрования проводят на 7 сутки после титрования по
оспенным узелкам на ХАО РКЭ. Титр вируса определяют в ЭИД50.
Титр вирусов рассчитывают по методу Рида и Менча. Инфекционная
активность вируса оспы овец и оспы коз должна быть не ниже 105,0
УЕ50/см3, а
вируса оспы кур – 107,0
УЕ50/см3.
2.9 Определение патогенности и вирулентности вирусов оспы.
Патогенность и вирулентность вируса оспы овец определяют на овцах,
вируса оспы коз - на козах, а вируса оспы птицы - на цыплятах. Для этого
испытуемым вирусом заражают животных соответствующего вида путем
внутрикожного введения возбудителя и ведут клиническое наблюдение за
инфицированными животными и птицей. У овец и коз ежедневно проводят
термометрию температуры тела.
При заражении овец и коз вирусом гомологических оспенных болезней на
5-7 сутки появляются кожные поражения в местах инокуляции вирусов,
характеризующиеся плотным воспалительным отеком, которая имеет ярко
красную окраску, переходящая затем в папулезно-пустулезное образование
(Рисунок 1, 2). Пустулы переходят в везикулы, напоминая некротизирующийся
участок ткани. За сутки до появления местной кожной реакции у овец и коз
повышается температура тела, которая остается на высоком уровне до перехода
папул в пустулы. Вслед за появлением гипертермии и оспенных узлов в месте
введения вируса, болезнь принимает генерализованную форму, при которой
развиваются вторичные оспенные узлы в коже различных участков тела. В этот
период часто развивается отек головы больных животных и, вместе везикул,
образуются сухие тканевые корочки. Вследствие воспалительного поражения
слизистой оболочки носовых полостей из носовых отверстий появляются
слизисто-серозные истечения. Болезнь обычно длится несколько недель и в 30-
60% случаев заканчивается летальным исходом больного животного. Процент
летальности может достигать значений и 80-90.
Вирулентность вирусов, как меру патогенности, определяют титрованием
вируса на восприимчивых животных.
Вирулентность вирусов оспы овец и оспы коз достигает до 106,0
-107,25
ИД50/см3.
При заражении цыплят вирусом оспы птицы на 7-9 сутки в месте
внутрикожной инокуляции вируса образуются оспенные узелки. Через
несколько суток происходит генерализация оспенного процесса, и вторичные
узелки появляются в других участках тела, особенно на гребешках, сережках и
Page 34
34
конечностях. Болезнь заканчивается в 20-40% случаях летальным исходом
больных цыплят.
Вирулентность вируса, определяемая титрованием на цыплятах, составляет
107,5
-108,5
ИД50/см3.
2.10 Определение антигенности вирусов оспы животных и птицы.
Антигенность вирусов оспы овец, оспы коз и оспы птицы определяют по
титрам вируснейтрализующих антител, вырабатываемых в ответ на введение
испытуемых штаммов указанных возбудителей. Для этого вирусами оспы овец,
оспы коз и оспы птицы в дозах по 103 ТЦД50 прививают двух овец, двух коз и
трех цыплят, соответственно и через 30 суток, от всех привитых собирают
пробы сыворотки крови, в которых, с помощью реакции нейтрализации
устанавливают титр вируснейтрализующих антител.
Испытуемые вирусы считаются антигенно активными в случае
формирования в организме животных и птицы, привитых ими,
противовирусных антител в титре от 1,0 log2.
Реакцию нейтрализации с вирусами оспы овец и оспы коз ставят в одной из
чувствительных культур клеток (ТЯ-КК49, ПЯ, ПО, ТТ), а с вирусом оспы
птицы в культуре ФКЭ. Для постановки реакции из каждой пробы сыворотки
крови, после предварительной термической обработки при температуре 56 оС в
течение 30 мин готовят двукратные разведения на растворе Хенкса. Затем
каждое разведение смешивают с равным объемом испытуемого вируса с титром
100 ТЦД50/0,5 см3. Смесь выдерживают в течение 60 мин при температуре 37-38
оС и каждым разведением инокулируют культуру клеток в 4-х пробирках или
флаконах. За культурами клеток наблюдают в течение 7-12 суток и
регистрируют ЦПД. Наличие ЦПД означает об отсутствии нейтрализующей
способности сыворотки, а отсутствие ЦПД – о наличии такой способности.
