Раздел 2. Нуклеиновые кислоты. Занятие 8. …biogen.chuvsu.ru/uch_2_biol/carantin/Lesson_8_2020.pdf6 типов: альфа,бета,дельта,...

Раздел 2. Нуклеиновые кислоты.

Занятие 8. Белки и ферменты, участвующие в репликации.

Обратная транскрипция

Предупреждение!На полях конспекта указывать ФИО и №

группы, не подписанные конспекты не принимаются!

План занятия

1. Структурная организация РНК. 2. Функции и разнообразие РНК. 3. Структуры РНК и их стабилизация. 4. Транскрипция и процессинг мРНК. Машины

репликации.5. Генетический код. 6. Транскрипция и процессинг тРНК. 7. Структура и функции рРНК.8. Клетка, как среда существования РНК.

3

Студент должен знать

1) теории абиогенеза и РНК мира;2) современная классификации РНК, понятие о РНК- и РН-омах, малые ядерные РНК, интерфирирующие РНК, цитоплазматические РКН, внеклеточные РНК и т.д.; 3) трехмерное строение РНК, виды РНК (одно- и двуцепочечные РНК);4) биологическое обеспечение стабильности РНК;5) функции различных видов РНК;6) внутриклеточные сигнальные системы, РНК-интерференция;7) понятие об эпигеноме и эпигенетичесой регуляции активности генома.

Студент должен уметь

1) решать простые задачи по молекулярной биологии;2) объяснить сущность регуляторных процессов,

осуществляемых с помощью различных видов РНК;3) объяснить логику образования и строения иРНК эукариот;4) собрать и обработать научно-образовательный материал в сети

интернет по теме занятий и сделать мультимедийноесообщение по заданию преподавателя.

Николай Константинович Кольцов

(1872-1940 г.)

Разработал гипотезу молекулярного строения и матричной репродукции хромосом («наследственные молекулы»), предвосхитившую главнейшие принципиальные положения современной молекулярной биологии и генетики (1928).

Всего существует 4 класса ферментов, осуществляющих матричный синтез нуклеиновых кислот:

1. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы (осуществляют репликацию — удвоение — молекул ДНК. В «норме» именно эти ферменты работают в ходе починки двойных разрывов ДНК); 2. РНК- зависимые ДНК-полимеразы, или обратные транскриптазы (синтезируют ДНК на матрице РНК); 3. ДНК-зависимые РНК-полимеразы (синтезируют РНК на матрице ДНК, отвечают за «считывание» генов —транскрипцию); 4. РНК-зависимые РНК-полимеразы (размножают молекулы РНК. Возможно, являются древнейшими из ферментов вообще).

Известны три способа репликацииКонсервативная репликация.Молекула ДНК служит матрицей для образования совершенно новой молекулы ДНК. В результате одна из образующихся клеток получает исходную молекулу ДНК, а другая – вновь синтезированную.Полуконсервативная репликация.Две цепи исходной молекулы ДНК расходятся вследствие разрыва слабых водородных связей между азотистыми основаниями. Каждая из них служит матрицей для образования новой цепи ДНК, а возникающие между азотистыми основаниями водородные связи соединяют старую и новую цепи, восстанавливая целостность молекулы. В результате каждая новая клетка получает гибридную молекулу ДНК, состоящую из одной старой и одной новой цепи (единственно верная).Дисперсная репликация.ДНК распадается на короткие фрагменты, используемые в качестве матриц для построения фрагментов двух новых молекул ДНК, которые затем каким-то образом соединяются между собой.

Полуконсервативный характер репликации был доказан Дж. Тейлором (в 1958 г.) на митотических клетках корешков бобов Vicia faba. Семена проращивали на среде, содержащей меченый 3Н‐тимидин (ТТФ, содержащий радиоактивныйводород). Радиоактивная метка включалась в ДНК, иобнаруживалась в хромосомах делящихся клеток спомощью радиоаутографии. Когда корешки перенесли в среду без метки, во вновь синтезированные цепи ДНК включался только немеченый тимидин.

После одного деления клеток в нормальной среде метку обнаруживали в обеих хроматидах метафазных хромосом, однако ее количество было меньшим наполовну,так как метка оставалась только в «материнской» нити ДНК, а вновь синтезированная нить была уже без метки. А послевторого деления - одна хроматида содержала метку, другая несодержала метки. Эти результаты согласуются с представлением о том, что хроматида состоит из одной молекулы ДНК, и ДНК реплицируется полуконсервативно. Позднее Дж. Тэйлор показал, что таким же образомреплицируются молекулы ДНК при удвоении хроматид (в S-фазе клеточного цикла) перед мейотическим делением.

Биологический смысл репликации ДНК:копирование генетической информации для переноса ее следующему поколению.

