Universidade Estadual de Campinas Faculdade de …repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/333660/1/...1 Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Rosanna Tarkany
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Universidade Estadual de Campinas
Faculdade de Ciências Médicas
Rosanna Tarkany Basting
Avaliação da associação do extrato bruto diclorometânico de frutos de Pterodon
pubescens Benth. e do óleo essencial de Cordia verbenacea DC na atividade
antinociceptiva e anti-inflamatória
Evaluation of the association of the crude dichloromethane extract from fruits
of Pterodon pubescens Benth. and the essential oil of Cordia verbenacea DC
in antinociceptive and anti-inflammatory activity
CAMPINAS
2018
2
Rosanna Tarkany Basting
Avaliação da associação do extrato bruto diclorometânico de frutos de Pterodon
pubescens Benth. e do óleo essencial de Cordia verbenacea DC na atividade
antinociceptiva e anti-inflamatória
Evaluation of the association of the crude dichloromethane extract from fruits
of Pterodon pubescens Benth. and the essential oil of Cordia verbenacea DC
in antinociceptive and anti-inflammatory activity
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a
obtenção do título de doutora em Ciências Médicas, Área de
concentração Ciências Biomédicas
Thesis presented to the Faculty of Medical Sciences at University of
Campinas in partial fulfillment of the requiriments to obtain a PhD in
Medical Sciences, area of concentration Biomedical Sciences
Orientadora: Profª. Drª. Mary Ann Foglio
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA TESE
DEFENDIDA PELA ALUNA
ROSANNA TARKANY BASTING E
ORIENTADA PELA PROFA. DRA.
MARY ANN FOGLIO
CAMPINAS
2018
3
4
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
ROSANNA TARKANY BASTING
ORIENTADOR: Mary Ann Foglio
MEMBROS:
1. PROF. DR. Mary Ann Foglio
2. PROF. DR. Jorg Kobarg
3. PROF. DR. Rodrigo Ramos Catharino
4. PROF. DR. Angela Regina Araújo
5. PROF. DR. Dulce Helena Siqueira Silva
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: DATA DA DEFESA [31/01/2018]
5
Dedico esta tese ao meu noivo Fabrício, aos meus pais Elisabeta e Roberto,
E aos meus irmãos Roberta e Roberto
6
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora, Profª Drª Mary Ann Foglio, pela confiança no meu
trabalho, por me abrir novas oportunidades, pelos ensinamentos, conselhos, dedicação e
amizade. Obrigada por me ajudar a concluir mais um sonho de forma tão ética e afetuosa.
Admiro-te muito.
Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências
Médicas (FMC) – Unicamp por possibilitar a realização do meu doutorado e aos funcionários
da Seção de Pós-Graduação, em especial à Marcinha, pela competência e por resolver toda a
parte burocrática de forma sempre eficiente.
Ao Centro de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) - Unicamp,
pela infraestrutura para a realização do trabalho.
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF) – Unicamp.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela
concessão das bolsas de mestrado, doutorado direto, bolsa de estágio em pesquisa no exterior
(Processos 2013/15709-5; 2015/08600-2; 2016/23816-4) e suporte financeiro.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à
Coordenadoria de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte
financeiro.
Aos prezados membros da banca examinadora por aceitarem o meu convite, pelo
interesse, disposição e contribuição com o meu trabalho.
Ao coorientador Beto, pelos conhecimentos compartilhados e auxílio nos testes.
Ao Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho pela amizade, apoio e ensinamentos.
Às queridas amigas Ilza, Núbia, Marianinha e Leila Servat pela amizade, carinho,
ajuda e companheirismo. Esse trabalho também é de vocês.
Às queridas Ana Possenti e Sica pela ajuda fundamental nos ensaios
farmacológicos, pela disposição, carinho e alegria sempre compartilhada e a Drª Ana Lúcia
por sempre estar disposta a ensinar.
Aos queridos amigos da Divisão da Farmacologia e Toxicologia e da Divisão de
Química de Produtos Naturais: Vanessa, Fabi, Rogério, Naty, Lúcia, Adriana, Ellen,
Michelle, Tuany, Patricia Zago, Paula Paiva, Elaine, Débora, Fabrício, Patricia, Gisele.
Obrigada a todos pela amizade, sugestões e por tornar meus momentos no laboratório mais
leves e felizes. Desejo muito sucesso a todos vocês.
Ao Institute for Pharma Techonolgy (IPT) da University of Applied Sciences and
7
Arts Northwestern (FHNW) – Basel, Suiça, pela parceria de colaboração.
A Profª. Drª. Veronika Butterweck e toda equipe seu laboratório da FHNW, pela
oportunidade de relizar os ensaios in vitro deste trabalho. Obrigada pelo grande crescimento
profissional e pessoal.
Ao meu amor Fabrício, que me acompanhou desde o começo desta jornada.
Obrigada pelo amor, paciência, companheirismo, apoio, incentivo e por me fazer acreditar
que posso ir além do que penso ser capaz.
Aos meus queridos pais, Elisabeta e Roberto, pelo suporte e incentivo, e por tudo
o que me ensinaram e continuam me ensinando até hoje. Obrigada por me amparar em mais
esta etapa.
Aos meus amados irmãos, Roberto e Roberta, pelo companheirismo, amizade,
carinho e apoio. Agradeço especialmente à Roberta, por desde pequena me despertar o
interesse pela pesquisa e me incentivar a seguir este caminho. Um dia quero ser pelo menos
metade do que você é.
Aos meus queridos sobrinhos, Vinícius e Gustavo, por representarem uma das
maiores fontes de alegria e amor da minha vida.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram e incentivaram a realização
deste trabalho.
E a Deus, por sempre me iluminar, me amparar e dar forças para mais essa etapa
concluída.
Muito Obrigada a todos!
8
“...É melhor tentar e falhar,
que preocupar-se em ver a vida passar;
É melhor tentar ainda que em vão,
que sentar-se fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar,
que em dias tristes em casa me esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco,
que em conformidade viver...”
Martin Luther King
“Por vezes, sentimos que aquilo que fazemos não é, senão, uma gota de água no mar.
Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
Madre Teresa de Calcutá
9
RESUMO
As espécies Pterodon pubescens Benth. (sucupira) e Cordia verbenacea DC são
plantas utilizadas pela população pelas suas propriedades analgésicas, anti-inflamatórias e
antirreumáticas. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito farmacológico da
associação do extrato bruto dos frutos de Pterodon pubescens Benth. (Pp) com o óleo
essencial de Cordia verbenacea DC (Cv) em modelos experimentais in vivo de nocicepção e
inflamação. Adicionalmente, os extratos, a associação dos extratos e dois dos principais
compostos ativos, α-Humuleno e os isômeros de posição éster 6α-acetoxi-7β-hidroxi-
vouacapano-17β-oato de metila e éster 6α-hidroxi -7β- acetoxi -vouacapano-17β-oato de
metila (vouacapano com m/z 404 – C1) foram avaliados na migração e proliferação de
queratinóticos imortalizados humanos (HaCaT) e na atividade anti-inflamatória (VEGF e IL-
8) in vitro em células estimuladas pelo fator de necrose tumoral alpha (TNF-α).
A administração oral das associações não causou alterações nos parâmetros
comportamentais dos animais, no aumento de peso nos testes de toxicidade aguda e teste de
campo aberto. A interação entre a associação dos extratos avaliada pelo método do
isobolograma foi classificada como uma interação de sinergismo. No teste de formalina, as
associações foram apenas significativas na fase inflamatória. Nos modelos de placa quente e
retirada de cauda, as associações não mostraram eficácia. No modelo de edema de pata
induzido por carragenina, as associações mostraram uma redução significativa do edema. No
modelo de edema de pata induzido por PGE2, a associação mostrou uma redução significativa
do edema. Na migração de leucócitos na peritonite induzida por carragenina, as associações
não reduziram significativamente a migração de leucócitos. Na alodinia mecânica induzida
por Adjuvante Completo de Freund, os dados mostraram que as associações foram efetivas na
fase aguda com pronunciado efeito na fase crônica. A análise realizada por HPLC-DAD e FID
mostrou concentrações determinadas importantes de α-Humuleno (0,64% Pp; 1,23% Cv),
trans-Cariofileno (4,54% Pp; 4,03% Cv), geranilgeraniol (0,21% Pp; 0,12% Cv) e compostos
m/z 404 (14,61% Pp) e m/z 362 (6,55% Pp).
Na avaliação da migração celular in vitro, foi demonstrado que o Pp, o Cv e a
associação de ambos inibiram a proliferação e a migração celular in vitro. O composto m/z
404 (C1) também apresentou ação antiproliferativa e inibiu a migração celular em
concentrações mais elevadas. Assim, estes compostos teriam potencial uso como um
tratamento local contra doenças cutâneas envolvidas na hiperproliferação. O α-Humuleno
demonstrou atividade na migração celular em todas as concentrações testadas. Nas células
10
estimuladas por TNF-α, Pp e Cv aumentaram a produção de VEGF, concentração-dependente.
A associação na maior concentração aumentou os níveis de VEGF. C1 aumentou os níveis de
VEGF em concentrações mais elevadas. O α-Humuleno aumentou significativamente os
níveis de VEGF em concentrações mais elevadas. Todas as amostras reduziram os níveis de
IL-8 na atividade anti-inflamatória in vitro. Portanto, sugerimos que o α-Humuleno pode ter
uma atividade dupla - em concentrações mais altas, o composto mostra um efeito anti-
inflamatório e angiogênico, enquanto em concentrações mais baixas, exerce atividade anti-
angiogênica inibindo a migração, possivelmente pela prevenção da secreção de VEGF. O
tratamento com α-Humuleno pode ser uma estratégia terapêutica potencial para promover a
cicatrização de feridas e para prevenir a inflamação em uma condição inflamatória persistente.
Os resultados apresentados demonstram que a associação do extrato bruto dos
frutos de Pterodon pubescens Benth. (Pp) com o óleo essencial da Cordia verbenacea DC
(Cv) apresentam efeito sinérgico e demonstram importantes atividades antinociceptivas e anti-
inflamatórias, em doses mais baixas do que os extratos brutos separados, provavelmente
atuando em diferentes receptores farmacológicos, sem demonstrar efeitos colaterais. No
entanto, este efeito sinérgico não foi observado nos testes in vitro.
Palavras chave: Pterodon pubescens Benth. Cordia verbenacea DC. Anti-inflamatórios.
Antinociceptivo. Sinergismo farmacológico. Migração celular.
11
ABSTRACT
Pterodon pubescens Benth. (sucupira) and Cordia verbenacea DC are plants
popurlaly used due to their analgesic, anti-inflammatory and antirheumatic properties. This
work aimed to evaluate the pharmacological effect of the association of the crude extract of
the fruits of Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the essential oil of Cordia verbenacea DC
(Cv) in in vivo experimental models of nociception and inflammation. Futhermore, the
extracts, the association of the extracts and two of the main active compounds, α-Humulene
and the position isomers 6α- hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-17β-oate methyl ester and 6α-
acetoxy-7β-hydroxyvouacapan-17β-oate methyl ester (m/z 404) were evaluated in the
migration and proliferation of human immortalized keratinocytes (HaCaT) and in anti-
inflammatory activity (VEGF and IL-8) in vitro in cells stimulated by tumor necrosis factor
alpha (TNF-α).
The oral administration of the associations did not cause changes in the animal´s
behavioral parameters, of the weight gain in the acute toxicity tests and in the open field test.
The interaction between the extracts association evaluated by the isobologram method was
classified as an interaction of synergism. In the formalin test, the associations were only
significant in the inflammatory phase. In the hot plate and tail withdrawal models, the
associations did not show significant efficacy against nociception due to thermal stimulation.
In the paw edema model induced by carrageenan, the associations showed a significant
reduction of edema. In the paw edema model induced by PGE2, the association showed a
significant reduction of edema. In the migration of leukocytes into carrageenan-induced
peritonitis, the associations did not significantly reduce leukocyte migration. In mechanical
allodynia induced by Freund's Complete Adjuvant, the data showed that the associations were
effective in the acute phase with a pronounced effect in the chronic phase. The analysis
performed by HPLC-DAD and FID showed important determined concentrations of α-
Humulene (0.64% Pp, 1.23% Cv), trans-Cariophilene (4.54% Pp, 4.03% Cv), geranylgeraniol
0.21% Pg, 0.12% Cv) and m / z 404 compounds (14.61% Pg) in / z 362 (6.55% Pg).
The in vitro cell migration evaluation, demonstrated that Pp, Cv and the
association of both inhibited proliferation and cell migration in vitro. Compound m/z 404
(C1) also showed antiproliferative effect and inhibited cell migration at higher concentrations.
Thus, these compounds would have potential use as a local treatment against cutaneous
diseases involved in hyperproliferation. α-Humulene demonstrated activity in cell migration
at all concentrations tested. In cells stimulated by TNF-α, Pp and Cv increased the production
12
of VEGF, in a concentration-dependent way. The association at the highest concentration
increased VEGF levels, whereas the lowest concentrations had no effect. Both C1 and α-
Humulene increased VEGF levels at higher concentrations. All samples reduced IL-8 levels
in anti-inflammatory activity in vitro. Therefore, we suggest that α-Humulene may have a
dual activity – since at higher concentrations, the compound shows an anti-inflammatory and
angiogenic effect, while at lower concentrations, anti-angiogenic activity is exerted, inhibiting
migration, possibly by preventing secretion of VEGF. Treatment with α-Humulene may be a
potential therapeutic strategy to promote wound healing and to prevent inflammation in a
persistent inflammatory condition.
The results showed that the association of the crude extract of the fruits of
Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the essential oil of Cordia verbenacea DC (Cv) showed
a synergistic effect and demonstrated important antinociceptive and anti-inflammatory
activities at lower doses than the separate crude extracts, probably acting at different
pharmacological receptors, without showing any side effects. However, this synergistic effect
was not observed in the in vitro tests.
Key words: Pterodon pubescens Benth. Cordia verbenacea DC. Anti-inflammatory agents.
Analgesics. Drug synergism. Cell migration.