Наивысшее разведение сыворотки, нейтрализовавшее репродукцию вируса,
считается нейтрализующим титром сыворотки.
2.11 Определение иммуногенности вирусов оспы животных и птицы.
Иммуногенность вакцинного вируса оспы овец устанавливают на 3-х овцах
2-3 летнего возраста. Для этого, содержимое трех флаконов/ампул с вирусом
растворяют, объединяют и разводят физиологическим раствором до
биологической активности 1000 ТЦД50/см3. После тщательного перемешивания
разведенный вирус в дозе по 1,0 см3/гол вводят овцам подкожно с помощью
шприца.
Через 14 сут после прививки всех трех вакцинированных и еще трех не
привитых овец аналогичного возраста заражают вирулентным штаммом
«Казахстан-К» вируса оспы овец путем внутрикожного ведения в дозе 1000
ИД50/гол в объеме 0,5 см3 в области вентральной поверхности хвоста.
Page 35
35
Учет результатов контрольного заражения проводят в течение 14 суток по
устойчивости к вирулентному вирусу оспы овец контрольных и
вакцинированных животных.
Вирус считают иммуногенным, в случае если у всех овец, привитых
модифицированным вирусом, после инфицирования вирулентным вирусом не
развиваются какие либо признаки заболевания оспой, в то время как у
контрольных – они должны развиться в полной мере.
Испытуемый модифицированный штамм «КазНИВИ» вируса оспы овец
должен быть иммуногенным.
Иммуногенность вакцинного штамма «ГК-35» вируса оспы коз определяют
также как и вакцинного вируса оспы овец, но с использованием такого же
количества и возраста коз. Из содержимого трех флаконов/ампул с вирусом
путем растворения на физиологическом растворе и объединения готовят
среднюю пробу. Среднюю пробу вируса разводят на том же растворе до
биологической активности 1000 ТЦД50/см3. Разведенный вирус в дозе по 1,0
см3/гол вводят козам подкожно.
Через 14 сут после прививки всех трех вакцинированных и еще трех не
привитых коз аналогичного возраста заражают вирулентным штаммом «Р-4»
вируса оспы коз путем внутрикожного ведения в дозе 1000 ИД50/гол в объеме 0,5
см3 в области вентральной поверхности хвоста.
Учет результатов контрольного заражения проводят в течение 14 суток по
устойчивости к вирулентному вирусу оспы коз контрольных и
вакцинированных животных.
Вирус считают иммуногенным, в случае если все привитые козы, после
заражения вирулентным вирусом не заболевают оспой, в то время как
контрольные – заболевают с характерными признаками оспы коз.
Испытуемый штамм «ГК-35» вируса оспы коз должен быть
иммуногенным.
Для определения иммуногенности штамма «КП-4» вируса оспы птицы, из
содержимого трех ампул или флаконов на физиологическом растворе хлорида
натрия готовят среднюю пробу, разводят на том же растворе до биологической
активности 100 ИД50/0,01 см3. Разведенной вакциной прививают 10 цыплят от 2-х
месячного возраста путем внутрикожной инокуляции вируса проколом
перепонки крыла с помощью двуигольного инъектора. Через 12 суток всех
привитых испытуемым штаммом вируса и 10 аналогичных цыплят, не
привитых вирусом, заражают вирулентным штаммом «К» вируса оспы птицы.
Вирулентный вирус вводят также как и аттенуированный внутрикожно в дозе
по 1000 ИД50/0,01 см3. За зараженными цыплятами ведут наблюдение в течение 14
суток. Об иммуногенности судят по результатам заражения цыплят
вирулентным вирусом. Вирус считается иммуногенным, если у привитых
цыплят после заражения вирулентным вирусом в месте введения возбудителя и
в общем состоянии не проявятся какие либо патологии, при развитии оспенных
узелков в месте введения вируса у контрольных цыплят.
Испытуемый штамм «КП-4» вируса оспы птицы должен быть
иммуногенным.