Этапы репликации:1. Инициация2. Элонгация3. Терминация

В настоящее время процесс репликации у прокариот достаточно изучен, однако с большой долей вероятности можно утверждать, что в большинстве клеток эукариот этот процесс протекает в основном одинаково.

Репликация ДНКпроцесс, обеспечивающий перенос информации с ДНК на ДНК, то есть

ДНК-копирование.

Принципы репликации:1. Комплементарность. 2. Антипараллельность. 3. Униполярность. 4. Потребность в затравке. 5. Прерывистость. 6. Полуконсервативность

Энергия, необходимая для синтеза, высвобождается при отщеплении пирофосфата, а катали-зируют реакцию особые ферменты – ДНК-полимеразы.

Понятие о матрице и затравке

Матрица для синтеза новых цепей -одноцепочечная ДНК.

Затравка – 3'-гидроксильный конец двуцепочечной ДНК, причем он должен быть спарен с матрицей.

Образование РНК-затравкипрокариоты

В ori районе (начало реп-ликации) есть 4 шпильки, они опознаются РНК-полимеразой.Вторая шпилька использу-ется в качестве матрицы для образования РНК-затравки 3'-конец которой используется для репликации ДНК полимеразой III.

У прокариот

Факторы репликации

ДНК-полимеразы

Топоизомеразы

Геликазы

Белки Альбертса

прокариоты

К репликации имеют отношение ДНК-полимеразы I и III.Полимераза III является репликазой, т.е.

синтезирует in vivo новые цепи ДНК. У ДНК-полимеразы I вспомогательная,

репаративная функция.ДНК-полимераза II имеет отношение лишь к

репарации

ДНК-полимеразыпрокариоты

ДНК-полимераза III-холоферментКлючевой фермент, ответственный за репликацию ДНК E. coli. Кор-фермент ДНК-полимеразы III состоит из трех субъединиц. Самая большая α-субъединица обладает полимеразной активностью, а ε-субъединица 3’→ 5’-экзонуклеазной активностью. Комплекс α и ε-субъединиц характе-ризуется более высокими полимеразной и 3’→ 5’-экзонуклеазной актив-ностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей θ-субъединицы корфермента пока не выяснена. Кроме указанных в состав ДНК-полимеразы III входят еще семь субъединиц:γ,β,δ,δ’,ψ… Таким образом, общая молекулярная масса ДНК-полимеразы III составляет 10³килодальтон. Роль β-субъединицы заключается в том, чтобы максимально снизить вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования. Точная функция других субъединиц неизвестна. ДНК-полимераза III обладает повышенным сродством к матрице и характеризуется более высокой эффективностью копирования, чем ДНК-полимераза I.

Отличительная черта холофермента ДНК-полимеразы III —исключительно высокая процессивность. Мерой процессивности является длина фрагмента вновь синтезированной макромолекулы, которую комплекс (или индивидуальные ферменты) способен образовывать в одном цикле, не диссоциируя от матрицы. Установлено, что холофермент ДНК-полимеразы III синтезирует ведущую цепь ДНК длиной в 50 ООО нуклеотидов Со скоростью более 500 нуклеотидов в секунду в одном цикле, ни разу не диссоциируя от ДНК-матрицы.

5’→ 3’-экзонуклеазная активность ДНК-полимераз I

Вторая реакция также заключается в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз идет с 5’-конца цепи ДНК к 3’-концу (5’→ 3’-экзонуклеазная активность). У разных участков ДНК-полимеразы I разная активность. Большой С- концевой участок (76 000 дальтон) проявляет 5’→3’-полимеразную и 3’→ 5’-экзонуклеазную активности. Малый, N-концевой, фрагмент (36 000 дальтон) обладает только 5’→ 3’-экзонуклеазной активностью. Большой фрагмент называется также фрагментом Кленова, он способен инициировать репликацию in vitro. 3’→ 5’-экзо-нуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого последующего нуклеотида и удаление ошибочно вставленного нуклеотида с растущего конца цепи ДНК. С помощью 5’→ 3’-экзонуклеазной активности вырезаются праймеры.

Ник-трансляция• ДНК-полимераза I способна удлинять 3’-конец одной из цепейДНК в месте разрывов и одновременно удалять нуклеотиды с 5’-конца того же разрыва. Этот процесс называется ник-трансляцией. Он играет ключевую роль в репарации повреждений ДНК.• В клетке E. coli имеется несколько сотен молекул ДНК-полимераз I. В целом ДНК-полимераза I имеет большее отношение к созреванию реплицирующейся ДНК, чемнепосредственно к полимеразным процессам в репликативной вилке.•ДНК-полимераза I и присущая ей экзонуклеазная активност играют большую роль в репликации и репарации хромосом-ной ДНК Е. coli. Экзонуклеазная активность 3' → 5' обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи.