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cordia verbenacea DC 29
Figura 2. Estrutura química do α-Humuleno e trans-Cariofileno 30
Figura 3. Pterodon pubescens Benth. 33
Figura 4. Compostos identificados com atividade antinociceptiva e anti-inflamatória isolados
dos frutos de Pterodon pubescens Benth. 34
Figura 5: Exemplo ilustrativo de isobolograma 37
Figura 6. Procedimento para o ensaio de migração celular 51
Figura 7. Intervalo causado pelo insert 52
Capítulo 1:
Figure 1. Evaluation of antinociceptive activity in the abdominal writhing test induced by
acetic acid of mice treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit
dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil 66
Figure 2. Evaluation of antinociceptive activity in the abdominal writhing induced by acetic
acid test of mice treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane
extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil 67
Figure 3. Isobologram demonstrating the antinociceptive interaction between the Pterodon
pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil in the
abdominal writhing test induced by acetic acid 67
Figure 4. Evaluation of the antinociceptive activity in the inflammatory phase of the formalin
model in the mice treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit
dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil 69
Figure 5. Evaluation of the antinociceptive activity in the inflammatory phase of the formalin
model in the mice treated orally with the with the association of the crude Pterodon pubescens
(Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil 69
Figure 6. Evaluation on total number of leukocytes in the peritoneum in carrageenan-induced
peritonitis model in mice treated orally with the with the association of the crude Pterodon
pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil 72
Figure 7. Effect on mechanical allodynia induced by complete Freund´s adjuvant by the
association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia
verbenacea (Cv) essential oil 74
Figure 8. Effect on mechanical allodynia induced by complete Freund´s adjuvant by the
association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia
14
verbenacea (Cv) essential oil. 75
Capítulo 2:
Figure 1. Chemical structure of α-Humulene 96
Figure 2. Compounds identified with antinociceptive and anti-inflammatory activity isolated
from the fruits of Pterodon pubescens Benth (isomers m/z 404 – C1) 97
Figure 3. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (ratio ½ :
½) (C), C1 (D) and α-Humulene (E) on the cellular ATP level 103
Figure 4. BrdU incorporation in de novo synthesized cellular DNA by Pterodon pubescens
extract (A), Cordia verbenacea essential oil (B), Association (C), C1 (D) and α-Humulene (E)
104
Figure 5. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging
interval snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the
momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a representative experiment. HaCaT cells were treated
with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and LY294002 (10 μM) 106
Figure 6. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were
taken every hour during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images
at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 106
Figure 7. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging
interval snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the
momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a representative experiment. HaCaT cells were treated
with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and Pterodon pubescens
extract (3.125, 6.25 and 12.5 μg/mL) 107
Figure 8. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were
taken every hour during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images
at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 108
Figure 9. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging
interval snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the
momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a representative experiment. HaCaT cells were treated
with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and essential oil of Cordia
verbenacea (3.125, 6.25 and 12.5 μg/mL) 109
Figure 10. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were
taken every hour during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images
at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 109
Figure 11. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse
15
imaging interval snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show
the momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a representative experiment. HaCaT cells were
treated with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and association of
Pterodon pubescens extract and essential oil of Cordia verbenacea (3.125; 6.25 and 12.5
μg/mL) 110
Figure 12. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were
taken every hour during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images
at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 111
Figure 13. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were
taken every hour during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images
at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 111
Figure 14. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse
imaging interval snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show
the momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a representative experiment. HaCaT cells were
treated with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and C1 (6.25; 12.5 and
25 μM) 112
Figure 15. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were
taken every hour during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images
at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 113
Figure 16. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse
imaging interval snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show
the momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a representative experiment. HaCaT cells were
treated with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and α-Humulene (6.25;
12.5 and 25 μM) 114
Figure 17. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were
taken every hour during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images
at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 114
Figure 18. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (C), C1
(D), α-Humulene (E), LY 294002 and hydrocortisone on TNF-α-induced (20 ng/mL) VEGF
secretion in HaCaT cells 115
Figure 19. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (C), C1
(D), α-Humulene (E) and hydrocortisone on TNF-α-induced (20 ng/mL) IL-8 secretion in
HaCaT cells 116
16
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Atividades farmacológicas descritas de Cordia verbenacea DC utilizando
diferentes tipos de solventes extratores 31
Tabela 2. Atividades farmacológicas descritas de extratos de frutos de Pterodon pubescens
Benth utilizando diferentes tipos de solventes extratores 34
Tabela 3. Descrição de sinergismo, adição e antagonismo em estudos de combinação de
substâncias, através do método de determinação do Índice Combinatório (IC) 38
Tabela 4. Associações do extrato bruto de frutos de Pterodon pubescens Benth (Pp) e do óleo
essencial de Cordia verbenacea DC (Cv) 46
Capítulo 1:
Table 1. Associations of crude dichloromethane of Pterodon pubescens Benth (Pp) fruit
extract and Cordia verbenacea DC (Cv) leaves’ essential oil tested in various combination
mixtures (25, 50, 75, 100 and 200 % of the ED50 of each extract tested alone) tested on
abdominal writhing experimental model induced by acetic acid for visualization of
pharmacological interaction effect 63
Table 2. Percentage amounts of active compounds present at crude dichloromethane
Pterodon pubescens fruits extract and Cordia verbenacea DC essential oil 67
Table 3. Ambulatory activity of Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and
Cordia verbenacea (Cv) essential oil 67
Table 4. Combination Index of the different proportions of the association of the crude
Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential
oil in the abdominal writhing test induced by acetic acid 70
Table 5. Compounds present in associations selected for pharmacological tests 72
Table 6. Evaluation of the anti-edematogenic activity in mice previously treated orally with
the association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and
Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses corresponding to 50% + 50%; 100% + 100%
and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the association 73
Table 7. Evaluation of the anti-edematogenic activity in mice previously treated orally with
the association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and
Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses corresponding to 50% + 50%; 100% + 100%
and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the association 74
Capítulo 2:
Table 1. Percentage amounts of active compounds present at crude dichloromethane
17
Pterodon pubescens fruits extract and Cordia verbenacea DC essential oil
102
18
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 20
2. REVISÃO DA LITERATURA 22
2.1. Inflamação e dor 22
2.2. Terapêutica para dor e inflamação 25
2.3. Plantas Medicinais 27
2.3.1. Cordia verbenacea DC 28
2.3.2. Pterodon pubescens Benth. (sucupira) 33
2.4. Interações farmacológicas 36
2.5. Justificativa 39
3. OBJETIVO 40
3.1. Objetivo Geral 40
3.2. Objetivos específicos 40
4. MATERIAL E MÉTODOS 41
4.1. Obtenção do material vegetal 41
4.2. Preparação dos extratos 41
4.2.1. Pterodon pubescens Benth. 41
4.2.2. Cordia verbenacea DC 41
4.2.3. Análise fitoquímica 42
4.2.3.1. Isolamento dos voucapanos 42
4.2.3.2. Análise GC-MS 42
4.2.3.3. Análise dos compostos voláteis por GC-FID (cromatografia gasosa
com detector de ionização de chamas) 42
4.2.3.4. Compostos vouacapanos – HPLC-DAD 43
4.3. Atividade Farmacológica 43
4.3.1. Animais e cuidados éticos 43
4.3.2. Estudo da toxicidade em dose única 43
4.3.3. Avaliação da atividade locomotora (campo-aberto) 44
4.3.4. Determinação da Dose Efetiva 50 (DE50) no modelo de contorção abdominal
induzida por ácido acético 44
4.3.5. Análise isobolográfica e construção do índice combinatório (IC) 44
4.3.6. Teste de lambedura de pata induzido por formalina 46
4.3.7. Retirada de cauda 47
19
4.3.8. Placa quente 47
4.3.9. Edema de pata por carragenina 48
4.3.10. Edema de pata induzido por prostaglandina E2 (PGE2) 48
4.3.11. Peritonite induzida por carragenina 48
4.3.12. Alodinia induzida por CFA – Adjuvante completo de Freund 49
4.4. Experimentos in vitro 49
4.4.1. Cultura de células 50
4.4.2. Ensaio de viabilidade celular (ATP) 50
4.4.3. Ensaio de proliferação celular 50
4.4.4. Ensaio de migração celular (“scratch assay”) 51
4.4.5. Atividade anti-inflamatória (VEGF e IL-8) 52
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA 54
6. RESULTADOS 55
6.1. Capítulo 1 55
6.2. Capítulo 2 93
7. DISCUSSÃO GERAL 126
8. CONCLUSÃO 139
9. PERSPECTIVAS FUTURAS 140
10. CONSIDERAÇÕES FINAIS 141
11. REFERÊNCIAS 142
12. ANEXOS 159
Anexo 1: Comitê de Ética em Experimentação Animal (nº 3181-1) 159
Anexo 2: Comitê de Ética em Experimentação Animal (nº 4392-1) 160
Anexo 3: Depósito de Patente Nacional 161
Anexo 4: Depósito de Patente Internacional 162
Anexo 5: Submissão de artigo a Journal of Etnopharmacology 163
20
1. INTRODUÇÃO
Esta Tese está de acordo com a Informação CCPG/001/2015, UNICAMP, de
17/06/2015, que regulamenta o formato alternativo para dissertação e tese, permitindo a
inserção de artigos científicos de autoria ou coautoria do candidato. Os resultados desta Tese
estão apresentados em capítulos, onde cada capítulo corresponderá a um artigo científico
distinto totalizando dois capítulos, sendo que os artigos encontram-se em fase de submissão
em revistas científicas.
A natureza é uma fonte fundamental no processo de busca pelo desenvolvimento
de novos fármacos. O Brasil apresenta a maior biodiversidade total do mundo,
compreendendo mais de 45.000 espécies de plantas superiores (20 -22% do total existente no
planeta) (Dutra et al., 2016). A enorme biodiversidade vegetal é capaz de fornecer insumos
para gerar fitoterápicos, fitofármacos e protótipos de novas drogas com importância
econômica (Cragg & Newman, 2013). De acordo com as estimativas, cerca de um terço dos
medicamentos de uso clínico são baseados em produtos naturais, incluindo constituintes
diretamente isolados a partir de produtos naturais, sintetizados ou semi-sintetizados por
modificação estrutural dos seus compostos naturais (Sticher, 2014). Em 2016, Cragg &
Newman estimavam que aproximadamente 55,1% de todas as novas drogas aprovadas no
período de 1981 a dezembro de 2014, eram derivados diretamente ou indiretamente de
produtos naturais (Cragg & Newman, 2016).
Dentre as espécies brasileiras nativas, encontram-se a Pterodon pubescens Benth.
e a Cordia verbenacea DC, com diversas atividades farmacológicas relatadas, como
antinociceptiva e anti-inflamatória (Spindola et al., 2009, Dutra et al., 2016). A literatura
científica tem demonstrado que frequentemente a ação farmacológica do princípio ativo
isolado, difere da ação encontrada nos extratos brutos. Acredita-se que essas vantagens
terapêuticas encontradas em medicamentos fitoterápicos e associações sejam decorrentes de
interações sinérgicas que potencializam os seus efeitos farmacológicos com redução dos
efeitos colaterais (Heinrich et al, 2007).
Como exemplo de combinações de fármacos com efeito sinérgico clinicamente
comprovado, a preparação fitofarmacêutica Iberogast® comercializada na Alemanha, e
composta por nove extratos de plantas, é utilizada para o tratamento de dispepsia funcional e
síndrome do intestino irritável. A preparação mostrou equivalência terapêutica quando
comparado com as drogas sintéticas usualmente utilizadas cisaprida e metoclopromida, porém
com a vantagem adicional de que o preparo fitoterápico mostrou pouco ou nenhum efeito
21
colateral (Allescher & Wagner, 2007).
A melhor eficácia de associações de compostos ou extratos pode demonstrar que
os efeitos sinérgicos são multialvos, onde a associação atua não apenas em um único alvo,
mas em vários alvos e, portanto cooperam de uma forma sinérgica. A estratégia de uso para
uma associação multialvo baseia-se na etiologia pluri-causal de muitas doenças e
fisiopatologia complexa, podendo ser tratados de forma mais eficaz com combinações
farmacêuticas bem escolhidas do que com uma única droga (Wagner & Ulrich-Merzenich,
2009; Ulrich-Merzenich, 2014). Portanto, apesar da descoberta dos compostos responsáveis
pela atividade, a mistura ainda pode propiciar melhores resultados (Heinrich et al., 2007).
No Brasil, o Ministério da Saúde em 1994, estabeleceu a primeira normativa para
avaliar a segurança, qualidade e eficácia de medicamentos à base de plantas comercializados.
Este regulamento proposto foi baseado principalmente nas orientações da Organização
Mundial da Sáude (WHO – World Health Organization) e nas diretivas francesas e alemãs
(Dutra et al., 2016). Atualmente, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária)
através da resolução RDC nº 17 de 16/04/2010 e RDC 26/2014, que regulamentam as boas
práticas de fabricação de medicamentos, que estabelece que estes devam apresentar
comprovação de eficácia, segurança e reprodutibilidade.
Portanto para aprimorar o conhecimento sobre os efeitos farmacológicos, efeitos
colaterais e garantia de uso seguro e eficaz de fitoterápicos, é importante a realização de
estudos químicos, biológicos e farmacológicos, para o alcance de um padrão de qualidade
necessário a um medicamento.
22
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Inflamação e dor
A inflamação pode ser definida como o conjunto de alterações bioquímicas,
fisiológicas e imunológicas em resposta a estímulos agressivos ao organismo. Ocorre após
dano tecidual e/ou celular causada por estímulos químicos (toxinas), físicos (radiação,
queimaduras traumas), imunológicos ou microbianos (Hume & Fairlie, 2005; Serhan & Savil,
2005, Stables & Gilroy, 2010). Foi caracterizada clinicamente em 30 a.C. pelo médico
romano Aulus Cornélius Celsus por quatro sinais cardinais: calor, rubor, edema e dor.
Posteriormente, Cláudio Galeno acrescentou a perda da função do membro afetado. A
inflamação tem como objetivo levar a resolução do dano tecidual, porém, quando esta
resposta não é modulada, ocorre exacerbação do processo com o quadro que pode tornar-se
crônico, culminando com a perda de função do tecido e diminuição da qualidade de vida do
organismo (Gilroy et al., 2004).
O processo inflamatório envolve uma complexa cascata de eventos bioquímicos e
celulares, que inclui extravasamento de plasma, ativação enzimática, migração celular,
sensibilização e ativação de receptores, lise e reparo tecidual (Carvalho & Lemônica, 1998).
Em geral, as lesões teciduais desencadeiam uma reação inflamatória local, iniciadas e
reguladas por mediadores inflamatórios: aminas (histamina e serotonina de mastócitos),
proteases plasmáticas [sistema complemento, cininas (bradicinina e calidina) e proteínas
fibrinolíticas e de coagulação], mediadores lipídicos [prostaglandinas, leucotrienos e fator
ativador de plaquetas (PAF)], citocinas (de linfócitos ativados e macrófagos – interleucinas e
fator de necrose tumoral), NO, entre outros (Rosenberg et al., 1999; Roberts II & Morrow,
2003; Stables & Gilroy, 2010).
A dor aparece devido aos efeitos diretos de mediadores resultantes tanto do dano
inicial quanto da resposta inflamatória em si, como pela compressão dos nervos sensoriais
ocasionada pelo edema local. Uma resposta inflamatória aguda bem sucedida resulta na
eliminação do agente infeccioso seguida pela fase de resolução e reparo, que é mediada
principalmente por macrófagos residentes e recrutados. Se a inflamação aguda falha em
eliminar o patógeno, o processo inflamatório persiste e adquire novas características. O
infiltrado de neutrófilos é substituído por macrófagos, e no caso de infecção por linfócitos T.
Se o efeito combinado dessas células ainda continua insuficiente, um estado inflamatório
crônico segue, envolvendo a formação de granulomas (Medzhitov, 2008).
Precisamente, a dor é um resultado subjetivo da nocicepção, que é definida como
processos neurais de codificação e processamento do estímulo nocivo (Loeser & Treede,
23
2008). Descrevendo melhor, a nocicepção é o processo pelo qual estímulos térmicos,
mecânicos ou químicos nocivos são detectados por uma subpopulação de fibras nervosas
periféricas, chamadas nociceptores, definidos por Sherrigton em 1906, como terminações
livres de neurônios aferentes primários (Basbaum et al., 2009).
Os nociceptores podem ser ativados por diversos estímulos, classificados como
dolorosos mecânicos, térmicos e químicos. Os mediadores inflamatórios promovem de forma
sinérgica uma alteração no mecanismo de transdução periférica desses estímulos, aumentando
a sensibilidade de transdução de receptores de elevado limiar, com consequente redução no
limiar de percepção do estímulo doloroso, exagerada resposta a estímulos nociceptivos supra
limiares e dor espontânea (Bonica et al., 1990; Meyer et al., 1994).
Estes nociceptores são extremamente heterogêneos, diferindo quanto aos tipos de
neurotransmissores que contêm, os receptores e canais iônicos que expressam, na velocidade
de condução, nas suas propriedades de resposta ao estímulo nocivo e sua capacidade de serem
sensibilizados durante a inflamação, lesão e doença (Stucky et al., 2001). Há três tipos de
transmissão do estímulo nociceptivo, de acordo com as características da fibra aferente
envolvida na transmissão nervosa. Estas são classificadas de acordo com sua anatomia e
função.
As fibras Aβ são mielinizadas, de amplo diâmetro, rápida condutância e em sua
maioria respondem por estímulos mecânicos inócuos, como um toque suave na pele (Meyer et
al., 2008). As fibras Aδ são pouco mielinizadas, com diâmetro de 2,0 a 6,0 μm, e propagam o
impulso mais rapidamente (responsáveis pela dor rápida ou primeira dor). Existem duas
principais subclasses de nociceptores Aδ e ambas respondem aos estímulos mecânicos
intensos, mas podem ser diferenciados pela sua responsividade ao calor intenso (tipo I-
ativadas a temperaturas de 53 °C; e tipo II - ativadas a 43°C) (Millan, 2002; Basbaum et al.,
2009). Em geral, a dor rápida é desencadeada por tipos de estímulos mecânicos e térmicos,
enquanto a dor crônica pode ser desencadeada pelos três tipos de estímulos (Guyton & Hall,
2011). A fibra do tipo C é amielinizada e seu diâmetro varia entre 0,4 a 1,2 µm, e são capazes
de propagar o impulso nervoso de maneira mais lenta (responsáveis pela dor lenta ou segunda
dor). As terminações desse tipo de fibra são receptores termossensíveis ao calor e ao frio e
também são sensibilizados por substâncias como acetilcolina, serotonina e histamina, bem
como a capsaicina, e são consideradas importantes no estudo da dor clínica (Stein et al., 2009;
Guyton & Hall, 2011).
A primeira sinapse da via da dor ocorre no corno dorsal espinal, sendo a chave da
regulação da transmissão da nocicepção (Heinricher et al., 2009). A sensibilização no corno
24
espinal resulta da liberação pré-sináptica de mediadores tais como glutamato e substância P.
Receptores de glutamato (NMDA, AMPA, cainato) e substância P agem
sinergicamente para promover aumento da excitabilidade neuronal, sensibilização central e
caracterizam um processo periférico conhecido como inflamação neurogênica (Geppetti et al.,
1996). Podem ainda estimular a síntese de óxido nítrico (NO) pelo endotélio vascular,
causando vasodilatação e extravasamento de plasma para os tecidos (edema), aumento da
liberação de enzimas lisossômicas e de prostaglandinas (Sung et al., 2004; Sherwood &
Toliver-Kinsky, 2004).
Após a transmissão sináptica e modulação do sinal nociceptivo pelos neurônios
sensoriais, esses sinais são finalmente percebidos como dor em um contexto que envolve
fatores cognitivos e ambientais (Woolf & Salter, 2000). A dor é uma qualidade sensorial
complexa e indefinida, pois é uma experiência que envolve múltiplos fatores que não inclui
apenas a nocicepção, mas implica também em componentes cognitivos, afetivos e emocionais
(Neugebauer et al., 2009). A via supraespinal do controle da dor se origina em muitas regiões
cerebrais, tais como substância periarquedutal cinzenta (PAG), núcleos medianos da rafe e
medula rostral ventromedial (RVM) e possuem papel crítico na determinação da dor crônica e
aguda (Heinricher & Ingram, 2008; Heinricher et al., 2009).
A sensação de dor nos alerta para uma real ou provável lesão e desencadeia
respostas apropriadas para proteger o organismo. Os nociceptores não sinalizam somente a
dor aguda, mas também contribuem em condições dolorosas persistentes de cunho patológico.
Embora a dor aguda possua um papel protetor como um sistema de alerta, a dor crônica como
a dor neuropática, é produzida pela disfunção ou lesão do sistema nervoso periférico ou
central e pode persistir por dias, meses ou anos após a lesão nervosa (Somers & Clemente,
2009). A dor neuropática é caracterizada por sintomas de hipersensibilidade dolorosa,
representados pela alodínia mecânica (respostas dolorosas a estímulos táteis normalmente
inócuos) e hiperalgesia mecânica e térmica (responsividade aumentada a estímulos
previamente nocivos) (Ji & Strichartz, 2004). A transição para a fase crônica envolve
mudanças na medula espinhal e encéfalo, resultando em duas diferentes condições: aumento
da responsividade dos neurônios da medula espinhal (sensibilização central) ou diminuição do
limiar de ativação dos nociceptores (sensibilização periférica). Também ocorre modulação
significativa nos locais onde as mensagens da dor são iniciadas no nível do primeiro neurônio
sensorial (Basbaum et al., 2009).
A dor é a razão mais comum para que as pessoas procurem cuidados médicos
(Melnikova, 2010). Estimativas da Sociedade Americana de Dor mostram que a dor afeta
25
mais de 100 milhões de adultos nos Estados Unidos e são gastos cerca de 635 bilhões de
dólares por ano em tratamento médico e perda de produtividade (Borsook et al., 2014).
