VALIDASI METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID …repository.usd.ac.id/20665/2/148114056_full.pdf · Secara farmakologis, kafein dalam tubuh mampu menstimulasi sistem syaraf pusat, stimulus
Post on 17-Jun-2019
217 Views
Preview:
Transcript
VALIDASI METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC) FASE TERBALIK PADA PENETAPAN
KADAR KAFEIN DALAM KOPI BUBUK MURNI ROBUSTA MEREK “X”
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Maria Clara
NIM: 148114056
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2018
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
VALIDASI METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC) FASE TERBALIK PADA PENETAPAN
KADAR KAFEIN DALAM KOPI BUBUK MURNI ROBUSTA MEREK “X”
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Maria Clara
NIM: 148114056
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2018
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Karya ini kupersembahkan kepada Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria yang
selalu memberikan hal terbaik untukku. Kepada Papa, Mama, dan Adik sebagai
bentuk pencapaian atas segala doa dan dukungan. Kepada keluarga dan sahabat
setia yang selalu mendukung. Serta almamater Universitas Sanata Dharma.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Syukur dan pujian penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
segala berkat dan karunia-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang
berjudul “Validasi Metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Fase Terbalik pada Penetapan Kadar Kafein dalam Kopi Bubuk Murni Robusta
Merek X” telah selesai. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi, Universitas
Sanata Dharma, Yogyakarta.
Selama proses penelitian berlangsung hingga selesai skripsi, penulis
mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,
penulis ingin menyampaikan terimakasih kepada:
1. Ibu Aris Widayati, M. Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt. selaku Ketua Program Studi Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
3. Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah
bersedia membimbing dengan segala kesabaran, dukungan, pengarahan, serta
saran selama proses penelitian hingga berakhirnya skripsi.
4. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku dosen penguji untuk segala
masukan, kritik, dan saran hingga skripsi ini tersusun.
5. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku dosen penguji untuk
segala masukan, bimbingan, dukungan, dan saran hingga skripsi ini tersusun.
6. Ibu Melania Perwitasari, M.Sc., Apt., Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., dan
Ibu Putu Dyana Christasani, M.Sc., Apt selaku Dosen Pembimbing Akademik
atas bimbingannya selama ini.
7. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Kepala Penanggung Jawab
Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin penggunaan
laboratorium untuk kepentingan penelitian.
8. Laboran Mas Bimo, Pak Ketul, Pak Kayat, Pak Parlan, Mas Kunto yang baik
hati membantu, menemani, dan mendukung proses penelitian di laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
9. Keluarga tercinta Papa Michael Dominicus Haryanto, Mama Septia Ping, dan
adik Christine Agnes yang selalu memberikan doa, dukungan, dan suka cita
setiap waktu.
10. Rekan istimewa pada penelitian ini, Yulius Denis Chrismaaji, untuk doa,
pengertian, dan bantuannya sehingga mampu melewati suka-duka proses
penelitian untuk menyelesaikan skripsi.
11. Rekan satu bimbingan “POLIMORFISME” yakni Maria Redita, Chintya
Halim, Yohana Alpionita, Petrus Febrian Widihantoro, Rabulas Nugroho,
Evan Julian, Jasvidianto Chriza, dan Dismas Adi Prabowo. Terima kasih atas
kerjasamanya.
12. Teman-teman FSM B 2014, serta sahabat/saudara terkasih yang mendukung:
Mbak Yokhe, Vincent, “Fant[4]stic” Marselly, Ham, dan Deni, “Enam Sejoli”
Momon, Anna, dan Ivon, “Sisterhood” Debby, Heppy, Eka, Fenny, Ranti,
Lenny, Devi, dan Maya, serta pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu per
satu.
Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan dalam penulisan
skripsi ini. Untuk hal tersebut, penulis mengharapkan saran dan kritik yang
membangun dari semua pihak. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat berguna bagi
pembaca dan ilmu pengetahuan.
Yogyakarta, 8 Januari 2018
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ vi
PRAKATA ....................................................................................................... vii
DAFTAR ISI .................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL ............................................................................................ x
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xi
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xii
INTISARI ......................................................................................................... xiii
ABSTRACT ....................................................................................................... xiv
PENDAHULUAN ........................................................................................... 1
METODE PENELITIAN ................................................................................. 3
HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 10
KESIMPULAN ................................................................................................ 19
SARAN ............................................................................................................ 19
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 20
LAMPIRAN ..................................................................................................... 22
BIOGRAFI PENULIS ………………………………………………………. 62
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR TABEL
Tabel I. Data resolusi kafein pada sampel kopi .................................................. 13
Tabel II. Data perolehan nilai AUC dari enam seri baku kafein ......................... 15
Tabel III. Data akurasi dan presisi baku kafein................................................... 17
Tabel IV. Data perolehan kembali adisi baku kafein .......................................... 18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Kriteria penerimaan akurasi .............................................................. 9
Gambar 2. Kriteria penerimaan presisi ............................................................... 10
Gambar 3. Struktur molekuler kafein, C8H10N4O2, serta profil kromofor dan
auksokrom ........................................................................................................... 11
Gambar 4. Spektrum serapan larutan seri kafein konsentrasi 25, 30, dan 50
ppm pada pelarut air dan metanol (50:50) .......................................................... 12
Gambar 5. Reaksi kafein terhadap penambahan NaOH ...................................... 13
Gambar 6. Kromatogram kafein pada larutan baku 75 ppm (a), sampel kopi
tanpa adisi baku (b), dan sampel kopi dengan adisi baku kafein 75 ppm ........... 14
Gambar 7. Kurva baku kafein (Replikasi 3) ....................................................... 16
Gambar 8. Kurva rentang seri konsentrasi kafein ............................................... 18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Sertifikat analisis standar kafein ..................................................... 22
Lampiran 2. Kemasan sampel kopi bubuk murni robusta................................... 23
Lampiran 3. Contoh perhitungan konsentrasi larutan kafein .............................. 24
Lampiran 4. Spektrum panjang gelombang maksimum kafein .......................... 25
Lampiran 5. Kromatogram pelarut aquabidestilata dan metanol ....................... 26
Lampiran 6. Kromatogram larutan seri baku kafein replikasi 1 ......................... 27
Lampiran 7. Kromatogram larutan seri baku kafein replikasi 2 ......................... 33
Lampiran 8. Kromatogram larutan seri baku kafein replikasi 3 ......................... 39
Lampiran 9. Kromatogram larutan seri baku kafein – data rentang ................... 45
Lampiran 10. Kromatogram larutan seri baku kafein – data akurasi dan
presisi ................................................................................................................. 51
Lampiran 11. Contoh perhitungan akurasi dan presisi........................................ 56
Lampiran 12. Kromatogram sampel kopi ........................................................... 57
Lampiran 13 Kromatogram sampel kopi adisi baku kafein 75 ppm ................... 59
Lampiran 14. Contoh perhitungan perolahan kembali ........................................ 61
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
INTISARI
Kafein termasuk alkaloid metil xantin yang ditemukan dalam kopi.
