Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｉｎｎａｍｙｌ　Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ Ｐｅａｒ　Ｆｒｕｉｔ

　中国南方果树／ＳＯＵＴＨ　ＣＨＩＮＡ　ＦＲＵＩＴＳ　２０１２；４１（３）：４０～４５

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研究报告 ·落叶果树·

梨果实中肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析

陶书田１，赵　梅１，张　彪１，Ｋｈａｎｉｚａｄｅｈ　Ｓｈａｈｒｏｋｈ２，张绍铃１

（１南京农业大学梨工程技术研究中心，南京，２１００９５；

２Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｒｅ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ａｇｒｉ－Ｆｏｏｄ　Ｃａｎａｄａ）

　收稿日期：２０１１－１１－２２；修回日期：２０１２－０３－１２基金项目：国家自然科学基金（３１０００８８８）；现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 建 设 专 项 资 金（ＣＡＲＳ－２９）；江 苏 省 博 士 后 科 研 基 金

（１００２０１８Ｂ）资助。

作者简介：陶书田，男 ，讲师，博士，研究方向为果实品质形成机理。电话：（０２５）８４３９６４８５，Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｏｓｔ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ通信作者：张绍铃，电话：（０２５）８４３９６５８０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｎｚｓｌ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

摘　要：肉桂醇脱氢酶（ＣＡＤ）是木质素生物合成过程中的一个关键酶。本研究分别提取了“砀山

酥梨”及“幸水”梨果肉总ＲＮＡ，并通过ＲＴ－ＰＣＲ、克隆和测序，成功获得了２个ＣＡＤ的大小为６８９

ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，并分别命名为ＰＢ－ＣＡＤ（登录号：ＦＪ４７８１５１）和ＰＰ－ＣＡＤ（登录号：ＦＪ４７８１５２）。在

核苷酸水平上，这两个基因片段只有４个碱基的差异，编码相似性达９９．６％的两个氨基酸序列，该

序列由２２９个残基组成。通过蛋白质序列比较，发现梨果实ＣＡＤ与许多植物中ＣＡＤ氨 基 酸 序 列

极为相似，与 苹 果 Ｍａｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ （ＡＡＣ０６３１９）、梅Ｐｒｕｎｕｓ　ｍｕｍｅ（ＢＡＥ４８６５８）、枇 杷Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ

ｊａｐｏｎｉｃａ（ＡＢＶ４４８１０）和葡萄Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＣＡＯ２１８９０）的相似性分别达到９７．８％、９５％、９２．６％和８３．４％。

关键词：梨；肉桂醇脱氢酶；ＲＴ－ＰＣＲ中图分类号：Ｓ　６６１．２　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００７－１４３１（２０１２）０３－００４０－０６

Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｉｎｎａｍｙｌ　Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍＰｅａｒ　ＦｒｕｉｔＴａｏ　Ｓｈｕｔｉａｎ１，Ｚｈａｏ　Ｍｅｉ　１，Ｚｈａｎｇ　Ｂｉａｏ１，Ｋｈａｎｉｚａｄｅｈ　Ｓｈａｈｒｏｋｈ２，Ｚｈａｎｇ　Ｓｈａｏｌｉｎｇ１

（１Ｐｅａｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ，２１００９５；２ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ

Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｒｅ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ａｇｒｉ－Ｆｏｏｄ　Ｃａｎａｄａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｉｎｎａｍｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＣＡＤ）ｐｌａｙｓ　ａ　ｋｅｙ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｌｉｇｎｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｗｏ　ｃＤ－

ＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ　ａｓ　ＰＢ－ＣＡＤ （ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＦＪ４７８１５１）ａｎｄ　ＰＰ－ＣＡＤ （Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＦＪ４７８１５２），ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ＣＡＤ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｆｒｏｍ ‘Ｄａｎｇｓｈａｎｓｕｌｉ’

ａｎｄ‘Ｋｏｕｓｕｉ’ｐｅａｒ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂｏｔｈ　ｃＤＮＡｓ　ｗｅｒｅ　６８９ｂｐ　ｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ，ａｎｄ

ｄｉｆｆｅｒｅｄ　ｂｙ　ｏｎｌｙ　４ｂｐ　ｉｎ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ，ｔｈｅｙ　ｗｏｕｌｄ　ｅｎｃｏｄｅ　ｔｗｏ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｆ　２２９

ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｔｈａｔ　ｓｈａｒｅｄ　９９．６％ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ｅａｃｈ　ｏｔｈｅｒ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ

ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　９７．８％ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｔｏ　ＣＡＤ　ｆｒｏｍ　Ｍａｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（ＡＡＣ０６３１９），９５％ｔｏ　ＣＡＤ　ｆｒｏｍＰｒｕｎｕｓ　ｍｕｍｅ（ＢＡＥ４８６５８），９２．６％ｔｏ　ＣＡＤ　ｆｒｏｍＥｒｉｏｂｏｔｒｙａｊａ－

ｐｏｎｉｃａ（ＡＢＶ４４８１０）ａｎｄ　８３．４％ｔｏ　ＣＡＤ　ｆｒｏｍＶｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＣＡＯ２１８９０），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｅａｒ（Ｐｙｒｕｓ）；ｃｉｎｎａｍｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＲＴ－ＰＣＲ

　第３期 陶书田，等：梨果实中肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析

　　梨果实中的石 细 胞 是 一 类 厚 壁 组 织 细 胞，是 影

响梨 鲜 果 品 质 和 加 工 工 艺 的 关 键 因 素 之 一［１－２］。

Ｓｔｅｒｌｉｎｇ［３］，Ｒａｎａｄｉｖｅ和 Ｈａａｒｄ［４］的 研 究 报 告 表 明，

梨石细胞是由木质 素 在 细 胞 壁 沉 积 而 形 成，在 我 们

此前研究中发现“砀山酥梨”石细胞中木质素含量高

达３０％。植物细 胞 的 木 质 化 过 程 包 括 木 质 素 单 体

的合成、单体的转运和氧化聚合步骤，每一步都由多

种酶及其相应的 基 因 进 行 调 控［５－６］。肉 桂 醇 脱 氢 酶

（ＣＡＤ）催化木质素 单 体 合 成 的 最 后 一 步 反 应［７］，因

此ＣＡＤ是控制木质素生物合成途径的关键酶之一。

随着分子生物学 特 别 是 基 因 工 程 技 术 的 发 展，

许多植物的ＣＡＤ基因被克隆出来，但目前尚未见有

梨果实中ＣＡＤ基因 克 隆 的 报 道。本 研 究 选 用 石 细

胞多，肉质 粗 糙 的“砀 山 酥 梨”Ｐｙｒｕｓ　ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ

ｃｖ．Ｄａｎｇｓｈａｎｓｕｌｉ及 石 细 胞 少、肉 质 细 腻 的“幸 水”