ДНК-полимераза II• ДНК-полимераза II (мол.масса 90 кДа) представлена одной полипептидной цепью, обладает полимеразной и 3’→ 5’-экзонуклеазной активностями. Она плохо соединяется с одноцепочечными ДНК, но лучше работает с биспиральной ДНК, имеющей одноцепочечные бреши длиной в несколько десятков нуклеотидов. Она может заполнять пробелы междуфрагментами ДНК за счет полимеразной активности, но не способна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки (т.к. не обладает5’→3’-экзонуклеазной активностью) или осуществлять ник-трансляцию.

Преимущественно работает в процессах репарации.

Топоизомеразы- ферменты, изменяющие топологию ДНК

классы

релаксазы гиразы

уменьшают число зацеплений

увеличивают число зацеплений

Геликазы

У бктерий имеется две хеликазы – хеликаза Rep и хеликазаDnaB. Считается, что хеликаза, движимая гидролизом АТФ,однонаправленно «едет» по одной из цепей ДНК, расплетаяперед собой двойную спираль.Хеликаза Rep продвигается от 3'‐конца к 5'‐концу цепи ДНК,служащей матрицей для ведущей цепи ДНК.Хеликаза DnaB продвигается по противоположной цепи,служащей для синтеза запаздывающей цепи. Продвижениехеликаз идет в направлении вместе с репликативной вилкой.

SSB (single strand bind) Белки Альбертса

Эти белки содержат кластер положитель-но заряженных ами-нокислотных остат-ков, но общий заряд белка отрицателен и связываются только с одноцепочечной ДНК

SSB удерживают матричные цепи ДНК в репликативной вилке в одноцепочечном состоянии и защищают одноцепочечную ДНК от действия нуклеаз.

Этапы репликации

1. Репликация начинается с расплетания цепей ДНК ГЕЛИКАЗАМИ (или Rep-протеином) при использовании энергию АТФ. Скорость расплетания составляет около 6000 мин-1.

2. SSB-белки присоединяются к комплементарным цепям, удерживая их от ассоциации. По мере продвижения репликационной вилки SSB-протеины передвигаются по цепи, диссоциируя с одного места и присоединяясь на другом. Этот процесс не требует затрат энергии АТФ.

3. Синтезируется праймер-затравка. Наличие затравки является необходимым условием функционирования ДНК-полимераз В качестве затравки выступают маленькие отрезки молекул РНК, которые синтезируются при помощи фермента ПРАЙМАЗЫ. Праймаза – фермент, синтезирующий РНК‐праймеры для запуска синтеза ведущей цепи ДНК и запуска синтеза фрагментов Оказаки на запаздывающей цепи ДНК. Праймаза активируется ДНК‐хеликазой и находится с ней в комплексе, который называется праймасомой. Без РНК‐праймеров синтез ДНК начаться не может.

4. Элонгация. Когда синтез на одном из фрагментов Оказаки достигает праймера другого фрагмента, РНК-овый праймер удаляется имеющейся у полимераз 5'-3' полимеразной активностью и достраивается дезоксирибонуклеотидами. После этого сахарофосфатный остов между фрагментами сшивается ковалентной связью при помощи фермента ДНК-лигазы.

Репликация концов ДНК хромосом эукариот

Удаление РНК-праймеров после завершения синтеза линейных ДНК и заделывание образующихся между фрагментами брешей нуклеотидами ДНК приводит к тому, что дочерние цепи ДНК оказываются короче материнских на размер первого РНК-праймера (10-20 нукл.).

1. Выступающие 3'-концы материнских цепей узнаются ферментом теломеразой -содержащим помимо бел-ковой части еще и РНК, выполняющую роль матрицы для наращива-ния ДНК повторами.

2. Теломераза после-довательно наращивает материнские цепи, используя 3'-концы в качестве затравок.

3. Образующиеся длинные одноцепочечные концы служат матрицами для синтеза дочерних цепей традиционным репликативным механизмом.

Хромосомы соматических клеток фланкированымногократно повторенными гексамерами TTAГГГ,общая длина районов с повторами может достигать10 т. п. н.

В комплексе со специфическими белками такиетан-демные повторы образуют теломеры.

При репликации происходит укорочение теломер всреднем на 50 пар нуклеотидов.

