3
РЕФЕРАТ
Отчет 63 с., 1 ч., 1 рис., 2 табл., 13 прил.
КОЛЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, ГЕНЕТИЧЕСКИЕ РЕСУРСЫ, ШТАММЫ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО НАЗНАЧЕНИЯ, ГЕНОМНЫЙ ФИНГЕРПРИНТИНГ,
МУЛЬТИСУБСТРАТНОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ
Объект исследования – биоресурсная коллекция «Коллекция полезных микроорганизмов
сельскохозяйственного назначения»
Цель работы – поддержание биоресурсной коллекции «Коллекция полезных
микроорганизмов сельскохозяйственного назначения».
Результаты. В рамках выполнения государственного задания были проведены следующие
работы:
1. Создан технологический паспорт ВКСМ ВНИИСХМ, содержащий:
1.1. полный набор ключевых стандартных операционных процедур (СОП ВКСМ),
обеспечивающих развитие и поддержание коллекционного фонда ВКСМ,
1.2. Научно-техническое обоснование смет стандартных операционных процедур ВКСМ
ВНИИСХМ.
2. Технологический паспорт ВКСМ размещен на интернет- сайте ВКСМ ВНИИСХМ.
3. Экспериментально верифицированы СОПы (и на их основе проведена характеризация
штаммов из коллекции ВКСМ ВНИИСХМ):
3.1. СОП ВКСМ для поддержания единиц хранения, верифицированный на 30 штаммах.
3.2. СОП ВКСМ для контроля качества единиц хранения, верифицированный на 30 штаммах.
3.3. СОП ВКСМ для коррекции нарушения качества единиц хранения, верифицированный
на 30 штаммах.
4. СОП ВКСМ для мультисубстратного тестирование с помощью системы MicroPlate GENIII
BioLog новых изолятов почвенных микроорганизмов (10 штаммов).
5. СОП ВКСМ для проведения генетической паспортизации штаммов с помощью метода
геномного AFLP- фингерпринтинга (10 штаммов).
6. Результаты верификации СОПов записаны в электронную базу ВКСМ
ВНИИСХМ.
7. Электронный каталог коллекции ВКСМ ВНИИСХМ пополнен информацией о 30
штаммах, охарактеризованных согласно СОП ВКСМ.
8. Коллекция ВКСМ ВНИИСХМ зарегистрирована на электронном ресурсе Сетевого центра
Коллекций микроорганизмов ФАНО России.
9. Две публикации, подготовленные на основе материалов коллекции направлены в
рецензируемые журналы (Scopus, WoS), одна из которых принята в печать.
4
СОДЕРЖАНИЕ
Обозначения и сокращения 6
Введение 7
Основная часть 9
1 Общая информация о коллекции 9
2 Краткая информация о проделанной работе в рамках дополнительного госзадания 10
3 Регистрация в государственных информационных системах и финансирование 10
4 Результаты, полученные в рамках дополнительного госзадания 10
Заключение 24
Приложение А Библиографический список публикаций, полученных
в результате выполнения научно-исследовательской работы 25
Приложение Б Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Криоконсервация
штаммов при –150 оС»
27
Приложение В Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Хранение штаммов
при -80оС на Станции низкотемпературного автоматизированного хранения биологических
образцов» 29
Приложение Г Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Стандартные
микробиологические рассевы» 31
Приложение Д Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Световая микроскопия
с использованием микроскопа Axiolab» 33
Приложение Е Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Секвенирование генов
рибосомных РНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl» 34
Приложение Ж Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Поиск гомологичных
последовательностей в базе данных GenBank» 36
Приложение И Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Последовательное
клонирование при загрязнении штаммов» 37
Приложение К Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Секвенирование
генов рибосомных РНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl» 39
Приложение Л Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Повторная
криоконсервация при снижении жизнеспособности штаммов ниже установленного
порога» 41
Приложение М Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Мультисубстратное
тестирование с помощью системы MicroPlate GENIII BioLog» 43
5
Приложение Н Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Проведение
генетической паспортизации штаммов с помощью метода геномного AFLP-
фингерпринтинга» 45
Приложение П Идентификация штаммов с помощью метода секвенирования
16S rDNA 47
6
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
ПЦР – полимеразная цепная реакция
AFLP – amplified fragment length polymorphism
BLAST - Basic logical alignment search tool
7
ВВЕДЕНИЕ
Биоресурсные коллекции в настоящее время рассматриваются, как важный компонент
научной инфраструктуры, поддерживаемой ФАНО России с целью повышения
эффективности научных исследований и разработок. В связи с этим расширение фонда
ВКСМ за счет новых штаммов сельскохозяйственных микроорганизмов и получение новой
информации о них является актуальной задачей, решение которой будет способствовать
повышению эффективности использования генетических ресурсов микроорганизмов в
сельскохозяйственных биотехнологиях.
Цель работы – поддержание биоресурсной коллекции «Коллекция полезных
микроорганизмов сельскохозяйственного назначения».
Задачи:
1. Создать технологический паспорт ВКСМ ВНИИСХМ, содержащий:
1.1. полный набор ключевых стандартных операционных процедур (СОП ВКСМ),
обеспечивающих развитие и поддержание коллекционного фонда ВКСМ,
1.2. Научно-техническое обоснование смет стандартных операционных процедур ВКСМ
ВНИИСХМ.
2. Разместить технологический паспорт ВКСМ на интернет- сайте ВКСМ ВНИИСХМ.
3. Экспериментально верифицировать СОПы (и на их основе провести характеризацию
штаммов из коллекции ВКСМ ВНИИСХМ):
3.1. СОП ВКСМ для поддержания единиц хранения, верифицированный на 30 штаммах.
3.2. СОП ВКСМ для контроля качества единиц хранения, верифицированный на 30 штаммах.
3.3. СОП ВКСМ для коррекции нарушения качества единиц хранения, верифицированный
на 30 штаммах.
4. Разработать СОП ВКСМ для мультисубстратного тестирование с помощью системы
MicroPlate GENIII BioLog новых изолятов почвенных микроорганизмов (10 штаммов).
5. Разработать СОП ВКСМ для проведения генетической паспортизации штаммов с
помощью метода геномного AFLP- фингерпринтинга (10 штаммов).
6. Записать результаты верификации СОПов в электронную базу ВКСМ
ВНИИСХМ.
7. Пополнить электронный каталог коллекции ВКСМ ВНИИСХМ информацией о 30
штаммах, охарактеризованных согласно СОП ВКСМ.
8. Зарегистрировать коллекцию ВКСМ ВНИИСХМ на электронном ресурсе Сетевого центра
Коллекций микроорганизмов ФАНО России.
8
9. Подготовить на основе материалов коллекции две публикации, направленные в
рецензируемые журналы (Scopus, WoS), одна из которых должна быть принята в печать.
10. Подготовить календарный план работ по выполнению дополнительного
государственного задания.
11. Разместить отчет о проделанной работе в рамках дополнительного государственного
задания на интернет-сайте коллекции ВКСМ ВНИИСХМ с указанием ссылки на номер
заключенного с ФАНО России соглашения на выполнение дополнительного
государственного задания.
В целом, поставленные цели и задачи дают необходимую базу для функционирования
биоресурсной коллекции «Коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного
назначения».
Настоящий отчет является заключительным по теме «Расширение и инвентаризация фонда
Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения»
за 2017 год.
9
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
1 Общая информация о коллекции
1.1 Название коллекции: «Коллекция полезных микроорганизмов
сельскохозяйственного назначения».
1.2 Наименование организации ФАНО России – держателя коллекции (если организация
прошла реорганизацию в 2017г, то указать старое и новое название): Федеральное
государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-
исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» (ФГБНУ ВНИИСХМ).
1.3 Регистрационный номер биоресурсной коллекции в информационной системе
«Парус» ФАНО России: 664.00.Х6800
1.4 Направление ФНИ: Земледелие. 144. Молекулярно-генетические основы интеграции
микроорганизмов и растений с целью создания эффективных растительно-микробных систем
и новых биопрепаратов с полифункциональными свойствами, обеспечивающих оптимальное
питание растений, высокую продуктивность и качество продукции.
1.5 Руководитель коллекции, поддерживающий коллекцию: Сафронова Вера Игоревна,
заведующая ВКСМ, к.б.н., [email protected], тел. раб. (812)4705100, тел. моб.
8(911)9721387
1.6 Назначение коллекции: Аккумуляция и долгосрочное хранение генетических
ресурсов сельскохозяйственных микроорганизмов, изучение их биоразнообразия. Разработка
методов генетической паспортизации штаммов, а также способов контроля за качеством
производимых микробных препаратов.
1.7 Регистрация коллекции в перечне ЦКП/УНУ «Современная исследовательская
инфраструктура Российской Федерации»: Есть
1.8 Наименование, реестровый номер и адрес ЦКП/УНУ: http://ckp-rf.ru/usu/77731/
1.9 Дата образования коллекции: 2010
1.10 Отражение коллекционной деятельности в Уставе организации: Есть; 21.1 Поиск,
выделение и конструирование новых микроорганизмов сельскохозяйственного назначения,
их депонирование, систематизация и долгосрочное хранение национальных
микробиологических ресурсов.
1.11 Положение о коллекции, утвержденное на Ученом совете организации: Выписка из
Протокола №9 заседания Ученого Совета ГНУ ВНИИСХМ от 2 сентября 2010 г.
1.12 Адрес WEB-сайта организации, на котором представлена информация о коллекции
http://arriam.ru/kollekciya-kul-tur1/
10
2 Краткая информация о проделанной работе в рамках дополнительного госзадания
2.1 Текст Отчета представлен на:
а) WEB-сайте организации: http://arriam.ru/kollekciya-kul-tur1/
б) Информационном портале БРК
http://www.biores.cytogen.ru/brc_cells/collections/ICGSBRAS_CELLS
2.2 Содержание основных результатов работы по дополнительному госзаданию в
соответствии с ПФНИ ГАН: новые штаммы микроорганизмов и их консорциумы для
создания биопрепаратов, методология и технологии хранения и использования
микроорганизмов, методы и технологии производства и способы применения биопрепаратов.
3 Регистрация в государственных информационных системах и финансирование
3.1 Регистрационный номер дополнительного госзадания по БРК в информационной
системе «Парус» ФАНО России: 0664-2017-0001
3.2 Регистрационный номер дополнительного госзадания по БРК в информационной
системе ЦИТИС: АААА-А17-117121140082-4
3.3 Отчет по дополнительному госзаданию 0664-2017-0001 подготовлен и загружен в
систему Парус.
3.4 Отчет по дополнительному госзаданию АААА-А17-117072000117-1 подготовлен и
загружен в систему ЦИТИС.
4 Результаты, полученные в рамках дополнительного госзадания
4.1 Создан технологический паспорт ВКСМ ВНИИСХМ, содержащий:
4.1.1 полный набор ключевых стандартных операционных процедур (СОП ВКСМ),
обеспечивающих развитие и поддержание коллекционного фонда ВКСМ,
4.1.2 научно-техническое обоснование смет стандартных операционных процедур ВКСМ
ВНИИСХМ.
4.2 Технологический паспорт ВКСМ размещен на интернет-сайте ВКСМ ВНИИСХМ
http://arriam.ru/kollekciya-kul-tur1/. СОПы находятся в Приложениях Б–М, ниже приведены
их названия:
11
Приложение Б Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Криоконсервация
штаммов при –150 оС»
Приложение В Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Хранение штаммов
при -80оС на Станции низкотемпературного автоматизированного хранения биологических
образцов»
Приложение Г Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Стандартные
микробиологические рассевы»
Приложение Д Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Световая микроскопия
с использованием микроскопа Axiolab»
Приложение Е Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Секвенирование генов
рибосомных РНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl»
Приложение Ж Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Поиск гомологичных
последовательностей в базе данных GenBank»
Приложение И Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Последовательное
клонирование при загрязнении штаммов»
Приложение К Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Секвенирование
генов рибосомных РНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl»
Приложение Л Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Повторная
криоконсервация при снижении жизнеспособности штаммов ниже установленного порога»
Приложение М Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Мультисубстратное
тестирование с помощью системы MicroPlate GENIII BioLog»
Приложение Н Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ «Проведение
генетической паспортизации штаммов с помощью метода геномного AFLP-
фингерпринтинга»
Для обоснования смет стандартных операционных процедур и расчета общей стоимости
работ, обеспечивающих развитие и поддержание коллекции ВКСМ, были собраны данные об
оплате труда, приобретении материалов, расходах на содержание оборудования,
коммунальных и иных затратах, необходимых для выполнения работ по перечисленным
ниже направлениям деятельности коллекции:
1) Выполнение стандартных операционных процедур (СОП).
2) Общее содержание коллекции.
Собранные данные были использованы для расчета стоимости выполнения 10 СОП,
величины накладных расходов на содержание коллекции и необходимого годового объема
финансирования. Обобщенный пример расчета стоимости СОП приведен в таблице 1.
12
Таблица 1 – Расчет стоимости СОП «Криоконсервация штаммов при –150 оС»
№,
п/п
Статья расходов Сумма, руб.
