Utilità ed approccio pratico della tecnica FISH nella ...
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«Utilità ed approccio pratico della tecnica FISH nella diagnosi dei Sarcomi»
Dott.ssa Aquino GabriellaBiologa S.C Anatomia
Patologica e Citopatologia
Micro Gap Technology Non-Biological Probe production
More genes simultaneously Automation, Digitalization
FISH-improvements
Classificazione dei tumori delle parti molli
2002 2013
• Gruppo di neoplasie eterogenee -> difficoltà di classificazione• WHO Classification (2013) 117 forme benigne e maligne•Diagnosi complessa
DIAGNOSTICO PROGNOSTICO PREDITTIVO RICERCA
Ruolo della FISH nei Sarcomi
Valutare la probabilità di risposta del tumorea determinati tipi di trattamento.
-Presenza o estensione di un tumore prima durante e dopo terapia
-Difficoltà nella distinzione tra lesioni benigne e maligne
Diagnosi differenziale tra istotipi con caratteristiche morfologiche/immunofenotipiche simili.
Valutare la aggressività biologica del tumore;
Ricerca di aneuploidie e nuovi riarrangiametiin campo oncologico
DIAGNOSTICO PROGNOSTICO PREDITTIVO RICERCA
Ruolo della FISH nei Sarcomi
Valutare la probabilità di risposta del tumorea determinati tipi di trattamento.
-Presenza o estensione di un tumore prima durante e dopo terapia
-Difficoltà nella distinzione tra lesioni benigne e maligne
Diagnosi differenziale tra istotipi con caratteristiche morfologiche/immunofenotipiche simili.
Valutare la aggressività biologica del tumore;
Ricerca di aneuploidie e nuovi riarrangiametiin campo oncologico
TERAPIE ORIENTATE
SULL’ISTOTIPO
LEIOMIOSARCOMA UTERINO
GEMCITABINA+TAXOTERE
LEIOMIOSARCOMA DACARBAZINA
LEIOMIOSARCOMA TRABECTIDINA
LIPOSARCOMA MIXOIDE
TRABECTIDINA
CELLULE ROTONDE VINCRISTINA + ETOPOSIDE
RABDOMIOSARCOMA IRINOTECAN
MPNST (tumore maligno delle guaine nervose periferice)
IFOSFAMIDE+ ETOPOSIDE
SARCOMA SINOVIALE PAZOPANIB
TERAPIE ORIENTATE SULL’ ISTOTIPO
Filtro diagnostico e
clinico
384 cases
Classificazione molecolare SarcomiTumor type Fusion Alveolar rhabdomyosarcoma PAX3-FOXO1, PAX7-FOXO1, PAX3-FOXO4, PAX3-
NCOA1, PAX3-NCOA2, PAX3-INO80D, VGLL2-CITED2
Alveolar soft-part sarcoma ASPSCR1-TFE3 Aneurysmal bone cyst CDH11-USP6, THRAP3-USP6, CNBP-USP6, OMD-
USP6, COL1A1-USP6, THRAP150-USP6, ZNF9-USP6
Angiomatoid fibrous histiocytoma EWSR1-AFT1, EWSR1-CREB1, EWSR1-CREM, FUS-ATF1