Особенности репликация у эукариот

У эукариот ДНК закрепляется белками в нескольких местах на ядерной мембране. На каждом отдельном участке работает топоизомераза. Сколько участков, столько и ori

Моно- и полирепликонные системы

Репликация ДНК (отличие ферментных систем)

ДНК-полимеразы

Прокариоты Эукариоты

типы 5 типов:I – V тип

6 типов: альфа, бета, дельта,эпсилон, гамма, дзета

Участие в синтезе ДНК

обе цепи ДНК синтезируются ДНК-

полимеразой III

альфа – инициация,дельта – элонгация ведущей, эпсилон –отстающей цепи

У бактерий обнаружено пять ДНК-полимераз:ДНК-полимераза I задействована в восстановлении ДНК,

обладает и 5'-3', и 3'-5'-экзонуклеазным действием;ДНК-полимераза II участвует в репарации поврежденной

ДНК. Обладает способностью 5'-3'-удлинения цепочки и 3'-5'-экзонуклеазным действием;

ДНК-полимераза III — основная полимераза бактерий, обладающая также 3'-5'-экзонуклеазным действием;

ДНК-полимераза IV, ДНК-полимераза семейства Y;ДНК-полимераза V, ДНК-полимераза семейства Y,

принимающая участие в пропуске поврежденных участков ДНК.

ДНК-полимераза α — первая ДНК-полимераза, обнаруженная в клетках эукариот. Она представлена в клетке в виде прочного комплекса с ДНК-праймазой — ферментом, осуществляющим синтез РНК-затравок. Комплекс ДНК-полимераза α-праймаза является единственным у эукариот ферментативным ансамблем, способным инициировать синтез ДНК de novo. В ходе репликации в клеточных ядрах ДНК полимераза α-праймаза синтезирует затравку лидирующей нити в участке ori и затравки фрагментов Оказаки запаздывающей нити. Как правило, ДНК-полимераза не обладает корректорской 3'→5'-экзонуклеазной активностью. По-видимому, в ходе эволюции экзонуклеазный центр в данном ферменте редуцировался.

ДНК-полимераза β является наименьшей по размеру и самой простой по строению ДНК-полимеразой в клетках эукариот. Основная функция ДНК-полимеразы β в клетке связана с эксцизионной репарацией ядерной ДНК (заполнение пробелов при репарации).

ДНК-полимераза δ — гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы (125—130 кДа) и субъединицы 48 — 55 кДа, необходимой для преодоления ферментом структурных барьеров в природных однонитевых матрицах и для связи с фактором процессивности PCNA (от англ. Proliferating Cell Nuclear Antigen –ядерный антиген пролиферирующих клеток). Три молекулы PCNA образуют кольцевой тример с отверстием для двунитевой ДНК в центральной части, который представляет собой перемещающуюся по ДНК подвижную платформу или «скользящую скрепку» в форме тора (бублика), удерживающую ДНК-полимеразу δ в ходе полимеризации на матрице и обеспечивающую высокопро-цессивный синтез ДНК. Хотя PCNA и прокариотический фактор процессивности субъединица β ДНК-полимеразы III Е. coli имеют низкую гомологию на уровне первичной структуры, оба белка формируют близкие по пространствен-ной геометрии структуры «скользящей скрепки».

ДНК-полимераза ε, выделена из клеток HeLa, содержит два полипептида — каталитический 261 кДа и полипептид 55 кДа. Каталитический полипептид обладает ДНК-полимеразной и 3'→5‘-экзонуклеазной активностями. Особенностью холофермента ДНК-полимеразы ε по сравнению с ДНК-полимеразой δ является его меньшая зависимость от вспомогательных факторов (PCNA, RFС – репликативный фактор С и RPA – репликативный ядерный белок А), а также низкая (почти на порядок) скорость синтеза ДНК. Это различие, возможно, связано с разной функцией ДНК-полимераз в репликативной вилке. Один холофермент, ДНК-полимераза δ осуществляет быстрый и процессивный синтез лидирующей нити, используя для элонгации единственную затравку, синтезируемую ДНК-полимеразой α-праймазой в районе ori, и диссоциирует только по достижении конца репликона, тогда как несколько холоферментов ДНК-полимеразы ε могут одновременно синтезировать фрагмены Оказаки в «зоне Оказаки», удлиняя затравки, синтезируемые ДНК-полимеразой α-праймазой в начале каждого фрагмента.

ДНК-полимераза γ локализована в митохондриях, ее функция связана с репликацией и репарацией митохондриальной ДНК, она кодируется ядерным геномом. ДНК-полимераза γ способна направлять высокопроцессивную полимеризацию на однонитевых ДНК-матрицах в отсутствие вспомогательных факторов. Охарактеризованы также другие ДНК-полимеразы эукариот: ή, θ, REV1 и др. Все эти ферменты участвуют в репарации ДНК. В последние годы наряду с углубленным изучением строения и свойств отдельных ДНК-полимераз эукариот большое внимание уделяется взаимодействию этих ферментов со вспомогательными факторами и механизму функционирования их в составе многокомпонентных репликативных и репаративных комплексов. Список белков, взаимодействующих с ДНК-полимеразами, постоянно растет и включает не только известные факторы PCNA, RFC и RPA, но и ключевые факторы регуляции клеточного метаболизма, такие, как белки группы МСМ (minichromosome maintenance factors), факторы узнавания участков ori репликации ORC (origin recognition complex) и др.