A dor crônica é uma das principais causas de incapacidade e afastamento do
trabalho, perda de funcionalidade e da qualidade de vida sendo um dos principais problemas
econômicos de saúde. Estimativas mostraram que a prevalência da dor neuropática é acima de
5% na população geral, onde um quarto desses sofre com uma intensidade severa (Baron,
2009). Apesar dos avanços nas diversas áreas de conhecimentos relacionadas à dor, como
epidemiologia, fisiopatologia e terapêutica, os resultados dos tratamentos como prevenção das
recorrências ainda não são satisfatórios devido a eventos adversos potenciais e falta de
eficácia (Recio et al., 2012).
2.2. Terapêutica para dor e inflamação
O papel dos opióides no tratamento da dor é conhecido há milhares de anos
(Tsagareli, 2012). Os analgésicos opióides são amplamente utilizados para aliviar dor severa
aguda, dor pós-operatória, crônica e dores mal localizadas (geralmente visceral) (Gurtskaia et
al., 2014). O uso de doses repetidas pode causar tolerância a estes fármacos e dependência de
modo que uma cessação súbita de analgésicos opióides pode precipitar síndrome de
abstinência, além de efeitos adversos, como náusea, constipação, depressão respiratória, e, em
longo prazo hipogonadismo, osteoporose, imunossupressão e hiperalgesia (Raghavan et al.,
2011; Gurtskaia et al., 2014). Para além dos fármacos opióides, a abordagem terapêutica
comumente utilizada para reduzir a dor e inflamação envolve o uso de drogas anti-
inflamatórias não esteroidais (AINEs) (McGettigan & Henry, 2013).
Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) representam um grupo de mais de
20 fármacos que desfrutam de ampla aplicação clínica e apresentam compostos com
estruturas químicas heterogêneas que demonstram eficácia para o tratamento da dor,
inflamação e propriedades anti-piréticas (Rigas & Tsioulias, 2015; Cornejo-Garcia et al.,
2009). O primeiro AINE, sintetizado por Felix Hoffmann em 1897, foi a Aspirina®, derivado
a partir do ácido salicílico encontrado na casca do salgueiro (Spiraea ulmaria, Salix species),
utilizado tradicionalmente para tratar febre e inflamação, tornou-se um dos medicamentos
mais usados mundialmente (Floyd & Ferro, 2014).
Com base na sua capacidade para inibir a isoforma de ciclooxigenase, os AINEs
são classificados como não seletivos, que inibem de forma significativa tanto a COX-1 e
COX-2, e seletivos que inibem a COX-2 (Rigas & Tsioulias, 2015).
26
A ciclooxigenase-1 (COX-1) é uma enzima expressa constitutivamente e catalisa
a produção de prostaglandinas que estão envolvidas em numerosas funções fisiológicas,
incluindo a manutenção da função renal normal nos rins, à proteção da mucosa no trato
gastrointestinal e o tromboxano A2 pró-agregatório nas plaquetas (Rao & Knaus, 2008).
Nos locais de inflamação está presente a isoforma ciclooxigenase-2 (COX-2) e
sua expressão é induzida por citocinas e outros mediadores inflamatórios em diversos tecidos,
incluindo as células endoteliais, que originam prostaglandinas que medeiam a inflamação
(Rigas & Tsioulias, 2015).
O uso indiscriminado e contínuo de AINEs pode levar a efeitos adversos sérios
podendo até mesmo ser letal (Salvo et al., 2011).
Ambos os efeitos terapêuticos e adversos dos AINEs são principalmente devido à inibição da
biossíntese de prostanóides (Patrono et al., 2001). Os principais efeitos colaterais dos AINEs
incluem distúrbios gastrointestinais, úlceras gástricas, toxicidade renal, insuficiência renal
aguda, principalmente pela inibição de COX-1, riscos cardiovasculares e no sistema nervoso
central pela atuação dos inibidores seletivos da COX-2, que atuam no desequilíbrio da
homeostase em favor da trombogênese e da vasoconstrição (Massó et al., 2010; Patrignani et
al., 2011; Adam, 2011; Doña et al., 2012; Bruno et al., 2014; Rigas & Tsioulias, 2015).
A inibição da COX-1 leva ao aparecimento de efeitos gastrointestinais que podem
variar de dispepsia a sangramentos do estômago e duodeno, lesões agudas na mucosa,
ativação de doenças inflamatórias intestinais quiescentes e dano tecidual, como úlceras no
trato gastrointestinal. As úlceras gástricas são decorrentes do efeito tópico e sistêmico de
alguns AINEs que promovem a alteração do pH, redução da secreção de muco e bicarbonato,
alterações microvasculares e indução de infiltração leucocitária na mucosa gástrica (Massó et
al., 2010; Patrignani et al., 2011).
Em 1999, baseado em resultados de estudos clínicos, o FDA aprovou a
comercialização do celecoxibe e o rofecoxibe, drogas inibidoras seletivas da COX-2, que
atingiram US$ 10 bilhões em vendas, por serem eficazes no tratamento de sinais e sintomas
de osteoartrite e artrite reumatoide, da dor aguda em adultos e dismenorreia (Bombardier,
2002; Fitzgerald, 2004). Inibidores da COX-2 (coxibes) são diferenciados dos AINEs
tradicionais farmacologicamente pela inibição apenas da enzima COX-2, e clinicamente por
taxas mais baixas de dano gastrointestinal superior e inferior (Salvo et al., 2011). Entretanto,
o mecanimo de inibição da COX-2 promovidos pelos coxibes acarretam a diminuição da
produção de prostaciclinas (PGI2) antitrobóticas e vasodilatadoras e um aumento da
incidência de eventos trombóticos foram detectados em ensaios controlados envolvendo os
27
inibidores da COX-2, celecoxibe, rofecoxibe (Bressalier et al., 2005; Solomon et al., 2005;
Nussmeier et al., 2005; Ott et al., 2005), predispondo os pacientes a eventos cardiovasculares
(Saraiva, 2007).
Em meados da década de 2000, em razão do risco de infarto do miocárdio e
acidentes vasculares cerebrais, houve a retirada do rofecoxibe do mercado, gerando uma
redução na prescrição de todos os AINEs, impulsionado principalmente por uma diminuição
marcada no uso de agentes de COX-2 seletivos. Um estudo prospectivo usando dados de
registros americanos demonstrou que o uso de agentes de COX-2 seletivos diminuiu 55,1 -
29,2% entre os pacientes com artrite reumatoide ou artrite psoriática entre 2003 e 2005. Em
contraste, o uso de AINES não seletivos aumentou 50,2 - 73,9% (Greenberg et al., 2009;
Conaghan, 2012).
Em 2015, a FDA (Food and Drug Administration), órgão governamental dos
Estados Unidos, publicou um anúncio de segurança para fortalecer o aviso já existente nos
rótulos dos AINEs que alertam os consumidores sobre o aumento de riscos de ataque cardíaco
e acidente vascular encefálico com o uso de AINES. Além disso, solicitaram a atualização de
todos os rótulos dos AINES que precisam de prescrição médica para inclusão de informações
de segurança (FDA, 2015).
2.3. Plantas Medicinais
O uso de plantas medicinais é frequente em muitas comunidades onde a
população utiliza as plantas de forma empírica para combater os sintomas da doença,
utilizando-se de chás e infusões. A união do conhecimento popular e a investigação científica
são denominadas etnofarmacologia, definida por Rivier & Bruhn em 1979, como sendo uma
“área multidisciplinar de pesquisa baseada na observação, descrição e investigação
experimental de drogas indígenas e sua atividade biológica”.
A natureza é uma fonte fundamental no processo de busca pelo desenvolvimento
de novos fármacos. O Brasil apresenta a maior biodiversidade total do mundo,
compreendendo mais de 45.000 espécies de plantas superiores (20 -22% do total existente no
planeta) (Dutra et al., 2016). A enorme biodiversidade vegetal é capaz de fornecer insumos
para gerar fitoterápicos, fitofármacos e protótipos de novas drogas com importância
econômica (Cragg & Newman, 2013).
De acordo com as estimativas, cerca de um terço dos medicamentos de uso clínico
são baseados em produtos naturais, incluindo constituintes diretamente isolados a partir de
produtos naturais, sintetizados ou semi-sintetizados por modificação estrutural dos seus
28
compostos naturais (Sticher, 2014). Exemplos bem conhecidos são a colchicina, morfina,
aspirina® semi-sintética, taxol, entre outros (Cragg & Newman, 2013).
Em 2016, Cragg & Newman estimavam que aproximadamente 55,1% de todas as
novas drogas aprovadas no período de 1981 a dezembro de 2014, eram derivados diretamente
ou indiretamente de produtos naturais (Cragg & Newman, 2016).
No Brasil, o Ministério da Saúde em 1994, estabeleceu a primeira normativa para
avaliar a segurança, qualidade e eficácia de medicamentos à base de plantas comercializados.
Este regulamento proposto foi baseado principalmente nas orientações da Organização
Mundial da Sáude (WHO – World Health Organization) e nas diretivas francesas e alemãs
(Dutra et al., 2016). Atualmente, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária)
através da resolução RDC nº 17 de 16/04/2010, regulamenta as boas práticas de fabricação de
medicamentos, que estabelece que estes devam apresentar comprovação de eficácia,
segurança e reprodutibilidade. Em adição, a RDC nº 26 de 02/06/2015, dispõe sobre o
registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais
fitoterápicos (http://portal.anvisa.gov.br/).
Na literatura, vários estudos relatam que extratos derivados de plantas demostram
atividade anti-inflamatória através do controle de níveis de citocinas inflamatórias ou
mediadores inflamatórios, como Il-1, Il-6, Il-10, iNOS e COX-2 e atividade antinociceptiva e
anti-inflamatória em modelos animais (Koretz et al., 2004; Debnath et al., 2013; Riegsecker
et al., 2013; Walker et al., 2013; Dutra et al., 2016).
2.3.1. Cordia verbenacea DC
A Cordia verbenacea DC (Cv), sinonímia de Varronia verbenacea (DC.) Borhidi
(Trópicos, 2017), é um arbusto perene nativo da Mata Atlântica, amplamente distribuída ao
longo da costa sudeste do Brasil, pertencente à família botânica Boraginaceae, popularmente
conhecida como erva baleeira, maria milagrosa, catinga preta, baleeira-cambará, camaradinha,
caraminha, caramoneira do brejo e maria-pretinha e suas folhas são popularmente utilizados
por sua atividade anti-inflamatória e cicatrizante (Michielin et al., 2009; Dutra et al., 2016).
Vários compostos são encontrados nas suas partes aéreas, incluindo taninos, flavonoides,
mucilagens além de óleos essenciais. Essas partes, folhas e inflorescências, são utilizadas na
medicina popular devido a suas ações antirreumática, anti-inflamatória, antimicrobiana,
analgésica sob a forma de extrato alcoólico, decocção e infusão (De Carvalho et al., 2004;
Passos et al., 2006; Dutra et al., 2016).
29
Figura 1. Cordia verbenacea DC. Fonte: Campo experimental CPQBA/UNICAMP, Basting, R.T.
Lins et al., segundo Barroso et al. (2002), em 1980 e 1990, estudando o extrato
etanólico desta espécie isolaram duas flavonas pentametoxiladas: 5,6'-diidroxi-3,6,7,3',4'-
pentametoxiflavona e a 5, 6'-diidroxi-3,3',4',6,7-pentametoxiflavona. Identificaram também a
presença de sitosterol. Valde et al., apud Barroso et al. (2002), confirmaram em 1982 a
presença das duas flavonas e isolaram da espécie o composto 5-hidroxi-3,6,7,3',4'-
pentametoxiflavona. Esses autores também isolaram dois triterpenos do grupo damarano, que
foram denominados de cordialina A e cordialina B.
Os primeiros estudos das propriedades anti-inflamatórias da C. verbenacea foram
iniciados na década de 80 por Sertié et al. (1988, 1990, 1991) que identificaram o composto
artemetina nos extratos avaliados em modelos farmacológicos atribuindo a atividade anti-
inflamatória a esse flavonoide. Porém Bayeux et al.(2002), avaliaram a atividade anti-
edematogênica do extrato bruto diclorometânico e da fração enriquecida com artemetina no
modelo de edema de pata induzido por carragenina. O extrato inibiu o edema, mas a fração de
artemetina não mostrou atividade. Esses resultados indicaram que a atividade estava
relacionada com componentes de baixa polaridade. O extrato diclorometânico também
mostrou atividade antinociceptiva. Passos et al., (2006) demonstraram a presença de vários
componentes através da análise fitoquímica do extrato etanólico, tais como taninos,
flavonóides, mucilagens e óleo essencial. Os principais constituintes do óleo essencial de
Cordia verbenacea DC identificados por cromatografia gasosa acoplada a detector de massas
foram α-Humuleno (29,69%), trans-Cariofileno (25,27%) e allo-aromadendrene (9,99%)
30
(Passos et al., 2006). Vila et al., em 2009, também analisaram o óleo essencial de Cordia
verbenacea e identificaram mais de 91% da composição (46 constituintes). O óleo avaliado
foi composto principalmente por hidrocarbonos terpênicos, monoterpenos (41,5%) e
sesquiterpenos (42,7%). Os principais compostos identificados foram α-pineno (36,5%), β-
Cariofileno (11,7%) e α-santaleno (8,6%). Também apresentou quantidades significativas de
allo-aromadendrene (4,3%) e α-Humuleno (3%) (Vila et al., 2009).
Dentre os diferentes componentes encontrados no óleo essencial, há o destaque
para dois compostos principais com importante atividade anti-inflamatória e anti-
edematogênica, o α-Humuleno e trans-Cariofileno ilustrados na Figura 2 (Passos et al., 2006).
Figura 2. Estrutura química do α-Humuleno e trans-Cariofileno (fonte: Sigma-Adrilch®)
Devido à diversidade de grupos químicos encontrados nos extratos dessa espécie,
há diversas atividades farmacológicas relatadas: antibacteriana, antinociceptiva, anti-
inflamatória, anti-edematogênica, antiulcerogênica, anticâncer, antitumoral, antifúngica,
antimicrobiana, entre outras. As ações dos diferentes extratos de C. verbenacea estão descritas
na Tabela 1.
31
Tabela 1. Atividades farmacológicas descritas de Cordia verbenacea DC utilizando diferentes tipos de solventes
extratores.
Atividade farmacológica Autores
Óleos essenciais
Atividade antifúngica Schlemper et al., 2000
Antibacteriana para bactérias Gram positivas De Carvalho et al., 2004
Larvicida para Aedes aegypti Santos et al., 2006
Compostos isolados do óleo essencial: α-Humuleno e trans-Cariofileno
apresentaram atividade anti-inflamatória e antialérgica contra veneno de
abelha
Passos et al., 2006
Os compostos isolados do óleo essencial α-Humuleno e trans-Cariofileno
apresentaram redução do edema de pata em ratos induzido por bradicinina
e carragenina, redução da atividade plaquetária. Também reduziram a
produção de prostaglandina E2 (PGE2), indução da sintase de óxido nítrico
(iNOS) e expressão de Ciclooxigenase (COX-2).
Fernandes et al., 2007
O composto α-Humuleno apresentou redução do edema de pata induzido
por histamina, prevenção da geração do TNF-α e da IL-1β na geração do
edema.
Fernandes et al., 2007
O composto trans-Cariofileno diminui a liberação do TNF-α na geração
do edema de pata
Fernandes et al., 2007
Os compostos α-Humuleno e trans-Cariofileno inibiram a ativação do NF-
kB induzida por LPS e migração de neutrófilos em modelo de inflamação
aguda na pata induzido por LPS, embora apenas α-Humuleno teve a
capacidade de impedir a produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e
Il-1β)1.
Medeiros et al., 2007
Antibacteriana para as gram-positivas Staphylococcus aureus ATCC 6538
e Enterococcus faecalis ATCC 29212
Meccia et al., 2009
Formulação em gel base provocou o aumento de fibroblastos em pele de
ratos Wistar, sem aumento do número de leucócitos, sugerido a redução
da reação inflamatória
Leonardi et al., 2010
Antimicrobiana e antifúngica, apresentando resultados positivos para a
inibição de Candida albicans e C. krusei e para as linhagens de bactérias
gram-positivas e gram-negativas multirresistentes
Rodrigues et al., 2012
Diminuição da reabsorção alveolar do osso, em modelo de periodontite
em ratos, além de reduzir a frequência de detecção de P. gingivalis
Pimentel et al., 2012
Extratos hidroalcoólico
Não apresentou efeitos tóxicos ou mudanças nos parâmetros do plasma
sanguíneo e na função cardíaca após 30 dias da administração oral,
sugerindo um efeito não tóxico
Oliveira et al., 1998
Ação anti-inflamatória, administrado por via oral ou tópica. Ação Sertié et al., 1991
32
protetora da mucosa gástrica
Extratos etanólicos
Atividade antifúngica Schlemper et al., 2000
Antiulcerogênica, atribuindo seu efeito provavelmente ao estar associado
com o aumento do mecanismo antioxidante. Ausência de toxicidade aguda
e atividade em modelos de analgesia (tail flick e hot plate)
Roldão et al., 2008
A atividade antifúngica moderada sobre Candida albicans e C. krusei e
que possui alta toxicidade em bioensaios realizados com Artemia salina
Oliveira et al., 2010
Antioxidante Michielin et al., 2011
Redução da secreção de histamina em células mastócitas de ratos em
modelos in vitro e in vivo, demonstrando um efeito antialérgico
Costa de Oliveira et al.,
2011
Extratos metanólicos
Diminuição na formação de edemas e diminução da miotoxicidade
induzida pelo veneno de Bothrops jararacuçu
Ticli et al., 2005
Eficácia no tratamento de infecções causadas por bactérias, tendo ação
fototóxica contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli
Matias et al., 2010
Atividade antibacteriana moderada para Staphylococcus aureus,
Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa
Matias et al., 2016
Extratos obtidos por fluido supercrítico
Atividade anticâncer, citotoxicidade e a apoptose de células de carcinoma
de Ehrlich
Kviecinski et al., 2010
Atividade in vitro antitumoral na redução, viabilização e proliferação de
células tumorais e redução na expressão de COX-2
Parisotto et al., 2012
Acheflan®
O fitoterápico Acheflan® demonstrou propriedades terapêuticas para
cicatrização de feridas in vivo, provavelmente devido à seu envolvimento
com o aumento da angiogênese e remodelação dérmica.