Ｐｙｒｕｓ　ｐｙｒｉｆｏｌｉａ　ｃｖ．Ｋｏｕｓｕｉ果 实，运 用 ＲＴ－ＰＣＲ的

方法，扩增了梨果 肉 中 肉 桂 醇 脱 氢 酶（ＣＡＤ）基 因 的

片段，并进行了生物信息学分析，为进一步获得梨果

实ＣＡＤ基因全长及研 究 其 表 达 特 性 与 木 质 素 合 成

等相关代谢的调控机制提供理论依据。

１　材料与方法

１．１　材料

新鲜无损的砀山酥梨及幸水幼果采自江苏省高

邮市果树实验场，冰盒保存带回实验室，清洗后直接

取果肉提取总ＲＮＡ。

１．２　方法

１．２．１　总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ 第一链的合成 　

ＲＮＡ提 取 参 照 ＲＮＡｉｓｏ试 剂 盒（ＴａｋａＲａ）说 明 书。

以２μＬ总ＲＮＡ为模板，利用引物ｄＴ（１６）反转录合

成ｃＤＮＡ 第 一 链。２０μＬ反 应 体 系 为：ＭＬＶ　５×

ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）８μＬ，Ａｄａｐｔｏｒ－ｄＴ（１６）

１μＬ，ＲＮＡ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　０．５μＬ，ＭＬＶ　１μＬ，ＲＮＡ　２

μＬ，Ｈ２Ｏ　３．５μＬ。ＲＴ反应条件：３０℃，１０分钟；４２

℃，３０分钟；９９℃，５分钟；５℃，５分钟。

１．２．２　ＣＡＤ基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增与回收　通过检

索、比 对 ＧｅｎｅＢａｎｋ中 已 有 的ＣＡＤ基 因 序 列，利 用

ＤＮＡｍａｎ设 计 得 到 正、反 向 引 物，以 正 向 引 物

ＰＣＡＤＦ：５’－ＧＴＧＡＣＣＧＧ（Ａ／Ｔ）ＧＣＴＴＣ（Ａ／Ｔ）

ＧＧＴＴＡＣＡＴ－３’和 反 向 引 物 ＰＣＡＤＲ：５’－ＧＣ （Ｃ／

Ｔ）ＡＧＡＡＴＡＴＧＴＧＣＡ（Ａ／Ｔ）ＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣ－３’，

以合 成 的ｃＤＮＡ 第 一 链 为 模 板，进 行 ＲＴ－ＰＣＲ扩

增。２５ｕＬ反应体系包括１０×ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，Ｍｇ２＋

２．５μＬ，ｄＮＴＰ（２５ｍＭ）２．５μＬ，Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．

６２５μＬ，Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．６２５μＬ，Ｔａｑ　ｅｎｚｙｍｅ　０．２

μＬ，Ｈ２Ｏ　１５．０５μＬ，模 板ｃＤＮＡ　１μＬ。ＰＣＲ程 序

为：９４℃预变 性３分 钟，９４℃变 性３０秒，５１℃退

火４５秒，７２℃延伸９０秒，共３５个循环，最后７２℃延伸１０分钟，１０℃１０分 钟。ＰＣＲ扩 增 产 物 经１％琼脂糖凝胶 电 泳 检 测 后，利 用 ＵＮＩＱ－１０柱 式ＤＮＡ胶回收试剂盒回收目的片段。

１．２．３　基因的克 隆 与 测 序　将 回 收 的 目 的 扩 增 片

段连 接 到ｐＭＤ－１９Ｔｖｅｃｔｏｒ。按《分 子 克 隆 实 验 指

南》完成转化与 重 组 菌 筛 选 培 养 等 步 骤［８］。选 取 含

目的条带的单菌落，送上海英骏公司进行序列测定。

１．２．４　基因序列 及 推 导 氨 基 酸 序 列 分 析　测 序 结

果在ＮＣＢＩ中利用Ｂｌａｓｔ工 具 与 Ｇｅｎｂａｎｋ中 的 已 知

序列比较。应 用ＤＮＡｍａｎ，ＢｉｏＥｄｉｔ，ＭＥＧＡ等 分 析

核 苷 酸 及 推 导 氨 基 酸 序 列。在 ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ　２．０

ｓｅｒｖｅｒ上进 行 蛋 白 质 三 级 结 构 预 测（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．

ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ／），并 用 ＰｙＭｏｌ

Ｖｉｅｗｅｒ进行观察。

２　 结果与分析

２．１　梨果实中ＣＡＤ基因ｃＤＮＡ的克隆

采用１％琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 ＲＮＡ完 整 性。

图１显 示２８ＳｒＲＮＡ和１８ＳｒＲＮＡ 共２条 明 显 的

带，从两条带的亮度判断，ＲＮＡ有较好的完整性，说

明本研究成功提取了梨果实的ＲＮＡ，可以进行ＲＴ－

ＰＣＲ扩增。

图１　砀山酥梨（Ａ）和幸水（Ｂ）果实ＲＮＡ

　　以砀山 酥 梨 及 幸 水 幼 果 果 肉 总 ＲＮＡ为 模 板，

通过ＲＴ－ＰＣＲ，获得了符合预期大小的ｃＤＮＡ片段，

该片段在两个品种中大小均为６８９ｂｐ（见图２）。将

目 的 片 段 进 行 回 收 纯 化 后 连 接 到ｐＭＤ－１９Ｔ载 体

上，转化大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α，挑

取白斑单菌落在液体培养基中振荡培养，取１μＬ菌

液进行ＰＣＲ扩增鉴定，选取阳性克隆进行测序。

１４

中 国 南 方 果 树／ＳＯＵＴＨ　ＣＨＩＮＡ　ＦＲＵＩＴＳ　　　　　　　　　第４１卷

图２　梨果实肉桂醇脱氢酶基因片段的ＰＣＲ扩增

２．２　核苷酸与蛋白质序列分析

通过ＲＴ－ＰＣＲ方 法 分 别 在 砀 山 酥 梨 和 幸 水 果

实中克隆 得 到 了 梨ＣＡＤｃＤＮＡ片 段，分 别 命 名 为

ＰＢ－ＣＡＤ（登 录 号：ＦＪ４７８１５１）和ＰＰ－ＣＡＤ（登 录 号：

ＦＪ４７８１５２），他们的碱基序列如图３所示。两者长度

都为６８９ｂｐ，Ｇ／Ｃ含量分别为４３．２５％和４３．１１％，

都编码２２９个 氨 基 酸，预 测 分 子 量 都 为２４．８ＫＤａ。

在核苷酸 水 平 上，两 者 的 序 列 同 源 性 达 到９９．５％（见图３），只 有４个 碱 基 的 差 异。而 在 氨 基 酸 水 平

上，两者相似性达到９９．６％（见图４），只有１个氨基

酸残基的差异。为了进一步验证这两个基因序列各

自的准确性，我 们 再 次 在 砀 山 酥 梨 和 幸 水 的ｃＤＮＡ克隆中分别随机筛 选 了６个 阳 性 克 隆 进 行 测 序，结

果表 明 重 复 之 间 的 测 序 结 果 没 有 任 何 差 异。经

ＧｅｎｅＢａｎｋ　ＢＬＡＳＴ检索显示，在氨基酸水平上，本研

究从砀山酥梨和幸水获得的两个氨基酸序列与许多

植 物 中 ＣＡＤ 氨 基 酸 序 列 极 为 相 似，其 中 与 梅

Ｐｒｕｎｕｓ　ｍｕｍｅ（ＰＲＭＵ－ＣＡＤ，ＢＡＥ４８６５８）、葡萄Ｖｉ－ｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ （ＶＩＶＩ－ＣＡＤ，ＣＡＯ２１８９０）、枇 杷Ｅｒｉｏ－ｂｏｔｒｙａｊａｐｏｎｉｃａ （ＥＲＪＡ－ＣＡＤ，ＡＢＶ４４８１０）和 苹 果

Ｍａｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ （ＭＡＤＯ－ＣＡＤ，ＡＡＣ０６３１９）的 相

似性分别达到９２．６％、８３．４％、９５％和９７．８％（见图

５），说明ＰＢ－ＣＡＤ和ＰＰ－ＣＡＤ都 是ＣＡＤ蛋 白 质 家

族成员之一。

图３　ＰＢ－ＣＡＤ 和ＰＰ－ＣＡＤ 核苷酸序列比对

２４

　第３期 陶书田，等：梨果实中肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析

图４　６个ＣＡＤ 氨基酸序列比对

２．３　进化树分析

为进一步分析ＣＡＤ基因的系统进化关系，通过

ＭＥＧＡ３．１构建ＰＢ－ＣＡＤ和ＰＰ－ＣＡＤ与 其 他１０种

植物 ＣＡＤ蛋 白 序 列 之 间 的 进 化 树，并 进 行 Ｂｏｏｔ－

ｓｔｒａｐ检测。结果显示，这１２种植物ＣＡＤ序列都有

较高的同源性和较近的亲缘关系。我们从砀山酥梨

和幸水中得到的ＣＡＤ蛋 白 形 成 特 异 的 一 个 种 群 聚

合 在 一 起，同 时 与 苹 果 （蔷 薇 科 苹 果 属，

ＡＡＣ０６３１９），梅（蔷 薇 科 李 属，ＢＡＥ４８６５８），枇 杷（蔷

薇 科 枇 杷 属，ＡＢＶ４４８１０），葡 萄（葡 萄 科 葡 萄 属，

ＣＡＯ２１８９０）的亲缘关系最近（见图５）。

２．４　ＣＡＤ疏水性及三级结构预测

通过ＢｉｏＥｄｉｔ软件，使 用 Ｋｙｔｅ和Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ的 方

法选择疏水等级 来 计 算 本 研 究 已 鉴 定 的２个ＣＡＤ氨基酸序列以及４个 来 自 其 他 物 种 的ＣＡＤ基 因 蛋

白疏水面平均 数 Ｍｅａｎ，进 行 疏 水 性 分 析（见 图６）。

结果表明，这６种ＣＡＤ疏水性峰值都较高的区域有

１０－１５、６５－７５、１１５－１２０、１８０－１９０和１９５－２０５，

说明他们具有相似 的 疏 水 性，且 都 分 布 于 部 分α－螺

旋和β－折叠区域中（见图７）。

图５ＵＰＧＭＡ 法构建ＰＢ－ＣＡＤ、ＰＰ－ＣＡＤ 与

其他植物ＣＡＤ蛋白质系统进化树

３　讨论

肉桂 醇 脱 氢 酶（ｃｉｎｎａｍｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎ－

ａｓｅ，ＣＡＤ，ＥＣ　１．１．１．１９５）是木质素合成途径中

第一个被研究的酶［９－１０］。它是木质素合成 过 程 中 关

键酶之一，催化多种不同的肉桂醛（香豆醛、芥子醛、

松柏醛等）生成木质素单体的前体物质。自１９９２年

３４

中 国 南 方 果 树／ＳＯＵＴＨ　ＣＨＩＮＡ　ＦＲＵＩＴＳ　　　　　　　　　第４１卷

从烟草Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ茎 部 分 离 得 到ＣＡＤ基 因

以来［１１］，ＣＡＤ基 因 及 其 同 源 基 因 在 多 种 植 物 中 被

报道，如毛 果 杨×美 洲 黑 杨［１２］、火 炬 松［１３］等，并 且

转基因方法也被 应 用 于 对ＣＡＤ功 能 的 研 究，例 如，

抑制ＣＡＤ活性的转 基 因 烟 草 中，ＣＡＤ的 活 性 为 正

常活性的１０％ ，然 而 并 没 有 改 变 烟 草 的 发 育 及 细

胞中木质素的总量［１４－１５］。反义ＣＡＤ转基因苜蓿［１６］

和杨树 ［１７］的木质素含 量 也 未 明 显 降 低，仅 特 殊 组

分松柏醛（Ｃｏｎｉｆｅｒｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ）明显增加。

　　我国是世界上 的 产 梨 大 国，梨 的 种 植 面 积 和 产

量均一直居世界首 位，梨 也 是 我 国 农 业 产 业 结 构 调

整、优化中重要的 经 济 作 物。但 近 年 来 由 于 品 种 退

化及栽培管理不善等原因，梨品质逐年下降，突出表

现为石细胞增多，导致我国梨果实商品性下降，缺乏

市场竞争力。Ｒａｎａｄｉｖｅ和 Ｈａａｒｄ［４］通过薄层层析法

研究“Ｙｕｚｕｈａｄａ”梨 石 细 胞 碱 性 硝 基 苯 氧 化 产 物 和

硫酸铜氧化产 物 时 发 现 梨 果 实 石 细 胞 中 含 有１８％

的木质素，而Ｔａｏ等［１８］报道白梨品种砀山酥梨石细

胞中木质素含量高达３０％，因 此，木 质 素 的 合 成、转

运和沉积与石细胞的发育有密切的关系。但目前为

止，对于梨果实中参 与 木 质 素 形 成 的 肉 桂 醇 脱 氢 酶

（ＣＡＤ）研 究 并 不 多 见。本 研 究 根 据 前 期 研 究 结

果［１９－２１］，选择花后２０天，处 于 石 细 胞 发 育 关 键 期 的

砀山酥梨和 幸 水 梨 幼 果 通 过 ＲＴ－ＰＣＲ的 方 法 克 隆

获得了梨果 实ＣＡＤ基 因 的６８９ｂｐ片 段，分 别 命 名

为ＰＢ－ＣＡＤ（ＦＪ４７８１５１）和ＰＰ－ＣＡＤ（ＦＪ４７８１５２），并

登录ＧｅｎｅＢａｎｋ，两个片段均编码２２９个氨基酸。多

重比较显示，来源于砀山酥梨和幸水梨的两个ＣＡＤ基因 片 段 同 源 性 高 达９９．５％，而 在 氨 基 酸 水 平 上，

ＰＢ－ＣＡＤ 和ＰＰ－ＣＡＤ 所 编 码 的 氨 基 酸 序 列 与 其 他

植物中ＣＡＤ氨基酸序列极为相似，尤其与同属蔷薇

科的苹果Ｍａｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、枇杷Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａｊａｐｏｎｉ－

ｃａ和梅Ｐｒｕｎｕｓ　ｍｕｍｅ相似度较高，甚至达到９７％。

ＣＡＤ系 统 进 化 树 显 示，ＰＢ－ＣＡＤ和 ＰＰ－ＣＡＤ与 苹

果、枇杷、梅、葡 萄、桉 树、楸 树、杜 仲、烟 草、水 稻、车

４４

　第３期 陶书田，等：梨果实中肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析

前草都有较 高 的 同 源 性 和 较 近 的 亲 缘 关 系［２２］。这

些分析表 明，本 研 究 克 隆 的ＰＢ－ＣＡＤ 和ＰＰ－ＣＡＤ是梨果实中编码肉 桂 醇 脱 氢 酶 的 基 因，且 不 同 物 种

间 ＣＡＤ 基 因 具 有 一 定 的 保 守 性 和 进 化 的 稳

定性［２３］。

果肉细胞的木质化是梨果实石细胞形成的直接

原因，也是造成梨果品质下降的重要因素，肉桂醇脱

氢酶是木质素代谢 过 程 中 一 个 关 键 酶，其 表 达 强 度

和酶活性将会影响梨果实中木质素、石细胞的含量，

最终影响果品品质，因此，对其研究具有重要的理论

和实际意义。梨果肉ＣＡＤ基因的克隆和分析，为进

一步获得梨果实ＣＡＤ基 因 全 长 以 及 研 究 其 表 达 特

性与木质素合成等相关代谢的调控机制提供了一定

的理论依据。

参　考　文　献

［１］　张秀芬，王奎玲，刘庆华，等．ＰＰ３３３对茌梨果实发育

的影响 ［Ｊ］．莱阳农学院学报，１９９６，１３（２）：１２４－１２８［２］　钱银才，顾志康，姚建祥，等．４种 类 型 果 袋 套 袋 对 梨

不同品种 果 实 品 质 的 影 响 ［Ｊ］．浙 江 林 学 院 学 报，

２０００，１７（３）：２７６－２７９［３］　Ｓｔｅｒｌｉｎｇ　Ｃ．Ｓｃｌｅｒｅｉｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｅｘｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｂａｒｔ－

ｌｅｔｔ　ｐｅａｒｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９５４，１９：４３３－４４３［４］　Ｒａｎａｄｉｖｅ　Ａ　Ｓ，Ｈａａｒｄ　Ｎ　Ｆ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｎａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｓｔｏｎｅ

ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｐｅａｒ　ｆｒｕｉｔ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，

１９７３，３８：３３１－３３３［５］　Ａｎｔｅｒｏｌａ　Ａ　Ｍ，Ｌｅｗｉｓ　Ｎ　Ｇ．Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ｌｉｇｎｉｎ　ｍｏｄｉｆｉｃａ－

ｔｉｏｎ：ａ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ／ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｌｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｉｎ－ｔｅｇｒｉｔｙ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，６１：２２１－２９４

［６］　Ｂａｕｃｈｅｒ　Ｍ，Ｈａｌｐｉｎ　Ｃ，Ｐｅｔｉｔ－Ｃｏｎｉｌ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｌｉｇｎｉｎ：

ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｎ　ｐｕｌｐｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｒｉｔｉ－ｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，

２００３，３８：３０５－３５０［７］　Ｓｉｂｏｕｔ　Ｒ，Ｅｕｄｅｓ　Ａ，Ｍｏｕｉｌｌｅ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｉｎｎａｍｙｌ　ａｌｃｏ－

ｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ－Ｃ　ａｎｄ－Ｄ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｌｉｇｎｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｌｏｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，２００５，１７：

２０５９－２０７６［８］　萨姆布鲁克Ｊ，拉塞尔 Ｄ　Ｗ．分子克隆实验指南（第

三版）［Ｍ］．黄 培 堂，王 嘉 玺，朱 厚 础，等 译．北 京：科学出版社，２００２

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２８３－２８６［１０］Ｍａｎｓｅｌｌ　Ｒ　Ｌ，Ｇｒｏｓｓ　Ｇ　Ｇ，Ｚｅｎｋ　Ｍ　Ｈ．Ｅｎｚｙｍｉｃ　ｒｅ－

ｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｃｏｕｍａｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｖｉａ　ｐ－ｃｏｕｍａｒｏｙｌ－ＣｏＡ　ｔｏ　ｐ－

ｃｏｕｍａｒｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７４，１３：

２４２７－２４３５［１１］Ｋｎｉｇｈ　Ｔ　Ｍ　Ｅ，Ｈａｌｐｉｎ　Ｃ，Ｓｃｈｕ　ＣＨ　Ｗ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｃｉｎ－ｎａｍｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌ　Ｂｉｏｌ，１９９２，１９：７９３－８０１