Page 36
36
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработанные методические указания предназначены для руководства при
проведении работ по выделению, идентификации, культивированию и
длительному хранению, а также освежению полевых популяций, лабораторных
и производственных штаммов вирусов оспы овец, оспы коз и оспы птицы. В
документе приведены методы обработки и контроля качества лабораторной
посуды, методы приготовления и рецептура необходимых солевых растворов,
питательных и защитных сред, методы получения и приготовления
биологических субстратов для выделения, культивирования, освежения и
титрования вирусов оспы, методы определения и оценки патогенности,
вирулентности, антигенности, иммуногенности указанных видов вирусов.
Приведенные в документе методические правила и строгое соблюдение их
при работе с вирусами оспы даст возможность изолировать и
идентифицировать полевой возбудитель этой болезни, культивировать и
получать активную биомассу, а также поддерживать его в репродуктивном
состоянии длительное время в условиях лаборатории. Методические указания
могут являться руководством при получении производственных штаммов,
изготовлении вакцинных и диагностических препаратов, используемых при
диагностике и профилактике оспенных болезней животных и птицы.
Данные методические указания составлены на основе результатов
собственных исследований авторов.
Page 37
37
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1 Кутумбетов Л.Б., Курченко Ф.П., Иванющенков В.Н., Уфимцев К.П.
Эффективность сухой культуральной вирусвакцины из штамма «НИСХИ»
против оспы овец. Журнал Ветеринария. № 10, 1994, - С.111-113.
2 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р. Способ получения биомассы вируса
оспы овец из штамма «НИСХИ». Авторское свидетельство РК №25167, от
07.11.1997.
3 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Майхин К.Т. Способ культивирования
вируса оспы овец. Авторское свидетельство РК №24863, от 07.11.1997.
4 Кульбаева К.Р. Разработка технологии приготовления пылевидной
вирусвакцины из штамма «НИСХИ» для аэрозольной иммунизации овец
против оспы//Автореф. дисс. .. канд.вет.наук. Алматы, 1997, 27 с.
5 Майхин К.Т. Технология изготовления вакцины против оспы овец из
аттенуированного штамма с использованием перевиваемой культуры
клеток//Дисс…. канд.вет.наук, Алматы, 2003, 97 с.
6 Кутумбетов Л.Б., Абдураимов Е.О., Мамбеталиев М. Изучение свойств
вируса оспы коз в клеточных культурах. Журнал Биотехнология. Теория и
практика. №1-2 (5-6) 1998 г. - С. 9-11.
7 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Штамм вируса оспы овец «VO-98» для
изготовления инактивированной вакцины против оспы овец. Авторское
свидетельство РК №25168, от 07.05.1998.
8 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Чувствительность различных
перевиваемых культур клеток к вирусу оспы овец. Материалы научной
конференции молодых ученых КазНИВИ «Инфекционные и паразитарные
болезни сельскохозяйственных животных», Алматы,1999 г. - С. 157-162.
9 Кутумбетов Л.Б. Штамм вируса Variola caprina «VCP-97/G7»,
используемый для изготовления культуральной вакцины против оспы коз.
Авторское свидетельство РК №9518, от 31.05.1999.
10 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т., Кульбаева К.Р. Репродукция вируса
оспы овец в культуре клеток перевиваемой линии почки эмбриона овцы.
Материалы международной научно-практической конференции «Роль
ветеринарной науки в развитии животноводства», посвященной 75-летию
КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 131-133.
11 Корпусова Т.И., Кутумбетов Л.Б., Куляшбекова Ш.К., Зиновьева М.С.
Культивирование аттенуированного вируса оспы овец штамма «ВНИИЗЖ» в
культуре клеток гонад козы роллерным методом. Материалы международной
научно-практической конференции «Роль ветеринарной науки в развитии
животноводства», посвященной 75-летию КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 128-
129.
12 Корпусова Т.И., Кутумбетов Л.Б., Манин Б.Л., Михалишин В.В.
Исследование перевиваемой культуры клеток гонад козы при культивировании
вирусов животных. Материалы международной научно-практической
конференции «Роль ветеринарной науки в развитии животноводства»,
посвященной 75-летию КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 121-122.
Page 38
38
13 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И., Манин Б.Л., Михалишин В.В.
Чувствительность перевиваемой линии клеток гонад козы к вирусу оспы птиц.
Материалы международной научно-практической конференции «Роль
ветеринарной науки в развитии животноводства», посвященной 75-летию
КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 130-131.
14 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И., Манин Б.Л., Михалишин В.В.