Perini et al., 2015
No ano de 2005, a empresa Aché Laboratórios S.A., lançou o primeiro anti-
inflamatório fitoterápico, desenvolvido inteiramente no Brasil, obtido a partir do óleo volátil
da planta Cordia verbenacea DC. O desenvolvimento do produto, cujo nome fantasia é
Acheflan®, utilizado para o tratamento de tendinites crônicas, dor miofacial, traumas
musculares e injúrias, (Chaves et al., 2008; Michielin, 2009). Este medicamento fitoterápico
pode ser considerado o primeiro caso de sucesso de uma tecnologia que foi desenvolvida no
Brasil baseada em uma planta nativa, cujo produto decorrente está no mercado, figurando
entre uns dos 20 fitoterápicos mais vendidos no Brasil (Dutra et al., 2016).
33
2.3.2. Pterodon pubescens Benth. (sucupira)
O gênero Pterodon compreende quatro espécies nativas do Brasil: Pterodon
abruptus Benth., Pterodon apparicioi Pedersoli, Pterodon pubescens Benth. (Pterodon
emarginatus Vog.) e Pterodon polygalaeflorus Benth. que se encontram amplamente
distribuídas na região central do Brasil (Dutra et al., 2016).
A espécie vegetal Pterodon pubescens Benth. (Pp), sinonímia botânica de
Pterodon emarginatus Vog., é uma árvore pertencente à família das Leguminosae-
Papillonoideae, conhecida popularmente como sucupira, faveiro, sucupira-branca, fava-de-
sucupira ou sucupira-lisa e estão distribuídas principalmente no cerrado dos estados de Minas
Gerais, São Paulo, Goiás e Mato Grosso do Sul. O uso popular da sucupira foi relatado
através de estudo etnobotânico em 30 cidades do interior de Minas Gerais, onde a população
fazia uso da espécie para tratamento de reumatismo, dores de garganta, problemas da coluna,
como tônico e depurativo, além do seu uso como anti-inflamatório e analgésico (Carvalho et
al., 1999).
Figura 3. Pterodon pubescens Benth. Fonte: Servat, L., 2010.
Na literatura estão descritas diversas atividades farmacológicas relatadas dessa
espécie: atividade antinociceptiva, anti-inflamatória, anti-edematogênica, antiartrítica,
antiproliferativa, antiplaquetária, antitumoral, entre outras (Denny, 2002; Coelho et al., 2001;
Vieira et al., 2008; Calixto et al., 2007; Spindola et al., 2009; Servat et al., 2012; Nucci-
Martins et al., 2015).
Alguns autores têm sugerido que o esqueleto diterpenos vouacapânico e o
sesquiterpeno geranilgeraniol estejam envolvidos com as propriedades anti-inflamatórias e
antinociceptiva do óleo dos frutos de P. pubescens (Nunan et al., 1982; Carvalho et al., 1999;
34
Silva et al., 2004, Spindola et.al, 2009). Esses compostos estão ilustrados na Figura 4.
Figura 4. Compostos identificados com atividade antinociceptiva e anti-inflamatória isolados dos frutos de
Pterodon pubescens Benth.
As atividades farmacológicas dos diferentes tipos de extratos de Pterodon
pubescens Benth. estão descritas na Tabela 2.
Tabela 2. Atividades farmacológicas descritas de extratos de frutos de Pterodon pubescens Benth utilizando
diferentes tipos de solventes extratores.
Atividade farmacológica Autores
Extratos hidroalcoólico
Atividade no modelo de artrite experimental e ausência de toxicidade
subaguda
Coelho et al., 2001
Extratos etanólicos
Atividade supressora de linfócitos T e B, relacionada à atividade anti-
inflamatória
Cardoso et al., 2008
Atividade antiproliferativa Vieira et al., 2008
Frações e composto geranilgeraniol obtidos do extrato etanólico -
Atividade contra T. cruzi
Menna-Barreto et al., 2008
Subfração terpênica contendo farnesol, geranilgeraniol e derivados Pereira et al., 2012
O
R
R
1
2
3 45
67
8
9
10
1112
13
14
15
17
18
O
OH
O
O
R
O
OHOH
OH
OH
O
OH
OH
CO2CH3
O
OAc
OH
O
OH
OAc
CO2CH3
O
OAc
OH
CO2CH3
O
OH
OH
CH2OH
O
R
R
1
2
3 45
67
8
9
10
1112
13
14
15
17
18
O
OH
O
O
R
O
OHOH
OH
OH
O
OH
OH
CO2CH3
O
OAc
OH
O
OH
OAc
CO2CH3
O
OAc
OH
CO2CH3
O
OH
OH
CH2OH
Éster 6α-hidroxi-7β- acetoxi-vouacapano-17β-oato de metila
Éster 6α-acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano-17β-oato de metila
Éster 6α ,7β-dihidroxivouacapano- 17β- oato de metila
OH
Geranilgeraniol
35
vouacapânicos induz apoptose em células humanas de leucemia
mielogênica crônica da linhagem K562. A ação anti-leucemia está
relacionada a inibição das vias de sinalização das ERKs, NF-kB e c-myc
resultando na redução da expressão da ciclina E2 mRNA.
O extrato inibiu a hiperalgesia mecânica e térmica na dor pós-operatória
em modelos animais
Nucci et al., 2012
Fração hexânica: anti-inflamatório em modelo de artrite induzido por CFA
e em modelo de pleurisia induzido por carragenina. A bioquímica
hematológica e histológica indicou decréscimo na glicose, colesterol e
níveis de triglicérides e redução do número total de leucócitos e células
mononucleares.
Hoscheid et al., 2013
Administração oral do extrato diminuiu a hiperalgesia mecânica e térmica
no modelo de ligação parcial do nervo ciático. Sugerido participação do
glutamato, NMDA, cainato, trans-ACPD, citocinas pró-inflamatórias
(TNF-α e IL-1β) e canais TRPV1 e TRPA1 ativadores (capsaicina e
cinamaldeído) como possíveis mecanismos de ação.
Nucci-Martins et al., 2015
Extrato bruto diclorometânico
Compostos com esqueleto vouacapânico de diterpernos furânicos isolados
do extrato diclorometânico
Nunan et al., 1982;
Carvalho et al., 1999; Silva
et al., 2004, Spindola et.al,
2009
Anti-inflamatória, anti-edematogênica nos modelos induzidos por
bradicinina e histamina, antinociceptiva, antiproliferativa em células
tumorais humanas
Denny, 2002
Fração ativa purificada – composto majoritário 6- hidroxi, 7-
acetoxivouacapano (responsável pela atividade antinociceptiva) - Não
participação de receptores opióides na atividade antinociceptiva
Spindola et al., 2011
Compostos isolados do extrato diclorometânico: 6α acetoxi-7β-
hidroxivouacapano (inédito), éster 6α,7β-diidroxivouacapano-17β oato de
metila e 6α,7β-diidroxivouacapano-17β-metilenol - Atividades
antinociceptiva e antitumoral, potencial quimioterápico em estudos in
vitro contra diversas linhagens tumorais
Spindola et al., 2011
Compostos isolados do extrato diclorometânico: geranilgeraniol e éster
6α,7β-diidroxivouacapano-17β oato de metila - Potencial quimioterápico
em estudos in vivo
Spindola et al., 2009
Compostos isolados do extrato diclorometânico: mistura dos isômeros
éster 6α-hidroxi-7β-acetoxi-vouacapano-17β-oato de metila e éster 6α-
acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano-17β-oato de metila - A atividade
antinociceptiva destes compostos estava mais relacionada à dor de origem
Servat et al., 2012
36
neurogênica; especificidade para as linhagens de ovário e mama na
atividade anticâncer in vitro. Foi observada a presença do sinergismo
existente entre os compostos ativos do extrato, evidenciado pela
similaridade nas doses efetivas apresentadas para a mistura de isômeros
isolados e o extrato bruto
Compostos isolados do extrato bruto diclorometânico: vouacapanos com
atividade antiproliferativa, indicando a seletividade desses compostos para
linhagem de próstata
Spindola et al., 2009
Compostos isolados do extrato diclorometânico: geranilgeraniol e éster
6α,7β-diidroxivouacapano-17β oato de metila - Mecanismos da ação
antinociceptiva receptor-específica através de diferentes modelos
experimentais in vivo, revelando principalmente atividade relacionada a
receptores imidazólicos e serotonérgicos
Spindola et al., 2010, 2011
Óleo essencial
Composto isolado da fração do óleo: ácido 6α,7β-dihidroxivouacapano-
17-óico - Atividade anti-edematogênica nos ensaios de edema de pata
induzido por carragenina e edema de orelha induzido por óleo de cróton,
sugerindo o envolvimento desse composto na atividade anti-inflamatória
Silva et al., 2004
Ação cicatrizante, possivelmente atribuída aos compostos
biciclogermacreno, trans-Cariofileno e α-Humuleno
Dutra et al., 2009
Geranilgeraniol isolado do óleo - Antiplaquetária, com ação atribuída a
inibição da enzima ciclooxigenase
Calixto et al., 2007
Fração hexânica
Rica no composto ácido 6-α,7β-dihidroxivouacapano-17-óico -
Atividade cicatrizante
Dutra et al., 2009
Óleo
Não apresentou efeitos tóxicos após administração aguda do óleo, com
doses extremamente mais altas do que as usadas pela população (2, 4 e 8
mg/kg por via oral). Não citotóxica e não mutagênica em ensaios com
células mononucleares de sangue periférico humano.
Sabino et al., 1999
Subfração terpênica
Induziu citotoxicidade e efeitos anti-proliferativo em células K562. A
down-regulação do gene de transcrição DNMT1 e a super expressão de
Apaf-1 mRNA sugere que a fração pode induzir a apoptose das células
K562 por regulação epigenética
Pereira et al., 2011
2.4. Interações farmacológicas
O interesse em estudar os efeitos sinérgicos ou antagônicos através de
experimentos com misturas tem crescido imensamente nas últimas duas décadas (Ritz &
37
Streibig, 2014). A palavra sinergia é derivada da palavra grega synergo´z, que significa
“trabalhando juntos” e sua busca no campo da farmacologia referem-se à elucidação e
quantificação da ação de medicamentos administrados em combinação (Sucher, 2014).
A literatura científica tem demonstrado que frequentemente a ação farmacológica
do princípio ativo isolado, difere da ação encontrada nos extratos brutos e fitoterápicos.
Acredita-se que essas vantagens terapêuticas encontradas em medicamentos fitoterápicos
sejam decorrentes de interações sinérgicas que potencializam os seus efeitos farmacológicos
com redução dos efeitos colaterais (Heinrich et al, 2007).
Os mecanismos de sinergismo podem ser divididos em quatro tipos (Hildebert,
2011; Wagner & Ultich-Merzenich, 2009): 1- Efeitos sinérgicos devido à atuação em vários
alvos; 2- Efeitos farmacocinéticos ou físico-químicos; 3- Interferência com mecanismos de
resistências em bactérias e 4- Efeitos de eliminação e neutralização. Dentre os métodos
descritos na literatura para avaliação da existência de efeitos sinérgicos em extratos vegetais,
destaca-se o método de Isobolograma descrito por Berenbaum em 1989. Esse é um modelo
muito utilizado, pois permite a avaliação das interações farmacológicas independente de seu
mecanismo de ação (Wagner, 2011).
Teoricamente o método de isobolograma permite visualizar três tipos de
interações farmacológicas como sinergismo, adição e antagonismo. Em um isobolograma, a
dose de um composto A está nas abcissas e a dose do outro composto B está representada nas
ordenadas, onde cada ponto marcado representa um par de doses dos dois compostos (A e B)
que atingem o DE50 quando administrados em associação. Na Figura 5 está representado um
Isobolograma.
Figura 5: Exemplo ilustrativo de isobolograma demostrando o efeito da associação de compostos (A e B) e a
representação de antagonismo, adição e sinergismo. Fonte: Wagner & Ulrich-Merzenich, 2009.
38
De acordo com Berenbaum (1989), a interação aditiva ocorre quando há uma pura
soma dos efeitos farmacológicos dos fármacos testados. Já a interação de antagonismo ocorre
quando o feito global atingido pela associação dos compostos é menor que o efeito de soma
das doses. Com isso será obtida uma curva convexa. Quando existe um sinergismo real, o
efeito global dos dois compostos será melhor que a somação dos efeitos dos compostos
separados. O resultado será uma curva côncava (Ulrich-Merzenich, et al., 2010; Geary, 2013).
Outro método utilizado para avaliação da interação entre compostos é o teorema
de Chou-Talalay, elaborado através do programa computacional CompuSyn®, que simula e
calcula automaticamente os parâmetros a partir de dados de dose-efeito observados em
qualquer nível de dose e efeito. Este software permite a expressão das principais
características das interações observadas através de um índice de combinação. Trata-se de um
processo analítico de resultados que permite a comparação com os dados obtidos com o
modelo do isobolograma (Chou, 2006; 2011). Neste método o índice de combinação (IC)
resultante é baseado em valores numéricos que indicam a interação entre os compostos
analisados e oferecem definição quantitativa para os efeitos observados, como descritos na
Tabela 3:
Tabela 3. Descrição de sinergismo, adição e antagonismo em estudos de combinação de substâncias, através do
método de determinação do Índice Combinatório (IC), de acordo com Chou (2006).
Faixa do IC Interpretação
< 0,10 Sinergismo muito forte
0,10 – 0,30 Sinergismo forte
0,30 – 0,70 Sinergismo
0,70 – 0,85 Sinergismo moderado
0,85 – 0,90 Sinergismo fraco
0,90 – 1,10 Adição
1,10 – 1,20 Antagonismo fraco
1,20 – 1,45 Antagonismo moderado
1,45 – 3,30 Antagonismo
3,30 – 10,00 Antagonismo forte
> 10,00 Antagonismo muito forte
Como exemplo de combinações de fármacos com efeito sinérgico clinicamente
comprovado, temos a preparação fitofarmacêutica Iberogast®, comercializada na Alemanha,
e composta por nove extratos de plantas, utilizada para o tratamento de dispepsia funcional e
síndrome do intestino irritável. A preparação mostrou equivalência terapêutica quando
comparado com as drogas sintéticas usualmente utilizadas cisaprida e metoclopromida, porém
39
com a vantagem adicional de que o preparo fitoquímico mostrou pouco ou nenhum efeito
colateral (Allescher & Wagner, 2007). Para o tratamento da málaria Falciparum, também é
utilizado a mistura de diversos compostos como a artemisinina, artemeter, lumefantrina,
doxiciclina e mefloquina, que demonstrou êxito no tratamento de casos graves de malária
(Wilairatana et al., 2002).
A melhor eficácia de associações de compostos ou extratos pode demonstrar que
os efeitos sinérgicos são multialvos, onde a associação atua não apenas em um único alvo,
mas em vários alvos e, portanto cooperam de uma forma sinérgica. A estratégia de uso para
uma associação multialvo baseia-se na etiologia pluri-causal de muitas doenças e
fisiopatologia complexa, podendo ser tratados de forma mais eficaz com combinações
farmacêuticas bem escolhidas do que com uma única droga (Wagner & Ulrich-Merzenich,
2009; Ulrich-Merzenich, 2014).
2.5. Justificativa
A descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos continuam a ser um
desafio, com cada vez mais elevados custos em pesquisa e desenvolvimento. Apesar dos
principais avanços no conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na dor e
inflamação, as terapias atuais são usualmente insuficientes por possuírem efeitos colaterais
severos ou eficácia limitada. Por esta razão, a identificação dos mecanismos da dor, a busca
por novas moléculas que sejam eficazes aliados a menos efeitos adversos, torna-se
extremamente necessária para as possíveis aplicações terapêuticas (Burgess & Williams,
2010; Rigas & Tsioulias, 2015).
40
3. OBJETIVO
3.1. Objetivo Geral:
Avaliar o efeito farmacológico da associação do extrato bruto dos frutos de
Pterodon pubescens Benth. (Pp) com o óleo essencial de Cordia verbenacea DC (Cv) em
modelos de antinocicepção e anti-inflamatórios.
3.2. Objetivos específicos
Avaliar a toxicidade aguda de dose única da mistura dos extratos;
Determinar a dose efetiva (DE50) de cada extrato no modelo de contorção
abdominal induzida por ácido acético;
Avaliar o efeito farmacológico da associação dos extratos através da
construção do isobolograma e construção do índice combinatório (IC) para determinação do
sinergismo entre os extratos no modelo de contorção abdominal induzida por ácido acético;
Avaliar as propriedades antinociceptivas da associação dos extratos em
modelos experimentais in vivo: contorção abdominal, tail flick, hot plate e formalina;
Avaliar a atividade anti-edematogênica da associação dos extratos no modelo
de edema de pata induzido por carragenina e por prostaglandina E2 (PGE2);
Avaliar a atividade anti-inflamatória da associação dos extratos no modelo de
peritonite induzida por carragenina e no modelo de alodinia induzida por CFA (Adjuvante
completo de Freund) – tratamento único e diário.
Avaliar a atividade dos extratos, da associação dos extratos e compostos
isolados ativos (α-Humuleno e composto m/z 404 – C1) na migração e proliferação de
queratinócitos (HaCaT) em testes in vitro;
Avaliar a atividade dos extratos, da associação dos extratos e compostos
isolados ativos nos níveis de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e Interleucina-8
(IL-8) em queratinócitos (HaCaT) em testes in vitro.
41
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Obtenção do material vegetal
Os frutos de Pterodon pubescens Benth. foram coletados em Ponto Chique (MG)
– (coordenadas 16°38'23.3"S 45°03'54.0"W). A identificação foi realizada pelo Prof. Dr. Jorge
Yoshio Tamashiro do departamento de Botânica do IB-UNICAMP. As exsicatas foram
depositadas no Herbarium da Universidade Estadual de Campinas do IB-UNICAMP com o
número 179739.