BCOR-rearranged Sarcoma BCOR-CCNB3, ZC3H7B-BCOR, BCOR-MAML3 CIC-rearranged sarcoma CIC-DUX4, CIC-FOXO4, CIC-NUTM1 Clear-cell sarcoma EWSR1-AFT1, EWSR1-CREB1, EWSR1-CREM, FUS-
CREM Desmoplastic small round-cell EWSR1-WT1 Epithelioid hemangioendothelioma WWTR1-CAMTA1, YAP1-TFE3 Epithelioid neoplasm with Gli1 rearrangement PTCH1-GLI1; MALAT1-GLI1 Ewing sarcoma EWSR1-FLI1, EWSR1-ERG, EWSR1-ETV1, EWSR1-
FEV, FUS-ERG, FUS-FEV, EWSR1-ETV4 Undifferentiaded small round cells Sarcoma EWSR1-NFAT2, EWSR1- SMARCA5, EWSR1-SP3,
EWSR1-PATZ1, CRTC1-SS18, TPM3-NTRK1, LMNA-NTRK1
Extraskeletal myxoid chondrosarcoma EWSR1-NR4A3, RBP56/TAF15-NR4A3, TCF12-NR4A3, TFG-NR4A3
Low-grade fibromyxoid sarcoma FUS-CREB3L1, FUS-CREB3L2 Mesenchymal chondrosarcoma HEY1-NCOA2, IRF2BP2-CDX1, NUPIO7-LRG5 Myoepithelial tumor of soft tissue and bone EWSR1-POU5F1, FUS-POU5F1, EWSR1-ZNF444,
EWSR1-PBX1, EWSR1-PBX3, FUS-KLF17 Myxoid/round-cell liposarcoma FUS-DDIT3, EWSR1-DDIT3 Synovial sarcoma SS18-SSX1, SS18-SSX2, SS18-SSX4, SS18L1-SSX1,
SS18-REPS2-SSX1 Sclerosing epithelioid fibrosarcoma FUS-CREB3L1, FUS-CREB3L2 Angiofibroma AHRR-NCOA2 Biphenotypic sinosal Sarcoma PAX3-MAML3 Congenital/infantile fibrosarcoma ETV6-NTRK3, EML4-NTRK3 Chondroid lipoma C11orf95-MKL2 Dermatofibrosarcoma protuberans COL1A1-PDGFB Low grade Endometrial stromal sarcoma JAZF1-SUZ12, JAZF1-PHF1, EPC1-PHF1, MEAF6-
PHF1 High grade Endometrial stroma Sarcoma YWHAE-NUTM2, FN1-ALK, ZC3H7B-BCOR Inflammatory myofibroblastic tumor TPM3/4-ALK, CLTC-ALK, RANBP2-ALK, CARS-ALK,
ATIC-ALK, SEC31A-ALK, PPFIBP1-ALK, NAB2-PDGFRB, TFG-ROS1, YWHAE-ROS1, EML4-ALK, PRKAR1A-ALK, LMNA-ALK, TFG-ALK, FN1-ALK
Leiomyomas (gastrointestinal) FN1-ALK Lipoblastoma COL1A2-PLAG1, HAS2-PLAG1 Lipoma HMGA2-LPP Meningeal hemangiopericytoma/ Solitary fibrous tumor
NAB2-STAT6
Myxoinflammatory fibroblastic sarcoma/ Pleomorphic Hyalinizing Angiectatic Tumor/ Hemosiderotic Fibrolipomatous Tumors
FBXW4-TGFBR3, TOM1L2-BRAF
Nodular fasciitis MYH9-USP6, HMGA2-LPP Pecoma SFPQ-TFE3 Perycitoma ACTB-GLI1 Spindle cell rhabdomyosarcoma SRF-NCOA2, TEAD1-NCOA2 Tenosynovial giant-cell Tumor COL6A3-CSF1
2002
2013
2020
Commercial FISH PROBE
SARCOMA DI EWINGLa t(11;22)(q24;q12) è la prima traslocazione associata ad un sarcoma ad esser stata caratterizzata a livello molecolare (Delattre et al. 1992).