Senyawa ini dapat meningkatkan performa kerja seseorang sehingga banyak
diminati. Meskipun demikian, penggunaan kafein yang berlebihan dapat memicu
kelainan yang mempengaruhi sistem syaraf pusat, sehingga dibutuhkan penetapan
kadar kafein pada kopi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) fase terbalik pada penetapan
kadar kafein dalam kopi bubuk murni robusta merek “X”.
Penelitian ini bersifat non-eksperimental deskriptif. Metode yang
digunakan yaitu High Performance Liquid Chromatography (HPLC) fase terbalik
dengan kolom oktadesil silika C18, komposisi fase gerak aquabidestilata : metanol
(50:50), kecepatan alir 1,0 mL/menit dan detektor UV 272 nm.
Parameter validasi yang diteliti meliputi selektivitas, linearitas, akurasi,
presisi, dan rentang. Hasil penelitian menunjukkan hasil selektivitas yang baik
dengan nilai resolusi (Rs) 2,293 dan linearitas yang baik dengan nilai koefisien
korelasi (r) 0,9956. Nilai akurasi dan koefisien variasi yang baik untuk baku kafein
pada konsentrasi 75 ppm dan 150 ppm secara berurutan adalah 102,606%; 1,789
dan 102,020%; 1,249. Rentang pengukuran yaitu pada konsentrasi 25-300 ppm.
Berdasarkan hasil tersebut, maka metode ini memiliki validitas yang baik untuk
penetapan kadar kafein dalam kopi bubuk murni robusta merek “X”.
Kata kunci: kafein, HPLC fase terbalik, validasi metode.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
ABSTRACT
Caffeine is one of methyl xanthine alkaloid can be found in coffee. This
substance can enhancing someone’s performance, therefore most people like it.
However, the excessive of caffeine intake can influence central nervous system, so
it is necessary to determine caffeine in coffee. This study aims to validate the
reversed phase HPLC method for caffeine determination in “X” brand robusta
coffee.
This was a non-experimental descriptive research using reversed phase
HPLC method by using octadecyl silica C18 as the stationary phase, redistilled water
and methanol as the mobile phase (50:50), flow rate 1.0 mL/min and UV detector
272 nm.
Validity parameter observed included selectivity, linearity, range,
accuracy, and precision. Result of the study shows that the method has good
selectivity with the resolution (Rs) of 2.293 and a good linearity with correlation
coefficient (r) of 0.9959. Recovery value and coefficient variation for raw caffeine
at the concentration 75 ppm and 150 ppm were 102.606%; 1.789 and 102.020%;
1.249 respectively. Range of the measurement were 25-300 ppm. Based on the
result, it can be summed up that this method is valid to determine caffeine in “X”
brand robusta coffee.
Keywords: caffeine, reversed phase HPLC, validation method.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Kopi termasuk tanaman perkebunan yang biasa dikonsumsi dalam bentuk
minuman dan banyak digemari karena memiliki rasa serta aroma yang menarik
(Rizky dkk., 2015). Kopi dikenal sebagai sumber utama kafein yang mampu
meningkatkan performa kerja seseorang (Nawrot et al., 2003). Minuman kopi
diperoleh dari proses pengolahan biji tanaman kopi menjadi bubuk kemudian
diseduh (Hayati dkk., 2012; Rizky dkk., 2015). Kopi bubuk merupakan biji kopi
yang telah disangrai, digiling atau ditumbuk hingga menyerupai serbuk halus
(Hayati dkk., 2012). Terdapat beberapa varietas kopi yang dibudidayakan di
Indonesia yakni robusta, arabika, dan liberika (Oktadina dkk., 2013). Menurut
Anonim (2016) sebesar 80% luas areal pertanaman kopi di Indonesia merupakan
jenis kopi robusta dan mendominasi hasil produksi.
Senyawa kafein (1,3,7-trimetilxantin) termasuk jenis alkaloid yang banyak
terdapat di daun teh (Camellia sinensis L.), biji kopi (Coffea arabica L.), dan biji
coklat (Theobroma cacao) (Patil, 2012). Secara farmakologis, kafein dalam tubuh
mampu menstimulasi sistem syaraf pusat, stimulus otot jantung, dan relaksasi otot
polos bronkus (Chowdhury et al., 2012). Penggunaan kafein dalam jumlah berlebih
atau dosis tinggi justru dapat memicu beragam kelainan yang mempengaruhi sistem
syaraf pusat, sistem kardiovaskular, peningkatan sekresi lambung, penurunan
fungsi hati, serta menyebabkan kematian jika kafein dalam tubuh mencapai 10 gram
(Patil, 2012).
Dalam Surat Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan
Republik Indonesia Nomor HK.00.05.23.3644 tentang Ketentuan Pokok
Pengawasan Suplemen Makanan disebutkan bahwa dosis maksimum kafein adalah
150 mg/hari yang dibagi minimal dalam tiga dosis (BPOM RI, 2004). Artinya,
dalam satu kali konsumsi produk kopi mengandung tidak lebih dari 50 mg kafein
per sajian. Di Indonesia, terdapat berbagai macam bentuk sediaan produk kopi yang
beredar di pasaran. Produk kopi tersebut di antaranya kopi instan, kopi bubuk
murni, kopi dekafeinasi, maupun permen kopi. Permasalahan yang muncul adalah
produk kopi bubuk murni tersebut tidak mencantumkan besarnya kadar kafein pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
kemasan sehingga masyarakat tidak mengetahui perkiraan kadar kafein dalam satu
kali penyeduhan kopi, padahal kafein memiliki efek merugikan jika dikonsumsi
berlebihan. Salah satu upaya menghindari timbulnya efek yang tidak diharapkan
tersebut, maka perlu dilakukan penetapan kadar kafein untuk memastikan bahwa
kadarnya masih memenuhi batas konsumsi yang sudah ditentukan. Untuk
menjamin bahwa metode yang akan digunakan memberikan hasil pengukuran yang
dapat dipertanggungjawabkan, maka harus dilakukan validasi metode terlebih
dahulu (Sugihartini dkk., 2014). Validasi metode dilakukan dengan menilai
beberapa parameter yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi dan rentang.
Berdasarkan review artikel oleh Patil (2012), disebutkan bahwa berbagai
jenis sampel yang mengandung kafein seperti kopi, teh, minuman energi, dan
formulasi farmasi mengandung obat dapat dianalisis menggunakan sistem HPLC
fase terbalik. Metode tersebut digunakan karena dapat menentukan kadar kafein
dalam sampel kompleks. Oleh karena itu, pada penelitian ini juga menggunakan
metode HPLC fase terbalik.