As folhas de Cordia verbenacea DC foram coletadas no campus experimental do
CPQBA (Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas) –
UNICAMP – Paulínia (SP). A espécie Cordia verbenacea faz parte da Coleção de Plantas
Medicinais e Aromáticas (CPMA) do CPQBA/UNICAMP, depositada com o voucher 115
CPQBA.
Os materiais vegetais utilizados possuem autorização de acesso ao patrimônio
genético (Conselho Nacional de Pesquisa - CNPq/Conselho de Gestão do Patrimônio
Genético - CGEN) sob o número 010829/2014-8.
4.2. Preparação dos extratos
4.2.1. Pterodon pubescens Benth.
O processo de extração dos frutos de Pterodon pubescens foi realizado em tanque
de aço inox com agitação mecânica utilizando diclorometano como líquido extrator. Os frutos
foram triturados com gelo seco para aumentar a superfície de contato propiciando maior
rendimento de extração. A relação massa de material vegetal (kg) por volume de solvente
extrator (l) foi de 1:3 realizando-se três extrações de 1,5 horas cada totalizando 4,5 horas à
temperatura ambiente, com renovação do solvente a cada etapa. Os extratos parciais obtidos
foram filtrados, reunidos e concentrados sob vácuo em sistema de evaporação rotativo na
temperatura de 40ºC (Buchi RE 120). O extrato foi acondicionado em frasco âmbar e
armazenado em temperatura ambiente. A análise residual do solvente diclorometano foi
realizadas por cromatografia gasosa com detector por ionização de chama.
4.2.2. Cordia verbenacea DC
O óleo essencial de Cordia verbenacea DC foi obtido através da técnica de arraste
a vapor, realizado pelo período de 1,5 a 2 horas. Folhas frescas e rasuradas foram colocadas
em dorna de aço inox com capacidade de 1500 l adicionando água até a cobertura das folhas.
O óleo foi separado da água, inicialmente no vaso florentino anexo à dorna e posteriormente
42
em laboratório, em um funil de separação, seguido do uso de sulfato de sódio anidro P.A para
eliminar traços residuais de água. O óleo foi armazenado em freezer até seu uso.
4.2.3. Análise fitoquímica
4.2.3.1. Isolamento dos voucapanos
Os isomeros Éster 6α-hidroxi-7β- acetoxi-vouacapano-17β-oato de metila e Éster
6α-acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano-17β-oato de metila (m/z 404) e Éster 6α ,7β-
dihidroxivouacapano- 17β- oato de metila (m/z 362) foram isolados a partir do extrato bruto
dos frutos de Pterodon pubescens Benth. por cromatografia em coluna (25x 500 mm),
utilizando gradiente de solvente de hexano e acetato de etila como descrito anteriormente
(Spindola et al., 2009). Os compostos purificados foram comparados com compostos
previamente identificados por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de hidrogênio e
carbono -13 e Espectrometria de Massas (MS). Os padrões possuem pureza maior que 90%.
4.2.3.2. Análise GC-MS
A análise GC-MS (cromatografia gasosa acoplada a detector de massas) foi
realizada com um sistema Agilent 5975 GC-MS. A coluna HP5 (30 m × 0,25 mm, 0,25 μm de
espessura da película) foi utilizada com hélio como gás transportador (1,0 ml / min). A
temperatura do forno GC foi mantida a 60 ° C durante 3 minutos e programada para 240 ° C a
uma taxa de 3 ° C / min e mantida constante a 240 ° C durante 5 minutos e depois programada
para 240 ° C a uma taxa de 1 ° C / min. A relação de divisão foi ajustada em 40: 1. A
temperatura do injector foi ajustada a 250 ° C. Os espectros de massa foram registrados a 70
eV. O intervalo de massa foi de m/z 100 a 600.
4.2.3.3. Análise dos compostos voláteis por GC-FID (cromatografia gasosa com
detector de ionização de chamas)
A análise dos compostos voláteis por cromatografia gasosa foi realizada
utilizando um sistema GC Agilent 6890N. A temperatura da ionização da chama foi de 250
°C. Para obter a mesma ordem de eluição com GC-MS, a auto-injeção simultânea foi feita em
uma duplicata da mesma coluna, aplicando as mesmas condições operacionais. As
quantificações foram realizadas usando o padrão analítico α-Humuleno, trans-Cariofileno e
geranilgeraniol (Sigma Aldrich Saint Louis, EUA).
43
4.2.3.4. Compostos vouacapanos – HPLC-DAD
O sistema HPLC-DAD (Shimadzu) consistiu em coluna de fase reversa C18
(Gemini -C18 250 mm × 4,6 mm x 5 μm) com 10 μL de injeção de amostra. A fase móvel foi
uma mistura de 70:30 acetronitrila:água com 0,1% de ácido acético (v:v). A taxa de fluxo e o
comprimento de onda UV foram fixados em 1 ml/min e 220 nm, respectivamente.
4.3. Atividade Farmacológica
4.3.1. Animais e cuidados éticos
Foram utilizados camundongos Swiss albinos fêmeas (para o teste de toxicidade
aguda) e machos (para todos os outros experimentos) (25-35g), provenientes do Centro de
Bioterismo da Unicamp (CEMIB) aclimatados às condições do biotério setorial por pelo
menos sete dias antes da manipulação experimental, sob temperatura (23 2C) e ciclo claro-
escuro de 12 horas controlado. Os animais foram alimentados com ração Purina e água ad
libitum. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da
UNICAMP – número 3181-1 e 4392-1 (Anexo 1 e 2).
4.3.2. Estudo da toxicidade em dose única
Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas divididas em grupos (n=6): um
grupo foi tratado com o veículo - 10 ml/kg (NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween®
80%) e os demais grupos tratados com uma dose única de 50, 100 e 500 mg/kg da mistura do
extrato bruto de frutos de Pterodon pubescens (Pp) e do óleo essencial de Cordia verbenacea
(Cv) na proporção de 1:1. Os tratamentos foram realizados oralmente através de sonda
gástrica flexível e após a administração da mistura foram realizadas observações
comportamentais sistemáticas (screening hipocrático) (OECD, 2002). Esta avaliação fornece
uma estimativa geral da toxicidade da amostra sobre o estado consciente e disposição geral,
atividade e coordenação do sistema motor, reflexos e atividades sobre o sistema nervoso
central e sobre o sistema nervoso autônomo. Parâmetros (tais como atividade geral, frênito
vocal, irritabilidade, resposta ao toque, resposta aperto cauda, contorção, posição trem
posterior, reflexo endireitamento, tônus do corpo, força para agarrar, ataxia, reflexo auricular,
reflexo corneal, tremores, convulsões, straub, hipnose, anestesia, lacrimação, ptose, micção,
defecação, piloereção, hipotermia, respiração, cianose, hiperemia, morte) foram avaliados no
tempo de 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h e 8 h após a administração e, diariamente, até o décimo
quarto dia (Britto, 1994). No décimo quarto dia, os animais sobreviventes foram anestesiados
44
e após o óbito foi realizada a análise macroscópica dos órgãos (coração, pulmão, baço, rins,
fígado, ovários e úteros) e a pesagem para determinar seus pesos relativos (peso do órgão por
100 g do peso corpóreo).
4.3.3. Avaliação da atividade locomotora (campo-aberto):
O método utilizado foi o “campo-aberto” (open-field) como descrito previamente
(Royce, 1977). O aparato consiste em uma caixa plástica medindo 45 x 45 x 20 cm, com o
fundo dividido em 9 áreas iguais (15 x 15 cm). O número de áreas cruzadas pelas quatro patas
dos animais (n = 6 por grupo) foram contadas em sessões de 6 minutos e tomadas como
índice comportamental. Os animais foram tratados, por via oral, com a mistura do extrato
bruto de Pp e óleo essencial de Cv (1:1) nas doses de 50, 100 e 500 mg/kg. O grupo controle
negativo foi tratado com veículo - 10 ml/kg (NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween®
80%) e o grupo controle positivo foi tratado com pentobarbital (35 mg/kg, i.p.).
4.3.4. Determinação da Dose Efetiva 50 (DE50) no modelo de contorção abdominal
induzida por ácido acético
Neste modelo foi avaliado se a amostra apresentava ou não ação analgésica, por
ser um modelo sensível a substâncias analgésicas de ação central e/ou periférica, dotadas dos
mais variados mecanismos de ação (Shafiee et al., 2003). Foram utilizados seis
camundongos Swiss machos tratados pela via oral, por grupo experimental.
Inicialmente, os grupos foram tratados por via oral com doses de 50, 100, 200 e
300 mg/kg de cada extrato (Pp ou Cv), separadamente, para a determinação da dose efetiva
(DE50). O controle negativo foi tratado com veículo - 10 ml/kg (NaCl 0,9% em tampão
fosfato pH 7 + Tween® 80%). Após 60 minutos, os animais receberam injeção
intraperitoneal de ácido acético (0,8% em solução de NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7, 10
ml/kg) e as contrações da parede abdominal seguida de torções do tronco e extensão dos
membros posteriores foram contadas durante 15 minutos (Koster et al., 1959).
4.3.5. Análise isobolográfica e construção do índice combinatório (IC)
Em um isobolograma, a dose de um fármaco (A) é representada nas abcissas,
enquanto a dose do outro fármaco (B) é representada nas ordenadas. Cada ponto marcado no
gráfico representa um par de doses dos dois fármacos que atingem o DE50 quando
administrados em associação. A linha que une os dois pontos dos fármacos isolados é
designada de linha de aditividade. Geralmente, em modelos experimentais farmacológicos, a
45
análise isobolográfica consiste em vários passos básicos (Luszczki, 2003). Neste trabalho,
foram realizadas as seguintes etapas:
a) Avaliação da atividade antinociceptiva do extrato bruto de frutos de Pterodon
pubescens (Pp) e do óleo essencial de Cordia verbenacea (Cv) através da determinação dos
valores da dose efetiva 50 (DE50) para cada extrato administrado isoladamente no teste de
contorção abdominal induzida por ácido acético. Os valores de DE50 foram determinados
diretamente através de respectiva curva dose/efeito.
b) Escolha teórica das proporções fixas para a combinação dos dois extratos pelo
cálculo do DE50,ad (ad=adição) para cada combinação. O DE50,ad representa a adição total
da dose dos fármacos, que teoricamente promovem 50% de antinocicepção nos animais diante
do teste de contorção abdominal induzido por ácido acético.
As DE50 de cada extrato foram aplicadas isoladamente em um gráfico de
dispersão em escala logarítmica, formando dois pontos que, unidos deram origem à curva de
aditividade. As doses da associação necessárias para inibir 50% das contorções abdominais
foram determinadas através de escala logarítmica e transformadas em mg/kg.
As três combinações determinadas pelo gráfico de modo a detectar possíveis
interações representam à mistura em combinações de 1:3; 3:1 e 1:1, que correspondem a 25%
dose efetiva de Pp + 75% da dose efetiva de Cv; a 75% dose efetiva de Pp + 25% da dose
efetiva de Cv e a 50% da dose efetiva de Pp + 50% da dose efetiva de Cv.
c) Determinação experimental das DE50,ad para as respectivas razões de
combinações dos fármacos através do teste de contorção abdominal induzido por ácido
acético utilizando grupos experimentais (n=6) de camundongos Swiss machos.
d) Por fim, os dados experimentais encontrados em relação à inibição de 50% no
teste de contorção abdominal induzido por ácido acético, foram encontrados através de
regressão linear, plotados no gráfico em escala logarítmica e transformadas em mg/kg e
lançadas no gráfico.
Para a análise do efeito farmacológico, a curva experimental foi comparada a
curva de aditividade. Se os pontos se posicionarem em torno da isobole de aditividade, a ação
será de aditividade; ao se colocarem abaixo, a ação será considerada como sinergismo e caso
se situem acima, a ação será considerada de antagonismo (Berembaum, 1989).
Para a construção do índice combinatório (IC) e avaliação quantitativa da
interação entre os extratos, foi utilizado o modelo de análise do efeito mediano utilizando o
software CompuSyn® 1.0 (Chou, 2006; 2011). Os dados experimentais da resposta
antinociceptiva das misturas obtidos pelo teste de contorção abdominal induzido por ácido
46
acético foram inseridos no software e o índice combinatório foi calculado.
Os extratos separadamente também foram avaliados no teste de contorção
abdominal nas doses efetivas encontradas e a 50% destas doses, correspondendo a 65 mg/kg
de Pp e 32,5 mg/kg de Pp e a 165 mg/kg de Cv e 82,5 mg/kg de Cv e também nas misturas
com 100% da dose efetiva de Pp + 100% da dose efetiva de Cv e a 200% da dose efetiva de
Pp + 200% da dose efetiva de Cv, para efeito de comparação da resposta antinociceptiva
com a associação dos extratos.
4.3.6. Teste de lambedura de pata induzido por formalina
O modelo de nocicepção induzido pela formalina permite avaliar dois tipos
distintos de nocicepção: a de origem neurogênica (estimulação direta das fibras nociceptivas)
e a de origem inflamatória (caracterizada pela liberação de mediadores inflamatórios)
(Hunskaar e Hole, 1987). Este experimento foi baseado nas descrições de Hunskaar & Hole
(1987), com algumas modificações. Foi utilizada uma câmara de observação, que consiste em
um funil com 20 cm de diâmetro. Cada camundongo foi previamente colocado no funil
câmara por 30 minutos antes da injeção intraplantar de formalina para permitir aclimatação
com o novo ambiente. Os grupos (n=6) foram tratados por via oral com veículo - 10 ml/kg
(NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%), com os extratos separadamente nas
doses efetivas encontradas no experimento anterior (contorção abdominal) e em diferentes
combinações, conforme Tabela 4.
Tabela 4. Associações do extrato bruto de frutos de Pterodon pubescens Benth (Pp) e do óleo essencial de
Cordia verbenacea DC (Cv).
Associação Cv Pp
A25 25% (41,25 mg/kg) 75% (48,75 mg/kg)
A50 50% (82,5 mg/kg) 50% (32,5 mg/kg)
A75 75% (123,75 mg/kg) 25% (16,25 mg/kg)
A100 100% (165 mg/kg) 100% (65 mg/kg)
A200 200% (330 mg/kg) 200% (130 mg/kg)
Após uma hora, 20 μl de solução de formalina 2,7 % em tampão fosfato foram
inoculados no coxim plantar da pata traseira direita. Os animais foram observados de 0 a 5
minutos (fase neurogênica) e de 15-30 minutos (fase inflamatória) após a injeção de
formalina. O tempo (em segundos) dispendido pelo animal lambendo/mordendo a pata
47
inoculada foi registrado e considerado como indicativo de dor.
4.3.7. Retirada de cauda
O teste da retirada de cauda consiste na submersão da cauda do animal em água a
50 ºC ± 0,5 °C provocando uma reação de retirada da cauda através de um movimento de
reflexo de origem espinhal, rápido e vigoroso. Quando há um aumento no tempo de retirada
da cauda, interpretra-se como uma ação antinociceptiva (Janssen et al., 1963). Grupos de
camundongos machos Swiss (n = 6) foram utilizados. Foi determinado o valor basal
submergindo a cauda do animal em banho com temperatura de 50ºC e anotado o tempo que o
animal levou a retirar a cauda do banho, 24 horas antes da administração das amostras
testadas. No dia seguinte, a resposta foi novamente avaliada após 30, 60, 90 e 120 minutos da
administração das amostras. O tempo máximo de contato do animal com a água quente foi de
20 s. Os camundongos foram pré-tratados oralmente com 10 ml/kg veículo (NaCl 0,9% em
tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%) e com a mistura de Pp + Cv nas 3 proporções das
doses efetivas encontradas anteriormente (contorção abdominal) : A50, A100 e A200. Como
controle positivo foi utilizada morfina (5 mg/kg s.c.), administrada 30 minutos antes do início
da avaliação.
4.3.8. Placa quente
Para o teste de placa quente os animais foram colocados em um cilindro de vidro
de 24 cm de diâmetro em uma placa de alumínio aquecida (56 ± 0,5 °C) e o tempo (s) para
que o animal tivesse a resposta de lamber, chacoalhar, retirar a pata ou pular foi registrado
como tempo de latência (Ankier, 1974). Os animais (n=6) foram previamente selecionados 24
horas antes do experimento, estabelecendo-se um padrão de tempo de latência de 15
segundos. Além disso, foi determinado o tempo limite de 30 s para que não houvesse lesão
tissular. No dia seguinte, a resposta foi novamente avaliada após 30, 60, 90 e 120 minutos da
administração das amostras. Os camundongos foram pré-tratados oralmente com 10 ml/kg
veículo (NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%) e com a mistura de Pp + Cv
nas 3 proporções das doses efetivas encontradas anteriormente (contorção abdominal) : A50,
A100 e A200. Como controle positivo foi utilizada morfina (5 mg/kg s.c.), administrada 30
minutos antes do início da avaliação.
48
4.3.9. Edema de pata por carragenina
Para verificar a possível atividade anti-edematogênica da mistura do extrato bruto
de Pterodon pubescens e do óleo essencial de Cordia verbenacea foi utilizado o método de
indução de edema de pata com carragenina em camundongos Swiss (Winter et al., 1962). Os
animais em jejum (n=6) foram divididos em grupos: controle negativo (10 ml/kg veículo -
NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%), controle positivo (dexametasona 5
mg/kg) e a mistura de Pp + Cv nas 3 proporções das doses efetivas encontradas anteriormente
(contorção abdominal): A50, A100 e A200.
Os tratamentos (associação e grupos controles) foram administrados pela via oral
1 hora antes da indução do edema através da injeção subcutânea de 40 μl/pata de carragenina
(3%) na região subplantar da pata posterior direita. O edema foi determinado pelo volume
mensurado após a injeção da carragenina (1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas após) empregando-se um
pletismômetro digital (UGO-Basile). A porcentagem de inibição do edema foi calculada da
seguinte forma: [(A - B) / A] × 100, onde A = volume de edema do grupo de controle
negativo e B = volume do edema do grupo experimental.