EWS-FLI190%
EWS-ERG5%
RGG box (RNA-binding domain) 656Aa
EWSR (22q12) FLI1 (11q24) ERG (21q22)Trascription factors
ETS box domain
Famiglia di Fattori TrascrizionaliDominio di legame al DNA C-terminale
RNA binding protein 1Dominio TAD N-terminale
SARCOMA DI EWING
Ulteriori indagini molecolari
EWSR1-NFATC2
EWSR1-UNUSUAL PATTERN
EWSR1-NFATC2
EWSR1-NFATC2
RT-PCREWSR1-FLI1 and EWSR1-ERG
NEGATIVE
Gene Promiscuity
Geneticamente differenti, ma clinicamentente identici
Gene Promiscuity
Geneticamente differenti, ma clinicamentente identici
Geneticamente Identici, ma clinicamente differenti
Ewing Sarcomat(11:22) (q24;q12) FLI1-EWSR1
ES vs Condrosarcoma mesenchimaleNR4A3 (TEC) vs FLI1
ES vs Sarcoma Desmoplastico a cellule rotondeWT1 vs FLI1
ES vs Sarcoma sinoviale scarsamente differenziato
FISH SS18
EWSR1 (R)
EWSR1-FLI1 (R)
Traslocazioni EWSR1
EWSR (22q12)
WT1 (11p13)
üSarcoma Desmoplastico a cellule rotonde
NR4A3 (TEC) (9q22)
üCondrosarcomamixoide
extrascheletrico
üSarcoma a cellule chiare
üIstocitoma (AFH)üCarcinoma
ialinizzante delle ghiandole salivari
ATF (12q13)/CREB1 (2q32) DDIT3 (CHOP)
üLiposarcomamixoide
CREB3L2 (7q33)
CREB3L1 (11p11)
üSarcoma fibromixoide di
basso grado
CUSTOMCUSTOM
Zyto Light
SPEC NR4A3Dual Color Break Apart
Probe
ZZyto Light
SPEC WT1 Dual Color Break Apart
Probe
Zyto Light
SPEC DDIT3 Dual Color Break Apart
Probe
SMALL ROUND CELL SARCOMA
ES98% t EWSR1-ETS
ESLEWSR-
IHCMorphology
MOLECULAR STUDIESFISH
CIC-DUX4
BCOR-CCNB
3
Clinically Different
SMALL BY
Undifferentiated
CIC-rearranged sarcoma
G. W. Charville et al Modern Pathology 2017
Synovial sarcoma
Diagnosi differenziale:
SCHWANNOMA,
FIBROMATOSI
SUPERFICIALE,
FIBROSO SOLITARIO,
SPINDLE CELL
CARCINOMA,
SPINDLE CELL
MELANOMA,
LEIOMIOSARCOMA,
SCHWANNOMA
MALIGNO
EWING SARCOMA
Rimodellamento della cromatina
SSX (Xp11.2)SYT(18q11.2)
CoattivatoreTrascrizionale
RepressoreTrascrizionale
Ruolo sconosciuto
• Circa il 5-10% dei sarcomi dei tX molli
• Più del 95% t(X;18)(p11.2;q11.2), SS18-SSX1, SS18-SSX2 e raramente SS18-SSX4
• <5% dei Sarcoma Synoviale può presentare una fusion alternativa SS18L1/SSX1 o riarrangiamento criptico.
SS18-UNUSUAL PATTERN
>1F+>2O
1F+1O
2F+1/2 O
>2F+>2O
SS18-SSX1 (80%)SS18-SSX2 (20%)
ZytoLight ® SPEC SS18/SSX1 TriCheckTM Probe
SS18-SSX2
SS18 translocationwithout involvement
of SSX1,2,4
SS18-SSX1or
SS18-SSX4NORMAL
M. El Beaino, Ann Surg Oncol (2017)
SS18-SSX1 associate a d un comportamento biologico più aggressivo
rispetto a SS18-SSX2
.SS18-SSX1 associate a tumori bifasici
con un alto Ki67, SS18-SSX2 associate a tumorimonofasico con un basso Ki67.
SS18/SSX1
NGS
1 23
FISH
4
+26 seq
Quando?Discrepanza tra morfologia/IHC vs FISHSarcomi indifferenziatiDiagnosi differenziale tra differenti entità che necessitano di più di 3-4 FISH Materiale scarso
ADIPOCYTIC NEOPLASM
Includono sia lesioni benigne (Lipoma) che maligne (Liposarcoma)
Liposarcoma ben differenziato (WDLPS):-localizzazione retroperitoneale-presenza di adipociti maturi proliferanti frammisti a lipoblasti e cellule stromali atipiche.
Liposarcoma dediferrenziato(DDLPS): -localizzazione retroperitoneale-assenza di adipociti maturi.-Tendenza alla metastatizzazione.
Amplificazione della regione 12q13-12q15 in cui mappano i geni HGMA2 (riscontrata nel 76% dei casi), MDM2 (95%) e CDK4 (80%).
