Vyšetřování parametrů humorální imunity
Post on 21-Jan-2016
102 Views
Preview:
DESCRIPTION
Transcript
Vyšetřování parametrů humorální imunity
Imunochemické metody
• řada metod založených na principu reakce:
antigen (Ag) + protilátka (Ab) → imunokomplex (IK)
• stanovujeme buď Ag nebo Ab (obecně analyt)
Vyšetřování humorální imunity• Imunoprecipitace v roztoku - Nefelometrie
- Turbidimetrie
• Imunoprecipitace v gelu - Imunodifuze
- Elektroforéza
• Aglutinace (Ag – korpuskulární charakter; IgM, IgG)
• Komplementfixační testy (Ab+Ag+komplement)
• Imunoreakce se značenými protilátkami (EIA, ELISA, RIA)
• Imunobloting (southerblot, notherbloting,westernbloting)
• imunofluorescence
Imunoprecipitační křivka
Zákalové metody: nefelometrie a turbidimetrie
Použití: – používá se prostanovení vzorků o vyšších
koncentracích proteinů
– stanovení množství (koncentrací) běžných proteinů lidského séra (jednotlivé třídy Ig, CRP, RF, složky komplementu C3 a C4, C1 INH)
Nefelometrie
Princip: základem metody je měření intenzity odraženého světla od zákalu vzniklého reakcí Ag – Ab.
Z – zdroj (laser, výbojka)
K – kyveta se vzorkem
D – detektor D↑
Z →→→→ K (Ag-Ab)
↓
D
Nefelometrie
Vyhodnocení: dle kalibrační křivky sestavené pomocí standardu (Ag o známé koncentraci) a získaných odpovídajících hodnot intenzity odraženého světla
intenzita odraženého světla
koncentrace Ag
Princip: měří úbytek intenzity světla po jeho
průchodu kyvetou obsahující IK
Zdroj – Kyveta – Detektor jsou umístěny v jedné přímce:
Z →→→→ IK (Ag-Ab) → D
Vyhodnocení: dle kalibrační křivky
Turbidimetrie
Radiální imunodifuze
Postup: gel smícháme s Ab → inkubace s Ag → Ag difunduje do okolí a tvoří s Ab imunokomplexy (IK) → prstencový precipitát
Hodnocení: změří se průměr prstence a koncentrace Ag se odečte na kalibrační křivce
Použití principu RID: stanovení celkové hemolytické aktivity komplementu, funkční test C1 INH
Jednoduchá radiální imunodifuze ( S1 – S7 – standardy, V1 – V2 – vzorky)
Dvojitá imunodifuzeOuchterlony
• pasivní dvojitá imunodifuze - difunduje Ag i Ab• používá se pro stanovení extrahovatelných jaderných antigenů
Identické antigeny neidentické antigeny částečně identické antigeny
Aglutinace (shlukování)
• Antigen v této reakci má korpuskulární charakter (např. erytrocyt, bakterie, Ag navázaný na latexové častici…)
• Protože protilátka (IgG, IgM) má více vazebných míst, dochází ke shlukování částic či buněk na jejichž povrchu je lokalizovaný Ag
EIA – enzyme immunoassay• skupina metod
Společný princip: použije se Ag nebo Ab značená enzymem (Ag*, Ab*) → po navázaní s hledaným Ag nebo Ab ze vzorku je tak enzymem označen celý IK (Ag-Ab*, Ab-Ag*) → enzym reaguje s přidaným substrátem za vzniku výsledného produktu, který detekujeme
Vyhodnocení: pomocí kalibrační křivky (Ag o známé koncentraci – standardy- a k nim změřené vlastnosti produktu – př. intenzita zbarvení)
Použití: kvantitativní stanovení malých množství některých proteinů (př. specifických Ab, hormonů, cytokinů, TU markerů...)
EIA – enzyme immunoassay
Dělení EIA metod:
a) dle typu enzymu, substrátu a detekce výsledného produktu:
• ELISA (fotometrická detekce barevného produktu)• FEIA (fluorometrická detekce fluorescence výsledného
produktu)• LEIA (luminometrická detekce světla
uvolněného/emitovaného při změně chemické struktury substrátu)
b) dle postupu: • heterogenní x homogenní • kompetitivní x nekompetitivní
EIA – enzyme immunoassay
ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay
= heterogenní nekompetitivní sandwichová ELISA vícevrstevnatá (sandwichová) metoda – analyt (Ag nebo Ab), je v konečné fázi vázán mezi dvěma vrstvami:Ab-Ag-Ab* nebo Ag-Ab-Ab*
Princip: pevná fáze je pokryta př. Ag → přidáme vzorek s hledanou Ab → tvorba IK (Ag - Ab) → promytí → přidáme konjugát, tzv. „sekundární Ab“ → vzniká komplex Ag-Ab-Ab* → promytí → přidán substrát → enzymatická reakce → vznik barevného produktu
ELISA
Hodnocení ELISA: fotometr měří absorbanci (intenzitu zbarvení) vzniklého barevného produktu.
Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci vyšetřovaného vzorku a příslušná hodnota se odečítá pomocí kalibrační křivky
ELISA
ELISA
ELISA
EIA – enzyme immunoassayPozn:
FEIA – fluoroenzymoimunoanalýza
- výsledkem reakce je fluoreskující produkt
hodnocení: dle kalibrační křivky! - fluorometr měří intenzitu fluorescence
použití: př. stanovení specifických IgE
LEIA – luminoenzymoimunoanalýza
– výsledkem reakce je změna chemické struktury substrátu - způsobí uvolnění fotonů - světélkování
hodnocení: dle kalibrační křivky! - luminometr měří intenzitu emitovaného světla
použití: př. stanovování hladin specifických IgE, ECP, některých hormonů, TU markerů atd.
RIA – radioimunoanalýza
Princip: Ag nebo Ab se značí radioaktivním isotopem (rozdíl od metody EIA)→ následně označen IK
• vysoká citlivost a specifičnost• nevýhoda: vyšší nároky na technické vybavení,
bezpečnost práce
Použití: př. stanovování hladin některých hormonů, TU markerů, ...
Nepřímá imunofluorescence
Postup:1. inkubace pacientova séra (Ab) se substrátem (Ag) fixovaným na podložním sklíčku2. inkubace s anti-lidskou protilátkou značenou např. FITC (anti-human IgM/FITC, anti-human IgG/FITC, anti-human IgA/FITC)3. detekce pomocí fluorescenčního mikroskopu
Nepřímá imunofluorescence
top related