4.3.10. Edema de pata induzido por prostaglandina E2 (PGE2)
O procedimento experimental foi semelhante ao utilizado no modelo de edema de
pata por carragenina, sendo os animais divididos nos seguintes grupos: controle negativo (10
ml/kg veículo - NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%), controle positivo
(indometacina 20 mg/kg) e a associação de Pp + Cv nas 3 proporções das doses efetivas
encontradas anteriormente (contorção abdominal): A50, A100 e A200. Após 1 hora, a
inflamação foi induzida através da injeção intraplantar de 20 μL de prostaglandina E2
(Sigma®), 1 μg/animal. As avaliações foram realizadas após 15, 30, 60 e 90 minutos da
indução da inflamação (Claudino et al., 2006).
4.3.11. Peritonite induzida por carragenina
Os animais (n=6) foram tratados oralmente com controle negativo (10 ml/kg
veículo - NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%), controle positivo
(dexametasona 5 mg/kg) ou a associação de Pp + Cv nas 3 proporções das doses efetivas
encontradas anteriormente (contorção abdominal): A50, A100 e A200. A peritonite foi induzida
1 hora após o tratamento por injeção intraperitoneal de uma solução de carragenina (500 μg /
250 μL) (Iwamoto et al., 2015). Quatro horas depois, os animais foram eutanásicos e a
cavidade peritoneal foi lavada com 5 ml de PBS (solução salina tamponada com fosfato)
49
contendo heparina 5 UI / ml. O líquido peritoneal foi recuperado para análise de números de
leucócitos totais usando um analisador de hematologia (modelo Sysmex Poch-100iV).
4.3.12. Alodinia induzida por CFA – Adjuvante completo de Freund
Os procedimentos foram semelhantes ao método descrito por Villetti et al., (2003)
com mudanças nos protocolos e análise dos dados. A inflamação foi induzida por uma
solução de CFA (complete freund´s adjuvant - 1 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis
atenuado por calor em 85% de parafina em óleo e 15% manide monoleato). Grupos
experimentais de 6 camundongos machos Swiss receberam o volume de 40 µl (s.pl.) de CFA
na pata direita. A alodinia mecânica foi mensurada utilizando um Anestesiômetro (Dynamic
Plantar Anaestesiomether- Ugo Basile, mod- 37450- Itália) que consiste em uma plataforma
elevada, com perfurações que permitem o acesso a superfície ventral das patas posteriores.
Uma haste de aço (diâmetro 0,5 mm) foi pressionada contra a pata em análise com uma força
crescente (0 a 8 g em 5 segundos para camundongos). Com a retirada da pata, o estímulo
mecânico foi automaticamente cessado e a força que cada animal suportou, gravada pelo
próprio equipamento. A avaliação da alodinia mecânica (resposta ao toque) foi realizada
conforme descrito: mensuração do estímulo basal na pata posterior direita por três vezes
(média); injeção do CFA intraplantar; 24 horas após a injeção mensuração do estado basal em
estado hiperálgico; tratamento com as amostras, com posterior mensuração da alodinia
mecânica aguda (30, 60 e 90 minutos). Após sete dias, os procedimentos foram repetidos para
a avaliação da alodínia mecânica crônica (basal, 30, 60 e 90 min pós-tratamento). Veículo (10
ml/kg - NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80% – controle negativo), morfina (5
mg/kg, s.c. – controle positivo) ou a associação de Pp + Cv nas 3 proporções das doses
efetivas encontradas anteriormente (contorção abdominal): A50, A100 e A200 foram
administradas por via oral 60 minutos antes da aplicação do estímulo em cada fase do
experimento.
Neste experimento, também foi avaliado o tratamento prolongado da associação
de Pp + Cv, onde os grupos foram tratados diariamente desde o dia 1 (primeiro dia após a
injeção de CFA) até o dia 7 com a mistura de Pp + Cv nas mesmas doses e proporções
descritas acima e também tratados com os controles positivo (dexametasona 5 mg/kg, v.o.) ou
negativo (veículo).
4.4. Experimentos in vitro
Estes experimentos foram realizados durante estágio de pesquisa no exterior no
50
laboratório da Prof. Dra. Veronika Butterweck - Institute for Pharma Technology (IPT) -
University of Applied Sciences and Arts Northwestern Switzerland (FHNW) – Muttenz –
Suíça.
4.4.1. Cultura de células
Os queratinócitos HaCaT não-tumorigênicos humanos (Cell Line Services,
Eppelheim, Alemanha) foram mantidos em meio DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s
medium) com alta glucose 1 x suplementado com 1% (v/v) de Penicilina 10000 U/ml e
Estreptomicina 10000 μg/mL e 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS) a 37 ° C
numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2. Os experimentos foram realizados com
aproximadamente 80-90% de confluência e realizados entre as passagens 43 e 52.
4.4.2. Ensaio de viabilidade celular (ATP)
O ensaio de viabilidade celular foi realizado através do kit Luminescente
CellTiter-Glo® e realizado de acordo com o protocolo da fabricação. Foram feitas as
seguintes alterações: as células foram cultivadas em uma placa transparente e estéril de 96
poços com uma densidade de 2,5 x 105 células/ml. Após um período de incubação de 24 h
(37º C, 5% de CO2), as células foram lavadas com PBS, subsequentemente tratadas de acordo
com 100 μL de solução e incubadas durante mais 24 h. Foram testadas as seguintes
concentrações dos extratos e compostos: para os extratos separados e associação (Pp + Cv - A
- relação ½ : ½ ) 50; 25; 15; 10; 5; 1 e 0,5 μg/mL e para os compostos isolados 50; 25; 12,5;
6,25; 3.125; 1,5625 e 0,78125 μM. Adicionou-se então 100 μL de reagente CellTiter-Glo® a
cada poço, resultando numa diluição 1: 1. As placas de amostra foram agitadas durante 2
minutos em um agitador orbital e incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente. 100
μL de cada poço foram então transferidos para uma placa branca e opaca de 96 poços estéril e
imediatamente realizou-se a leitura por um leitor de microplacas (SpectraMAX L, Molecular
Devices).
4.4.3. Ensaio de proliferação celular
O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. 100 μL de uma
suspensão de células HaCaT foram plaqueadas em placas estéril de 96 poços a uma
concentração de 2,5 × 105 células/ml. Após 24 h de incubação (37 ° C, 5% de CO2), o meio
contendo 10% de FBS foi descartado e a placa foi lavada com 200 μL/poço de PBS. Pterodon
pubescens Benth. (Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) e a associação (Pp + Cv - A - relação ½ :
51
½) foram testadas em concentrações de 25; 12,5; 6,25; 3.125 e 1.5625 μg/mL e os compostos
isolados foram testados em concentrações de 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,125 μM, respectivamente.
Após o período de incubação de 24 h com as amostras, adicionou-se reagente BrdU (10 μM,
10 μl) em todos os poços, exceto o controle não tratado. Após o descarte do meio, foram
adicionados 200 μL de uma solução de fixação/desnaturação e incubados durante mais 30
minutos. Posteriormente, o líquido foi trocado pelo anticorpo monoclonal anti-BrdU primário
e incubado durante 1 hora. Posteriormente, o anticorpo não ligado foi lavado e adicionou-se
“horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG”, que se liga ao anticorpo do
detector. Finalmente, foram adicionados 50 μL de substrato 3,3', 5,5''-tetrametilbenzidina
(TMB) e convertidos pelo conjugado de peroxidase e a reação foi parada por solução de ácido
sulfúrico 2,5 N. A leitura da placa foi realizada a 450 nm (Spectramax i3x Plataforma de
detecção multimodo, Molecular Devices).
4.4.4. Ensaio de migração celular (“scratch assay”)
Após o posicionamento dos inserts nas placas de 12 poços de cultura celular, as
células HaCaT foram inoculadas em uma concentração de 2,5 × 105 células/ml nos poços.
Após um período de incubação de 24 horas, as células atingiram a confluência e os inserts
foram removidos causando uma lacuna de 450 μm (Figuras 6 e 7). Os poços foram lavados
com 1 ml de PBS, aspirados e adicionou-se 1 ml dos extratos de teste, associação e
compostos.
Figura 6. Procedimento para o ensaio de migração celular. 1) Coloque a inserção aderida na parte inferior da
placa. 2) Coloque 70 μl da suspensão celular em cada parte da inserção e incube durante 24 horas para
semeadura e fixação. 3) Retire a inserção após o cultivo, aspirar o meio e lavar cuidadosamente com 1 ml de
PBS. Remova imediatamente o PBS e 4) preencha com as amostras a serem testadas.
52
Figura 7. Intervalo causado pelo insert.
As amostras foram colocadas nos poços de acordo com as diferentes
concentrações. Os extratos, associação e compostos isolados foram dissolvidos em DMEM
contendo 0,1% de DMSO. O DMEM suplementado com 2% de FBS foi utilizado como
controle positivo e 0% de FBS + 0,1% de DMSO (DMEM sem suplementos) foi utilizado
como controle.
As imagens em tempo real foram realizadas com o microscópio invertido
automatizado Olympus IX83 para imagens de células vivas. A ampliação da imagem foi
ajustada para 10x. As imagens de cinco momentos específicos em 0, 6, 12, 18 e 24 h após a
adição do tratamento foram analisadas usando o software Olympus cellSens Dimension
1.81®. Para calcular o tamanho das lacunas ao longo do tempo, foi utilizado o software Image
J®, incluindo a ferramenta de cicatrização de feridas e a área da lacuna livre de células foi
medida com base no número de pixels. Portanto, os espaços detectados foram convertidos em
porcentagens: 0% refere-se a nenhum movimento de células e 100% representa um
fechamento da lacuna total. Pterodon pubescens Benth. (Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) e a
associação (Pp + Cv - A - relação ½ : ½) foram testadas em concentrações de 12,5; 6,25 e
3,125 μg/mL e os compostos foram testados em concentrações de 25; 12,5 e 6,25 μM,
respectivamente.
4.4.5. Atividade anti-inflamatória
A metodologia experimental, incluindo a concentração de TNF-α, foi escolhida de
acordo com Park et al., 2010, com algumas modificações. Para amostras não estimuladas, as
células foram semeadas em placas de 12 poços a uma densidade de 2,5 × 105 células/ml. Após
um tempo de incubação de 24 h (37 °C, 5% de CO2), o meio DMEM foi descartado e as
células foram lavadas com 1 ml/poço de PBS e as amostras foram adicionadas como se segue:
Pterodon pubescens Benth. (Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) e a associação (Pp + Cv - A -
relação ½ : ½) em concentrações de 12,5; 6,25 e 3,125 μg/mL e os compostos isolados em
concentrações de 25; 12,5 e 6,25 μM, respectivamente. Hidrocortisona (10 μM) e LY294002
53
(10 μM) foram utilizadas como controle. Para avaliar a secreção basal de VEGF ou IL-8 em
queratinócitos, o DMEM com 0% de FBS foi aplicado como controle. Em contraste, todos os
poços das células estimuladas foram suplementados com TNF-α 20 ng/ml e substâncias testes
e incubadas durante 24 horas. Os sobrenadantes foram armazenados em tubos de
microcentrífuga estéril e congelados (- 20 ° C) imediatamente. O VEGF-ELISA e IL-8-
ELISA foram realizados de acordo com as instruções do fabricante (PeproTech®). A
absorvância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas (SpectraMax M2e).
54
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos na forma de média erro padrão da média (e.p.m)
dos parâmetros obtidos. Os valores médios obtidos foram submetidos à análise de variância
de uma via (ANOVA), seguida do teste de Dunnett para comparação entre o grupo controle e
os grupos testes, ou teste de Student (t) para comparar dois grupos. O programa estatístico
utilizado foi o GraphPad Prism 5®. O nível de significância mínimo utilizado foi de p < 0,05.
55
6. RESULTADOS
6.1. Capítulo 1
Synergistic effect of Pterodon pubescens and Cordia verbenacea plant
extracts association in antinociception and anti-inflammatory experimental
models
Artigo submetido para a Journal of Etnopharmacology
56
Abstract:
Pharmacology relevance:
Cordia verbenacea DC leaves are used in folk medicine due to their anti-
rheumatic, anti-inflammatory, antimicrobial, analgesic actions. Pterodon pubescens Benth.,
popularly known as sucupira, is used in folk medicine for the treatment of rheumatism, sore
throats, inflammation and as analgesic.
The present study aimed to evaluate the pharmacological effect of the association
of crude dichloromethane extract from the fruits of Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the
essential oil of Cordia verbenacea DC (Cv) in antinociception and anti-inflammatory
experimental models.
Material and methods:
Preliminary safety characterizations of the association of both extracts were
evaluated though acute toxicity and open field test. Data of acetic acid-induced writhing test
defined the effective doses of each extract and synergism between the extracts assessed by
isobologram method. Evaluation of the antinociceptive effect was performed through acetic
acid-induced writhing test, formalin test, tail flick and hot plate. The anti-inflammatory
activity was evaluated in paw edema model induced by carrageenan and PGE2 in mice,
carrageenan-induced peritonitis and mechanical allodynia induced by Complete Freund´s
Adjuvant (CFA). Phytochemical analysis and quantification of active compounds was
assessed by HPLC-DAD and FID.
Results:
Oral administration of the associations did not cause changes in the behavioral
parameters of the animals and in the weight gain. The associations were significant effective
in reducing abdominal writhings. The interaction between the extracts was a synergism
interaction evaluated by isobologram method. At the formalin test, associations were only
significant effective at inflammatory phase. In tail flick and hot plate models, the association
did not show significant efficacy against the nociception due to thermal stimulation. In the
paw edema model induced by carrageenan, the association showed a significant reduction of
edema. In the paw edema model induced by PGE2, the association showed a significant
reduction of edema. At carrageenan-induced leukocyte migration in the mouse peritoneal
cavity test, associations did not significantly reduced leukocyte migration. At mechanical
allodynia induced by Complete Freund´s Adjuvant our results showed that the associations
were effective at acute phase with pronounced effect at chronic phase. Phytochemical analysis
showed important estimated concentrations of α-Humulene, trans-Caryophyllene,
57
geranylgeraniol and compounds m/z 404 and m/z 362.
Conclusions:
The results presented herein demonstrate that the association of crude
dichloromethane extract from the fruits of Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the essential
oil of Cordia verbenacea DC (Cv) promote synergistic antinociceptive and anti-inflammatory
activities, at lower doses than the separate crude extracts, probably acting in different
pharmacological receptors, without demonstrating side effects.
Keywords: Pterodon pubescens Benth., Cordia verbenacea DC, natural products, synergism,
antinociceptive, anti-inflammatory.
1. Introduction
Inflammation is typically viewed as a localized protective response to tissue
damage and/or microbial invasion, which serves to isolate and destroy the injurious agent and
the injured tissue preparing the organ for eventual repair and healing (Medzhitov, 2008;
Granger & Senchenkova, 2010). This protective response is mainly achieved by increased
movement of the blood-defending cells in injured or infected tissues. Inflammation is usually
regulated by a cascade of many molecular interactions and biochemical reactions responsible
for propagating and maturing the inflammatory response involving the local vascular system,
the immune system and various cell types (Pomin, 2015). Inflammation has been studied
universally in an attempt to combat the deleterious effects on the human body. Though,
inflammation plays a central role in the pathogenesis of various disorders such as rheumatoid
arthritis, cancer, diabetes, obesity, cardiovascular complications the role in the pathogenesis
may vary from disease to disease (Kotas & Medzhitov, 2015). Pain is a common symptom of
various inflammatory diseases defined as an unpleasant sensory experience associated with
actual or potential tissue damage (IASP taxonomy, 2012). Precisely, pain is a subjective result
of nociception, which is defined as neural processes of coding and processing of noxious
stimulus (Loeser & Treede, 2008). The sensitization occurs initially in nociceptive neurons
near the injured tissue and leads to an increase in local pain sensation (Pinho-Ribeiro et al.,
2015). According to the National Institutes of Health (NIH), pain is one of the most important
national public health issues, a silent epidemic (Lippe et al., 2010). Estimations from the
American Pain Society show that pain affects more than 100 million adults in the United
States spending about $ 635 billion a year in medical treatment and lost productivity (Institute
of Medicine, 2011; Borsook et al. 2014).
The therapeutic approach commonly used to reduce pain and inflammation
58
involves the use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) (McGettigan & Henry,
2013). NSAIDs represent a group of more than 20 drugs that enjoy wide clinical application
and present compounds with heterogeneous chemical structures that demonstrate efficacy for
the treatment of pain, inflammation, and antipyretic properties (Rigas & Tsioulias, 2015) but
their long-term use has a straight relationship with complications of the gastrointestinal tract,
including peptic ulcers, renal toxicity, cardiovascular risks (Tielemans et al., 2014; Bruno et
al., 2014). In this sense, the development of novel drugs to treat inflammatory and painful
states, with minimal adverse effects, constitutes a challenge and is constantly under debate
and research (Knowles, 2014).
Nature has a fundamental role in the process of developing new drugs. The
enormous plant biodiversity provides inputs to generate phytotherapics, phytopharmaceuticals
and prototypes of new drugs of economical importance (Cragg & Newman, 2013). By 2016,
Cragg & Newman estimated that approximately 55.1% of all new drugs approved from 1981
to December 2014 were derived directly or indirectly from natural products (Cragg &
Newman, 2016). Brazil has the highest total biodiversity in the world, comprising more than
45.000 species of higher plants (20-22% of the total on the planet) (Dutra et al., 2016).