1 Оплата труда 592,33
2 Приобретение материалов 1128,20
3 Иные затраты –
4 Содержание оборудования 476,81
Итого: 2197,34
Расчеты проводились в соответствии моделью и методикой оценки, разработанными ИЦиГ
СО РАН в рамках выполнения дополнительного государственного задания по теме:
«Разработка модели финансового управления сохранением и рациональным использованием
биоресурсов в рамках функционирования биоресурсных научных коллекций». Полный набор
данных представлен на портале «Биоресурсные коллекции ФАНО России».
4.3 Экспериментально верифицированы СОПы (и на их основе проведена характеризация
штаммов из коллекции ВКСМ ВНИИСХМ):
4.3.1 СОП ВКСМ для поддержания единиц хранения, верифицированный на 30 штаммах и
включающий:
4.3.1.1 Криоконсервацию штаммов при –150 оС.
Криоконсервацию штаммов проводили по следующей методике:
Приготовить по 200 мл питательных сред (г/л) – 3 вымытых и высушенных культуральных
флакона: Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар -
20. Стерилизация 30 минут при 120 оС. Мясо-пептонный бульон: ГМФ бульон – 20.
Стерилизация 30 минут при 120 оС. Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 минут при
120оС.
Разлить 10 чашек Петри с МПА или R2A (в зависимости от вида штамма) - по 20 мл в
чашку.
Разлить 5 пробирок Falcon 15 мл с ГМФ бульоном – по 10 мл в пробирку.
Культивировать штамм микроорганизма при 28 оС в течение 3 суток (до стационарной фазы
роста) – 1 чашка, 1 микробиологическая петля.
13
Суспензировать полученную биомассу в ГМФ бульоне (титр суспензии 108-10
9 кл/мл) – 1
пробирка Falcon 15 мл, 4 микробиологические петли.
Добавить к суспензии стерильный глицерин Ultra Pure Grade – 2 мл глицерина, 1 наконечник.
Выдержать суспензию 40 мин при комнатной температуре.
Приготовить последовательные 10-кратные разведения суспензии – 4 пробирки Falcon 15 мл,
4 наконечника.
Высеять из каждого разведения по 100 мкл на 2 чашки Петри – 8 чашек, 1 наконечник.
Культивировать чашки Петри при 28 оС в течение 2-10 суток до появления отдельных
колоний.
Расфасовать суспензию в стерильные криопробирки на 1,5 мл (в криокоробках) - 4
криопробирки, 1 наконечник.
Разместить пробирки в морозильную камеру на –150 оС.
По прошествии 1 суток переместить 2 криопробирки на 1,5 мл в морозильную камеру на
–80оС.
В результате верификации 30 штаммов из коллекции ВКСМ (таблица 2)
криоконсервированы при –150 оС.
Таблица 2 - Штаммы, использованные в работе для верификации СОП ВКСМ
Оригиналь
ный номер
штамма
Номер
штамма в
коллекции
ВКСМ
Использование штамма в СОП
1 2 3 4 5
T1Ks14 RCAM 04487 + + - + -
T1Ks19 RCAM 04488 + + - + -
T1Kr02 RCAM 04486 + + - + -
K2Kn02 RCAM 04485 + + - + -
CУГ-3 RCAM 04696 + + - + -
HP4 RCAM 04651 + + - + -
EG1QL3 RCAM 04635 + + - + -
EG2QL8 RCAM 04650 + + - + -
EG3QL57 RCAM 04649 + + - + -
RU5S2 RCAM 04636 + + - + -
495 RCAM 04611 + + - - -
496 RCAM 04612 + + - - -
14
Продолжение таблицы 2
498 RCAM 04614 + + - - -
500 RCAM 04616 + + - - -
503 RCAM 04619 + + - - -
504 RCAM 04620 + + - - -
505 RCAM 04670 + + - - -
506 RCAM 04671 + + - - -
508 RCAM 04673 + + - - -
510 RCAM 04675 + + - - -
512 RCAM 04677 + + - - -
514 RCAM 04679 + + - - -
515 RCAM 04680 + + - - -
Изолят 1 RCAM 04637 + + - - -
Изолят 2 RCAM 04638 + + - - -
Изолят 3 RCAM 04639 + + - - -
Изолят 4 RCAM 04640 + + - - -
Изолят 5 RCAM 04641 + + - - -
SH RCAM 04652 + + - - -
DPRK-17 RCAM 04578 + + - - -
0203 RCAM 0203 - - + - -
0206 RCAM 0206 - - + - -
0418 RCAM 0418 - - + - -
0419 RCAM 0419 - - + - -
0610 RCAM 0610 - - + - -
0616 RCAM 0616 - - + - -
0626 RCAM 0626 - - + - -
0702 RCAM 0702 - - + - -
0706 RCAM 0706 - - + - -
0716 RCAM 0716 - - + - -
1026 RCAM 1026 - - + - -
1076 RCAM 1076 - - + - -
1326 RCAM 1326 - - + - -
1361 RCAM 1361 - - + - -
1365 RCAM 1365 - - + - -
15
Продолжение таблицы 2
1610 RCAM 1610 - - + - -
1614 RCAM 1614 - - + - -
1723 RCAM 1723 - - + - -
1750 RCAM 1750 - - + - -
1761 RCAM 1761 - - + - -
1801 RCAM 1801 - - + - -
1802 RCAM 1802 - - + - -
2102 RCAM 2102 - - + - -
2110 RCAM 2110 - - + - -
2490 RCAM 2490 - - + - -
24100 RCAM 24100 - - + - -
2707 RCAM 2707 - - + - -
2720 RCAM 2720 - - + - -
2802 RCAM 2802 - - + - -
2908 RCAM 2908 - - + - -
LB_1 - - - - - +
LB_2 - - - - - +
LB_3 - - - - - +
LB_4 - - - - - +
LB_7 - - - - - +
LB_8 - - - - - +
LB_9 - - - - - +
LB_10 - - - - - +
LB_11 - - - - - +
LB_12 - - - - - +
Примечание – Использованы следующие обозначения:
1 - СОП ВКСМ для поддержания единиц хранения (30 штаммов).
2 - СОП ВКСМ для контроля качества единиц хранения (30 штаммов).
3 -СОП ВКСМ для коррекции нарушения качества единиц хранения (30 штаммов).
4 -СОП ВКСМ для мультисубстратного тестирование с помощью системы MicroPlate GENIII BioLog новых
изолятов почвенных микроорганизмов (10 штаммов).
5 -СОП ВКСМ для проведения генетической паспортизации штаммов с помощью метода геномного AFLP-
фингерпринтинга (10 штаммов).
+ штамм использован для верификации СОП, - штамм не использован для верификации СОП
16
4.3.1.2 Хранение штаммов при -80 оС на Станции низкотемпературного автоматизированного
хранения биологических образцов.
Хранение штаммов осуществляли по следующей методике:
Приготовить по 40 мл питательных сред (г/л) – 2 вымытых и высушенных культуральных
флакона: Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар - 20.
Стерилизация 30 мин, 120 оС. Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 мин, 120
оС.
Разлить 1 чашку Петри с МПА или R2A (в зависимости от вида штамма) – 20 мл.
Разлить 3 пробирки Falcon 15 мл с МПА или R2A (в зависимости от вида штамма) - по 6 мл
в пробирку.
Выгрузить микропробирку с 2D баркодом из Станции низкотемпературного
автоматизированного хранения биологических образцов.
Разморозить ее при 37 оС в течение 3 мин.
Высеять суспензию на 1 чашку Петри и культивировать при 28 оС в течение 3 суток.
Зафиксировать наличие роста и пересеять биомассу на пробирки Falcon 15 мл – 3 пробирки,
1 микробиологическая петля.
Культивировать 3 пробирки Falcon 15 мл при 28 оС в течение 3 суток.
Хранить пробирки Falcon 15 мл при +4 оС.
В результате верификации 30 штаммов из коллекции ВКСМ (таблица 2) размещены на
долгосрочное хранение при –80 оС на Станции низкотемпературного автоматизированного
хранения биологических образцов.
4.3.2 СОП ВКСМ для контроля качества единиц хранения, верифицированный на 30
штаммах и включающий:
4.3.2.1 Стандартные микробиологические рассевы.
Стандартные микробиологические рассевы проводили по следующей методике:
Приготовить 200 мл питательной среды (г/л), в зависимости от вида штамма – 1 вымытый и
высушенный культуральный флакон: Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ
бульона – 20, агар-агар - 20. Стерилизация 30 мин, 120 оС. Среда R2A: R2A agar – 15.
Стерилизация 30 минут при 120 оС.
Приготовить 50 мл мясо-пептонного бульона (г/л): ГМФ бульон – 20. Стерилизация 30 мин,
120 оС.
Разлить 10 чашек Петри с МПА или R2A - по 20 мл в чашку.
Разлить 4 пробирки Falcon 15 мл с ГМФ бульоном – по 10 мл в пробирку.
17
Выгрузить микропробирку с 2D баркодом из Станции низкотемпературного
автоматизированного хранения биологических образцов (или достать криопробирку из
морозильной камеры).
Разморозить микропробирку (или криопробирку) при 37 оС в течение 3 мин.
Отобрать 100 мкл суспензии в пробирку Falcon 15 мл – 1 пробирка Falcon 15 мл, 1
наконечник.
Приготовить последовательные 10-кратные разведения суспензии – 4 пробирки Falcon 15 мл,
4 наконечника.
Высеять из каждого разведения по 100 мкл на 2 чашки Петри – 8 чашек, 1 наконечник.
Культивировать чашки Петри при 28 оС в течение 2-10 суток до появления отдельных
колоний.
После появления отдельных колоний на чашках Петри подсчитать титр замороженных
суспензий в процессе хранения (Тхр).
Расчитать процент выживаемости для криоконсервированной культуры как Тхр /Тисх х 100%.
Пул из 10 – 20 колоний штамма пересеять на чашки Петри – 2 чашки, 1 микробиологическая
петля.
Культивировать штамм микроорганизма при 28 оС в течение 2 суток.
Хранить штамм микроорганизма при +4оС.
В результате верификации 30 штаммов из коллекции ВКСМ (таблица 2) проведены через
процедуру стандартных микробиологических рассевов.
4.3.2.2 Световая микроскопия с использованием микроскопа Axiolab.
Микроскопию проводили по следующей методике:
Нанести на предметное стекло каплю воды и внести биомассу клеток.
Тщательно перемешать.
Накрыть препарат покровным стеклом, избегая образования воздушных пузырей.
Для микроскопии использовать увеличение, соответствующее размеру объекта и целям
исследования.
Зафиксировать следующие характеристики образца: однородность, размер и форму клеток
(кокки, удлиненные или укороченные палочки), наличие форму и расположение спор
(центральное, апикальное), подвижность клеток (хаотичное или направленное движение).
В результате верификации 30 штаммов из коллекции ВКСМ (таблица 2) проверены с
помощью световой микроскопии с использованием микроскопа Axiolab.
18
4.3.2.3 Секвенирование генов рибосомных РНК на генетическом анализаторе ABI PRISM
3500xl.
Секвенирование проводили по следующей методике:
Приготовить 10 мл жидкой питательной среды R2A (г/л) – 1 культуральный флакон: R2A
бульон – 15. Стерилизация 30 мин, 120 оС.
Разлить 1 пробирку Falcon 15 мл с R2A бульоном – 10 мл в пробирку.
Засеять пробирку штаммом и культивировать на качалке при 28 оС в течение 1-3 суток – 1
микробиологическая петля.
Отобрать 5 мл суспензии и использовать для выделения ДНК набор для выделения геномной
ДНК (Fermentas) из различных источников в соответствии с рекомендациями производителя
– 1 реакция, 5 наконечников.
Для амплификации использовать 50 нг выделенной ДНК, смесь для проведения ПЦР,
включающую специфические праймеры и Taq-полимеразу – 1 реакция, 2 ед Taq-полимеразы,
5 наконечников.
ПЦР проводить в планшетах для проведения полимеразной цепной реакции – 1 планшет на
96 реакций, 1 наконечник.
Оценку результата проводить в агарозном 1,5% геле с участием маркера длины ДНК
GeneRuler™ 1 kb Plus (75-20 000 п.н.) – 1 г агарозы; 2,5 мкг маркера; 2 наконечника.
Для выделения из геля и очистки ДНК использовать набор для выделения ДНК из агарозного
геля и очистки продуктов ПЦР PureLink Combo – 1 реакция, 3 наконечника.
Секвенирование проводить на генетическом анализаторе ABI 3500xl с использованием
набора для очистки продуктов секвенирования BigDye Xterminator и универсального
полимера POP-7 – 1 набор BigDye Xterminator на 2500 реакций, 1 уп. полимера на 960
реакций, 4 наконечника.
В результате верификации для 30 штаммов из коллекции ВКСМ (таблица 2) получены
нуклеотидные последовательности генов рибосомных РНК, которые приведены в
Приложении П.
4.3.2.4 Поиск гомологичных последовательностей в базе данных GenBank.
Поиск гомологичных последовательностей проводили по следующей методике:
Выверенные последовательности ДНК анализировать с помощью базы данных NCBI
GenBank и программы BLAST, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov.
Для конструирования филогенетического дерева применять программу MEGA5 и метод
Neighbor-Joining (модель Maximum Composite Likelihood).