Таким образом, поскольку эукариотические ДНК-полимеразы α и βлишены 3′ → 5 ′ и 5 ′ → 3 ′ -экзонуклеазных активностей, становится понятным участие ДНК-полимераз δ и ε в процессе репликации ядерной ДНК в качестве корректирующих ферментов, а ДНК-полимеразе ε приписывают также функцию удаления РНК-праймеров на концах фрагментов Оказаки.

Еще раз. Основные функции ферментов репликации:•ДНК‐топоизомеразы ‐ ферменты изменяющие степеньсверхспирализации ДНК, путем внесения одноцепочечныхили двухцепочечных разрывов в ДНК.•ДНК‐хеликаза – фермент разделяющий цепидвухцепочечной ДНК на одинарные цепи.. •ДНК‐праймаза — это фермент РНК‐полимераза,синтезирующий короткий фрагмент РНК, называемыйпраймером, комплементарный одноцепочечной матрицеДНК.•ДНК‐полимеразы ‐ ферменты катализирующие синтездочерних цепей на матрице ДНК по принципукомплементарности.•ДНК‐лигаза – фермент катализирующий сшиваниеодноцепочечных фрагментов ДНК.

БИОСИНТЕЗ ДНК НА РНК МАТРИЦЕ

У некоторых вирусов геномом служит не ДНК, а РНК. Среди них выделяется группа ретровирусов (ретро –обратный), которые способны осуществлять синтез ДНК на РНК матрице, т. е. противоположно тому, что происходит в клетках высших организмов. Такой процесс получил название обратной транскрипции, а фермент, его осуществляющий, был назван обратной транскриптазой, или ревертазой.Вирусный фермент – обратная транскриптаза – синтезирует сначала одну нить ДНК на матрице вирусной РНК. Затем уже на матрице синтезированной нити ДНК фермент клетки ДНК-полимераза достраивает вторую, комплементарную ей нить. Образуется двунитевая молекула ДНК, котораяинтегрируется в хромосомную ДНК клетки-хозяина

РНК- полимераза работает как молекулярная машина, в которой есть различные детали, выполняющие свою функцию. Нависающая над "пастью" часть β΄-субъединицы – «заслонка» удерживает передний ДНК-дуплекс. После связывания с ДНК заслонка опускается, проходя путь в 30 Å, и зажимает ДНК так, чтобы она не могла выпасть в процессе транскрипции. Внутри "пасти" находится активный центр РНК - полимеразы, где непосредственно происходит комплементарное взаимодействие поступившего по боковому каналу рибонуклеозидтрифосфата с ДНК-матрицей.

Если прибывший нуклеотид комплементарен матрице, то он пришивается к свободному 3' –концу РНК. В реакции образования новой связи в участвуют два Mg2+.

Один постоянно находится в активном центре, а второй Mg2+ поступает с нуклеотидом и после образования новой связи между рибонуклеотидами уходит, затем поступает новый нуклеотид со своим новым Mg2+.При выходе из РНК-полимеразы ДНК-РНК гибрид должен быть расплетен. В этом участвует структура, называемая "шип". В транслокации, то есть перемещении РНК-полимеразы по нити ДНК, участвует α-спиральная структура, снизу вверх торчащая из β-субъединицы.

В перемещении по ДНК участвует элемент РНК-полимеразы F-спираль (α-спиральная структуры, точащая из β-субъединицы вверх в главный канал). F-спираль при этом изгибается, перемещается вместе с комплексомРНК-ДНК, освобождается от них и опять выпрямляется. Перемещается F-спираль за один шаг на 3,4 Ǻ. Именно такой шаг у РНК-полимеразы.

Обратная транскриптаза используется для транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК.В процессе внутриклеточного развития ретровирус проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина. В 1964 г. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. Усилия, направленные на выделение такого фермента, увенчались успехом, и в 1970 г. Темин с Мизутани, а также независимо от них Балтимор открыли искомый фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза.

Обратная транскриптаза

Обратная транскрипцияНобелевская премия по медицине и биологии 1975 была присужденаDavid Baltimore, Renato Dulbecco and Howard Martin Temin "за ихоткрытия, касающиеся взаимодействия между опухолевымивирусами и генетическим материалом клетки".