One example of a native species of the Brazilian flora is Cordia verbenacea DC
(Boraginaceae), a botanical synonymy of Varronia verbenacea DC Borhidi (Tropicos, 2017)
that is a perennial shrub native to the Atlantic Forest, widely distributed along the
southeastern coast of Brazil, popularly known as miracle maria, black catinga, camaradinha,
caraminha, and maria-pretinha. Several compounds are found in their aerial parts, including
tannins, flavonoids, mucilages in addition to essential oils. The leaves and inflorescences are
used in folk medicine due to their anti-rheumatic, anti-inflammatory, antimicrobial, analgesic
actions in the form of alcoholic extract, decoction and infusion (De Carvalho et al., 2004;
Dutra et al., 2016). Due to the diversity of chemical groups found in extracts of this species,
there are several pharmacological activities reported, antibacterial, anti-inflammatory, anti-
edematogenic, antiulcerogenic, antitumor, healing properties, among others (Matias et al.,
2016; Passos et al., 2006; Fernandes et al., 2007; Roldão et al., 2008; Parisotto et al., 2012;
Perini et al., 2015). Of the different components found in the essential oil, there are two main
compounds with important anti-inflammatory and anti-edematogenic activity, α-Humulene
and trans-Caryophyllene (Passos et al., 2006).
The other example of a native species of the Brazilian flora is Pterodon pubescens
Benth. (Leguminosae-Papillonoideae,), a botanical synonym of Pterodon emarginatus Vog.,
widely distributed in the central region of Brazil and popularly known as sucupira, faveiro,
59
sucupira-branca or sucupira-lisa. The folk use of sucupira was reported through an
ethnobotanical study in 30 cities in the interior of Minas Gerais State, where the population
used the species for the treatment of rheumatism, sore throats, as well as anti-inflammatory
and analgesic (Carvalho et al., 1999). A number of reported pharmacological activities of this
species have been described: antinociceptive, anti-inflammatory, anti-edematogenic, anti-
arthritic, antiproliferative and other activities (Servat et al., 2012; Nucci-Martins et al., 2015;
Spindola et al., 2011; Spindola et al., 2009; Grando et al., 2017). Some authors have
suggested that the diterpenes vouacapane and the geranylgeraniol sesquiterpene moities are
involved with the anti-inflammatory and antinociceptive properties of P. pubescens (Silva et
al., 2004, Spindola et al., 2009).
The interest in studying synergistic or antagonistic effects through experiments
with associations has grown immensely since mid-1990’s (Ritz & Streibig, 2014). The word
synergy is derived from the Greek word synergo'z, meaning "working together" and the idea
in the field of pharmacology refers to the elucidation and quantification of the action of drugs
administered in combination (Sucher, 2014). The scientific literature has shown that often the
pharmacological action of the active principle alone differs from the action found in crude
extracts with believe that the advantage of herbal medicines is due to synergistic interactions
that potentiate their pharmacological effects with reduced side effects (Wagner & Ulrich-
Merzenich, 2009). The increased effectiveness of combinations of compounds or extracts can
be understood by the synergistic effects of multi-target where the association acts in a
synergistic manner. The strategy of use for a multivalued association is that many diseases
have a pluri-causal etiology and complex pathophysiology, being treated more effectively
with well-chosen pharmaceutical combinations than with a single drug (Wagner & Ulrich-
Merzenich, 2009; Ulrich-Merzenich, 2014). Therefore, the present study was carried out using
an association of extracts aiming to evaluate the pharmacological effect of the association of
crude dichloromethane extract from the fruits of Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the
essential oil of Cordia verbenacea DC (Cv) in antinociception and anti-inflammatory
experimental models.
2. Material and methods
2.1.1. Plant material and extraction
Fruits of Pterodon pubescens Benth were collected from Ponto Chique (MG –
Brazil - coordinates 16 ° 38'23.3 "S 45 ° 03'54.0 " W). The dried specimen was deposited at
the Herbarium of the University of Campinas (Unicamp) under number 179739.
Leaves of Cordia verbenacea DC were collected in CPQBA – Unicamp experimental field
60
(Multidisciplinary Center for Chemical, Biological and Agricultural Researches – Paulínia –
SP - Brazil). The dried specimen was deposited at Herbarium of the University of Campinas
(Unicamp) under number 112744. The plant materials received authorization to use the
Brazilian genetic resources under number 010829/2014-8.
The extraction process of Pterodon pubescens Benth fruits was carried out in
stainless steel tank with mechanical stirring using dichloromethane as liquid extractor. The
fruits were ground with dry ice to increase the contact surface providing a higher extraction
yield. The plant material (kg) by volume of organic solvent (l) ratio was a 1: 3 by performing
three extractions of 1.5 hours each, a total of 4.5 hours (3 times 1.5 h) at room temperature
renewing the solvent at each step. The partial extracts were filtered, combined and
concentrated under vacuum by rotary evaporation system at 40°C (Büchi RE 120). The
extract was stored in amber bottle and stored at room temperature.
Cordia verbenacea DC leaves’ essential oil was obtained by steam distillation
technique, carried out during a 1.5 to 2 hours period. Therefore, crushed fresh leaves were
used in stainless steel vat with capacity for 1500 l. The oil was separated from the water
initially in the annex to the florentine vase vat and afterwards in a separating funnel, followed
by the use of anhydrous sodium sulfate to remove residual traces of water. The oil was stored
in a freezer until use.
2.1.2. Isolation of voucapan
The isomers voucapan 6α- hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-17β-oate methyl ester
and 6α-acetoxy-7β-hydroxyvouacapan-17β-oate methyl ester (m/z 404) and 6α,7β-
dihydroxyvouacapan-17β-oate methyl ester (m/z 362) from crude dichloromethane extract
from the fruits of Pterodon pubescens Benth. were isolated by column chromatography (25x
500 mm), using solvent gradient of hexane and ethylacetate as previously described (Spindola
et al., 2009). The purified compounds of data were compared to previously identified
compounds by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Mass Spectrometry (MS).
2.1.3. GC–MS analysis
The GC–MS (Gas chromatography–mass spectrometry) analysis was carried out
with an Agilent 5975 GC–MS system. HP5 column (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm film
thickness) was used with helium as carrier gas (1.0 ml/min). GC oven temperature was kept at
60°C for 3 minutes and programmed to 240°C at a rate of 3°C/ min, and kept constant at
240°C for 5 minutes and then programmed to 240°C at a rate of 1°C/min. Split ratio was
adjusted at 40:1. The injector temperature was set at 250°C. Mass spectra were recorded at 70
eV. Mass range was from m/z 100 to 600.
61
2.1.4. GC analysis essential oil quantification
The GC (Gas chromatography) analysis was carried out using an Agilent 6890N
GC system. FID (Flame ionization detector) temperature was 250°C. To obtain the same
elution order with GC–MS, simultaneous auto-injection was done on a duplicate of the same
column applying the same operational conditions. Quantifications were accomplished using
analytical standard α-Humulene, trans-caryophyllene and geranylgeraniol (Sigma Aldrich
Saint Louis USA).
2.1.5. HPLC analysis voucapan compounds
The HPLC-DAD system (Shimadzu) consisted of C18 reverse phase column
(Gemini -C18 250 mm × 4.6 mm x 5µm) with 10 µL sample inject. The mobile phase was a
mixture of 70:30 Acetronitrile: water with 0.1% acetic acid (v:v). The flow rate and UV
wave-length were set at 1 ml/min and 220 nm, respectively.
2.2. Pharmacological evaluations
2.2.1. Animals
Swiss mice of either sex were used (25-35 g) for experiments. Animals were
obtained from CEMIB (Multidisciplinary center for biological research in the field of animal
laboratory science) - Unicamp and adapted to laboratory conditions for at least seven days
prior to experimental manipulation under temperature (23 2 C) and light-dark cycle of 12
hours controlled. The animals were fed with Purina and water ad libitum. Efforts were made
to minimize animal suffering and to reduce the number of animals used. The experimental
protocols were approved by Institute of Biology Ethics Committee for Animal Research
(CEUA) of Unicamp nº 3181-1 and 4392-1. All animals were withdrawn from food 4 hours
prior of each experiment.
2.2.2. Acute toxicity test
The acute toxicity test for the association of crude dichloromethane Pterodon
pubescens Benth (Pp) fruits extracts and Cordia verbenacea DC leaves’ essential oil (Cv) was
carried out to evaluate any possible toxicity. Female Swiss mice (n=6) were tested by
administering different doses of the association (50, 100 e 500 mg/kg of each extract at ratio
1:1), while the control group received 10 ml/kg of vehicle (saline solution 0,9 % sodium
chloride with Tween® 80 1%). The treatments were accomplished by oral route and all
groups were observed for any side effect during the first 8 hours and daily until the fourteenth
day, when surviving animals were anesthetized and post mortem macroscopic analysis of the
organs (heart, lung, spleen, kidney, ovary and uterus) was performed and weighed to
determine their relative weights (organ weight per 100 grams of body weight) (OECD, 2002).
62
2.2.3. Open field test
The open field test was performed as previously described (Royce, 1977) with
some modifications. The apparatus used for this activity consisted of a plastic white box
divided into 9 squares (15 x 15 cm) by black lines. Female Swiss mice (n=6) were treated
orally by the association of Pp + Cv at doses of 50, 100 and 500 mg/kg at a ratio of 1:1. The
negative control group received vehicle (10 ml/kg, v.o.) and the positive control group was
treated with pentobarbital (35 mg/kg, i.p.). After one hour of treatment each animal was
placed in the center of the box and the numbers of lines crossed by the four legs of the
animals were counted for each mouse during 6 minutes and taken as behavioral session index.
2.2.4. Determination of effective dose 50 (ED50) with abdominal writhing test
induced by acetic acid
Male Swiss mice (n=6) were treated orally, for each experimental group.
Initially, the groups were treated with different doses (50, 100, 200 and 300 mg/kg) for each
extract (Pp or Cv), separately, to determine separate dose-response curves. Negative control
was treated with 10 ml/kg of vehicle. After 60 minutes of the treatments, animals received
i.p. injection with 0.8% acid acetic (0.1 ml/10 g) and the numbers of abdominal writhes was
counted after 5 minutes of acetic acid injection for the period of 15 minutes (Koster et al.,
1959). The extracts were also evaluated at the effective doses found and at 50% of these
doses, for comparison effect of the antinociceptive response with those of the extracts
association.
2.2.5. Isobolographic analysis and construction of combinatorial index (CI)
Standard isobologram analysis was used to evaluate the potential synergistic
interaction between these two extracts, according to Berenbaum method (1978): the crude
dichloromethane extract of Pterodon pubescens Benth fruits (Pp) and Cordia verbenacea DC
(Cv) leaves’ essential oil were tested in various combination associations shown in Table 1,
according to ED50 previously determined at abdominal writhing test induced by acetic acid
(2.2.4.).
63
Table 1. Associations of crude dichloromethane of Pterodon pubescens Benth (Pp) fruit extract and Cordia
verbenacea DC (Cv) leaves’ essential oil tested in various combination mixtures (25, 50, 75, 100 and 200 % of
the ED50 of each extract tested alone) tested on abdominal writhing experimental model induced by acetic acid
for visualization of pharmacological interaction effect.
Associations Cv Pp
A25 25% (41,25 mg/kg) 75% (48,75 mg/kg)
A50 50% (82,5 mg/kg) 50% (32,5 mg/kg)
A75 75% (123,75 mg/kg) 25% (16,25 mg/kg)
A100 100% (165 mg/kg) 100% (65 mg/kg)
A200 200% (330 mg/kg) 200% (130 mg/kg)
For the analysis of the pharmacological effect, the experimental curve was
compared to the additivity curve. If the points were positioned around the isobole of
additivity, the action was additivity; if they were placed below, the action was considered as
synergism and if they were situated above, the action was considered antagonism
(Berembaum, 1989). Male Swiss mice (n=6) were treated with different associations and
submitted to the abdominal writhing test induced by acetic acid as previously described.
For the construction of the combinatorial index (CI) and quantitative evaluation of
the interaction between the extracts, the median effect analysis model was used using
CompuSyn® 1.0 software (Chou, 2006). Experimental data of the antinociceptive response of
the associations obtained by the acetic acid-induced abdominal writhing test were entered into
the software and the combinatorial index was calculated.
2.2.6. Formalin test
This experiment was based on the descriptions of Hunskaar & Hole (1987), with
some modifications. An observation chamber was used, consisting of a funnel 20 cm in
diameter. Each mouse was previously placed in the funnel chamber for 30 minutes prior to the
intraplantar injection of formalin to allow for adaption with the new environment. The groups
(n = 6) were orally treated with vehicle - 10 ml/kg, extracts separately at the effective doses
found in the previous experiment (acetic acid induced writhing test) and 50% of these doses,
corresponding to 65 mg/kg and 32.5 mg/kg of Pp and 165 mg/kg and 82.5 mg/kg of Cv, and
with the associations of the extracts at the doses describe previously. After one hour, 20 μl of
2.7% formalin solution in phosphate buffer were inoculated into the plantar pad of the right
hind paw. The animals were observed from 0 to 5 minutes (neurogenic phase) and from 15-30
minutes (inflammatory phase) after formalin injection. The time (in seconds) spent by the
animal licking/biting the inoculated paw was recorded and considered as indicative of pain.
64
For the following experiments, the 3 associations with the best performance in abdominal
writhing test induced by acetic acid and formalin test were selected.
2.2.7. Hot plate test
Male Swiss mice (n=6) were for used for each experimental group. Animals were
subjected to pre-testing on hot plate maintained at 55 ± 0.5 °C and having latency time greater
than 15 seconds on hot plate during the pre-testing were rejected (latency time). Mice were
pre-treated orally with vehicle (10 ml/kg), association of Pp + Cv in different 3 doses as
described previously (A50, A100 and A200) and morphine (5 mg/kg, s.c.) as positive control.
After 60 minutes for treatments and 30 minutes for morphine, animals were placed on hot
plate and the latency time (time for which mouse remains on the hot plate 55 ± 0.5 °C without
licking or flicking of hind limb or jumping) was measured in seconds. In order to prevent the
tissue damage a cut-off time of 30 seconds were imposed for all animals. The latency time for
all groups was recorded at 0, 30, 60, 90 and 120 minutes (Ankier, 1974).
2.2.8. Tail flick
Groups of Swiss male mice (n=6) were used. A basal value was determined by
submerging the tail of the animal in a bath at a temperature of 50° C and noted the time the
animal took to remove the tail of the bath 24 hours prior to the administration of the samples
tested. The next day, the response was again evaluated after 30, 60, 90 and 120 minutes of
sample administration. The maximum contact time of the animal with hot water was 20 s. The
mice were pre-treated orally with 10 ml/kg vehicle and association of Pp + Cv in different 3
doses as described previously (A50, A100 and A200). As a positive control, morphine (5 mg/kg,
s.c.) was administered 30 minutes before the beginning of the test (Janssen et al., 1963).
2.2.9. Paw edema induced by carrageenan
To verify the possible anti-edematogenic activity from the association of extracts,
the methodology of paw edema induced by carrageenan in male Swiss mice were performed
(Winter et al., 1962). The animals were divided in groups (n=6): negative control (10 ml/kg –
vehicle), positive control (dexamethasone – 5 mg/kg) and the association in 3 doses (A50, A100
and A200). All treatments were administrated orally 1 hour before the induction of the edema
through the subcutaneous injection of 40 µl of carrageenan (3%) at the sub plantar region of
posterior right paw. The edema was determined by the volume measured after the injection of
carrageenan (1, 2, 4, 6, 24 and 48 hours after) using a digital plethysmometer (UGO-Basile).
The percentage of edema inhibition was calculated as follows: [(A − B) / A] × 100, where
A = edema volume of negative control group and B = edema volume of experimental group.
65
2.2.10. Paw edema induced by PGE2 (Prostaglandin E2)
Swiss male mice were divided in groups (n=6): negative control (10 ml/kg –
vehicle), positive control (indomethacin – 20 mg/kg) and the association in 3 doses (A50, A100
and A200). All treatments were administrated orally 1 hour before edema induction by
subcutaneous injection of PGE2 (1 μg/paw) at the sub plantar region of posterior right paw.
The edema was determined by the volume measured after the injection (15, 30, 60 and 90
minutes after) using a digital plethysmometer (UGO-Basile). The percentage of inhibition of
edema was calculated as follows: [(A − B) / A] × 100, where A = edema volume of negative
control group and B = edema volume of experimental group (Claudino et al., 2006).
2.2.11. Carrageenan-induced leukocyte migration in the mouse peritoneal cavity
(peritonitis)
Swiss male mice (n = 6) were treated orally with vehicle, associations (A50, A100
and A200) or dexamethasone (5 mg/kg). Peritonitis was induced 1 hour min later, by i.p.
injection of carrageenan solution (500 μg/250 μL) (Iwamoto et al., 2015). Four hours later,
mice were euthanized, and the peritoneal cavity was washed with 5 ml of PBS (phosphate-
buffered saline) containing heparin 5 IU/ml. The peritoneal fluid was recovered for analysis
of total leukocyte numbers using a hematology analyser (Sysmex model Poch-100iV).
2.2.12. Mechanical allodynia induced by Complete Freund´s Adjuvant (CFA)
The procedures were similar to the method described by Villetti (2003) with
protocol adaptions and data analysis. The inflammation was induced by a solution of CFA
(complete freund's adjuvant - 1 mg/ml heat-attenuated Mycobacterium tuberculosis in 85%
paraffin in oil and 15% manide monoleate). Experimental groups of 6 Swiss male mice
received the volume of 40 μl (s.pl.) of CFA on the right hind paw. Mechanical allodynia was
measured using an Anesthesiometer (Dynamic Plantar Anaestesiomether-Ugo Basile, mod-
37450- Italy) consisting of a raised platform with perforations that allow access to the ventral
surface of the hind legs. A steel rod (diameter 0.5 mm) was pressed against the paw under
increasing force (0 to 8 g in 5 seconds for mice). With the withdrawal of the paw, the
mechanical stimulus was automatically ceased and the strength that each animal endured,
recorded by the equipment. The evaluation of mechanical allodynia (touch response) was
performed as described: three measurement (mean)of the basal stimulus in the right hind paw;
Intraplantar CFA injection; 24 hours after injection measurement of basal state in
hyperalgesic state; Treatment with the samples, with subsequent measurement of acute
mechanical allodynia (30, 60 and 90 minutes). After seven days, procedures were repeated for
evaluation of chronic mechanical allodynia (baseline, 30, 60 and 90 min post-treatment).