19
Для оценки уровней поддержки кластеров проводить бутстреп-анализ на основе 1000
повторов.
В результате верификации 30 штаммов из коллекции ВКСМ (таблица 2)
идентифицированы с помощью поиска гомологичных последовательностей в базе
данных GenBank (Приложение П).
4.3.3 СОП ВКСМ для коррекции нарушения качества единиц хранения, верифицированный
на 30 штаммах и включающий:
4.3.3.1 Последовательное клонирование при загрязнении штаммов.
Клонирование проводили по следующей методике:
Приготовить по 200 мл питательных сред (г/л) – 3 вымытых и высушенных культуральных
флакона: Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар - 20.
Стерилизация 30 минут при 120 оС. Мясо-пептонный бульон: ГМФ бульон – 20.
Стерилизация 30 минут при 120 оС. Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 минут при
120оС.
Разлить 20 чашек Петри с МПА и R2A - по 20 мл в чашку.
Разлить 10 пробирок Falcon 15 мл с ГМФ бульоном – по 10 мл в пробирку.
Культивировать штамм микроорганизма при 28 оС в течение 2 суток – 1 чашка, 1
микробиологическая петля.
Суспензировать полученную биомассу в ГМФ бульоне (титр суспензии 107-10
8 кл/мл) – 1
пробирка Falcon 15 мл, 1 микробиологическая петля.
Приготовить последовательные 10-кратные разведения суспензии – 4 пробирки Falcon 15 мл,
4 наконечника.
Высеять из каждого разведения по 100 мкл на 4 чашки Петри – 16 чашек, 2 наконечника.
Культивировать 8 чашек Петри с R2A при 28 оС в течение 2-10 суток до появления
отдельных колоний.
Культивировать 8 чашек Петри с МПА при 37 оС в течение 3 суток до появления отдельных
колоний.
Колонию очищенного штамма последовательно клонировать истощающим посевом на
чашках Петри – 2 чашки, 6 микробиологических петель.
Пул из 10 – 20 колоний очищенного штамма пересеять на чашку Петри – 1 чашка, 2
микробиологические петли.
Культивировать штамм микроорганизма при 28 оС в течение 2 суток.
Хранить штамм микроорганизма при +4оС.
20
В результате верификации 30 штаммов из коллекции ВКСМ (таблица 2) проведены
через процедуру последовательного клонирования для контроля загрязнения штаммов.
4.3.3.2 Секвенирование генов рибосомных РНК на генетическом анализаторе ABI PRISM
3500xl (Life Technologies, США).
Методика описана в п. 3.2.3. В результате верификации для 30 штаммов из коллекции ВКСМ
(таблица 2) получено подтверждение их таксономического статуса.
4.3.3.3 Повторная криоконсервация при снижении жизнеспособности штаммов ниже
установленного порога.
Повторная криоконсервация проводилась по следующей методике:
Приготовить по 200 мл питательных сред (г/л) – 3 вымытых и высушенных культуральных
флакона: Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар - 20.
Стерилизация 30 мин, 120оС. Мясо-пептонный бульон: ГМФ бульон – 20. Стерилизация 30
мин, 120оС. Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 мин, 120
оС.
Разлить 10 чашек Петри с МПА или R2A - по 20 мл в чашку.
Разлить 5 пробирок Falcon 15 мл с ГМФ бульоном – по 10 мл в пробирку.
Культивировать штамм микроорганизма при 28 оС в течение 3 суток (до стационарной фазы
роста) – 1 чашка, 1 микробиологическая петля.
Суспензировать полученную биомассу в ГМФ бульоне (титр суспензии 108-10
9 кл/мл) – 1
пробирка Falcon 15 мл, 4 микробиологические петли.
Добавить к суспензии стерильный глицерин Ultra Pure Grade – 2 мл глицерина, 1 наконечник.
Выдержать суспензию 40 мин при комнатной температуре.
Приготовить последовательные 10-кратные разведения суспензии – 4 пробирки Falcon 15 мл,
4 наконечника.
Высеять из каждого разведения по 100 мкл на 2 чашки Петри – 8 чашек, 1 наконечник.
Культивировать чашки Петри при 28 оС в течение 2-10 суток до появления отдельных
колоний.
Расфасовать суспензию в стерильные криопробирки на 1,5 мл (в криокоробках) и
микропробирки с 2D баркодом на 300 мкл (в планшетах) - 2 криопробирки, 12
микропробирок, 2 наконечника.
Разместить 2 криопробирки в морозильную камеру на –80 оС, 12 микропробирок – в
Станцию низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов.
В результате верификации 30 штаммов из коллекции ВКСМ (таблица 2) проведена их
повторная криоконсервация после снижения жизнеспособности.
21
4.4 СОП ВКСМ для мультисубстратного тестирование с помощью системы MicroPlate
GENIII BioLog новых изолятов почвенных микроорганизмов (10 штаммов).
Тестирование проводилось по следующей методике:
Приготовить по 40 мл питательных сред (г/л) – 2 вымытых и высушенных культуральных
флакона:
Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар - 20.
Стерилизация 30 мин, 120 оС.
Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 мин, 120 оС.
Разлить 1 чашку Петри с МПА или R2A (в зависимости от вида штамма) – 20 мл.
Высеять штамм на чашку Петри и культивировать при 28 оС в течение 2 суток.
Биомассу использовать для приготовления суспензий в инокулирующих жидкостях IF-AB с
использованием турбидиметра – 1 пробирка.
Приготовленные суспензии по 100 мкл разнести в лунки 96-луночных микропланшетов ID
Microplate (BioLog) – 1 микропланшет, 1 наконечник к дозатору Ovation.
Микропланшет инкубировать при 33 оС в течение 1 - 7 суток.
Результат инкубирования в виде наличия (+) или отсутствия (-) окрашивания каждой лунки
проанализировать с помощью компьютерной программы MicroLogMSystem.
В результате верификации 10 штаммов из коллекции ВКСМ (таблица 2) изучены с
помощью системы MicroPlate GENIII BioLog.
4.5 СОП ВКСМ для проведения генетической паспортизации штаммов с помощью метода
геномного AFLP- фингерпринтинга (10 штаммов).
Паспортизация проводилась по следующей методике:
Приготовить 10 мл жидкой питательной среды R2A (г/л) – 1 культуральный флакон: R2A
бульон – 15. Стерилизация 30 мин, 120 оС.
Разлить 1 пробирку Falcon 15 мл с R2A бульоном – 10 мл в пробирку.
Засеять пробирку штаммом и культивировать на качалке при 28 оС в течение 1-3 суток – 1
микробиологическая петля.
Отобрать 5 мл суспензии и использовать для выделения ДНК набор для выделения геномной
ДНК (Fermentas) из различных источников в соответствии с рекомендациями производителя
– 1 реакция, 5 наконечников.
Выделенную геномную ДНК (50 нг) использовать для реакции рестрикции с помощью
рестриктаз MseI и EcoRI - по 2,5 ед, 4 наконечника.
Реакцию проводить при 37 оС в течение 16 часов.
22
Для амплификации использовать 4 мкл реакционной смеси, смесь для проведения ПЦР,
включающую специфические праймеры и Taq-полимеразу – 1 реакция, 2 ед Taq-полимеразы,
5 наконечников.
ПЦР проводить в планшетах для проведения полимеразной цепной реакции – 1 планшет на
96 реакций, 1 наконечник.
Первичную оценку результата проводить в агарозном 1,5% геле с участием маркера длины
ДНК GeneRuler™ 1 kb Plus (75-20 000 п.н.) – 1 г агарозы; 2,5 мкг маркера; 2 наконечника.
Финальную амплификацию проводить в условиях автоматического капиллярного
электрофореза на генетическом анализаторе ABI 3500xl с использованием интернального
стандарта молекулярного веса GeneScan TM 600 LIZ и универсального полимера POP-7 – 1
уп. стандарта на 800 реакций, 1 уп. полимера на 960 реакций, 2 наконечника.
Файлы, полученные после электрофоретического разделения фрагментов и содержащие
«кривые», соответствующие фрагментам AFLP (FAM) и стандарту молекулярного веса (LIZ)
анализировать с помощью программы Bionumerics для определения точного размера AFLP-
фрагментов.
В результате верификации 10 штаммов из коллекции ВКСМ (таблица 2) изучены с помощью
метода геномного AFLP- фингерпринтинга. На рисунке 1 представлены профили фрагментов
ДНК.
Рисунок 1 - Профили штаммов, использованных при верификации СОП ВКСМ для
проведения генетической паспортизации штаммов с помощью метода геномного AFLP-
фингерпринтинга
Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%] ABI
100 8
0 60
40
ABI
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
LB_1
LB_8
LB_4
LB_13
LB_7
LB_11
LB_3
LB_9
LB_10
LB_12
23
4.6 Результаты верификации СОПов записаны в электронную базу ВКСМ
ВНИИСХМ.
4.7 Электронный каталог коллекции ВКСМ ВНИИСХМ пополнен информацией о 30
штаммах, охарактеризованных согласно СОП ВКСМ.
4.8 Коллекция ВКСМ ВНИИСХМ зарегистрирована на электронном ресурсе Сетевого центра
Коллекций микроорганизмов ФАНО России.
4.9 Две публикации, подготовленные на основе материалов коллекции направлены в
рецензируемые журналы (Scopus, WoS), одна из которых принята в печать.
4.10 Составлен календарный план работ по выполнению дополнительного
государственного задания.
4.11 Отчета о проделанной работе в рамках дополнительного государственного задания
размещен на интернет- сайте коллекции с указанием ссылки на номер заключенного с
ФАНО России соглашения на выполнение дополнительного государственного задания.
24
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате работы:
1. Получен Технологический паспорт ВКСМ ВНИИСХМ, содержащий: 1.1. полный набор
ключевых стандартных операционных процедур (СОП ВКСМ), обеспечивающих развитие и
поддержание коллекционного фонда ВКСМ, 1.2. Научно-техническое обоснование смет
стандартных операционных процедур ВКСМ ВНИИСХМ.
2. Технологический паспорт ВКСМ размещен на интернет- сайте ВКСМ ВНИИСХМ.
3. Экспериментально верифицированы СОПы (и на их основе проведена характеризация
штаммов из коллекции ВКСМ ВНИИСХМ): 3.1. СОП ВКСМ для поддержания единиц
хранения, верифицированный на 30 штаммах, 3.2. СОП ВКСМ для контроля качества
единиц хранения, верифицированный на 30 штаммах, 3.3. СОП ВКСМ для коррекции
нарушения качества единиц хранения, верифицированный на 30 штаммах.
4. СОП ВКСМ для мультисубстратного тестирование с помощью системы MicroPlate GENIII
BioLog новых изолятов почвенных микроорганизмов (10 штаммов).
5. СОП ВКСМ для проведения генетической паспортизации штаммов с помощью метода
геномного AFLP- фингерпринтинга (10 штаммов).
6. Результаты верификации СОПов записаны в электронную базу ВКСМ
ВНИИСХМ.
7. Электронный каталог коллекции ВКСМ ВНИИСХМ пополнен информацией о 30
штаммах, охарактеризованных согласно СОП ВКСМ.
8. Коллекция ВКСМ ВНИИСХМ зарегистрирована на электронном ресурсе Сетевого центра
Коллекций микроорганизмов ФАНО России.
9. Две публикации, подготовленные на основе материалов коллекции направлены в
рецензируемые журналы (Scopus, WoS), одна из которых принята в печать.
10. Подготовлен календарный план работ по выполнению дополнительного
государственного задания.
11. Отчет о проделанной работе в рамках дополнительного государственного задания
размещен на интернет-сайте коллекции с указанием ссылки на номер заключенного с
ФАНО России соглашения на выполнение дополнительного государственного задания.
Поставленные задачи выполнены в полном объеме.
25
ПРИЛОЖЕНИЕ А
Библиографический список публикаций, полученных
в результате выполнения научно-исследовательской работы
1. Кимеклис А.К., Кузнецова И.Г., Сазанова А.Л., Сафронова В.И., Белимов А.А.,
Онищук О.П., Курчак О.Н., Аксёнова Т.С., Пинаев А.Г., Андронов Е.Е., Проворов Н.А.
Дивергентная эволюция симбиотических бактерий: ризобии реликтового бобового Vavilovia
formosa формируют обособленную группу в пределах вида Rhizobium leguminosarum bv.
viciae // Генетика. В печати.
2. Safronova V.I., Belimov A.A., Sazanova A.L., Chirak E.R., Verkhozina A.V., Kuznetsova
I.G., Andronov E.E., Puhalsky J.V., Tikhonovich I.A. Taxonomically different co-microsymbionts
of a relic legume Oxytropis popoviana have complementary sets of symbiotic genes and together
increase the efficiency of plant nodulation // MPMI. Under review.