Beberapa penelitian lain tentang analisis kafein dalam berbagai produk
juga telah banyak dilakukan. Penelitian oleh Chowdhury et al (2012) tentang
validasi metode HPLC fase terbalik pada penentuan kadar kafein dalam tablet
parasetamol-kafein dengan komposisi fase gerak air : metanol (60:40), kecepatan
alir 1,0 mL/menit, deteksi UV pada panjang gelombang 272 nm memberikan hasil
yang cepat, akurat, selektif, presisi dan sensitif. Selain itu, Agung (2017) telah
melakukan uji validasi metode bioanalisis kafein dengan instrumen kromatografi
cair kinerja tinggi fase terbalik menggunakan sampel plasma darah orang jawa
memberikan hasil optimal. Komposisi fase gerak yang digunakan adalah
aquabidestilata : metanol (50:50) dan dijadikan acuan pada penelitian ini.
Oleh karena itu, penelitian ini melakukan validasi metode pada penetapan
kadar kafein dalam kopi bubuk murni robusta merek “X” menggunakan metode
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Reversed Phase atau dengan
nama lain Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan yang digunakan yaitu sampel kopi bubuk murni jenis Robusta
merek “X”, metanol, kloroform (pro analysis grade) (Merck), aquabidestilata,
baku kafein (certificate of analysis working standart, no. 17/03/WS/014, USP),
natrium hidroksida, seng asetat, dan kalium ferosianida.
Alat dan instrumentasi
Alat yang digunakan yaitu seperangkat alat HPLC fase terbalik LC-2010C
(Shimadzu) dengan detektor UV, kolom C18 dimensi 250 x 4,6 mm dan ukuran pori
5 µm (Phenomenex), seperangkat komputer (Dell) B6RDZIS Connexant system
RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer merek HP (Deskjet 1000 J110a),
spektrofotometer UV-1800 (Shimadzu), ultrasonikator (Retsch), alat vakum (Gast),
vortex (Ika-Werk), sentrifugator (Thermo Scientific Heraeus Pico), timbangan
analitik (Ohaus PA224C) (max 220 g, d=0,0001 g), solvent membrane filter
Whatman (0,45 µm), syringe filter ukuran pori 0,45 µm (Minisart), spuit injeksi 5
mL (Terumo), mikropipet 100 µL dan 1000 µL (Acura 825), mikrotube 2 mL,
waterbath, corong Buchner, dan alat-alat gelas (Pyrex).
Metode
Validasi metode analisis pada penetapan kadar kafein dalam kopi bubuk
murni robusta merek “X” dilakukan dengan metode Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi fase terbalik menggunakan komposisi fase gerak hasil optimasi oleh
Kurniawan (2017) yaitu aquabidestilata dan metanol (50:50), fase diam kolom
oktadesil silika C18, kecepatan alir 1,0 mL/menit, volume injeksi 20 µL, panjang
gelombang pengamatan 272 nm, dan dengan kondisi isokratik. Parameter validasi
metode analisis yang diteliti yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi dan
rentang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan yaitu aquabidestilata dan metanol. Masing-
masing larutan disaring menggunakan kertas saring Whatman pada corong Buchner
dengan bantuan pompa vakum, selanjutnya diawaudarakan menggunakan
ultrasonikator selama 5 menit. Pencampuran fase gerak dilakukan di dalam
instrumen HPLC dengan perbandingan aquabidestilata : metanol (50:50).
Pembuatan pelarut
Pelarut yang digunakan yaitu metanol dan aquabidestilata yang dicampur
dengan perbandingan 50:50. Larutan disaring menggunakan kertas saring Whatman
pada corong Buchner dengan bantuan pompa vakum, selanjutnya diawaudarakan
menggunakan ultrasonikator selama 5 menit.
Pembuatan larutan stok dan intermediet kafein
Baku kafein ditimbang saksama lebih kurang 100 mg kemudian dilarutkan
dengan pelarut dalam labu takar 50 mL sehingga didapat konsentrasi larutan stok
2000 ppm. Sejumlah 5,0 mL larutan stok kafein dilarutkan dengan pelarut dalam
labu takar 10 mL sehingga didapat konsentrasi larutan intermediet kafein 1000
ppm.
Pembuatan larutan seri baku kafein
Larutan seri kafein dibuat dengan cara mengambil masing-masing 75, 100,
125, 150, 175, dan 200 µL larutan intermediet kafein kemudian dimasukkan
kedalam mikrotube berbeda, setelah itu ditambahkan sejumlah tertentu pelarut
sampai masing-masing seri volumenya menjadi 1 mL sehingga didapat larutan seri
baku kafein dengan konsentrasi 75, 100, 125, 150, 175 dan 200 ppm. Masing-
masing larutan seri baku kafein ditambahkan sejumlah 40 µL NaOH 10 N kemudian
diekstraksi menggunakan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform diambil
dan ditampung dalam suatu wadah. Ekstraksi menggunakan kloroform dilakukan
tiga kali untuk masing-masing larutan seri baku kafein kemudian diuapkan
menggunakan waterbath suhu 90°C dalam lemari asam sampai diperoleh ekstrak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
kering kafein. Ekstrak kering yang didapat kemudian dilarutkan dengan 1 mL
pelarut. Larutan tersebut disaring menggunakan syringe filter ukuran pori 0,45 µm
lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama 5 menit. Dilakukan
replikasi tiga kali.
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum kafein
Larutan seri kafein untuk penetapan panjang gelombang serapan
maksimum dibuat dengan cara mengambil sebanyak 125, 150 dan 250 µL larutan
intermediet kafein kemudian ditambahkan pelarut dalam labu takar 5 mL sehingga
didapat larutan seri dengan konsentrasi 25, 30 dan 50 ppm. Masing-masing larutan
dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 225-325 nm menggunakan
spektrofotometer UV. Panjang gelombang maksimum dipilih dari seri konsentrasi
yang memberikan nilai absorbansi paling tinggi, kemudian digunakan untuk
mendeteksi kafein pada sistem HPLC.
Preparasi sampel kopi
Sampel kopi bubuk ditimbang saksama lebih kurang 2 g kemudian
dilarutkan dalam 150 mL akuades panas lalu diaduk. Sejumlah 1 mL larutan kopi
ditampung mikrotube, kemudian ditambahkan seng asetat dan kalium ferosianida
masing-masing 500 µL lalu divortex. Koloid yang terbentuk kemudian
disentrifugasi menggunakan sentrifugator kecepatan 5000 rpm selama 5 menit
sehingga terpisah dengan filtrat. Filtrat yang diperoleh kemudian ditampung dalam
mikrotube kemudian ditambahkan 40 µL NaOH 10 N. Selanjutnya diekstraksi
dengan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform diambil dan ditampung
dalam suatu wadah. Ekstraksi menggunakan kloroform dilakukan tiga kali untuk
masing-masing larutan sampel kopi kemudian diuapkan menggunakan waterbath
suhu 90°C dalam lemari asam sampai diperoleh ekstrak kering kafein. Ekstrak
kering yang didapat kemudian dilarutkan dengan 1 mL pelarut. Larutan tersebut
disaring menggunakan syringe filter ukuran pori 0,45 µm lalu diawaudarakan
menggunakan ultrasonikator selama 5 menit. Dilakukan replikasi tiga kali.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Penentuan persen perolehan kembali
Sampel kopi bubuk ditimbang saksama lebih kurang 2 g kemudian
dilarutkan dalam 150 mL akuades panas lalu diaduk. Sejumlah 1 mL larutan kopi
ditampung dalam mikrotube, kemudian ditambahkan sejumlah 75 µL baku kafein,
seng asetat dan kalium ferosianida masing-masing 500 µL lalu divortex. Koloid
yang terbentuk kemudian disentrifugasi menggunakan sentrifugator kecepatan
5000 rpm selama 5 menit sehingga terpisah dengan filtrat. Filtrat yang diperoleh
kemudian ditampung dalam mikrotube kemudian ditambahkan 40 µL NaOH 10 N.
