中山大学中山医学院 　朱振宇 教授、博士生导师 020-87330640 （ O ）

中山大学中山医学院

　朱振宇 教授、博士生导师020-87330640 （ O ）

Kary Mullis

PCR 技术最早由美国 Cetus 公司人类遗传研究室Kary Mullis 及同事于 1985 年发现并研制成功

Kary Mullis 因发明了“聚合酶链式反应”而获得 1993 年度诺贝尔化学奖。

　 PCR 是在模板 DNA 、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下， DNA 聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分变性、退火、延伸三步。经过若干循环后使目的 DNA 得以迅速扩增。

PCR 技术自 1989 年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点 .目前，临床 PCR 检验已经广泛使用商品化、规范化的试剂盒

● PCR 试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而 且是至关重要的

● 试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制 诸要素的影响，原材料的质量、方法学设计、包 装、运输和贮存等一系列的环节，都对试剂盒的 质量有决定性的影响

● 如何选择质量好的且符合自己实验室要的试剂盒？ ● 如何保证拿到手里的试剂盒具有好的质量 ?

　　　　 PCR 或 RT-PCR 试剂盒的组成

●核酸提取试剂 ●核酸扩增或反转录－核酸扩增试剂 ●产物检测试剂

　影响 PCR 试剂盒质量的因素 ●标本处理（核酸提取）方法、用于核酸扩 增的原材料及方法学设计 ●运输和贮存中所存在的问题

　　　　　核酸提取方法 ●经典方法：酚－氯仿抽提法，提取效率高、纯度好，但过程繁琐，易增加标本间相互污染的机会 ●简便方法：煮沸裂解法、玻璃粉或硅吸附法等 核酸提取除了要求操作简便外，更重要的是提取的效率及纯度，因此煮沸裂解法已被核酸纯化方法替代。

核酸提取的效率及纯度的检测

使用已知阳性（包括病毒含量）的溶血和脂血血清标本，用试剂盒提供的标本处理方法提取核酸后扩增检测，与无溶血和脂血的血清标本比较，观察测定结果的差异，从而判断提取方法的优劣。

核酸扩增所需的原材料

●寡核苷酸引物　 ●扩增缓冲液 　 ●dNTP 　 ●Taq 酶以及反转录酶等

寡核苷酸引物和探针 ●引物和探针纯度对试剂盒的质量的影响 纯度的高低可根据 260/280 吸光度比值来判断，如小于2.0，则需重新纯化 ●引物和探针的结合特异性 应减少假阳性或假阴性的出现

　　　　扩增缓冲液和 dNTP

●缓冲液包括： Tris-HCL(pH8.3~8.8) ， KCl 或 NaCl ，酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、 Tween20或 DTT ● Mg2+ ，过高或过低镁离子浓度均不利于扩增 ●四种 dNTP 的终浓度应相等

　　　　 Taq 酶以及反转录酶 ●酶浓度太高，则会出现非特异扩增；过低时，则靶序列产量很低 。 ●每 100μl 反应液中含 1～ 2.5U（比活性为 20U/pmol ） Taq DNA 聚合酶为佳

产 物 检 测

●杂交固相：通常为聚丙烯微孔板和硝酸纤维素膜，其质量高低直接影响产物的测定 ●标记物：最常用的是辣根过氧化物酶（ HRP ）

试剂盒的运输和贮存

●贮存：核酸扩增部分－ 20℃，产物检测部分试剂则应贮存于 2 ～ 8℃

●有效期 :在适当的贮存温度下， PCR 试剂盒的一般为 6个月

临床 PCR 试剂盒的分类

●临床 PCR 试剂盒按其测定目的可分为定性和定量测定两大类

●前者主要是用于未知病因患者的临床病因诊断

●后者则是用于已知患者治疗的动态观察

目前国内用于定性测定的 PCR 试剂盒的测定模式主要有 PCR － ELISA 和 PCR －膜上杂交（杂交流）和分子信标荧光检测等；用于定量测定的试剂盒的测定模式则主要有 TaqMan和 Amplisensor荧光定量以及 PCR － Elisa 定量等

临床 PCR 试剂盒的选用原则

●参考实际生产厂家的信息广告 ●参考同行对有关试剂盒的使用效果 ●参考有关机构的综合评价

如何选择适用的试剂盒

●根据使用目的的选择 ●根据所在实验室的技术特点选择 ●根据所在地区患者的承受能力选择

临床 PCR 试剂盒的质检 ●内外包装的检查（厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等 )，内包装的检查主要是看试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等 ●试剂盒测定性能的检验（采用“血清盘”进行 ）

●血清盘是由一定数量的原血清阴阳性样本、以及 3-5份系列稀释阳性样本所组成 ●原血清样本可用于判断 PCR 试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率；系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限

质检时，用待检 PCR 试剂盒测定血清盘中的各份样本，以血清盘的结果为标准，计算被检 PCR 试剂盒的灵敏度、特异性和符合率。

试剂盒评价四格表 血清盘结果（ + ）

血清盘结果（ - ）

合计

被检试剂盒结果 +

a b a+b

被检试剂盒结果 -

c d c+d

合计 a+c b+d a+b+c+d

表中 a为真阳性， b为假阳性，各项指标的计算公式如下：　特异性（ %） =d/b+d×100%　灵敏度（ %） =a/a+c×100 ％　符合率（ %） =a+d/a+b+c+d×100 ％ 理想情况下，试剂盒的特异性、灵敏度及符合率应为 100%。

此外，也可采用弱阳性（低拷贝数）质控物进行质检

　　对不同试剂生产厂家或同一厂家不同批号试剂盒采用同一弱阳性定值质控物检测，可比较出不同厂家或不同批号试剂盒的测定下限的差异。在每次临床检测中，同时带上弱阳性质控物与临床标本一起检测，对判断试剂盒的质量及其稳定性具有重要的参考价值。