26
27
ПРИЛОЖЕНИЕ Б
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Криоконсервация штаммов при –150 оС»
Составлено: к.б.н. зав. лаб., В.И. Сафронова, к.б.н., ст.н.с., Ж.П. Попова
Содержание и назначение: определяет протокол криоконсервации штаммов при –150 оС
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Морозильник низкотемпер. MDF-1156ATN
- Весы лабораторные ВК-300
- Стерилизатор паровой Touchclave-Lab 200л
- Термостат суховоздушный BD240, Binder
- Машина для мойки лабораторной посуды в к-те FlaskScrubber
- Шкаф сушильный ШСС-250
- Бокс биологической безопасности LA-4A1 ESCO
- Дозатор автоклавируемый одноканальный HTL переменного объема
- Низкотемпературное устройство для хранения биоматериала с мониторингом
температурного режима MDF-U73V Sanyо
- ГМФ-агар. Питательный агар на основе гидролизата мяса
- Агар-агар микробиологический импортный
- Наконечники полимерные одноразовые Finntip для медицинских пипеток: 2000-10000 мкл
- ГМФ-бульон. Питательный бульон на основе гидролизата мяса
- Петли микробиологические, 5 шт/уп
- R2A агар
- Глицерин Ultra Pure Grade
- Чашки Петри
- Пробирки типа Falcon 15 мл
- Криопробирки объемом 1,5 мл
- Флаконы культуральные
28
Подготовка материалов
1. Приготовить по 200 мл питательных сред (г/л) – 3 вымытых и высушенных
культуральных флакона:
1.1 Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар - 20.
Стерилизация 30 минут при 120оС.
1.2 Мясо-пептонный бульон: ГМФ бульон – 20. Стерилизация 30 минут при 120оС.
1.3 Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 минут при 120оС.
2. Разлить 10 чашек Петри с МПА или R2A (в зависимости от вида штамма) - по 20 мл
в чашку.
3. Разлить 5 пробирок Falcon 15 мл с ГМФ бульоном – по 10 мл в пробирку.
4. Культивировать штамм микроорганизма при 28оС в течение 3 суток (до стационарной
фазы роста) – 1 чашка, 1 микробиологическая петля.
5. Суспензировать полученную биомассу в ГМФ бульоне (титр суспензии 108-10
9 кл/мл) – 1
пробирка Falcon 15 мл, 4 микробиологические петли.
6. Добавить к суспензии стерильный глицерин Ultra Pure Grade – 2 мл глицерина, 1
наконечник.
7. Выдержать суспензию 40 мин при комнатной температуре.
8. Приготовить последовательные 10-кратные разведения суспензии – 4 пробирки Falcon 15
мл, 4 наконечника.
9. Высеять из каждого разведения по 100 мкл на 2 чашки Петри – 8 чашек, 1 наконечник.
10. Культивировать чашки Петри при 28оС в течение 2-10 суток до появления отдельных
колоний.
11. Расфасовать суспензию в стерильные криопробирки на 1,5 мл (в криокоробках) - 4
криопробирки, 1 наконечник.
12. Разместить пробирки в морозильную камеру на –150 оС.
13. По прошествии 1 суток переместить 2 криопробирки на 1,5 мл в морозильную камеру на
–80оС.
14. После появления отдельных колоний на чашках Петри подсчитать исходный титр
замороженных суспензий (Тисх).
29
ПРИЛОЖЕНИЕ В
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Хранение штаммов при –80оС на Станции низкотемпературного автоматизированного
хранения биологических образцов»
Составлено: к.б.н. зав. лаб., В.И. Сафронова, к.б.н., ст.н.с., Ж.П. Попова
Содержание и назначение: определяет протокол закладки штаммов на хранение при –80оС на
Станции низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Станция низкотемп. автомат. хранения биолог. образцов STC 3k-UL Ликоник АГ
- Весы лабораторные ВК-300
- Стерилизатор паровой Touchclave-Lab 200л
- Термостат суховоздушный BD240, Binder
- Машина для мойки лабораторной посуды в к-те FlaskScrubber
- Шкаф сушильный ШСС-250
- Бокс биологической безопасности LA-4A1 ESCO
- Модуль для загрузки и выгрузки образцов совм.с низкотемп. станцией хранения
биообразцов
- Генератор жидкого азота для поддержания низкотемп. режима
- Холодильник Daewoo FRA-320 WA
- ГМФ-агар. Питательный агар на основе гидролизата мяса
- Агар-агар микробиологический импортный
- R2A агар
- Петли микробиологические, 5 шт/уп
- Чашки Петри
- Флаконы культуральные
- Пробирки типа Falcon 15 мл
30
Подготовка материалов
1. Приготовить по 40 мл питательных сред (г/л) – 2 вымытых и высушенных культуральных
флакона:
1.1 Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар - 20.
Стерилизация 30 мин, 120оС.
1.2 Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 мин, 120оС.
2. Разлить 1 чашку Петри с МПА или R2A (в зависимости от вида штамма) – 20 мл.
3. Разлить 3 пробирки Falcon 15 мл с МПА или R2A (в зависимости от вида штамма) - по 6
мл в пробирку.
4. Выгрузить микропробирку с 2D баркодом из Станции низкотемпературного
автоматизированного хранения биологических образцов.
5. Разморозить ее при 37оС в течение 3 мин.
6. Высеять суспензию на 1 чашку Петри и культивировать при 28оС в течение 3 суток.
7. Зафиксировать наличие роста и пересеять биомассу на пробирки Falcon 15 мл – 3
пробирки, 1 микробиологическая петля.
8. Культивировать 3 пробирки Falcon 15 мл при 28оС в течение 3 суток.
9. Хранить пробирки Falcon 15 мл при +4оС.
31
ПРИЛОЖЕНИЕ Г
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Стандартные микробиологические рассевы»
Составлено: к.б.н. ст.н.с., Ж.П. Попова, н.с. Н.Ю. Тихомирова
Содержание и назначение: определяет протокол проведения стандартных
микробиологических рассевов
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Стерилизатор паровой Touchclave R 120л
- Весы лабораторные ВК-300
- Термостат суховоздушный BD240, Binder
- Машина для мойки лабораторной посуды в к-те FlaskScrubber
- Шкаф сушильный ШСС-250
- Шкаф ламинарный АНС-4А1, "Esco"
- Дозатор автоклавируемый одноканальный HTL переменного объема
- Холодильник Daewoo FRA-320 WA
- ГМФ-агар. Питательный агар на основе гидролизата мяса
- Агар-агар микробиологический импортный
- R2A агар
- ГМФ-бульон. Питательный бульон на основе гидролизата мяса
- Чашки Петри
- Флаконы культуральные
- Петли микробиологические, 5 шт/уп
- Пробирки типа Falcon 15 мл
- Наконечники полимерные одноразовые Finntip для медицинских пипеток: 2000-10000 мкл
32
Подготовка материалов
1. Приготовить 200 мл питательной среды (г/л), в зависимости от вида штамма – 1 вымытый
и высушенный культуральный флакон:
1.1 Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар - 20.
Стерилизация 30 мин, 120оС.
1.2 Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 минут при 120о
С.
2. Приготовить 50 мл мясо-пептонного бульона (г/л): ГМФ бульон – 20. Стерилизация 30
мин, 120оС.
3. Разлить 10 чашек Петри с МПА или R2A - по 20 мл в чашку.
4. Разлить 4 пробирки Falcon 15 мл с ГМФ бульоном – по 10 мл в пробирку.
5. Выгрузить микропробирку с 2D баркодом из Станции низкотемпературного
автоматизированного хранения биологических образцов (или достать криопробирку из
морозильной камеры).
6. Разморозить микропробирку (или криопробирку) при 37оС в течение 3 мин.
7. Отобрать 100 мкл суспензии в пробирку Falcon 15 мл – 1 пробирка Falcon 15 мл, 1
наконечник.
8. Приготовить последовательные 10-кратные разведения суспензии – 4 пробирки Falcon 15
мл, 4 наконечника.
9. Высеять из каждого разведения по 100 мкл на 2 чашки Петри – 8 чашек, 1 наконечник.
10. Культивировать чашки Петри при 28оС в течение 2-10 суток до появления отдельных
колоний.
11. После появления отдельных колоний на чашках Петри подсчитать титр замороженных
суспензий в процессе хранения (Тхр).
12. Расчитать процент выживаемости для криоконсервированной культуры как Тхр /Тисх х
100%.
13. Пул из 10 – 20 колоний штамма пересеять на чашки Петри – 2 чашки, 1
микробиологическая петля.
14. Культивировать штамм микроорганизма при 28оС в течение 2 суток.
15. Хранить штамм микроорганизма при +4оС.
33
ПРИЛОЖЕНИЕ Д
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Световая микроскопия с использованием микроскопа Axiolab»
Составлено: к.б.н. в.н.с., Ю.С. Оследкин
Содержание и назначение: определяет протокол проведения световой микроскопии с
использованием микроскопа Axiolab
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Микроскоп "Аксиостар плюс"
- Петли микробиологические, 5 шт/уп
- Набор для микроскопии
Подготовка материалов
1. Нанести на предметное стекло каплю воды и внести биомассу клеток.
2. Тщательно перемешать.
3. Накрыть препарат покровным стеклом, избегая образования воздушных пузырей.
4. Для микроскопии использовать увеличение, соответствующее размеру объекта и
целям исследования.
5. Зафиксировать следующие характеристики образца: однородность, размер и форму
клеток (кокки, удлиненные или укороченные палочки), наличие форму и расположение спор
(центральное, апикальное), подвижность клеток (хаотичное или направленное движение).
34
ПРИЛОЖЕНИЕ Е
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Секвенирование генов рибосомных РНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl»
Составлено: к.б.н. ст.н.с., А.Л. Сазанова, инженер-исследователь И.Г. Кузнецова
Содержание и назначение: определяет протокол проведения секвенирования генов
рибосомных РНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот Т100 Thermal Cycler
- Гельдокументирующая система UVP DigDOC-ltn(TFM 30V)
- Шейкер термостатируемый ES-20 без платформы
- Генетический анализатор ABI PRISM 3500xl
- Дозатор автоклавируемый одноканальный HTL переменного объема
- Агароза LE
- Набор для выделения геномной ДНК из различных источников Fermentas (селективное
осаждение ДНК из лизата при помощи детергентов)
- Маркеры длины ДНК GeneRuler™ 1 kb Plus (75-20 000 п.н.) (0,5 мкг/мкл), 50 мкг
- Набор для выделения ДНК из агарозного геля и очистки продуктов ПЦР PureLink Combo,
50 реакций (RT)
- Универсальный полимер POP-7 серия 3500 POP-7 TM Polymer
- Набор для очистки продуктов секвенирования BigDye Xterminator
- Наконечники полимерные одноразовые Finntip для медицинских пипеток: 2000-10000 мкл
- Taq-полимераза
- R2A агар
- Пробирки типа Falcon 15 мл
- Петли микробиологические, 5 шт/уп
- Флаконы культуральные
- Смесь для проведения ПЦР
35
Подготовка материалов
1. Приготовить 10 мл жидкой питательной среды R2A (г/л) – 1 культуральный флакон:
R2A бульон – 15. Стерилизация 30 мин, 120оС.
2. Разлить 1 пробирку Falcon 15 мл с R2A бульоном – 10 мл в пробирку.
3. Засеять пробирку штаммом и культивировать на качалке при 28оС в течение 1-3
суток – 1 микробиологическая петля.
4. Отобрать 5 мл суспензии и использовать для выделения ДНК набор для выделения
геномной ДНК (Fermentas) из различных источников в соответствии с рекомендациями
производителя – 1 реакция, 5 наконечников.
5. Для амплификации использовать 50 нг выделенной ДНК, смесь для проведения
ПЦР, включающую специфические праймеры и Taq-полимеразу – 1 реакция, 2 ед Taq-
полимеразы, 5 наконечников.
6. ПЦР проводить в планшетах для проведения полимеразной цепной реакции – 1
планшет на 96 реакций, 1 наконечник.
7. Оценку результата проводить в агарозном 1,5% геле с участием маркера длины ДНК
GeneRuler™ 1 kb Plus (75-20 000 п.н.) – 1 г агарозы; 2,5 мкг маркера; 2 наконечника.
8. Для выделения из геля и очистки ДНК использовать набор для выделения ДНК из
агарозного геля и очистки продуктов ПЦР PureLink Combo – 1 реакция, 3 наконечника.
9. Секвенирование проводить на генетическом анализаторе ABI 3500xl с
использованием набора для очистки продуктов секвенирования BigDye Xterminator и
универсального полимера POP-7 – 1 набор BigDye Xterminator на 2500 реакций, 1 уп.
полимера на 960 реакций, 4 наконечника.
36
ПРИЛОЖЕНИЕ Ж
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Поиск гомологичных последовательностей в базе данных GenBank»
Составлено: к.б.н. ст.н.с., А.Л. Сазанова, инженер-исследователь И.Г. Кузнецова
Содержание и назначение: определяет протокол поиска гомологичных последовательностей
в базе данных GenBank
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Системный блок Pentium (комп. с монит)
- Монитор NEC MultiSync 1704M 17"
- Центр многофункциональный Xerox Phaser 3100MF/S
Подготовка материалов
1. Выверенные последовательности ДНК анализировать с помощью базы данных NCBI
GenBank и программы BLAST (Basic logical alignment search tool), http://
www.ncbi.nlm.nih.gov.