Selanjutnya diekstraksi dengan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform
diambil dan ditampung dalam suatu wadah. Ekstraksi menggunakan kloroform
dilakukan tiga kali untuk masing-masing larutan sampel kopi kemudian diuapkan
menggunakan waterbath suhu 90°C dalam lemari asam sampai diperoleh ekstrak
kering kafein. Ekstrak kering yang didapat kemudian dilarutkan dengan 1 mL
pelarut. Larutan tersebut disaring menggunakan syringe filter ukuran pori 0,45 µm
lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama 5 menit. Dilakukan
replikasi tiga kali. Konsentrasi baku kafein yang ditambahkan dalam sampel
dihitung dari selisih hasil konsentrasi sampel adisi dengan konsentrasi sampel kopi,
kemudian dihitung nilai persen perolehan kembali.
Validasi metode analisis
1. Penentuan selektivitas dan spesifisitas
Sampel kopi bubuk ditimbang saksama lebih kurang 2 g kemudian
dilarutkan dalam 150 mL akuades panas lalu diaduk. Sejumlah 1 mL larutan kopi
ditampung dalam mikrotube, kemudian ditambahkan sejumlah 75 µL baku kafein,
seng asetat dan kalium ferosianida masing-masing 500 µL lalu divortex. Koloid
yang terbentuk kemudian disentrifugasi menggunakan sentrifugator kecepatan
5000 rpm selama 5 menit sehingga terpisah dengan filtrat. Filtrat yang diperoleh
kemudian ditampung dalam mikrotube kemudian ditambahkan 40 µL NaOH 10 N.
Selanjutnya diekstraksi dengan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform
diambil dan ditampung dalam suatu wadah. Ekstraksi menggunakan kloroform
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
dilakukan tiga kali untuk masing-masing larutan sampel kopi kemudian diuapkan
menggunakan waterbath suhu 90°C dalam lemari asam sampai diperoleh ekstrak
kering kafein. Ekstrak kering yang didapat kemudian dilarutkan dengan 1 mL
pelarut. Larutan tersebut disaring menggunakan syringe filter ukuran pori 0,45 µm
lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama 5 menit. Dilakukan
replikasi tiga kali. Selektivitas ditentukan dengan mengamati resolusi dari
kromatogram kafein pada sampel kopi. Spesifisitas ditentukan dengan mengamati
kromatogram dan waktu retensi kafein pada larutan baku, sampel kopi tanpa adisi
baku, dan sampel kopi dengan adisi baku kafein.
2. Penentuan kurva baku dan linearitas
Larutan seri kafein dibuat dengan cara mengambil sebanyak 75, 100, 125,
150, 175, dan 200 µL larutan intermediet kafein dalam masing-masing mikrotube,
kemudian ditambahkan sejumlah tertentu pelarut sampai masing-masing seri
volumenya menjadi 1 mL sehingga didapat larutan seri baku kafein dengan
konsentrasi 75, 100, 125, 150, 175 dan 200 ppm. Masing-masing larutan seri baku
kafein ditambahkan sejumlah 40 µL NaOH 10 N kemudian diekstraksi
menggunakan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform diambil dan
ditampung dalam suatu wadah. Ekstraksi menggunakan kloroform dilakukan tiga
kali untuk masing-masing larutan seri baku kafein kemudian diuapkan
menggunakan waterbath suhu 90°C dalam lemari asam sampai diperoleh ekstrak
kering kafein. Ekstrak kering yang didapat kemudian dilarutkan dengan 1 mL
pelarut. Larutan tersebut disaring menggunakan syringe filter ukuran pori 0,45 µm
lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama 5 menit. Dilakukan
replikasi tiga kali. Dari kromatogram akan diperoleh nilai AUC untuk masing-
masing seri konsentrasi. Nilai AUC kemudian diplotkan terhadap masing-masing
seri konsentrasi baku kafein untuk memperoleh persamaan y=bx+a. Linearitas
ditentukan dari nilai koefisien korelasi (r).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
3. Penentuan akurasi dan presisi
Larutan seri kafein dibuat dengan cara mengambil sebanyak 75, 150, dan
200 µL larutan intermediet kafein dalam mikrotube, kemudian ditambahkan
sejumlah tertentu pelarut sampai masing-masing seri volumenya menjadi 1 mL
sehingga didapat larutan seri baku kafein dengan konsentrasi 75, 150, 200 ppm.
Masing-masing larutan seri baku kafein ditambahkan sejumlah 40 µL NaOH 10 N
kemudian diekstraksi menggunakan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform
diambil dan ditampung dalam suatu wadah. Ekstraksi menggunakan kloroform
dilakukan tiga kali untuk masing-masing larutan seri baku kafein kemudian
diuapkan menggunakan waterbath suhu 90°C dalam lemari asam sampai diperoleh
ekstrak kering kafein. Ekstrak kering yang didapat kemudian dilarutkan dengan 1
mL pelarut. Larutan tersebut disaring menggunakan syringe filter ukuran pori 0,45
µm lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama 5 menit. Dilakukan
replikasi tiga kali. Nilai akurasi ditentukan dengan membandingkan hasil kadar
analit uji dengan kadar standar analit untuk masing-masing seri konsentrasi. Nilai
presisi ditentukan dengan membandingkan hasil standar deviasi dengan rata rata
jumlah akurasi.
4. Penentuan rentang
Larutan seri kafein dibuat dengan cara mengambil sebanyak 25, 50, 225,
250, 275, dan 300 µL larutan intermediet kafein dalam mikrotube, kemudian
ditambahkan sejumlah tertentu pelarut sampai masing-masing seri volumenya
menjadi 1 mL sehingga didapat larutan seri baku kafein dengan konsentrasi 25, 50,
225, 250, 275 dan 300 ppm. Masing-masing larutan seri baku kafein ditambahkan
sejumlah 40 µL NaOH 10 N kemudian diekstraksi menggunakan 1 mL kloroform
lalu divortex. Fase kloroform diambil dan ditampung dalam suatu wadah. Ekstraksi
menggunakan kloroform dilakukan tiga kali untuk masing-masing larutan seri baku
kafein kemudian diuapkan menggunakan waterbath suhu 90°C dalam lemari asam
sampai diperoleh ekstrak kering kafein. Ekstrak kering yang didapat kemudian
dilarutkan dengan 1 mL pelarut. Larutan tersebut disaring menggunakan syringe
filter ukuran pori 0,45 µm lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
5 menit. Rentang pengukuran ditentukan dari konsentrasi terendah dan tertinggi seri
baku kafein yang masih memenuhi parameter linearitas, akurasi, dan presisi.