Дэвид Балтимор

Ренато Дульбекко

Говард Темин

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ

РНК выступает в роли матрицы для синтеза ДНК при обратной транскрипции ретровирусов (например, ВИЧ), ретротранспозонов и при поддержании длины теломер(повторяющихся последовательностей ДНК на концах хромосом, необходимых для их стабильности).

Никаких указаний на прямое участие РНК как матрицы в репарации хромосом, включая залечивание двухцепочечных разрывов (ДЦР), получено не было, несмотря на то, что РНК присутствует в ядре в большом количестве.

В большинстве организмов ДЦР устраняются за счёт гомологичной рекомбинации, или же за счёт негомологичного соединения концов разрыва.

Cостоит из двух субъединиц — α (65 кДа) и β (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. Обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной - использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) активностью РНКазы Н - гидролизующей РНК в составе гибрида РНК—ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Обратная транскриптаза

Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах.

Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер).

Праймером может служить одноцепочечныйсегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК.

Обратная транскриптаза

Обратная транскриптаза

Теломераза

В 1961г. Л. Хейфлик и П. Мурхед показали ограниченность репликативной способности нормальных фибробластов человека.

Когда нормальные эмбриональные клетки человека растут в наиболее благоприятных условиях, старение и смерть их неизбежно наступает после ~50 удвоений популяции.

ТеломеразаВ 1971г. А.М. Оловников предположил, что причина старения и смерти на клеточном уровне заключается в недорепликации ДНК-полимеразой (теломеразой) концов хромосом (теломер) при клеточных делениях. Это связано с использованием затравочных РНК-праймеров при синтезе ДНК от 5'-конца к 3'-концу и их последующим удалением. При этом 5'-конец реплики остается недореплицированным. С каждым актом репликации хромосом их концы укорачиваются на размер, занимаемый теломеразой. Этот размер - своеобразная "мертвая зона", в которой не происходит удвоение однотяжных ДНК при делениях клеток. И это происходит до тех пор, пока не начинаются утраты жизненно важных кодирующих последовательностей ДНК, граничащих с теломерами. Число укорочений теломер служит репликометром, определяющим количество делений, которые должна совершить нормальная клетка. После достижения минимального критического числа повторяющихся теломерных последовательностей TTAGGG, клетки теряют способность к делению. Так считалось до недавнего времени.

ТеломеразаГрейдер и Блэкберн на Tetrahymena обнаружили механизм противостояния эффекту «мертвых зон». Они открыли терминальную трансферазу -рибонуклеопротеиновый фермент, получивший название "теломераза". Теломеры после каждого деления клеток синтезируются теломеразой заново. Фермент достраивает 3' - конец теломер и, таким способом, удлиняет теломеры, компенсируя эффект "мертвой зоны". Теломераза оказалась необычной обратной транскриптазой, то есть РНК зависимой ДНК полимеразой со своей собственной матрицей РНК для синтеза коротких повторяющихся последовательностей концевых ДНК хромосом. Наиболее хорошо изучена матричная область РНК Tetrahymena thermophila. Эта область содержит 9 нуклеотидных остатков в позиции от 43 до 51 (5'-CAACCCCAA-3'). Из них только 7 нуклеотидных остатков (43-49) являются собственно матричными, они составляют активную часть теломеразы и определяют каталитические функции фермента. Теломераза обнаружена в экстрактах иммортализованных клеток человека. В отличие от нормальных смертных клеточных штаммов линии аномальных бессмертных клеток не стареют и продуцируют теломеразу. Поэтому теломеры иммортализованных клеток не укорачиваются при последовательных пассажах in vitro. Особенно эффективно такая защита от укорочений ДНК представлена у раковых клеток. В норме также обнаруживаются аналогичные процессы, например, в тканях плода и семенниках.

Альтернативный (ALT) механизм удлинения теломер (ALT - Alternative Mechanism for

Lengthening of Telomeres)В некоторых случаях теломеразная активность не выявляется, хотя сравнение паттернов терминального рестрикционного фрагмента (TRF) до и после иммортализации показывает, что удлинение теломердействительно произошло.В рамках ALT-пути имеет место необычный феномен синтеза ДНК "в отсутствие" кодирующей вещественной комплементарной матрицы ДНК или РНК.Природа механизма (или механизмов) ALT в настоящее время неизвестна, хотя есть предположение, не основанное на эксперименте, что здесь может работать механизм рекомбинационного удлинения теломер.

РНК зависимая РНК-полимераза колифага QbВ системе in vitro Qb-репликаза может работать как машина саморепликации молекул РНК. Этот фермент может синтезировать определенные последовательности коротких РНК без матрицы РНК. Аналогичный "безматричный" синтез РНК обнаружен для РНК полимеразы бактериофага T7 и синтеза РНК de novoпосредством ДНК-зависимой РНК-полимеразы фагов Т7, Т3 и SP6.