Роллерный метод культивирования вируса оспы птиц. Материалы
международной научно-практической конференции «Роль ветеринарной науки
в развитии животноводства», посвященной 75-летию КазНИВИ, Алматы, 2000
г. - С. 119-120.
15 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Майхин К.Т. Способ культивирования
вируса Variola ovina. Авторское свидетельство РК №8413, от 05.6.1998. Бюлл.
№1, 14.1.2000 г.
16 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Майхин К.Т. Штамм вируса Variola
ovina «КазНИВИ» для изготовления культуральной вакцины против оспы овец.
Авторское свидетельство РК №9442, от 11.3.1999. Бюлл. №9, 15.9.2000 г.
17 Кутумбетов Л.Б., Зиновьева М.С., Корчагина Н.И. Цитопатогенная
активность клона Г-35 вируса оспы коз в культуре клеток гонад козы.
Материалы конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патологии
свиней, крупного и мелкого рогатого скота», Владимир, 2002 г. - С. 7-12.
18 Кутумбетов Л.Б., Назаров А.С., Хлебопашникова С.В. Результаты
изучения антигенного родства между вирусами оспы овец и оспы коз.
Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные
проблемы ветеринарной медицины Восточной Сибири», посвященной 70-
летию Иркутской НИВС. РАСХН. Иркутск, 2002 г. - С.80-81.
19 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И.,Зиновьева М.С. Результаты
культивирования вируса оспы птиц в перевиваемой культуре клеток ВНК-21.
Материалы международной научно-практической конференции «Биолого-
экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в
патологии сельскохозяйственных животных и людей» РАСХН ВНИИВВиМ.
Покров, 2002 г. - С. 301-303.
20 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И., Манин Б.Л., Зиновьева М.С.,
Михалишин В.В. Получение и использование стабильного производственного
трофоварианта клеток гонад козы для вирусологических исследований.
Материалы международной научно-практической конференции «Биолого-
экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в
патологии сельскохозяйственных животных и людей» РАСХН. ВНИИВВиМ.
Покров, 2002 г. - С. 290-293.
21 Кутумбетов Л.Б., Ковалишина Н.И.,Корпусова Т.И.,Бочарников А.В.
Культивирование вируса оспы птиц. Материалы межведомственного
тематического научного сборника Ветеринарная медицина Академии Аграрной
науки Украины. Харьков, 2002 г. - С.355-359.
22 Кутумбетов Л.Б., Зиновьева М.С., Хлебопашникова С.В., Ковалишина
Н.И. Патогенность и иммуногенность вирусов оспы овец и оспы коз на
гетеровидовых животных. Материалы межведомственного тематического
Page 39
39
научного сборника Ветеринарная медицина Академии Аграрной науки
Украины. Харьков, 2002 г. - С. 359-361.
23 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Клонирование и адаптация вируса оспы
овец из штамма «НИСХИ» к перевиваемой линии культуры клеток. Материалы
5-ой Международной научно-практической конференции «Научное
обеспечение устойчивого развития агропромышленного комплекса Республики
Казахстан, Сибири, Монголии и Республики Беларусь», Абакан, 2002 г. – С.
242-243.
24 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т., Маманова С.Б. Репродукция вируса
оспы овец из штамма «КазНИВИ» в перевиваемой культуре клеток. Материалы
5-ой Международной научно-практической конференции «Научное
обеспечение устойчивого развития агропромышленного комплекса Республики
Казахстан, Сибири, Монголии и Республики Беларусь» Абакан, 2002 г. - С. 243-
244.
25 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т., Абеуов Х.Б. Культивирование вируса
оспы овец в перевиваемых культурах клеток с различной пролиферативной
активностью. Материалы научно-практической конференции «Состояние и
перспективы аграрной науки Казахстана и Западной Сибири» Петропавловск,
2003 г. – С. 251-257.
26 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Назаров А.С. Патогенность вируса
оспы коз. Материалы международной научно-практической конференции
«Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» МСХ
РТ. Таджикский НИВИ. Душанбе, 2003 г. - С. 40-42.