Analisis hasil
1. Selektivitas dan spesifisitas
Selektivitas metode ditentukan dari nilai resolusi. Resolusi yang baik yaitu
puncak senyawa analit terpisah dari puncak senyawa lain dengan nilai ≥ 1,5
(AOAC, 2013). Spesifisitas ditentukan dengan mengamati kromatogram dan waktu
retensi kafein pada larutan baku, sampel kopi tanpa adisi baku, dan sampel kopi
dengan adisi baku kafein. Syarat variasi waktu waktu retensi yaitu ≤0,05 menit
(Snyder et al., 2010).
2. Linearitas
Konsentrasi seri larutan baku kafein diplotkan terhadap nilai AUC masing-
masing seri larutan baku kafein sehingga diperoleh persamaan y=bx+a. Linearitas
ditentukan dari nilai koefisien korelasi (r) yaitu > 0,99 (AOAC, 2013).
3. Akurasi
Akurasi ditentukan dari perbandingan hasil kadar analit uji dengan kadar
standar analit yang dinyatakan dalam persen, yang dihitung dengan rumus:
Akurasi = kadar terukur
kadar sebenarnya x 100%
Konsentrasi Rentang Penerimaan (%)
100% 98-101
10% 95-102
1% 92-105
0,1% 90-108
0,01% 85-110
10 µg/g (ppm) 80-115
1 µg/g (ppm) 75-120
10 µg/kg (ppb) 70-125
Gambar 1. Kriteria penerimaan akurasi (AOAC, 2013)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
4. Presisi
Presisi ditentukan dari nilai koefisien variasi (KV), yang dihitung dengan
rumus: KV = standar deviasi (SD)
rata-ratax 100%
Konsentrasi Rentang Penerimaan RSD (%)
100% 1
10% 1,5
1% 2
0,1% 3
0,01% 4
10 µg/g (ppm) 6
1 µg/g (ppm) 8
10 µg/kg (ppb) 15
Gambar 2. Kriteria penerimaan presisi (AOAC, 2013)
5. Rentang
Konsentrasi seri larutan baku kafein diplotkan terhadap AUC masing-
masing seri larutan baku kafein sehingga diperoleh persamaan y=bx+a. Rentang
ditentukan dari konsentrasi terendah dan tertinggi seri baku kafein yang masih
memenuhi linearitas, akurasi, dan presisi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Validasi metode pada penetapan kadar kafein dilakukan dengan metode
High Performance Liquid Chromatography (HLPC) fase terbalik menggunakan
komposisi fase gerak aquabidestilata dan metanol (50:50), fase diam kolom
oktadesil silika C18, dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit pada panjang gelombang
pengamatan 272 nm. Validasi metode dilakukan untuk menjamin hasil yang
diperoleh dapat dipertanggungjawabkan sehingga dapat digunakan untuk
menghitung kadar kafein dalam sampel kopi bubuk murni robusta. Parameter
validasi yang diteliti meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi dan rentang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum kafein
Penentuan panjang gelombang maksimum pada penelitian ini dilakukan
dengan mengukur serapan kafein dalam pelarut aquabidestilata dan metanol
(50:50) menggunakan spektrofotometer UV. Kafein memiliki gugus kromofor dan
auksokrom pada strukturnya (Gambar 3) sehingga dapat memberikan serapan pada
daerah sinar ultraviolet.
Gambar 3. Struktur molekuler kafein, C8H10N4O2, serta profil kromofor dan auksokrom.
Pada penentuan panjang gelombang pengamatan digunakan tiga seri
konsentrasi kafein yaitu 25, 30 dan 50 ppm dengan tujuan untuk memastikan bahwa
pada panjang gelombang yang diperoleh terjadi serapan maksimal senyawa kafein.
Masing-masing seri konsentrasi diukur serapannya pada rentang panjang
gelombang 225-325 nm, karena panjang gelombang maksimum teoritis kafein
berkisar pada rentang panjang gelombang tersebut yaitu 273 nm (Moffat et al.,
2011). Panjang gelombang hasil pengukuran dapat digunakan apabila besarnya
lebih kurang 3 nm terhadap panjang gelombang teoritis (Snyder et al., 2010). Hasil
spektrum serapan larutan kafein (Gambar 4) menunjukkan bahwa ketiga seri
konsentrasi memberikan serapan maksimal pada 272 nm sehingga pada analisis
selanjutnya panjang gelombang tersebut digunakan untuk pengukuran larutan baku
kafein maupun sampel kopi pada sistem HPLC.
Auksokrom
Kromofor
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
Gambar 4. Spektrum serapan larutan seri kafein konsentrasi 25, 30 dan 50 ppm pada
pelarut aquabidestilata dan metanol (50:50)
Preparasi sampel kopi
Sampel yang akan diinjeksikan pada sistem HPLC merupakan filtrat yang
telah dipisahkan dari koloid dengan cara preparasi sampel kopi. Preparasi sampel
merupakan suatu prosedur pembersihan (clean up) matriks sampel dari senyawa-
senyawa lain sehingga dapat mengisolasi analit dengan efektif (Nollet and Toldra,
2015). Tahap ini menggunakan seng asetat dan kalium ferosianida yang kemudian
membentuk seng ferosianida. Seng ferosianida merupakan clarifying/clearing
agents yang berfungsi untuk mengendapkan protein, lemak, tannin, asam amino
serta zat warna pada sampel kopi (Nollet and Toldra, 2015). Penambahan seng
ferosianida pada sampel kopi akan membentuk endapan koloid sehingga harus
dipisahkan dari filtrat dengan cara sentrifugasi. Filtrat yang didapat kemudian
ditambahkan dengan NaOH 10 N lalu diekstraksi menggunakan pelarut kloroform
dengan bantuan vortex. Fase kloroform kemudian diuapkan diatas waterbath
sampai diperoleh ekstrak kering kafein. Ekstraksi sampel kopi menggunakan
pelarut kloroform karena kafein mudah larut dalam kloroform dengan kelarutan
1 g dalam 5,5 mL (Anonim, 2014; Moffat et al., 2011). Tujuan penggunaan NaOH
adalah untuk melepas kafein dalam sampel kopi yang berbentuk garam larut dalam
air supaya menjadi kafein berbentuk basa larut dalam kloroform. Reaksi kafein
terhadap penambahan NaOH ditampilkan pada Gambar 5.
nm.
225.00 240.00 260.00 280.00 300.00 325.00
Ab
s.
2.500
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
11
1
Konsentrasi 25 ppm
Konsentrasi 30 ppm
Konsentrasi 50 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Gambar 5. Reaksi kafein terhadap penambahan NaOH
Penentuan selektivitas dan spesifisitas
Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk
memisahkan analit secara tepat dalam matriks sampel yang masih terdapat
senyawa-senyawa lain. Penentuan selektivitas diamati dari pemisahan puncak
kafein dalam sampel kopi dan dinyatakan dengan nilai resolusi (Rs). Berdasarkan
AOAC (2013), nilai resolusi yang diharapkan yaitu ≥ 1,5. Hasil penentuan
selektivitas ditunjukkan pada Tabel I.