［１２］Ｂａｕｃｈｅｒ　Ｍ，Ｃｈａｂｂｅｒｔ　Ｂ，Ｐｉｌａｔｅ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｄ　ｘｙｌｅｍａｎｄ　ｈｉｇｈｅｒ　ｌｉｇｎｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔａｂｉｌｉｔｙ　ｂｙ　ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ａＣｉｎｎａｍｙｌ　Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｉｎ　Ｐｏｐｌａｒ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９６，１１２（４）：１４７９－１４９０

［１３］Ｒａｌｐｈ　Ｊ，ＭａｃＫ　Ｊ　Ｊ，Ｈａｔｆｉｅｄ　Ｒ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ａｂｎｏｒｍａｌｌｉｎｇｎｉｎ　ｉｎ　ａ　ｌｏｂｉｏｌｌｙ　ｐｉｎｅ　ｍｕｔａｎｔ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，

２７７：２３５－２３９［１４］Ｈａｌｐｉｎ　Ｃ，Ｋｎｉｇｈｔ　Ｍ　Ｅ，Ｆｏｘｏｎ　Ｇ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｍａｎｉｐｕｌａ－

ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇｎｉｎ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｂｙ　ｄｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｉｎｎａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ．１９９４，６（３）：３３９－３５０

［１５］Ｙａｈｉａｏｕｉ　Ｎ，Ｍａｒｑｕｅ　Ｃ，Ｍｙｔｏｎ　Ｋ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ　ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｃｉｎｎａｍｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｌｉｇｎｉｎｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，１９９８，２０４：８－１５

［１６］Ｂａｕｃｈｅｒ　Ｍ，Ｂｅｒｎａｒｄ－Ｖａｉｌｈ　Ｍ　Ａ，Ｃｈａｂｂｅｒｔ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｉｎｎａｍｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ａｌｆａｌｆａ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）ａｎｄ　ｔｈｅｉｍｐａｃｔ　ｏｎ　ｌｉｇｎｉｎ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，３９：４３７－４４７

［１７］Ｌａｐｉｅｒｒｅ　Ｃ，Ｐｏｌｌｅｔ　Ｂ，Ｐｅｔｉｔ－Ｃｏｎｉｌ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｌｉｇｎｉｎｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｏｐｌａｒｓ　ｗｉｔｈ　ｄｅ－ｐｒｅｓｓｅｄ　ｃｉｎｎａｍｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｒ　ｃａｆｆｅｉｃａｃｉｄ　Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｈａｖｅ　ｏｐｐｏｓｉｔｅ　ｉｍ－ｐａｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ｋｒａｆｔ　ｐｕｌｐｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９９，１１９：１５３－１６３

［１８］Ｔａｏ　Ｓ，Ｋｈａｎｉｚａｄｅｈ　Ｓ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎａｔｏｍｙ，ｕｌｔｒａ－ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｌｉｇｎｉｎ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｏｎｅ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｗｏＰｙｒｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１７６：４１３－４１９

［１９］陶书田，张绍铃，乔勇进，等．梨果实发育过程中 石 细

胞团及几种相关酶活性变 化 的 研 究 ［Ｊ］．果 树 学 报，

２００４，２１（６）：５１６－５２０［２０］张绍铃，张振铭，乔勇进，等．不同时期套袋对幸 水 梨

果实品质、石 细 胞 发 育 及 其 相 关 酶 活 性 变 化 的 影 响

［Ｊ］．西北植物学报，２００６，２６（７）：１３６９－１３７７［２１］张振铭，张绍铃，乔勇进，等．不同果袋对砀山酥 梨 果

实品质的影响 ［Ｊ］．果树学报，２００６，２３（４）：５１０－５１４［２２］刘卫平，韩玉珍，赵德刚．杜仲肉桂醇脱氢酶基因克隆

及序 列 分 析［Ｊ］．中 国 农 业 大 学 学 报，２００３，８（１）：

２７－３０［２３］张鲁斌，谷　会，弓德强，等．植物肉桂醇 脱 氢 酶 及

其基因研究进展［Ｊ］．西北植物学报，２０１１，３１（１）：

２０４－２１１

（责任编辑：王新娟；英文编辑：董朝菊）

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