2. Для конструирования филогенетического дерева применять программу MEGA5 и
метод Neighbor-Joining (модель Maximum Composite Likelihood).
3. Для оценки уровней поддержки кластеров проводить бутстреп-анализ на основе 1000
повторов.
37
ПРИЛОЖЕНИЕ И
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Последовательное клонирование при загрязнении штаммов»
Составлено: к.б.н. ст.н.с., Ж.П. Попова, н.с. Н.Ю. Тихомирова
Содержание и назначение: определяет протокол проведения последовательного
клонирования при загрязнении штаммов
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Морозильник MDF-U500VX-PE Panasonic
- Станция низкотемп. автомат. хранения биолог. образцов STC 3k-UL Ликоник АГ
- Модуль для загрузки и выгрузки образцов совм.с низкотемп. станцией хранения
биообразцов
- Генератор жидкого азота для поддержания низкотемп. Режима
- Весы лабораторные ВК-300
- Стерилизатор паровой Touchclave-Lab 200л
- Термостат суховоздушный BD240, Binder
- Машина для мойки лабораторной посуды в к-те FlaskScrubber
- Шкаф сушильный ШСС-250
- Бокс биологической безопасности LA-4A1 ESCO
- Дозатор автоклавируемый одноканальный HTL переменного объема
- ГМФ-агар. Питательный агар на основе гидролизата мяса
- Агар-агар микробиологический импортный
- Флаконы культуральные
- ГМФ-бульон. Питательный бульон на основе гидролизата мяса
- Петли микробиологические, 5 шт/уп
- R2A агар
- Глицерин Ultra Pure Grade
- Чашки Петри
38
- Пробирки типа Falcon 15 мл
- Криопробирки объемом 1,5 мл
- Наконечники полимерные одноразовые Finntip для медицинских пипеток: 2000-10000 мкл
- Микропробирки с 2D баркодом
Подготовка материалов
1. Приготовить по 200 мл питательных сред (г/л) – 3 вымытых и высушенных
культуральных флакона:
1.1 Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар - 20.
Стерилизация 30 минут при 120оС.
1.2 Мясо-пептонный бульон: ГМФ бульон – 20. Стерилизация 30 минут при 120оС.
1.3 Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 минут при 120оС.
2. Разлить 20 чашек Петри с МПА и R2A - по 20 мл в чашку.
3. Разлить 10 пробирок Falcon 15 мл с ГМФ бульоном – по 10 мл в пробирку.
4. Культивировать штамм микроорганизма при 28оС в течение 2 суток – 1 чашка, 1
микробиологическая петля.
5. Суспензировать полученную биомассу в ГМФ бульоне (титр суспензии 107-10
8 кл/мл) – 1
пробирка Falcon 15 мл, 1 микробиологическая петля.
6. Приготовить последовательные 10-кратные разведения суспензии – 4 пробирки Falcon 15
мл, 4 наконечника.
7. Высеять из каждого разведения по 100 мкл на 4 чашки Петри – 16 чашек, 2 наконечника.
8. Культивировать 8 чашек Петри с R2A при 28оС в течение 2-10 суток до появления
отдельных колоний.
9. Культивировать 8 чашек Петри с МПА при 37оС в течение 3 суток до появления
отдельных колоний.
10. Колонию очищенного штамма последовательно клонировать истощающим посевом на
чашках Петри – 2 чашки, 6 микробиологических петель.
11. Пул из 10 – 20 колоний очищенного штамма пересеять на чашку Петри – 1 чашка, 2
микробиологические петли.
12. Культивировать штамм микроорганизма при 28оС в течение 2 суток.
13. Хранить штамм микроорганизма при +4оС.
39
ПРИЛОЖЕНИЕ К
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Секвенирование генов рибосомных РНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl»
Составлено: к.б.н. ст.н.с., А.Л. Сазанова, инженер-исследователь И.Г. Кузнецова
Содержание и назначение: определяет протокол проведения секвенирования генов
рибосомных РНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500xl
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот Т100 Thermal Cycler
- Гельдокументирующая система UVP DigDOC-ltn(TFM 30V)
- Шейкер термостатируемый ES-20 без платформы
- Генетический анализатор ABI PRISM 3500xl
- Дозатор автоклавируемый одноканальный HTL переменного объема
- Агароза LE
- Набор для выделения геномной ДНК из различных источников Fermentas (селективное
осаждение ДНК из лизата при помощи детергентов)
- Маркеры длины ДНК GeneRuler™ 1 kb Plus (75-20 000 п.н.) (0,5 мкг/мкл), 50 мкг
- Набор для выделения ДНК из агарозного геля и очистки продуктов ПЦР PureLink Combo,
50 реакций (RT)
- Универсальный полимер POP-7 серия 3500 POP-7 TM Polymer
- Набор для очистки продуктов секвенирования BigDye Xterminator
- Наконечники полимерные одноразовые Finntip для медицинских пипеток: 2000-10000 мкл
- Taq-полимераза
- R2A агар
- Пробирки типа Falcon 15 мл
- Петли микробиологические, 5 шт/уп
- Флаконы культуральные
- Смесь для проведения ПЦР
40
Подготовка материалов
1. Приготовить 10 мл жидкой питательной среды R2A (г/л) – 1 культуральный флакон:
R2A бульон – 15. Стерилизация 30 мин, 120оС.
2. Разлить 1 пробирку Falcon 15 мл с R2A бульоном – 10 мл в пробирку.
3. Засеять пробирку штаммом и культивировать на качалке при 28оС в течение 1-3
суток – 1 микробиологическая петля.
4. Отобрать 5 мл суспензии и использовать для выделения ДНК набор для выделения
геномной ДНК (Fermentas) из различных источников в соответствии с рекомендациями
производителя – 1 реакция, 5 наконечников.
5. Для амплификации использовать 50 нг выделенной ДНК, смесь для проведения
ПЦР, включающую специфические праймеры и Taq-полимеразу – 1 реакция, 2 ед Taq-
полимеразы, 5 наконечников.
6. ПЦР проводить в планшетах для проведения полимеразной цепной реакции – 1
планшет на 96 реакций, 1 наконечник.
7. Оценку результата проводить в агарозном 1,5% геле с участием маркера длины ДНК
GeneRuler™ 1 kb Plus (75-20 000 п.н.) – 1 г агарозы; 2,5 мкг маркера; 2 наконечника.
8. Для выделения из геля и очистки ДНК использовать набор для выделения ДНК из
агарозного геля и очистки продуктов ПЦР PureLink Combo – 1 реакция, 3 наконечника.
9. Секвенирование проводить на генетическом анализаторе ABI 3500xl с
использованием набора для очистки продуктов секвенирования BigDye Xterminator и
универсального полимера POP-7 – 1 набор BigDye Xterminator на 2500 реакций, 1 уп.
полимера на 960 реакций, 4 наконечника.
41
ПРИЛОЖЕНИЕ Л
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Повторная криоконсервация при снижении жизнеспособности штаммов ниже
установленного порога»
Составлено: к.б.н. зав. лаб., В.И. Сафронова, к.б.н., ст.н.с., Ж.П. Попова
Содержание и назначение: определяет протокол повторной криоконсервации штаммов при
снижении жизнеспособности штаммов ниже установленного порога
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Морозильник MDF-U500VX-PE Panasonic
- Станция низкотемп. автомат. хранения биолог. образцов STC 3k-UL Ликоник АГ
- Модуль для загрузки и выгрузки образцов совм.с низкотемп. станцией хранения
биообразцов
- Генератор жидкого азота для поддержания низкотемп. Режима
- Весы лабораторные ВК-300
- Стерилизатор паровой Touchclave-Lab 200л
- Термостат суховоздушный BD240, Binder
- Машина для мойки лабораторной посуды в к-те FlaskScrubber
- Шкаф сушильный ШСС-250
- Бокс биологической безопасности LA-4A1 ESCO
- Дозатор автоклавируемый одноканальный HTL переменного объема
- ГМФ-агар. Питательный агар на основе гидролизата мяса
- Агар-агар микробиологический импортный
- Флаконы культуральные
- ГМФ-бульон. Питательный бульон на основе гидролизата мяса
- Петли микробиологические, 5 шт/уп
- R2A агар
- Глицерин Ultra Pure Grade
- Чашки Петри
42
Пробирки типа Falcon 15 мл
- Криопробирки объемом 1,5 мл
- Наконечники полимерные одноразовые Finntip для медицинских пипеток: 2000-10000 мкл
- Микропробирки с 2D баркодом
Подготовка материалов
1. Приготовить по 200 мл питательных сред (г/л) – 3 вымытых и высушенных
культуральных флакона:
1.1 Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар - 20.
Стерилизация 30 мин, 120оС.
1.2 Мясо-пептонный бульон: ГМФ бульон – 20. Стерилизация 30 мин, 120оС.
1.3 Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 мин, 120оС.
2. Разлить 10 чашек Петри с МПА или R2A - по 20 мл в чашку.
3. Разлить 5 пробирок Falcon 15 мл с ГМФ бульоном – по 10 мл в пробирку.
4. Культивировать штамм микроорганизма при 28оС в течение 3 суток (до стационарной
фазы роста) – 1 чашка, 1 микробиологическая петля.
5. Суспензировать полученную биомассу в ГМФ бульоне (титр суспензии 108-10
9 кл/мл) – 1
пробирка Falcon 15 мл, 4 микробиологические петли.
6. Добавить к суспензии стерильный глицерин Ultra Pure Grade – 2 мл глицерина, 1
наконечник.
7. Выдержать суспензию 40 мин при комнатной температуре.
8. Приготовить последовательные 10-кратные разведения суспензии – 4 пробирки Falcon 15
мл, 4 наконечника.
9. Высеять из каждого разведения по 100 мкл на 2 чашки Петри – 8 чашек, 1 наконечник.
10. Культивировать чашки Петри при 28оС в течение 2-10 суток до появления отдельных
колоний.
11. Расфасовать суспензию в стерильные криопробирки на 1,5 мл (в криокоробках) и
микропробирки с 2D баркодом на 300 мкл (в планшетах) - 2 криопробирки, 12
микропробирок, 2 наконечника.
12. Разместить 2 криопробирки в морозильную камеру на –80оС, 12 микропробирок – в
Станцию низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов.
13. После появления отдельных колоний на чашках Петри подсчитать исходный титр
замороженных суспензий (Тисх).
43
ПРИЛОЖЕНИЕ М
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Мультисубстратное тестирование с помощью системы MicroPlate GENIII BioLog»
Составлено: к.б.н. зав. лаб. В.И. Сафронова, инженер-исследователь И.Г. Кузнецова
Содержание и назначение: определяет протокол проведения мультисубстратного
тестирования с помощью системы MicroPlate GENIII BioLog
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Пипетка электронная Ovation
- Стерилизатор паровой Touchclave R 120л
- Весы лабораторные ВК-300
- Термостат суховоздушный BD240, Binder
- Машина для мойки лабораторной посуды в к-те FlaskScrubber
- Шкаф сушильный ШСС-250
- Шкаф ламинарный АНС-4А1, "Esco"
- Системный блок Pentium (комп. с монит)
- Монитор NEC MultiSync 1704M 17"
- Центр многофункциональный Xerox Phaser 3100MF/S
- Турбидиметр с программным обеспечением MicroLogMSystem
- ГМФ-агар. Питательный агар на основе гидролизата мяса
- Агар-агар микробиологический импортный
- Петли микробиологические, 5 шт/уп
- Чашки Петри
- R2A агар
- Микропланшеты GEN III для исследования Г+ и Г- - бактерий
- Микропланшеты для идентификации GN2
- Флаконы культуральные
- Наконечники дозаторов Ovation
44
- Резервуары стерильные
- Жидкость для иннокуляции IF-АB
Подготовка материалов
1. Приготовить по 40 мл питательных сред (г/л) – 2 вымытых и высушенных
культуральных флакона:
1.2 Мясо-пептонный агар (МПА): ГМФ агар - 20 или ГМФ бульона – 20, агар-агар - 20.
Стерилизация 30 мин, 120оС.
1.3 Среда R2A: R2A agar – 15. Стерилизация 30 мин, 120оС.
2. Разлить 1 чашку Петри с МПА или R2A (в зависимости от вида штамма) – 20 мл.
3. Высеять штамм на чашку Петри и культивировать при 28оС в течение 2 суток.
4. Биомассу использовать для приготовления суспензий в инокулирующих жидкостях IF-AB
с использованием турбидиметра – 1 пробирка.
5. Приготовленные суспензии по 100 мкл разнести в лунки 96-луночных микропланшетов ID
Microplate (BioLog) – 1 микропланшет, 1 наконечник к дозатору Ovation.
6. Микропланшет инкубировать при 33оС в течение 1 - 7 суток.
7. Результат инкубирования в виде наличия (+) или отсутствия (-) окрашивания каждой
лунки проанализировать с помощью компьютерной программы MicroLogMSystem.