Tabel I. Data resolusi kafein pada sampel kopi
Replikasi Resolusi
1 2,677
2 2,042
3 2,162
Tabel I menunjukkan nilai resolusi kafein pada sampel kopi dari tiga kali
replikasi. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa seluruhnya memenuhi kriteria
resolusi maka metode analisis yang digunakan memiliki selektivitas yang baik
karena dapat memisahkan kafein (analit) dari senyawa lainnya dalam sampel.
Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk
mendeteksi analit dalam matriks sampel secara spesifik. Pada penelitian ini,
spesifisitas ditentukan dengan mengamati kromatogram dan waktu retensi kafein
pada larutan baku, sampel kopi tanpa adisi baku, dan sampel kopi dengan adisi baku
kafein.
Kafein bentuk garam (larut dalam
air).
Kafein bentuk basa (larut dalam
kloroform).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
(a)
(b)
(c)
Gambar 6. Kromatogram kafein pada larutan baku 75 ppm (a), sampel kopi tanpa adisi
baku (b), dan sampel kopi dengan adisi baku kafein 75 ppm (c).
Keterangan: Komposisi fase gerak air dan metanol (50:50), fase diam kolom oktadesil
silika C18, kecepatan alir 1,0 mL/menit, dan panjang gelombang pengamatan 272 nm.
Dari kromatogram (Gambar 6) diketahui bahwa baku kafein, sampel kopi
tanpa adisi baku, dan sampel kopi dengan adisi baku kafein secara berurut-urut
memiliki waktu retensi 2,491; 2,472; dan 2,482 menit. Menurut Snyder et al (2010)
syarat variasi waktu retensi yaitu ≤0,05 menit, dan selisih waktu retensi baku kafein
dengan sampel kopi hanya 0,019 menit maka dapat dikatakan dalam sampel kopi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
terdapat kandungan kafein. Selain itu, dari kromatogram sampel kopi dengan adisi
baku kafein (c) terjadi peningkatan tinggi pucak dan respon AUC sehingga
mendukung pernyataan bahwa dalam sampel yang digunakan terdapat kandungan
kafein.
Penentuan kurva baku
Kurva baku merupakan kurva yang menunjukkan hubungan antara
konsentrasi seri baku kafein dengan respon instrumen berupa Area Under Curve
(AUC). Larutan seri baku kafein dibuat dengan enam konsentrasi yaitu 75, 100,
125, 150, 175, dan 200 ppm yang direplikasi tiga kali. Tiap-tiap replikasi baku
kafein dibuat kurva hubungan antara konsentrasi baku dengan respon AUC
kemudian dipilih salah satu kurva baku yang akan digunakan untuk analisis
kuantitatif.
Tabel II. Data perolehan nilai AUC dari enam seri baku kafein
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Konsentrasi
baku kafein
(ppm)
AUC
Konsentrasi
baku kafein
(ppm)
AUC
Konsentrasi
baku kafein
(ppm)
AUC
79,125 2902996 79,125 3027324 79,125 2811785
105,500 3280099 105,500 3858806 105,500 4018724
131,875 5694373 131,875 4146723 131,875 5400692
158,250 6593247 158,250 5180387 158,250 6275503
184,625 7783849 184,625 7016203 184,625 7900548
211,000 9676685 211,000 8912115 211,000 8543801
a = -1598090,771 a = - 917758,095 a = - 646024,400
b = 52299,059 b = 43255,041 b = 44609,736
r = 0,9876 r = 0,9630 r = 0,9959
Dari ketiga replikasi tersebut dipilih nilai koefisien korelasi (r) yang paling
baik karena memiliki hubungan peningkatan konsentrasi dan respon instrumen
yang linear. Berdasarkan AOAC (2013) koefisien korelasi yang disarankan yaitu
r ≥ 0,99. Tabel II menunjukkan bahwa replikasi tiga dengan persamaan
y = 44609,736x–646024,400 memiliki nilai koefisien korelasi paling baik (r =
0,9959) sehingga dipilih dan digunakan untuk menghitung kadar kafein dalam
sampel kopi bubuk.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Gambar 7. Kurva baku kafein (Replikasi 3)
Akurasi dan Presisi
Akurasi merupakan kedekatan hasil yang diperoleh pada saat penelitian
dibandingkan dengan hasil yang sebenarnya (true value), dan presisi merupakan
kedekatan antar hasil pengukuran pada kondisi yang telah ditentukan dan
dinyatakan dengan nilai koefisien variasi (KV) (Snyder et al., 2010). Penetapan
akurasi dan presisi dilakukan menggunakan tiga seri konsentrasi baku kafein
dengan tiga kali replikasi. Dari hasil pengukuran, nilai AUC diolah menggunakan
persamaan kurva baku sehingga diperoleh data konsentrasi terukur dan konsentrasi
sebenarnya. Menurut AOAC (2013) kriteria penerimaan akurasi dan presisi pada
konsentrasi 100 ppm yaitu 85% - 110% dan 4%, sedangkan pada konsentrasi 1000
ppm yaitu 90%-108% dan 3%. Berdasarkan Tabel III, maka level konsentrasi
bawah (75 ppm) dan tengah (150 ppm) memiliki akurasi dan presisi yang baik
karena memenuhi kriteria penerimaan. Sedangkan pada level konsentrasi atas (200
ppm) memiliki nilai akurasi yang baik namun tidak memenuhi nilai presisi yang
baik.
y = 44609,736x - 646024,400
r = 0,9959
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
0 50 100 150 200 250
AU
C
Konsentrasi kafein (ppm)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Tabel III. Data akurasi dan presisi baku kafein
Pada penelitian ini juga dilakukan penentuan persen perolehan kembali
menggunakan metode penambahan baku. Baku kafein yang ditambahkan ke dalam
sampel kopi sejumlah 75 ppm. Nilai persen perolehan kembali menjadi tolak ukur
efisiensi ekstraksi dan untuk mengetahui bahwa keseluruhan metode analisis,
termasuk proses clean up, tidak menghilangkan kafein. Berdasarkan Tabel IV,
diketahui bahwa konsentrasi sampel adisi melebihi nilai kadar terukur pada level
konsentrasi atas (200 ppm) yang ditampilkan pada Tabel III. Hal ini menandakan
terjadi ekstrapolasi karena konsentrasi adisi sampel tidak masuk dalam penentuan
kurva baku, tetapi berdasarkan parameter rentang yang ditampilkan pada
Gambar 8 menunjukkan bahwa perpanjangan seri konsentrasi baku kafein masih
memberikan kurva yang linear dengan nilai koefisien korelasi yang baik yaitu
0,9983. Kriteria perolehan kembali untuk kadar 100 ppm menurut AOAC (2013)
yaitu tidak kurang dari 95% dan hasil rata-rata perolehan kembali baku kafein
sebesar 98,619% sehingga terbukti bahwa metode analisis yang digunakan mampu
memberikan perolehan kembali baku kafein dengan baik.