Репарация возможна и непосредственно на основе РНК-матриц, без предварительного изготовления ДНК-матрицы и без участия специфических ферментов — обратных транскриптаз, кодируемых ретротранспозонами.В данном случае обратная транскрипция небольших фрагментов РНК осуществляется не специализированными обратными транскриптазами, а самыми обычными ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами (ферментами первой группы)

Обратная транскрипция без обратной транскриптазы

Передача наследственной информации

без ДНК и РНК !!!

Самое непонятное в понимании сущности прионов - факт вирусоподобной штаммовой специфичности в патогенезе,

вызываемом разными типами PrPsc (их известно более 20), при видимом отсутствии у них ДНК или РНК, то есть генетического

аппарата.

Дрожжевые прионы (Psi+ и Sup35) у Saccharamyces cerevisiaeпередают генетические наследуемые признаки без участия ДНК или РНК.

[University of Chicago Medical Center press release, 1997]

РНК интерференцияНобелевскую премию за открытия в области медицины и физиологии в 2006 году получили в равных долях американские ученые Эндрю Файр (Andrew Z. Fire. Гражданин США. Профессор кафедры патологии и генетики Медицинской школы Стэнфордскогоуниверситета, США) и Крэйг Меллоу (Craig C. Mello. Гражданин США. Профессор кафедры молекулярной медицины Медицинской школы Университета Массачусетса, США) за "открытие РНК-интерференции - подавления генов двухцепочечной РНК".Малая интерферирующая РНК (siRNA) обладает способностью "выключать" гены, воздействуя на процесс передачи "инструкций" между ДНК и всей остальной «машинерией» клетки. Обладает исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени. Основная функция этого механизма – защита наследственной информации. Механизм, связанный с siRNAпредохраняет нас как от спорадических мутаций, так и от внешних атак на нашу наследственную информацию.

РНК-интерференция (RNAi, RNA interference) — специфическая деградация молекул РНК с помощью образования двухцепочечных молекул РНК (siRNA) и их избирательной деградации

В класс малых РНК включают молекулы, содержащие от 20 до 300 нуклеотидов. За эффект РНК - интерференции отвечают самые короткие из них - siRNA, состоящие всего из 21-28 (у млекопитающих из 21-23) нуклеотидов. Особенностью этих молекул является то, что они, в отличие от большинства других клеточных РНК, состоящих всего из одной цепи нуклеотидов, являютсядвунитчатыми. Нуклеотиды с противоположных нитей (цепей) siRNA спариваются друг с другом по тем же законам комплементарности, которые формируют двунитчатые цепи ДНК в хромосомах. Кроме того, по краям каждой из цепей siRNA всегда остается два неспаренных нуклеотида.

На первом этапе с молекулой siRNA связываются белки-ферменты хеликаза и нуклеаза, формируя комплекс RISC (RNA-induced silencing complex; silencing - замолкание, так в англоязычной и специальной литературе называют процесс «выключения» гена). Хеликаза раскручивает нити siRNA, в результате чего они расходятся. Одна из этих нитей, к которой прикреплен фермент нуклеаза, может теперь связаться с комплементарным участком однонитчатой мРНК, позволяя нуклеазе разрезать ее. Разрезанные же участки мРНК подвергаются действию других клеточных РНКаз, которые доразрезают их на более мелкие куски.

• На первом этапе с молекулой siRNA связываются белки-ферменты хеликаза и нуклеаза, формируя комплекс RISC (RNA-induced silencing complex; silence - англ. молчать, замолкать; silencing -замолкание, так в англоязычной и специальной литературе называют процесс «выключения» гена). Хеликаза раскручивает нити siRNA, в результате чего они расходятся. Одна из этих нитей, к которой прикреплен фермент нуклеаза, может теперь связаться с комплементарным участком однонитчатой мРНК, позволяя нуклеазе разрезать ее. Разрезанные же участки мРНК подвергаются действию других клеточных РНКаз, которые доразрезают их на более мелкие куски.

• На первом этапе с молекулой siRNA связываются белки-ферменты хеликаза и нуклеаза, формируя комплекс RISC (RNA-induced silencing complex; silence - англ. молчать, замолкать; silencing -замолкание, так в англоязычной и специальной литературе называют процесс «выключения» гена). Хеликаза раскручивает нити siRNA, в результате чего они расходятся. Одна из этих нитей, к которой прикреплен фермент нуклеаза, может теперь связаться с комплементарным участком однонитчатой мРНК, позволяя нуклеазе разрезать ее. Разрезанные же участки мРНК подвергаются действию других клеточных РНКаз, которые доразрезают их на более мелкие куски.