45
ПРИЛОЖЕНИЕ Н
Стандартная операционная процедура (СОП) ВКСМ
«Проведение генетической паспортизации штаммов с помощью метода геномного AFLP-
фингерпринтинга»
Составлено: к.б.н. зав. лаб. В.И. Сафронова, к.б.н. ст.н.с., А.Л. Сазанова
Содержание и назначение: определяет протокол проведения генетической паспортизации
штаммов с помощью метода геномного AFLP-фингерпринтинга
Местонахождение: ФГБНУ ВНИИСХМ
Пересмотр через: 1 год
Оборудование и материалы
Перечень необходимого оборудования и расходных материалов:
Лабораторное оборудование (приведены возможные варианты производителей и марок
оборудования)
- Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот Т100 Thermal Cycler
- Гельдокументирующая система UVP DigDOC-ltn(TFM 30V)
- Генетический анализатор ABI PRISM 3500xl
- Дозатор автоклавируемый одноканальный HTL переменного объема
- Термостат суховоздушный BD240, Binder
- Шейкер термостатируемый ES-20 без платформы
- Системный блок Pentium (комп. с монит)
- Монитор NEC MultiSync 1704M 17"
- Центр многофункциональный Xerox Phaser 3100MF/S
- Агароза LE
- Набор для выделения геномной ДНК из различных источников Fermentas (селективное
осаждение ДНК из лизата при помощи детергентов)
- Маркеры длины ДНК GeneRuler™ 1 kb Plus (75-20 000 п.н.) (0,5 мкг/мкл), 50 мкг
- Рестриктазы EcoRI, Msp I
- Универсальный полимер POP-7 серия 3500 POP-7 TM Polymer
- Наконечники полимерные одноразовые Finntip для медицинских пипеток: 2000-10000 мкл
- Размерный стандарт GeneScan TM 600 LIZ v 2.0
- Планшеты для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР-диагностики)
- Taq-полимераза
- R2A агар
46
- Пробирки типа Falcon 15 мл
- Петли микробиологические, 5 шт/уп
- Флаконы культуральные
- Смесь для проведения ПЦР
Подготовка материалов
1. Приготовить 10 мл жидкой питательной среды R2A (г/л) – 1 культуральный флакон:
R2A бульон – 15. Стерилизация 30 мин, 120оС.
2. Разлить 1 пробирку Falcon 15 мл с R2A бульоном – 10 мл в пробирку.
3. Засеять пробирку штаммом и культивировать на качалке при 28оС в течение 1-3
суток – 1 микробиологическая петля.
4. Отобрать 5 мл суспензии и использовать для выделения ДНК набор для выделения
геномной ДНК (Fermentas) из различных источников в соответствии с рекомендациями
производителя – 1 реакция, 5 наконечников.
5. Выделенную геномную ДНК (50 нг) использовать для реакции рестрикции с
помощью рестриктаз MseI и EcoRI - по 2,5 ед, 4 наконечника.
6. Реакцию проводить при 37оС в течение 16 часов.
7. Для амплификации использовать 4 мкл реакционной смеси, смесь для проведения
ПЦР, включающую специфические праймеры и Taq-полимеразу – 1 реакция, 2 ед Taq-
полимеразы, 5 наконечников.
8. ПЦР проводить в планшетах для проведения полимеразной цепной реакции – 1
планшет на 96 реакций, 1 наконечник.
9. Первичную оценку результата проводить в агарозном 1,5% геле с участием маркера
длины ДНК GeneRuler™ 1 kb Plus (75-20 000 п.н.) – 1 г агарозы; 2,5 мкг маркера; 2
наконечника.
10. Финальную амплификацию проводить в условиях автоматического капиллярного
электрофореза на генетическом анализаторе ABI 3500xl с использованием интернального
стандарта молекулярного веса GeneScan TM 600 LIZ и универсального полимера POP-7 – 1
уп. стандарта на 800 реакций, 1 уп. полимера на 960 реакций, 2 наконечника.
11. Файлы, полученные после электрофоретического разделения фрагментов и
содержащие «кривые», соответствующие фрагментам AFLP (FAM) и стандарту
молекулярного веса (LIZ) анализировать с помощью программы Bionumerics для
определения точного размера AFLP-фрагментов.
47
ПРИЛОЖЕНИЕ П
Идентификация штаммов с помощью метода секвенирования 16S rDNA
1. Штамм T1Ks14
Ensifer adhaerens strain S4-6
Query cover – 100%
Identity – 99.89%
Ensifer adhaerens strain WJB133
Query cover -100%
Identity – 99.89%
Ensifer adhaerens strain WJB36
Query cover – 100%
Identity – 99.89%
GGTTAGCTGCCTCCTTGCGGTTAGCGCACTACCTTCGGGTAGAACCAACTCCCATGGTG
TGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCATGCTGATCTGCGA
TTACTAGCGATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGATG
GCTTTTGGAGATTAGCTCGACCTCGCGGTCTCGCTGCCCACTGTCACCACCATTGTAGC
ACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCT
CGGCTTATCACCGGCAGTCCCCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGGGCG
AGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGC
CATGCAGCACCTGTCTCCGATCCAGCCGAACTGAAGGAAAACGTCTCCGTAATCCGCG
ATCGGGATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTC
CACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCC
AGGCGGAATGTTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCGAACAGTAAACTGCCCGACGGCTAA
CATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCCACGCT
TTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGACCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCG
AATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTCACCTCTTCCATACTCTAGA
CACCCAGTATCAAAGGCAGTTCCGGGGTTGAGCCCCGGGATTTCACCCCTGACTTAAA
TGTCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAA
2. Штамм T1Ks19
Kocuria sp. ZS2-6
Query cover – 99%
Identity – 100%
Kocuria rosea
Query cover 99%
Identity – 100%
K.erythromyxa
Query cover 99%
Identity – 100%
TTACACATGCAAGTCGAACGATGATGCCCAGCTTGCTGGGCGGATTAGTGGCGAACGG
GTGAGTAATACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTC
TAATACTGGATACTACCTCTTACCGCATGGTGGGTGGTGGAAAGGGTTTTACTGGTTTT
GGATGGGCTCACGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGAC
48
GGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT
CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCGA
CGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCG
AGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA
ATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTT
TGTCGCGTCTGCTGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGGTCTGCAGTGGGTACGGGCA
GACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATA
TCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTTACTGACGCTGAGGAGC
GAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGG
GCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCC
CGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCAC
AAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGA
CATTCACCGGACCGCCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTCGGGGCTGGTGGACAGGTGGTG
CATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA
CCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTC
AACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTC
ACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCC
AAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTC
GCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACAC
CGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGG
GAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACTAAGTCGTAAC
3. Штамм T1Kr02
Ochrobactrum sp. LMG 20564
Query cover 100%
Identity 100%
Ochrobactrum thiophenivorans strain FL93
Query cover 99%
Identity 100%
Ochrobactrum thiophenivorans strain KUSB1
Query cover 99%
Identity 99.85%
AGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACC
TTTTGCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGA
AAGATTTATCGGCAAAGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGC
TCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGA
GACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCA
AGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAGCTCTTTCA
CCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCA
GCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACG
TAGGCGGACTTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTG
ATACTGGAAGTCTTGAGTATGGTAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAAT
TCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACCATTACTGACG
CTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT
AAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGGAGTTTACTCTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTA
AACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC
49
CCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGC
CCTTGACATACCGGTCGCGGACACAGAGATGTGTCTTTCAGTTCGGCTGGACCGGATA
CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC
GAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAAGGGACTGCCA
GTGATAAGCTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGG
GCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCAAGCACGCGAGTGTGAGCTA
ATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGA
ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC
ACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTCTGCCCGAAGGCACTGTGCTAACCGTAAGG
AGGCAGGTGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAA
4. Штамм K2Kn02
Acinetobacter sp. AA42
Query cover 100%
Identity 99.93%
Acinetobacter sp. WJ07
Query cover 100%
Identity 99.93%
Acinetobacter guillouiae, strain: MSP4-18
Query cover 100%
Identity 99.65%
TCGAGCGGGGGAAGTTGCTTCGGTAACTGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACTT
AGGAATCTGCCTATTAATGGGGGACAACATCTCGAAAGGGATGCTAATACCGCATACG
CCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCACTTGTGACCTTGCGTTAATAGATGAGCCTAAGT
CGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTG
AGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG
CAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAA
GAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTCTTCTAGTTAATACC
TAGGATGAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCG
CGGTAATACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGG
CGGCTTTTTAAGTCGGATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACT
GGGAAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGT
AGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGA
GGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAAC
GATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGT
AGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCC
GCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTC
TTGACATAGTAAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTACATACAGG
TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC
GCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCACTTCGGGTGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTG
ACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGC
TACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAAT
CTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGA
ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC
ACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCGTAAGG
AGGACGCTTACCACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAG
50
5. Штамм CУГ-3
Paraburkholderia sp. SOS3
Identity-100%
Query cover-100%
Burkholderia solisilvae strain Y-47 (T)
Identity-98.84%
Query cover-100%
Burkholderia humisilvae strain Y-12 (T)
Identity-98.61%
Query cover-100%
CCCTGGCGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGTCCTGGAGTGGGG
GATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCTGAGGATGAAAGCGGGGG
ACCGCAAGGCCTCGCGCTCAAGGAGCGGCCGATGGCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTA
AAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGG
GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATG
GGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGC
ACTTTTGTCCGGAAAGAAAACTTCGTCCCTAATATGGATGGAGGATGACGGTACCGGA
AGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGC
GTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTGATGTAAGACCGATGTGA
AATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGCATTGCTGGAGTATGGCAGA
GGGGGGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCGA
TGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGC
AAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTCGGG
CCTTCATTGGCTTGGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGT
CGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTG
GATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGACGGAACCTCGA
TGAGAGTTGAGGGTGCCCGAAAGGGAGCCGTCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCA
GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCTGGTT
GCTACGCAAGAGCACTCCAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT
GACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGA
ACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCG
GATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGC
ATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGT
GGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACC
6. Штамм HP4
Halobacillus trueperi type strain DSM 10404
Query cover-100%
Identity-99.36%
Halobacillus karajiensis type strain DSM 14948
Query cover-100%
Identity-99.36%
Halobacillus aidingensis type strain AD-6
Query cover-100%
Identity-97.92%
TAGGTGTTAGGGGGCTTCCACCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCT
GGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG
GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCC
TTGGACCTCCCTAGAGATAGGGATTTCCCTTCGGGGACCAAGTGACAGGTGGTGCATG
GTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCT
51
GATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGG
AGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTG
CTACAATGGATGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGTGTAGCAAATCCCATAAAA
CCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTA
ATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC
ACACCACGAGAGTTGGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTT
7. Штамм EG1QL3
Chromohalobacter salexigens type strain DSM 3043
Query cover – 100%
Identity –100%
GCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGAC
TAGCCGTTGGGTCCCTTGAGGACTTAGTGGCGCAGTTAACGCGATAAGTCGACCGCCT
GGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG
GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACCCTTGACATCCT
GCGAACCCGGAAGAGATTCCGGGGTGCCTTCGGGAGCGCAGAGACAGGTGCTGCATG
GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTT
GTCCCTATTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCG
GAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGGTAGGGCTACACACGT
GCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGAAGCCGCGAGGTGAAGCCAATCCCAGAAA
GCCGGCCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAG
TAATCGTGCATCAGAATGGCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG
TCACACCATGGGAGTGGACTGCACCAGAAGTGGTTAGCCTAACTTCGGAGGGCGATCA
CCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAG
8. Штамм EG2QL8
Salinibacillus aidingensis type strain 25-7
Query cover-97%
Identity-99.46%
Salinibacillus kushneri type strain 8-2
Query cover-97%
Identity-99.04%
Salinibacillus xinjiangensis type strain J4
Query cover-99%
Identity-98.26%
CCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTG
GTAGTCCACGCCGTAAACGTTGAGTGCTAGGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCT
GAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAA
GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG
AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGCTACCTCTAGAGATAGAGGGTTCCCTTCG
GGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT
TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCT
AGGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGC
CCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACCAATGGATGGTACAAAGGGCAGCGAAGC
CGTGAGGTGAAGCTAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTC
GCCTGTATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGT
52
TCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGCAACACCCGAAGTCG
GTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGCCAATGATGGGTGAAGT
9. Штамм EG3QL57
Haloterrigena saccharevitans type strain AB14
Query cover-100%
Identity-98.90%
Haloterrigena thermotolerans type strain PR5
Query cover-100%
Identity-98.28%
AGTTGAGACTCGTAGCAGATAGCTCAGTAACACGTGGCCAAACTACCCTATGGATCCG
AATAACCTCGGGAAACTGAGGCTAATTCGGAATACGATTCATCACCTGGAGTGGTGTG
AATCCGAAACGCTCCGGCGCCATAGGATGTGGCTGCGGCCGATTAGGTAGACGGTGGG
GTAACGGCCCACCGTGCCCATAATCGGTACGGGTTGTGAGAGCAAGAGCCCGGAGACG
GTATCTGAGACAAGATACCGGGCCCTACGGGGCGCAGCAGGCGCGAAACCTTTACACT
GCACGCGAGTGCGATAGGGGGACTCCAAGTGCGAGGGCATATAGTCCTCGCTTTTTGC
GACCGTAAGGAGGTCGCGGAATAAGTGCTGGGCAAGACCGGTGCCAGCCGCCGCGGT
AATACCGGCAGCACGAGTGATGACCGCTATTATTGGGCCTAAAGCGTCCGTAGCTGGC
CGTGCAAGTCCATCGGGAAATCCGCGCGCTTAACGCGCGGGCGTCCGGTGGAAACTGC
ACGGCTTGGGACCGGAAGACCAGAGGGGTACGTCCGGGGTAGGAGTGAAATCCCGTA
ATCCTGGACGGACCACCGGTGGCGAAAGCGCCTCTGGAAGACGGATCCGACGGTGAG
GGA
10. Штамм RU5S2
Halomonas ventosae type strain Al12
Query cover – 99%
Identity –98.72%
GCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAACGATGGAGCTTGCTCCAGGCGTCGAGCGGCG
GACGGGTGAGTAATGCATAGGAATCTGCCCGGTAGTGGGGGATAACCTGGGGAAACC
CAGGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCT
ATCGGATGAGCCTATGTCGGATTAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGAC
GATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATCGGGACTGAGACACGGCCCGAA
CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCC
ATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCTTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGAGGAAGAACG
CCTCGGGGCCAATACCCCCGAGGAAGGACATCACTCACAGAAGAAGCACCGGCTAACT
CCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCG
TAAAGCGCGCGTAGGTGGCTTGATAAGCCGGTTGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGG
AACGGCATCCGGAACTGTCAGGCTAGAGTGCAGGAGAGGAAGGTAGAATTCCCGGTG
TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAATACCAGTGGCGAANGCGGCCTTCTGG
ACTGACACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGNGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGG
TAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGGTCCTAGAGACCTTTGTGGCG
CAGTTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAT
GAATTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGGTTTAATTCGATGCAACGC
GAAGAACCTTACCTACCC
53
11. Штамм 495
Bradyrhizobium elkanii strain USDA 4348
Query cover - 100%
Identity - 100%
Bradyrhizobium elkanii strain USDA 4345
Query cover - 100%
Identity - 100%
Bradyrhizobium elkanii, strain: HBO 14
Query cover - 100%
Identity - 100%
GCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGGCATAGCAATATGTCAGCGGCAGACGGGTGAGTA
ACGCGTGGGAACGTACCTTTTGGTTCGGAACAACTGAGGGAAACTTCAGCTAATACCG
GATAAGCCCTTACGGGGAAAGATTTATCGCCGAAAGATCGGCCCGCGTCTGATTAGCT
AGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAT
CAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAA
TATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTA
GGGTTGTAAAGCTCTTTTGTGCGGGAAGATAATGACGGTACCGCAAGAATAAGCCCCG
GCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCA
CTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGGTCTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCTGGAGCTCA
ACTCCAGAACTGCCTTTGATACTGAAGATCTTGAGTTCGGGAGAGGTGAGTGGAACTG
CGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTC
ACTGGCCCGATACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA
CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTAGTGGGTTTACTCACTAGT
GGCGCAGCTAACGCTTTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTC
AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAAC
GCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGGTCGCGGACTCCAGAGACGGAGTTCTT
CAGTTCGGCTGGACCGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA
TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCCGTCCTTAGTTGCTACCATTTAGTTG
AGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAGCCGCGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAG
TCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAATGGGA
TGCTAAGGGGCGACCCTTCGCAAATCTCAAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGGGCTCT
GCAACTCGAGCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCACGCCACGGTG
AATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCTG
AAGACGGTGCGCTAACCGAAAGGGGGCAGCCGGCCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGG
TGAAGTCGTAACAAG
12. Штамм 496
Bradyrhizobium japonicum strain PZS_S03
Query cover - 99%
Identity - 100%
Bradyrhizobium embrapense strain SEMIA 6208
Query cover - 99%
Identity - 100%
Bradyrhizobium viridifuturi strain SEMIA 690
Query cover - 99%
Identity - 100%
Bradyrhizobium elkanii isolate CI-40F
Query cover - 99%
Identity - 100%
CTTGTTACGACTTCACCCCAGTCGCTGACCCTACCGTGGCCGGCTGCCCCCTTTCGGTT
AGCGCACCGTCTTCAGGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGG
CCCGGGAACGTATTCACCGTGGCGTGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCAT
54
GGGCTCGAGTTGCAGAGCCCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTTGAGATTTGCGAAGGG
TCGCCCCTTAGCATCCCATTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAA
GGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCGCGGCTTATCACCGGCAGTCTCC
TTAGAGTGCTCAACTAAATGGTAGCAACTAAGGACGGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGAC
TTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCCGGTC
CAGCCGAACTGAAGAACTCCGTCTCTGGAGTCCGCGACCGGGATGTCAAGGGCTGGTA
AGGTTCTGCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGT
CAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAAAGCGTT
AGCTGCGCCACTAGTGAGTAAACCCACTAACGGCTGGCATTCATCGTTTACGGCGTGG
ACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGCGTCAGTATC
GGGCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTGCGAATATCTACCGA
13. Штамм 498
Bradyrhizobium elkanii strain: PCM 5
Identity-100%
Query cover-100%
Bradyrhizobium elkanii strain SEMIA 662
Identity-90.90%
Query cover-100%
Bradyrhizobium elkanii gene strain: PHM 4
Identity-90.90%
Query cover-100%
ACACATGCAAGTCGAGCGGGCATAGCAATATGTCAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGC
GTGGGAACGTACCTTTTGGTTCGGAACAACTGAGGGAAACTTCAGCTAATACCGGATA
AGCCCTTACGGGGAAAGATTTATCGCCGAAAGATCGGCCCGCGTCTGATTAGCTAGTT
GGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGC
CACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG
GACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTT
GTAAAGCTCTTTTGTGCGGGAAGATAATGACGGTACCGCAAGAATAAGCCCCGGCTAA
CTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGGG
CGTAAAGGGTGCGTAGGCGGGTCTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCTGGAGCTCAACTCC
AGAACTGCCTTTGATACTGAAGATCTTGAGTTCGGGAGAGGTGAGTGGAACTGCGAGT
GTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGG
CCCGATACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTG
GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTAGTGGGTTTACTCACTAGTGGCG
CAGCTAACGCTTTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAG
GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGC
AGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGGTCGCGGACTCCAGAGACGGAGTTCTTCAGTT
CGGCTGGACCGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG
GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCCCGTCCTTAGTTGCTACCATTTAGTTGA
14. Штамм 500
Bradyrhizobium elkanii strain PV3.24
Identity-100%
Query cover-100%
Bradyrhizobium ferriligni strain CCBAU 51502
Identity-100%
Query cover-100%
Bradyrhizobium elkanii strain UFLA05-11
Identity-100%
Query cover-100%
55
GTAACGCGTGGGAACGTACCTTTTGGTTCGGAACAACTGAGGGAAACTTCAGCTAATA
CCGGATAAGCCCTTACGGGGAAAGATTTATCGCCGAAAGATCGGCCCGCGTCTGATTA
GCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGAT
GATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG
GAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCC
CTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTGTGCGGGAAGATAATGACGGTACCGCAAGAATAAGCC
CCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAA
TCACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGGTCTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCTGGAGC
TCAACTCCAGAACTGCCTTTGATACTGAAGATCTTGAGTTCGGGAGAGGTGAGTGGAA
CTGCGAGT
15. Штамм 503
Bradyrhizobium sp. strain SEMIA 5087
Identity-100%
Query cover-100%
Bradyrhizobium japonicum strain PZS_S03
Identity-100%
Query cover-100%
Bradyrhizobium embrapense strain SEMIA 6208
Identity-100%
Query cover-100%
Bradyrhizobium viridifuturi strain SEMIA 690
Identity-100%
Query cover-100%
CGACTTCACCCCAGTCGCTGACCCTACCGTGGCCGGCTGCCCCCTTTCGGTTAGCGCAC
CGTCTTCAGGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGA
ACGTATTCACCGTGGCGTGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGGGCTCG
AGTTGCAGAGCCCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTTGAGATTTGCGAAGGGTCGCCCC
TTAGCATCCCATTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCAT
GAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCGCGGCTTATCACCGGCAGTCTCCTTAGAGT
GCTCAACTAAATGGTAGCAACTAAGGACGGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCC
AACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCCGGTCCAGCCGA
ACTGAAGAACTCCGTCTCTGGAGTCCGCGACCGGGATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCT
GCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCC
TTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAAAGCGTTAGCTGCG
CCACTAGTGAGTAAACCCACTAACGGCTGGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCA
GGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGCGTCAGTATCGGGCCAG
TGAGCCGCC
16. Штамм 504
Bradyrhizobium sp. strain SEMIA 5087
Identity-100%
Query cover-99%
Bradyrhizobium elkanii strain: PHM 4
Identity-100%
Query cover-99%
Bradyrhizobium elkanii strain: HBO 14
Identity-100%
Query cover-99%
Bradyrhizobium elkanii strain USDA 4348
Identity-100%
Query cover-99%
56
TAACATGCAAGTCGAGCGGGCATAGCAATATGTCAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGC
GTGGGAACGTACCTTTTGGTTCGGAACAACTGAGGGAAACTTCAGCTAATACCGGATA
AGCCCTTACGGGGAAAGATTTATCGCCGAAAGATCGGCCCGCGTCTGATTAGCTAGTT
GGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGC
CACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG
GACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTT
GTAAAGCTCTTTTGTGCGGGAAGATAATGACGGTACCGCAAGAATAAGCCCCGGCTAA
CTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGGG
CGTAAAGGGTGCGTAGGCGGGTCTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCTGGAGCTCAACTCC
AGAACTGCCTTTGATACTGAAGATCTTGAGTTCGGGAGAGGTGAGTGGAACTGCGAGT
GTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGG
CCCGATACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTG
GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTAGTGGGTTTACTCACTAGTGGCG
CAGCTAACGCTTTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAG
GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGC
AGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGGTCGCGGACTCCAGAGACGGAGTTCTTCAGTT
CGGCTGGACCGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG
GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCCGTCCTTAGTTGCTACCATTTAGTTGAGCAC
TCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAGCCGCGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCA
TGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAATGGGATGCTAA
GGGGCGACCCTTCGCAAATCTCAAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGGGCTCTGCAACT
CGAGCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCACGCCACGGTGAATACG
TTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACC
17. Штамм 505
Phyllobacterium trifolii strain 10
Identity-99.60%
Query cover-100%
Phyllobacterium trifolii strain GAB14
Identity-99.60%
Query cover-100%
Phyllobacterium trifolii strain G019
Identity-99.60%
Query cover-100%
AGTCGAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACC
CAATTCTTCGGAACAACTGAGGGAAACTTCAGCTAATACCGGATGTGCCCTTCGGGGG
AAAGATTTATCGGAATTGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGG
CCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTG
AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGC
AAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAGCACTTTC
ACCGGAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGC
AGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCAC
GTAGGCGGACTATTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTT
GATACTGGTAGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAA
TTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGAC
GCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCC
GTAAACTATGAGAGCTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCAT
TAAGCTCTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGG
GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCA
GCCCTTGACATCCCGATCGCGGTTACCAGAGATGGTATCCTTCAGTTAGGCTGGATCGG
TGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGC
AACGAGCG
57
18. Штамм 506
Phyllobacterium trifolii strain PETP02(Т)
Identity-99.64%
Query cover-100%
Phyllobacterium trifolii strain BIHB 4156
Identity-99.35%
Query cover-100%
Phyllobacterium trifolii strain BIHB 4155
Identity-99.28%
Query cover-100%
CATGCAAGTCGAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAA
TCTACCCAATTCTTCGGAACAACTGAGGGAAACTTCAGCTAATACCGGATGTGCCCTTC
GGGGGAAAGATTTATCGGAATTGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGT
AAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGG
GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATG
GGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAGC
ACTTTCACCGGAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTG
CCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAG
CGCACGTAGGCGGACTATTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTG
CCTTTGATACTGGTAGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGG
TGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATA
CTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA
CGCCGTAAACTATGAGAGCTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAAC
GCATTAAGCTCTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGAC
GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTT
ACCAGCCCTTGACATCCCGATCGCGGTTACCAGAGATGGTATCCTTCAGTTAGGCTGGA
TCGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC
CCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGG
GACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTT
ACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACCGCGA
GGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCA
TGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGG
CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTGCTGTGCTA
ACCGCAAGGAGGCAGGCAACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTC
19. Штамм 508
Rhizobium leguminosarum bv. viciae strain BIHB 1217
Identity-99.80%
Query cover-100%
Rhizobium leguminosarum bv. viciae strain BIHB 1148
Identity-99.80%
Query cover-100%
Rhizobium leguminosarum strain Vaf-26
Identity-99.80%
Query cover-100%
ACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGG
GAATCTACCCTTGACTACGGAATAACGCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGTC
CTTCGGGAGAAAGATTTATCGGTCAAGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTG
GGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACA
TTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGAC
AATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTA
58
AAGCTCTTTCACCGGAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTT
CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGT
AAAGCGCACGTAGGCGGATCGATCAGTCAGGGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGG
AACTGCCTTTGATACTGTCGATCTGGAGTATGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGT
AGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTC
CATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTA
GTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAG
CTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAA
TTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAG
AACCTTACCAGCCCTTGACATGCCCGGCTACTTGCAGAGATGCAAGGTTCCCTTCGGGG
ACCGGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGGTTA
A
20. Штамм 510
Phyllobacterium loti strain S658 (Т)
Identity-99.71%
Query cover-100%
Phyllobacterium trifolii strain BIHB 4156
Identity-99.63%
Query cover-100%
Phyllobacterium trifolii strain PETP02 (Т)
Identity-99.63%
Query cover-100%
GGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCCAATTCTTCGGAACAACTGAGGGAA
ACTTCAGCTAATACCGGATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGAATTGGATGAGC
CCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCT
GGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGA
GGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGT
GTGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAGCACTTTCACCGGAGAAGATAATGACGGTATCC
GGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTA
GCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACTATTAAGTCAGGGGT
GAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGTAGTCTTGAGTTCGAGA
GAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCA
GTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG
CAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACTATGAGAGCTAGCCGTCGG
GCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCTCTCCGCCTGGGGAGTACGG
TCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT
GGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGATCGCGGTT
ACCAGAGATGGTATCCTTCAGTTAGGCTGGATCGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCG
TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTA
GTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAG
GTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAA
TGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACCGCGAGGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTC
AGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGG
ATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAT
GGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTGCTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCAACCACGGT
AGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTC
21. Штамм 512
Afipia sp. BAC307
Identity-100%
Query cover-100%
59
Bosea sp. R-38307
Identity-99.86%
Query cover-100%
Bosea lathyri strain 7
Identity-99.93%
Query cover-98%
CATGCAAGTCGAACGGGTATCTTCGGATACTAGTGGCAGACGGGTGAGTAACACGTGG
GAACGTACCTTTCGGTTCGGAATAATACAGGGAAACTTGTACTAATACCGGATAAGCC
CTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCGATAGATCGGCCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTG
AGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACA
CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGAC
AATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTA
AAGCACTTTTGTCCGGGAAGATAATGACTGTACCGGAAGAATAAGCCCCGGCTAACTT
CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGGGCGT
AAAGGGCGCGTAGGCGGACTCTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCCAGGGCTCAACCCTGG
AATTGCCTTCGATACTGAGAGTCTTGAGTTCGGAAGAGGTTGGTGGAACTGCGAGTGT
AGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCAACTGGTC
CGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT
AGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTGGGGTGCATGCACCTCAGTGGCGCA
GCTAACGCTTTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGA
ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAG
AACCTTACCAGCTTTTGACATGTCCGGTTTGATCGACAGAGATGTCTTTCTTCAGTTCG
GCTGGCCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGG
TTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGAACTC
TAGGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGCGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCAT
GGCCCTTACAGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAATGGGCAGCGAAG
GAGCGATCCGGTGCTAATCCCAAAAAGCCGTCTCAGTTCAGATTGCACTCTGCAACTC
GAGTGCATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGT
TCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTTACCCGAAGGCG
TCGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCGACCACGGTAGGCTCAGCGACTGGGGTGAAGT
CG
22. Штамм 514
Phyllobacterium trifolii strain GAB14
Identity-100%
Query cover-100%
Phyllobacterium trifolii strain 10
Identity-99.84%
Query cover-100%
Phyllobacterium trifolii strain G019
Identity-99.69%
Query cover-100%
TCGGAACAACTGAGGGAAACTTCAGCTAATACCGGATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATT
TATCGGAATTGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCA
AGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACG
GCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTG
ATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAGCACTTTCACCGGA
GAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCG
GTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCG
GACTATTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTG
GTAGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAG
ATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGG
60
TGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACTA
TGAGAGCTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCTCT
CCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCA
CAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTG
ACATCCCGATCGCGGTTACCAGAGATGGTATCCTTCAGTTAGGCTGGATCGGTGACAG
GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG
CGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTG
ATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGC
TACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACCGCGAGGTCGAGCTAAT
CTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAAT
CGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACAC
CGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTGCTGTGCTAACCGC
23. Штамм 515
Bosea vestrisii strain PYEM-1
Identity-99.07%
Query cover-100%
Bosea vestrisii strain R-51039
Identity-99.07%
Query cover-100%
Bosea eneae
Identity-99.07%
Query cover-100%
CTTAACACATGCAAGTCGAACGGGCACTTCGGTGCTAGTGGCAGACGGGTGAGTAACA
CGTGGGAACGTACCTTTCGGTTCGGAATAATTCAGGGAAACTTGGACTAATACCGGAT
AAGCCCTTCGGGGGAAAGATTCATCGCCGATAGATCGGCCCGCGTCTGATTAGCTAGT
TGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAG
CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT
GGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGATGAAGGCCTTAGGGT
TGTAAAGCACTTTTGTCCGGGAAGATAATGACTGTACCGGAAGAATAAGCCCCGGCTA
ACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGG
GCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGACTCTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCCAGGGCTCAACC
CTGGAATTGCCTTCGATACTGAGAGTCTTGAGTTCGGAAGAGGTTGGTGGAACTGCGA
GTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCAACT
GGTCCGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC
TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTGGGGTGCATGCACCTCAGTGG
CGCAGCTAACGCTTTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAA
AGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC
GCAGAACCTTACCAGCTTTTGACATGTCCGGTTTGATCGACAGAGATGTCTTTCTTCAG
TTCGGCTGGCCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT
GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGA
ACTCTAGGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGCGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCT
CATGGCCCTTACAGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAATGGGCAGCG
AAGGAGCGATCTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGTCTCAGTTCAGATTGCACTCTGCAA
CTCGAGTGCATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATA
CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTTACCCGAAG
GCGTCGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCGACCACGGTAGGCTCAGCGACTGGGGTGA
AGTCGTAAC
61
Идентификация штаммов с помощью метода секвенирования ITS региона
1. Изолят 1
Aspergillus sp. strain AQGWD
Query cover -100%
Identity -98.6%
Aspergillus flavus strain RG01
Query cover -100%
Identity -97.7%
Aspergillus nomius strain SGE19
Query cover -100%
Identity -97.6%
ATATGGTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAGATT
GATTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACG
CTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCGGAGAGGG
GACGACGACCCAACACACAAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGC
ATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGA
ATTCTGCAATTCACACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCA
AGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAG
ATCAGACAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGG
CGGCCATGAATGGCGGGCCCGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAG
GTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCCTACGG
AAGGATCATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAGCCCAACCTCCACCGTGTTTACTGTA
CCTTAGTTGCTTCGGCGGGC
2. Изолят 2
Talaromyces sp. isolate XI39
Query cover -100%
Identity -99.15%
Talaromyces cellulolyticus isolate KNU14-25
Query cover -97%
Identity -97.18%
Talaromyces funiculosus voucher MHE 27 MC
Query cover -98%
Identity -95.97%
GAGGTTGGCCGCGAGGCCCGCACTCGGTAATGATTCCTGTAGGGTGAACCTGCGGAAG
GATCATTACCGAGTGCGGGCCCTCGCGGCCCAACCTCCCACCCTTGTCTCTATACACCT
GTTGCTTTGGCGGGCCCACCGGGGCCACCTGGTCGCCGGGGGACGCACGTCCCCGGGC
CCGCGCCCGCCGAAGCGCTCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGAGTACTATG
AAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCA
GCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAAC
GCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCT
CAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTGTGGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGG
CGACGTCCGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAGGGACCTGC
GGGGGTTGGTCACCACCATGTTTTTTACCACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTAC
62
CCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGAAGATCATTACCGAGTGCGGGCCCTCGC
GGCCAACCTCCACTTGTCTCTATACACTGTTGCTTTGGCGGGC
3. Изолят 3
Alternaria alternata isolate TAS 2-1
Query cover -100%
Identity -100%
Alternaria alternata isolate SDM 2-1
Query cover -100%
Identity -100%
Alternaria alternata strain TD4
Query cover -100%
Identity -100%
ATCCTACCTGATCCGAGGTCAAAGTTGAAAAAAAGGCTTAATGGATGCTAGACCTTTG
CTGATAGAGAGTGCGACTTGTGCTGCGCTCCGAAACCAGTAGGCCGGCTGCCAATTAC
TTTAAGGCGAGTCTCCAGCAAAGCTAGAGACAAGACGCCCAACACCAAGCAAAGCTTG
AGGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCTTTGGAATACCAAAGGGCGCAATGTG
CGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGC
TGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAATTATTAAT
TTGTTACTGACGCTGATTGCAATTACAAAAGGTTTATGTTTGTCCTAGTGGTGGGCGAA
CCCACCAAGGAAACAAGAAGTACGCAAAAGACAAGGGTGAATAATTCAGCAAGGCTG
TAACCCCGAGAGGTTCCAGCCCGCCTTCATATTTGTGTAATGATCCCTCCGCAGGTTC
4. Изолят 4
Bacillus velezensis strain 157
Query cover – 99%
Identity –99.65%
Bacillus amyloliquefaciens strain LM2303
Query cover – 99%
Identity -99.65%
Bacillus polyfermenticus KJS-2
Query cover – 99%
Identity –99.65%
AGACCTYGGGTCTTATAAACAGAACGTTCCCTGTCTTGTTTAGTTTTGAAGGATCATTC
GATTCTTCGAGATGTTGTTCTTTGAAAACTAGATAACAGAAGTAATTCACATTCAATTA
GTAATGCAAGATATCACGTAGTGATTCTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACG
GTGGATGCCTTGGCACTAGGAGCCGATGAAGGACGGGACGAACACCGATATGCTTCGG
GGAGCTGTAAGCAAGCTTTGATCCGGAGATTTCCGAATGGGGAAACCCGG
5. Изолят 5
Bacillus velezensis strain NJAU-Z9
Query cover -97%
Identity -99.8%
Bacillus amyloliquefaciens strain WS-8
Query cover -97%
Identity -99.8%
63
Bacillus vallismortis strain NBIF-001
Query cover -97%
Identity -99.8%
CCCCCATTTCCGGGTTTCCCCATTCGGAAATCTCCGGATCAAAGCTTGCTTACAGCTCC
CCGAAGCATATCGGTGTTCGTCCCGTCCTTCATCGGCTCCTAGTGCCAAGGCATCCACC
GTGCGCCCTTTCTAACTTAACCGTTAAAAAGAATCACTACGTGATATCTTGCATTACTA
ATTGAATGTGAATTACTTCTGTTATCTAGTTTTCAAAGAACACGTTGGTGGAGCCTAGC
GGGATCGAACCGCTGACCTCCTGCGTGCAAAGCAGGCGCTCTCCCAGCTGAGCTAAGG
CCCCGTATTGGGTAAAGATGGTGGGCCTGAGTGGACTCGAACCACCGACCTCACGCTT
ATCAGGCGTGCGCTCTAACCAGCTGAGCTACAGGCCCATCTACCATATGAAAGAATCA
AAGTTCCTTCAAAACTAAACAAGACAGGGAACGTTCTGTTTATAAGACCCAAGGTCTT
ATATTCCGTTAAAATCCTTAGAAAGGAGGGGATCCAGCCGCAA
6. Штамм SH
Streptococcus pyogenes strain GURSA1
Ouery cover-100%
Identity-100%
TTTATCGTCTTATTTAGTTTTGAGAGGTCTTGTGGGGCCTTAGCTCAGCTGGGAGAGCG
CCTGCTTTGCACGCAGGAGGTCAGCGGTTCGATCCCGCTAGGCTCCATCAGGATACAA
TCCTACTAAACTTAATACAAGTGAAGTTGAACACGCAACTCACTTCCTAGGAAAATAG
ACAATCTTCGCTTGTGTGCAAGGCACACATGGTCAGATTCCTAATTTTCTACAGAAGTT
TCGCTAAAGCGAGCGTTGCTTAGTATCCTATATAATAGTCCATTGAAAATTGAATATCT
ATATCAAATTCCACGATCTAGAAATAGATTGTAGAAAAGTAACAAGAAAATAAACCGA
AAACGCTGTGATTATTTAATAAGTTTTCTAGTTTTAAAAAACTAGGTTAATAAGGTTAA
GTTAATAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCACTAGAAGCCGAAGAAGGACGTGACA
AACGACGAAATGCTT
7. Штамм DPRK-17
B. thuringiensis type strain ATCC 10792T
Query cover – 98%
Identity – 99.7%
B. cereus type strain ATCC 14579T
Query cover – 98%
Identity – 99.3%
TTTTGCGGCTGGATCCCCTCCTTTCTATGGAGAATTGATGAACGCTGTTCATCAATATA
AGTTTCCGTGTTTCGTTTTGTTCAGTTTTGAGAGAACTATCTCTCATATATAAATGTATG
TTCTTTGAAAACTAGATAACAGTGTAGCTCATATTTTTTAATTTTTAGTTTGGTTAAGTT
AGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGACACTAGGAGTCGATGAAGGACGGGACTAAC
GCCGATATGCTTCGGGGAGCTGTAAGTAAGCTTTGATCCGAAGATTTCCGAATGGGGA
AACCCGGA