Level
Konsentrasi
Kadar
Kafein
Teoritis
(ppm)
Kadar
Kafein
Terukur
(ppm)
Akurasi
(%)
Rata-
Rata SD
CV
(%)
Bawah 79,125
79,557 100,546 102,6063
1,8358
1,7891
82,344 104,068
81,660 103,204
Tengah 158,250
162,280 102,546 102,0204
1,274
1,249
159,147 100,567
162,914 102,947
Atas 211,000
214,877 101,837 104,3506
4,6077
4,4156
214,261 101,545
231,400 109,668
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Tabel IV. Data perolehan kembali adisi baku kafein
Konsentrasi (ppm)
Konsentrasi
adisi baku
kafein (ppm) Perolehan
kembali (%)
Rata-rata
(%)
Sampel Sampel
Adisi
C sampel
adisi – C
sampel
172,670 251,482 78,812 105,082
98,619
172,707 245,206 72,499 96,665
181,294 251,875 70,581 94,108
Rentang
Rentang suatu metode didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dan
tertinggi analit yang masih memenuhi parameter linearitas, akurasi, dan presisi.
Berdasarkan Gambar 8, didapatkan rentang pengukuran seri konsentrasi baku
kafein yaitu 25 ppm - 300 ppm dengan nilai koefisien korelasi yaitu 0,9983.
Gambar 8. Kurva rentang seri konsentrasi kafein
y = 47543x - 984563
r = 0,9983
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
0 50 100 150 200 250 300 350
AU
C
Konsentrasi kafein (ppm)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
KESIMPULAN
Metode analisis pada penetapan kadar kafein dalam kopi bubuk murni
robusta merek “X” menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik
menggunakan fase diam kolom oktadesil silika C18, fase gerak aquabidestilata dan
metanol (50:50), dan kecepatan alir 1,0 mL/menit telah memenuhi parameter
validasi yang baik meliputi selektivitas (Rs= 2,293), linearitas (r = 0,9959), akurasi
dan presisi pada konsentrasi 75 ppm dan 150 ppm, serta rentang pengukuran pada
konsentrasi 25- 300 ppm.
SARAN
Penelitian terkait penetapan kadar kafein dalam sampel kopi bubuk murni
robusta merek “X” dapat menggunakan metode yang telah divalidasi ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
DAFTAR PUSTAKA
Agung, S., 2017. Validasi Metode Bioanalisis Kafein dalam Sampel Darah Orang
Jawa dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik.
Universitas Sanata Dharma.
Anonim, 2014. Farmakope Indonesia.
Anonim, 2016. Outlook Kopi Komoditas Pertanian Subsektor Perkebunan. Pusat
Data dan Sistem Informasi Pertanian Sekretariat Jendral Kementrian
Pertanian, 2, 25.
AOAC, 2013. Guideline for dietary supplements and botanicals. Association of
Official Analytical Chemists, 3-9.
Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004. Ketentuan Pokok
Pengawasan Suplemen Makanan. Kepala Badan Pengawas Obat dan
Makanan Republik Indonesia, 13.
Chowdhury, S.R., Maleque, M., dan Shihan, M.., 2012. Development and
Validation of a Simple RP-HPLC Method for Determination of Caffeine in
Pharmaceutical Dosage Forms. Asian Pharma Press., 2 (1), 1–4.
Hayati, R., Marliah, A., dan Rosita, F., 2012. Sifat Kimia dan Evaluasi Sensori
Bubuk Kopi Arabika. Jurnal Floratek., 66.
Kurniawan, J. R., 2017. Optimasi Metode Bioanalisis Kafein dalam Sampel Darah
Orang Jawa dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik.
Universitas Sanata Dharma.
Moffat, A. C., Osselton, M. D., and Widdop, B., 2011. Clarke's Analysis of Drugs
and Poisons.
Nawrot et al., 2003. Effects of Caffeine on Human Health. Taylor and Francis
Group EBSCO., 20 (1), 1–30.
Nollet, L. M. L., and Toldra, F., 2015. Handbook of Food Analysis.
Oktadina, F.D., Argo, B.D., dan Hermanto, M.B., 2013. Pemanfaatan Nanas
(Ananas Comosus L. Merr) untuk Penurunan Kadar Kafein dan Perbaikan
Citarasa Kopi (Coffea Sp) dalam Pembuatan Kopi Bubuk. Jurnal Keteknikan
Pertanian Tropis dan Biosistem., 1 (3), 266.
Patil, P.N., 2012. Caffeine in Various Samples and Their Analysis with HPLC – A
Review. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and
Research., 16 (2), 76–83.
Pradeep, S., Rameshaiah, G.N., dan Ashoka, H., 2015. Caffeine Extraction and
Characterization. International Journal of Current Research and Review, 7
(9), 16–19.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Rizky, T.A., Saleh, C., dan A., 2015. Analisis Kafein dalam Kopi Robusta (Toraja)
dan Kopi Arabika (Jawa) dengan Variasi Siklus pada Sokletasi. Jurnal Kimia
Mulawarman., 13 (1), 41.
Snyder, R.L., Kirkland, J.J., dan Dolan, J.W., 2010. Introducing to Modern Liquid
Chromatography.
Sugihartini, N., Fudholi., A., Pramono, S., 2014. Validasi Metode Analisa
Penetapan Kadar Epigalokatekin Galat dengan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi. Pharmaciana., 4 (2), 112.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Lampiran 1. Sertifikat analisis standar kafein
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Lampiran 2. Kemasan sampel kopi bubuk murni robusta
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Lampiran 3. Contoh perhitungan konsentrasi larutan kafein
a. Perhitungan konsentrasi larutan stok kafein
Sejumlah 100 mg kafein dilarutkan dengan pelarut hingga 50 mL
Konsentrasi larutan stok kafein 100 mg / 50 mL = 2000 mg/mL = 2000 ppm
b. Perhitungan konsentrasi larutan intermediet kafein 1000 ppm
Sejumlah 5 mL larutan stok kafein (2000 ppm) diencerkan dengan pelarut hingga
10 mL
Konsentrasi larutan intermediet kafein (2000 ppm x 5 mL) / 10 mL = 1000
ppm
c. Perhitungan larutan seri kafein
Sejumlah 75 µL larutan intermediet kafein (1000 ppm) diencerkan dengan
pelarut hingga 1 mL
Konsentrasi larutan seri kafein (1000 ppm x 75 µL) / 1000 µL = 75 ppm
Perhitungan lainnya dilakukan sama seperti contoh sesuai dengan jumlah larutan
intermediet yang diambil.
Seri
ke-
Jumlah larutan
intermediet diambil
(µL)
Jumlah
aqubidestilata
ditambahkan (µL)
Konsentrasi seri yang
didapat (µg/mL)
1 75 925 75
2 100 900 100
3 125 875 125
4 150 850 150
5 175 825 175
6 200 800 200
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 4. Spektrum panjang gelombang maksimum kafein
a. Data absorbansi baku kafein konsentrasi 25 ppm
b. Data absorbansi baku kafein konsentrasi 30 ppm
c. Data absorbansi baku kafein konsentrasi 50 ppm
nm.