MDM2/CEN 12 Dual ColorProbe
LIPOSARCOMA BEN DIFFERENZIATO (WDL)LIPOSARCOMA DEDIFFERENZIATO(DDLPS)
FISH Gold standard
IHC Aspecifico
Alti livelli di amplificazione di MDM2 sono associati ad una peggior DFSIn DDLPS Amplificazioni di MDM2 e CDK4 si associa ad elevato rischio di recidiva locale (47% VS 12,5% in caso di sola amplificazione di MDM2)
Chop +Fus +
Chop +Fus -
Chop -Fus +
EWSR1+Liposarcoma Mixoide Sarcoma fibromixoide
di basso gradoà RT-pcr
CREB3L2 (7q33)
CREB3L1 (11p11)
Differential Diagnosis•Lipomatous tumors•Other myxoid neoplasms
• Aggressive angiomyxoma
• Intramuscular myxoma• Juxta-articular
myxoma• Low grade
myxofibrosarcoma• Extraskeletal myxoid
chondrosarcoma• Small round blue cell
tumors
LIPOSARCOMA MIXOIDE
ZytoLight ® SPEC DDIT3 DC/BAZytoLight ® SPEC FUS DC/BA
t(12;16)(q13;p11) >95%DDIT3-FUS With 11 isoforms
t(12;22)(q13;q12) <5%DDIT3-EWSR1
With 4 different isoforms
Liposarcoma mixoide
t(12;22)(q13;q12)DDIT3- EWSR1 t(11;16)(p11;p11)
FUS/CREB3
t(12;16)(q13;p11) DDIT3-FUS
-Localizzazione a livello degli arti
-Presenza di lipoblasti a diverso stadio di differenziazione di forma rotonda/ovale.
-Tumore aggressivo con propensione alla metastatizzazione.
La proteina chimerica FUS-DDIT3 blocca il processo di differenziazione adipocitaria nelle cellule progenitrici mesenchimali
Dermatofibrosarcoma protuberans
• (COLA1-PDGFB) 90%• Sarcoma di basso grado• Forte espressione CD34• Dermatofibroma VS
Dermatofibrosarcoma protuberans
FISH analysis has been helpful for confirming the diagnosis of dermatofibrosarcoma protuberans in 25% (104/411) of cases and necessary for the diagnosis of dermatofibrosarcoma protuberans in 5% (21/411) of cases.
Cut off >20%
SPEC COL1A1/PDGFB Dual Color Dual Fusion Probe
Differential Diagnosis•Sarcoma (general)•Low grade fibromyxoid sarcoma•Inflammatory myofibroblastic tumor•Fibroma of tendon sheath•Desmoplastic fibroblastoma•Intramuscular myxoma•Juxta-articular myxoma•Myofibroma
Nodular fasciitis
Sensibilità: 86%Specificità 100%VPP: 100%VPN:90%
4 Diagnosi possible Fascite Nodulare1FISH+7 Diagnosi Fascite nodulare6FISH+
ZytoLight ® SPEC USP6 Dual Color Break Apart Probe
MYH9/USP6t(17;22)(p13;q12)
USP6 B\A DDIT3 B\A FUS B\A
CONCLUSIONI
o UN’ACCURATA DIAGNOSI DI SARCOMA RICHIEDE UN’INTEGRAZIONE CLINICA, ISTOPATOLOGICA E MOLECOLARE
o LA CLASSIFICAZIONE PATOLOGICA CORRELA CON I DISTINTI OUTCOME DELLE DIVERSE ENTITà
o La FISH è UN UTILE STRUMENTO DIAGNOSTICO
o DESCRIVERE SEMPRE QUALSIASI ALTERAZIONE
o INTEGRAZIONE TRA LE TECNICHE CHE CONSENTONO DI FARE DIAGNOSI
o OGNI ALTERAZIONE MOLECOLARE DEVE ESSERE CONTESTUALIZZATA CON IL QUADRO MORFOLOGICO E IMMUNOFENOTIPICO
Dott.ssa M.Curcio Dott. M. Di BonitoDott.ssa G. Liguori Dott.ssa A. De Chiara
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