• Такие «вторичные» молекулы смогут специфично связываться не только с тем участком вирусной мРНК, к которому была направлена «первичная» молекула, но и с другими участками, что резко усиливает эффективность клеточной защиты.

• Таким образом, у растений и низших животных организмов siRNA являются важным звеном своеобразного «внутриклеточного иммунитета», позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужую РНК. В том случае, если в клетку проник РНК -содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться.

• Если же вирус содержит ДНК, система siRNA будет мешать ему производить вирусные белки (так как необходимая для этого мРНК будет распознаваться и разрезаться), и с помощью этой стратегии, замедлит его распространение по организму.

У млекопитающих работает еще и другая система защиты. При попадании в «зрелую» клетку чужой РНК, длина которой больше 30 нуклеотидов, клетка начинает синтез интерферона. Интерферон, связываясь со специфическими рецепторами на клеточной поверхности стимулирует в клетке группу генов в результате чего в клетке синтезируются ферменты, которые тормозят синтез белков и расщепляют вирусные РНК. Кроме того, интерферон действуя на соседние, еще не зараженные клетки блокирует распространение вируса.

Названия «interferon» и «(RNA) interference» происходят от общего корня. Но есть у них и одно очень существенное различие: если интерферон при первых признаках вторжения просто «замораживает» работу клетки, не позволяя (на всякий случай) производство многих, в том числе и «невиновных» белков в клетке, то система siRNA отличается чрезвычайной разборчивостью: каждая siRNAбудет распознавать и уничтожать только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции.

В этом и заключается основное преимущество малых РНК: ни один из блокаторов генов не обладает такой исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени. Однако, как видно на примере многих опасных вирусных заболеваний у людей, ни иммунная, ни интерфероновая защита не всесильны, так что нам самое время позаимствовать у кого-нибудь передовой опыт в борьбе с вирусами. Почему бы не у растений или у насекомых? Ни те, ни другие не обладают системой адаптивного иммунитета. Чтобы выжить, растения были вынуждены «изобрести» РНК - интерференцию, которая до сих пор успешно защищает их клетки от внедрения вирусов. Появляется вполне закономерный вопрос: нельзя ли применить этот же подход в отношении клеток животных и людей?

• Геном любого многоклеточного организма включает в себя множество элементов, которые когда-то были привнесены в него в процессе эволюции извне, например как результат встраивания вируса. На их фоне всего лишь 1 процента собственно генов, кодирующих наши клеточные белки, кажутся такой же маловажной деталью, как и siRNA среди огромного разнообразия своих больших «сестер».

• Итак, основная «специальность» siRNA в клетке – это:- блокирование тех генов, которые соответствуют одной

из цепочек внутри siRNA,- защита от проникновения вирусов путем активаций

комплекса ферментов RISC. Растения и насекомые изобрели своеобразный путьусиления защитного действия siRNA. Присоединяясь к цепи мРНК, участок siRNA может с помощьюкомплекса ферментов, называемого DICER, сначаладостроить вторую цепочку мРНК, а затем разрезать ее в разных местах, создавая, таким образом, разнообразные«вторичные» siRNA памяти. Они, в свою очередь, формируют RISC и проводят мРНК через все стадии, о которых шла речь выше, вплоть до ее полногоуничтожения.

• LINEs, SINEs, остатки вирусной ДНК и транспозоны, за свою способность к перемещениям именуемые подвижными, или мобильными элементами генома, представляют значительную опасность для наших хромосом. «Чужие среди своих», они при определенных обстоятельствах могут поднять бунт и привести к внутриклеточному хаосу.

• Некоторые из них - остатки вирусов, или протоонкогены- способны при «включении» вызывать рак;

• мобильные элементы, размножаясь и перемещаясь, меняют структуру хромосом, что может привести к мутациям. Их перемещения внутри генома так индивидуальны и непредсказуемы, что положение некоторых из них может служить «молекулярным паспортом», точно определяющим личность хозяина, что уже используется на практике.

Система внутриклеточных siRNA выполняет «надзирательскую» функцию за поведением мобильных элементов. Кроме того, ошибки в развитии органов и тканей при отключении генов, кодирующих систему siRNA у подопытных животных, а также ее активность в «незрелых» клетках указывают на то, что механизм РНК - интерференции активно участвует в регуляции программы «созревания» клеток и, как следствие, может играть одну из ключевых ролей в формировании целостного организма.Еще одна из предполагаемых нормальных функций siRNA -отслеживание неправильно обработанных копий других типовРНК в клетке.Имеются данные, что в некоторых случаях siRNA, воздействует прямо на ДНК, изменяя структуру хроматина и способствуя длительному «замолканию» одних, и, возможно, активизации других генов.