225.00 240.00 260.00 280.00 300.00 325.00
Ab
s.
2.500
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
11
1
Konsentrasi 50 ppm
Konsentrasi 25 ppm
Konsentrasi 30 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Lampiran 5. Kromatogram pelarut aquabidestilata dan metanol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Lampiran 6. Kromatogram larutan seri baku kafein replikasi 1
1. Konsentrasi 75 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
2. Konsentrasi 100 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
3. Konsentrasi 125 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
4. Konsentrasi 150 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
5. Konsentrasi 175 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
6. Konsentrasi 200 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
Lampiran 7. Kromatogram larutan seri baku kafein replikasi 2
1. Konsentrasi 75 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
2. Konsentrasi 100 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
3. Konsentrasi 125 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
4. Konsentrasi 150 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
5. Konsentrasi 175 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
6. Konsentrasi 200 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
Lampiran 8. Kromatogram larutan seri baku kafein replikasi 3
1. Konsentrasi 75 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
2. Konsentrasi 100 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
3. Konsentrasi 125 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
4. Konsentrasi 150 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
5. Konsentrasi 175 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
6. Konsentrasi 200 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Lampiran 9. Kromatogram larutan seri baku kafein – data rentang
1. Konsentrasi 25 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
2. Konsentrasi 50 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
3. Konsentrasi 225 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
4. Konsentrasi 250 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
5. Konsentrasi 275 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
6. Konsentrasi 300 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Lampiran 10. Kromatogram larutan seri baku kafein – data akurasi dan presisi
1. Konsentrasi 75 ppm replikasi 1
2. Konsentrasi 75 ppm replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
3. Konsentrasi 75 ppm replikasi 3
4. Konsentrasi 150 ppm replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
5. Konsentrasi 150 ppm replikasi 2
6. Konsentrasi 150 ppm replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
7. Konsentrasi 200 ppm replikasi 1
8. Konsentrasi 200 ppm replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
9. Konsentrasi 200 ppm replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Lampiran 11. Contoh perhitungan akurasi dan presisi
Persamaan y = 44609,736x – 646024,400
Contoh perhitungan menggunakan level konsentrasi bawah
Perhitungan kadar terukur
Replikasi 1 2902996 = 44609,736x – 646024,400
x = (2902996 + 646024,400) / 44609,736 = 79,557 ppm
Replikasi 2 x = (3027324 + 646024,400) / 44609,736 = 82,344 ppm
Replikasi 3 x = (3027324 + 646024,400) / 44609,736 = 81,660 ppm
Perhitungan nilai akurasi
Replikasi 1 (79,557 / 79,125) x 100% = 100,546%
Replikasi 2 (82,344 / 79,125) x 100% = 104,068%
Replikasi 1 (81,660 / 79,125) x 100% = 103,204%
Rata-rata nilai akurasi = (100,546% + 104,068% + 103,204%) / 3 = 102,606%
Standar deviasi = 1,835
Koefisien variasi = (1,835 / 102,606%) x 100% = 1,789 %
Level
konsentrasi
Konsentrasi
sebenarnya
Nilai AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Bawah 79,125 2902996 3027324 2996831
Tengah 158,250 6593247 6453485 6621558
Atas 211,00 8939605 8912115 9676685
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
Lampiran 12. Kromatogram sampel kopi
1. Replikasi 1
2. Replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
3. Replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
Lampiran 13. Kromatogram sampel kopi adisi baku kafein 75 ppm
1. Replikasi 1
2. Replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
3. Replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
Lampiran 14. Contoh perhitungan perolehan kembali
Persamaan y = 44609,736x – 646024,400
Perhitungan konsentrasi sampel
Replikasi 1 7056753 = 44609,736x – 646024,400
x = (7056753 + 646024,400) / 44609,736 = 172,670 ppm
Replikasi 2 x = (7058402 + 646024,400) / 44609,736 = 172,707 ppm
Replikasi 3 x = (7441432 + 646024,400) / 44609,736 = 181,294 ppm
Perhitungan konsentrasi sampel adisi
Replikasi 1 x = (10572523 + 646024,400) / 44609,736 = 251,482 ppm
Replikasi 2 x = (10292561 + 646024,400) / 44609,736 = 245,206 ppm
Replikasi 3 x = (10590031 + 646024,400) / 44609,736 = 251,875 ppm
Perhitungan konsentrasi adisi baku kafein = Konsentrasi sampel adisi –
konsentrasi sampel
Replikasi 1 251,482 - 172,670 = 78,812 ppm
Replikasi 2 245,206 - 172,707 = 72,499 ppm
Replikasi 3 251,875 - 181,294 = 70,581 ppm
Perhitungan perolehan kembali
Replikasi 1 (78,812 ppm / 79,125 ppm) x 100% = 105,080 ppm
Replikasi 2 (72,499 ppm / 79,125 ppm) x 100% = 96,665 ppm
Replikasi 3 (70,581 ppm / 79,125 ppm) x 100% = 94,108 ppm
Rata-rata = (105,080 ppm + 96,665 ppm + 94,108 ppm) / 3 = 98,618 ppm
Replikasi AUC
Sampel Sampel adisi
1 7056753 10572523
2 7058402 10292561
3 7441432 10590031
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi berjudul “Validasi Metode High
Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) Fase
Terbalik pada Penetapan Kadar Kafein dalam Kopi
Bubuk Murni Robusta Merek X” memiliki nama lengkap
Maria Clara. Penulis lahir di Pangkalan Bun pada tanggal
16 Februari 1997 sebagai putri pertama, dari dua
bersaudara, dari pasangan Michael Dominicus Haryanto
dan Septia Ping. Pendidikan formal yang pernah ditempuh
penulis yaitu TK Cahaya Mulia Pangkalan Bun (2001-
2002), SDK Santa Maria Pangkalan Bun (2002-2008), SMP Negeri 1 Arut Selatan
Pangkalan Bun (2008-2011), SMA Stella Duce 2 Yogyakarta (2011-2014).
Pendidikan dilanjutkan pada tahun 2014 ke perguruan tinggi Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat aktif dalam organisasi,
kegiatan kepanitiaan dan sebagai asisten praktikum di kampus yaitu menjadi
anggota divisi Advokasi Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi periode
2015-2016, anggota divisi Perlengkapan PPRTOS 2014, peserta Latihan
Kepemimpinan 1 2014, anggota divisi Dokumentasi Kampanye Informasi Obat
2014, anggota divisi Pendaftaran PPRTOS 2015, koordinator divisi Dekorasi dan
Dokumentasi Latihan Kepemimpinan 1 2015, sekretaris panitia Pelepasan Wisuda
2015, sekretaris panitia PPRTOS 2016, anggota divisi Kesekretariatan TITRASI
2016, asisten praktikum Komunikasi Farmasi 2017, serta asisten praktikum Kimia
Analisis 2017.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
top related