27 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Получение и цитопатогенная активность
клонового вируса оспы овец из модифицированного штамма «НИСХИ»,
Сборник научных трудов «Современные меры борьбы с инфекционными и
инвазионными болезнями сельскохозяйственных животных в Казахстане», ДГП
«НИВИ», Алматы, 2003 г. - С.91-95
28 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р. Методические указания по
культивированию вируса оспы овец. Алматы, 2005 г. – 35 с.
29 Кутумбетов Л.Б. Оценка методов установления биологической
активности вируса оспы птиц. Вестник науки Казахского агротехнического
университета имени С.Сейфуллина. Астана, 2008. -№2 (49). – С. 132-137.
30 Кутумбетов Л.Б. Количественная оценка вирусов оспы овец и оспы коз.
Сборник научных трудов КазНИВИ «Теория и практика борьбы с болезнями
животных в Казахстане». Алматы, 2008. Т. LIV. – С. 259-263. Библ.14.
31 Кутумбетов Л.Б. Технологические параметры культивирования
клоновой популяции модифицированного вируса оспы коз. Вестник науки
Казахского агротехнического университета имени С.Сейфуллина. Астана, 2008.
-№3 (50). – С. 157-162.
32 Кутумбетов Л.Б. Репродуктивная активность вируса оспы птиц в
фибробластах куриных эмбрионов при использовании различных
технологических параметров культивирования. Сборник научных трудов
КазНИВИ «Теория и практика борьбы с болезнями животных в Казахстане».
Алматы, 2008. –Т. LIV. – С. 268-272.
Page 40
40
33 Кутумбетов Л.Б. Способ получения биомассы вируса оспы кур для
изготовления вакцины. Авторское свидетельство РК №21434 от 03.06.2008 г.
34 Кутумбетов Л.Б. Иммуногенность вакцины против оспы птиц
культуральной живой сухой. Материалы международной конференции,
посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. Самара, 2009 г.
- С.256-260.
35 Кутумбетов Л.Б. Технологические основы изготовления вакцины
ассоциированной против оспы и инфекционного энцефаломиелита птиц.
Материалы международной научно-практической конференции «Высшее
образование и аграрная наука – сельскому хозяйству». Семей-Казахстан, 2009 г.
Т.1. – С. 87-90.
36 Кутумбетов Л.Б. Сохраняемость вируса оспы. Результаты.
Исследования. КазНАУ, №1, 2010 г.
37 Кутумбетов Л.Б. Чувствительность к вирусам оспы первичных культур
клеток, полученных из органов животных доноров с разным иммунным
статусом по отношению к указанным возбудителям. Гигиена, эпидемиология и
иммунобиология, №1, 2010 г.
38 Кутумбетов Л.Б. Ассоциированная живая сухая вакцина против оспы
овец и оспы коз. Вестник сельскохозяйственной науки, №5, 2010 г.
39 Кутумбетов Л.Б. Изменчивость вирусов оспы. Вестник науки
Семипалатинского Государственного Университета им. Шакарима №2, 2010 г.
40 Кутумбетов Л.Б. Биологические свойства эпизоотических полевых
изолятов вируса оспы овец. Вестник науки КазНУ имени Аль-Фараби, серия
биологическая, №3, 2010 г.
41 Кутумбетов Л.Б., Мырзахметова Б.Ш. Выделение вируса оспы коз из
организма больных овец. Материалы Республиканской научно-практической
конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в развитие сельского
хозяйства Республики» г.Ташкент. 2010 г.
Page 42
42
Рис. 1 – Оспенные узелки в месте введения вируса оспы коз.
Примечание: Цифрами показаны места внутрикожного введения
десятикратных разведений штамма «Р-4» вируса оспы коз, на выбритой
поверхности кожи козы. Цифры «1,2,3» обозначают последовательные
десятикратные разведения вируса. Стрелками показаны оспенные узелки,
развившиеся вторично (после генерализации оспенного процесса).
Page 43
43
Рис. 2 – Оспенные узелки в месте введения вируса оспы коз.
Примечание: Цифрами показаны места первичного внутрикожного
введения десятикратных разведений штамма «Р-4» вируса оспы коз, на
выбритую поверхность кожи козы. Цифры «4,5,6,7» обозначают
последовательные десятикратные разведения вируса.
Page 44
44
Рис. 3 – Монослой культуры клеток ТЯ-КК49.
Page 45
45
Рис. 4 – Монослой культуры клеток ФКЭ.