66
Vehicle (10 ml/kg -negative control), morphine (5 mg/kg, s.c. - positive control) and
association of Pp + Cv in different 3 doses as described previously (A50, A100 and A200) were
administered orally 60 minutes before the application of the stimulus in each phase of the
experiment. In this experiment, the prolonged treatment of the Pp + Cv association was also
evaluated, where the groups were treated daily from day one (first day after CFA injection)
until day seven with the Pp + Cv association at the same doses, positive control
(dexamethasone 5 mg/kg, v.o.) and negative (vehicle).
3. Statistical analysis
Results were expressed as mean mean standard error (S.E.M.) of the measured
parameters. Mean values were subjected to analysis of variance of one way (ANOVA)
followed by Dunnett's test to compare treated groups with control group or Student´s test (t)
to compare two groups. The statistical program used was GraphPad Prism 5. The minimum
level of significance was set at p < 0.05.
4. Results
4.1. Plant extraction
For the crude dichloromethane Pterodon pubescens fruits extract 1500 g of
ground fruits were placed in a stainless steel tank with mechanical stirring. The extraction
process provided approximately 675 g, representing 45% yield.
Cordia verbenacea DC essential oil was obtained by means of the steam
distillation technique for 1 ½ to 2 hours, using crushed fresh leaves using a stainless steel set
containing 1500 l capacity providing the essential oil in 0.34% yield.
4.2. Phytochemical analysis
Quantifications were accomplished using analytical standard α-Humulene, trans-
Caryophyllene and geranylgeraniol (Sigma Aldrich Saint Louis USA). The peak area
calculated from HPLC chromatograms was correlated linearly with compound m/z 404
concentrations in the range of 17–2180 µg/ml (R2= 0.999) and compound m/z 362 range of
8.7-1117 µg/ml (R2= 0.999). The peak area calculated from FID chromatograms was
correlated linearly with α-Humulene concentrations in the range of 15–1000 µg/ml (R2=
0.9996), trans-Caryophyllene 20-1300 µg/ml (R²=0.9971) and geranylgeraniol 19-1230 µg/ml
(R²=0.9995). The percentage amounts of the separated compounds were calculated in samples
test (Table 2).
67
Table 2. Percentage amounts of active compounds present at crude dichloromethane Pterodon pubescens fruits
extract and Cordia verbenacea DC essential oil
Extract
trans-
Caryophyllene
(% w/w)
α-Humulene
(% w/w)
Geranylgeraniol (%
w/w)
Voucapane
362
(% w/w)
Voucapane
404
(% w/w)
P. pubescens extract 4.54 ±0.51 0.64 ±0.04 0.21 ±0.01 6.55 ± 0.83 14.61 ± 1.25
C. verbenacea
essential oil 4.03 ±0.08 1.23 ±0.03 0.12 ±0.01 - -
4.2. Pharmacological evaluations
4.2.1. Acute toxicity test
Oral administration of the association (ratio 1: 1) of crude Pterodon pubescens
Benth. fruit dichloromethane extract (Pp) and Cordia verbenacea DC leaves essential oil (Cv)
at 50, 100 and 500 mg/kg doses for each extract in association did not cause changes in
behavioral parameters of the animals analyzed compared to the parameters obtained by the
group treated with vehicle with no mortality observed. The animals were active and gained
weight normally. Another parameter analyzed was the relative weight of organs obtained by
the ratio of organ weight and total weight of the animal. After performing statistical test
(Student´s t test), there was no significant difference (p> 0.05) between groups treated with
the mixture of the extracts and treated with the vehicle (data not shown).
4.2.2. Open field test
In this experimental model, the association of the extracts did not change the
behavior of the animals compared with the control group (vehicle 10 ml/kg), while the
positive control group (pentobarbital 35 mg/kg i.p.) exhibited maximum sedation which was
significantly (p<0.001) different from vehicle control (Table 3).
Table 3. Ambulatory activity of Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea
(Cv) essential oil. The values represent the numbers of lines crossed by the four legs by animal in box, after one
hour of treatment with vehicle, the association of Pp + Cv and pentobarbital. Data expressed by mean ± S.E.M.
(n=6), Dunnett´s Test. ***p<0.001 level of significant compared with control.
Treatment Dose (mg/kg) Number of line crossed in 6 min
Vehicle 10 ml/kg 113.8 ± 1.377
Pentobarbital 35 27.75 ± 4.956***
Pp + Cv 50 + 50 102.5 ± 5.737
Pp + Cv 100 + 100 105.5 ± 3.122
Pp + Cv 500 + 500 102.8 ± 1.493
4.2.3. Determination of effective dose 50 (ED50) with abdominal writhing test
induced by acetic acid
For the determination of the effective doses Pp and Cv extracts, the animals were
68
treated orally with 50, 100, 200 and 300 mg/kg doses of each extract and submitted to the
abdominal writhing test induced by acetic acid. The effective dose (ED50) were calculated
using a mathematical model of non-linear regression employing GraphPad Prism® software.
For the crude Pterodon pubescens Benth fruit dichloromethane extract the effective dose
found was 65 mg/kg and Cordia verbenacea essential oil the effective dose found was 165
mg/kg.
4.2.4. Isobolographic analysis and construction of combinatorial index (CI)
After determination of the effective doses for each extract, specific combinations
of the associations were tested in the abdominal writhing model for the construction of the
isobologram. The combinations tested correspond to A25; A50 and A75 as described on Table 1.
For the purpose of comparison, experimental groups were treated with the extracts separately
at 65 mg/kg of Pp (effective dose - 100%) and 32.5 mg/kg doses of Pp (50% of the effective
dose) and at 165 mg/kg of Cv (effective dose - 100%) and 82.5 mg/kg of Cv (50% of the
effective dose) and in associations A100 and A200.
For the groups treated with the extracts separately, the 32.5 mg/kg and 65 mg/kg
doses of Pp showed inhibition of 29% (39 ± 2) and 48% (28 ± 2) respectively and 82, 5 mg/kg
and 165 mg/kg Cv doses showed inhibition of 31% (38 ± 1) and 47% (30 ± 3) respectively,
when compared to the negative control group (vehicle). The vehicle group presented mean
contortions of 55 ± 3. The result is expressed in Figure 1.
0
20
40
60
80Vehicle
32,5 mg/kg Pp
65 mg/kg Pp
82,5 mg/kg Cv
165 mg/kg Cv***29%
***31%
48 %
*** ***47%
Abdominal writhing induced by aceticacid
Treatments
Nu
mb
er
of
Wri
thin
gs
Figure 1. Evaluation of antinociceptive activity in the abdominal writhing test induced by acetic acid of mice
treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv)
essential oil at doses corresponding to 100% and 50 % of the effective dose of each extract. Data expressed by
the mean (bars) ± standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test *** p <0.001. The values (%)
correspond to the reduction of the mean in relation to the control group (vehicle - saline).
For the groups treated with the associations the inhibitions were 66% (18 ± 2),
70% (16 ± 1), 65% (19 ± 2), 73% (14 ± 1.3) and 74% (14 ± 0.6) for the respective
associations. The vehicle group presented mean contortions of 55 ± 3. The result is shown in
Figure 2.
69
0
20
40
60
80
******
****** ***
65%66%70%
73% 74%
Vehicle
A75
A25A50
A100A200
Abdominal writhing induced by aceticacid
TreatmentsN
um
ber
of
Wri
thin
gs
Figure 2. Evaluation of antinociceptive activity in the abdominal writhing induced by acetic acid test of mice
treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp)fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv)
essential oil in doses corresponding to 75% + 25%; 50% + 50%; 25% + 75%; 100% + 100% and 200% + 200%
of the effective dose of each extract in the association. Data expressed by the mean (bars) ± standard error of the
mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test *** p <0.001. The values (%) correspond to the reduction of the
mean in relation to the control group (vehicle - saline).
Finally, we evaluated antinociceptive effects of different combinations of extracts
by the isobologram method presented in Figure 3.
Figure 3. Isobologram demonstrating the antinociceptive interaction between the Pterodon pubescens (Pp)fruit
dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil in the abdominal writhing test induced by
acetic acid. Results were plotted using an isobologram analysis based on the ED50 of each extract. The concave
slope of the isobologram plots indicates synergistic interactions between the extracts, whereas a straight isobole
similar to the theoretical additive line would indicate an additive effect.
The results obtained in the abdominal writhing test induced by acetic acid of the
associations in their different proportions were used in the analysis model of the median effect
for the construction of the combinatorial index, using CompuSyn® 1.0 software. The
combination index (CI) and their respective interactions are described in Table 4.
0
10
20
30
40
50
60
70
0 50 100 150 200
Pte
rod
on
pu
bes
cen
s B
en
th (
mg/
kg) i
n
asso
ciat
ion
Cordia verbenacea DC (mg/kg) in association
Additive line
70
Table 4. Combination Index of the different proportions of the association of the crude Pterodon pubescens (Pp)
fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil in the abdominal writhing test induced by
acetic acid.
Associations Cv Pp CI Interaction
A25 25% (41,25 mg/kg) 75% (48,75 mg/kg) 0,28 Strong Synergism
A50 50% (82,5 mg/kg) 50% (32,5 mg/kg) 0,27 Synergism
A75 75% (123,75 mg/kg) 25% (16,25 mg/kg) 0,41 Synergism
A100 100% (165 mg/kg) 100% (65 mg/kg) 0,46 Synergism
A200 200% (330 mg/kg) 200% (130 mg/kg) 0,87 Weak Synergism
4.2.5. Formalin test
For the formalin test, the animals were treated with both the extracts separately
and in pre-established mixtures to better visualize the suggested synergistic effect between the
extracts. In a first experiment, the animals were treated with the pure extracts at the
corresponding effective doses found in the abdominal writhing test, as well as at 50% of the
effective dose. Thus, the groups of animals were treated with Pp extract at 65 mg/kg (ED50)
and 32.5 mg/kg (50% of the effective dose) doses and with Cv essential oil at 165 mg/kg
(ED50) and 82.5 mg/kg (50% of the effective dose) doses. In the neurogenic phase, both Pp
and Cv at the doses used did not present antinociceptive activity when compared to the
vehicle group (negative control). The lick means (s) were 105 ± 6 for the vehicle, 82 ± 9 for
65 mg/kg of Pp; 106 ± 8 for 32.5 mg/kg of Pp; 90 ± 11 for 165 mg/kg of Cv and 97 ± 88 for
82.5 mg/kg of Cv.
In the inflammatory phase, both the 65 mg/kg of Pp extract and the Cv essential
oil at 165 mg/kg and 82.5 mg/kg doses had an antinociceptive effect with inhibition of 38%
(200 ± 19 S), 38% (176 ± 12 s) and 36% (181 ± 25 s) respectively when compared to vehicle
(285 ± 26 s) (Figure 4).
71
0
100
200
300
400Vehicle
32,5 mg/kg Pp
65 mg/kg Pp
165 mg/kg Cv
82,5 mg/kg Cv** ** *38% 38%
36%29%
Inflammatory phase
Treatments
Tim
e o
f li
ckin
g (
s)
Figure 4. Evaluation of the antinociceptive activity in the inflammatory phase of the formalin model in the mice
treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv)
essential oil at doses corresponding to 100% and 50% of the effective dose of each extract. Data expressed by
the mean (bars) ± standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test * p <0.05; ** p <0.01 and ***
p <0.001. The values (%) correspond to the reduction of the mean in relation to the control group (vehicle -
saline).
In a second experiment, the animals were orally treated with the associations of
the extracts in concentrations previously described in Table 1. In the neurogenic phase, the
associations did not present any antinociceptive activity when compared to the vehicle group
(negative control). The lick means (s) were 105 ± 6 for the vehicle, 87 ± 16 s; 85 ± 13 s; 85 ±
6 s; 92 ± 15 s; 85 ± 6 s and 99 ± 11 s for the associations, respectively.
In the inflammatory phase, all the associations showed significant efficacy against
the nociception caused by the injection of formalin when compared to the vehicle. Inhibitions
were 51% (137 ± 21 s); 70% (85 ± 27 s); 56% (125 ± 26 s); 66% (95 ± 4 s) and 62% (106 ±
19 s) for the respective mixtures described above. The negative control group presented a
mean of 285 ± 26 s (Figure 5).
0
100
200
300
400Vehicle
A25
A100
A50
A75
A200** ****** *** ***
56%51%
70% 66% 62%
Inflammatory phase
Treatments
Tim
e o
f li
ckin
g (
s)
Figure 5. Evaluation of the antinociceptive activity in the inflammatory phase of the formalin model in the mice
treated orally with the with the association of the crude Pterodon pubescens (Pp)fruit dichloromethane extract
and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses corresponding to 75% + 25%; 50% + 50%; 25% + 75%; 100%
+ 100% and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the association. Data expressed by the mean
(bars) ± standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test * p <0.05; ** p <0.01 and *** p <0.001.
The values (%) correspond to the reduction of the mean in relation to the control group (vehicle - saline).
72
With these results, the three best doses of the associations with the best
performances in the formalin test were selected to continue the pharmacological tests. The
doses that were chosen corresponded to 50% of the effective dose of each extract in the
association A50 (32.5 mg/kg Pp + 82.5 mg/kg Cv), at 100% of the effective dose of each
extract in the association A100 (65 mg/kg Pp + 165 mg/kg Cv) and 200% of the effective dose
of each extract in the association A200 (130 mg/kg Pp + 330 mg/kg Cv). For the selected
combinations the following concentrations of the active compounds in mg (Table 5) were
expected to be found.
Table 5. Compounds present in associations selected for pharmacological tests.
Association
trans-
Caryophyllene
(mg)
α-Humulene
(mg)
Geranylgeraniol
(mg)
Voucapane
362
(mg)
Voucapane
404
(mg)
A50 4.79 1.21 0.16 2.12 4.74
A100 9.59 2.43 0.33 4.25 9.49
A200 19.20 4.88 0.67 8.51 18.99
4.2.6. Tail flick and Hot plate
In the tail flick and hot plate models, the association of Pp + Cv in the three doses
tested did not show significant efficacy against the nociception due to thermal stimulation
during the times of 30, 60, 90 and 120 minutes after the administration of the treatment (data
not shown).
4.2.7. Paw edema induced by carrageenan
In the paw edema model induced by carrageenan, the association of Pp + Cv in
the 3 doses tested showed a significant reduction of edema from the fourth hour after
carrageenan administration, maintaining the effect after 48 hours of the beginning of the test.
For the first and second hours of evaluation, the values were not significant when compared to
vehicle control. From the fourth hour of evaluation on, A200 showed 26% inhibition in edema
volume when compared to the negative control (vehicle). After 6 hours of edema induction,
the doses A50 and A100, respectively, showed edema inhibition in 19% and 23%, while A200
showed reduction of about 39% when compared to the negative control (vehicle). The results
and percentages of inhibitions of the associations in edema and the positive control
(dexamethasone) are shown in Table 6, when compared to the negative control (vehicle).
73
Table 6. Evaluation of the anti-edematogenic activity in mice previously treated orally with the association of
the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at
doses corresponding to 50% + 50%; 100% + 100% and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the
association. The animals were evaluated at the basal state and times of 1, 2, 4, 6, 24 and 48 hours after treatment.
Data expressed by the mean (n = 6). Dunnett's test * p <0.05; ** p <0.01 and *** p <0.001. The values (%)
correspond to the reduction of the mean in relation to the control group (vehicle - saline).
Volume difference (%)
Treatments Dose
(mg/kg)
Basal 4 6 24 48
Control - 0.19 ± 0.03 0.28 ± 0.03 0.31 ± 0.05 0.26 ± 0.01 0.24 ± 0.01
Dexamethasone 5 0.23 ± 0.02 0.22 ± 0.03
(22%)*
0.19 ± 0.02
(38%)***
0.17 ± 0.03
(33%)***
0.16 ± 0.01
(31%)***
A50 32.5 Pp +
82.5 Cv
0.18 ± 0.01 0.29 ± 0.03 0.25 ± 0.02
(19%)*
0.18 ± 0.01
(31%)***
0.16 ± 0.01
(30%)***
A100 65 Pp +
165 Cv
0.16 ± 0.02 0.29 ± .040 0.24 ± 0.03
(23%)**
0.17 ± 0.02
(34%)***
0.17 ± 0.01
(29%)***
A200 130 Pp +
330 Cv
0.18 ± 0.01 0.21 ± 0.01
(26%)**
0.19 ± 0.02
(39%)***
0.16 ± 0.03
(36%)***
0.16 ± 0.01
(32%)***
4.2.8. Paw edema induced by PGE2
In the paw edema model induced by PGE2, the association of Pp + Cv in the 3
doses tested showed a significant reduction of edema at different times of evaluation after
administration of PGE2.
The A50 was the only dose that showed significate edema reduction at all
evaluation times at 29%, 18%, 17% and 13% for 15, 30, 60 and 90 minutes of evaluation,
respectively.
The A100 only showed significant edema reduction (25% and 24%, respectively) at
15 minutes and 30 minutes after administration and of PGE2 when compared to negative
control (vehicle). The A200 only showed significant edema reduction (25%) at 15 minutes
after administration of PGE2 when compared to negative control (vehicle). The results and
percentages of inhibitions of the associations in edema and the positive control
(indomethacin) are shown in Table 7, when compared to the negative control (vehicle).
74
Table 7. Evaluation of the anti-edematogenic activity in mice previously treated orally with the association of
the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at
doses corresponding to 50% + 50%; 100% + 100% and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the
association. The animals were evaluated at the basal state and times of 15,30,60 and 90 minutes after treatment.
Data expressed by the mean (n = 6). Dunnett's test * p <0.05; ** p <0.01 and *** p <0.001. The values (%)
correspond to the reduction of the mean in relation to the control group (vehicle - saline).
Volume difference (%)
Treatments Dose
(mg/kg)
Basal 15 30 60 90
Control - 0.158 ± 0.018 0.281 ± 0.052 0.235 ± 0.052 0.200 ± 0.030 0.185 ± 0.023
Indomethacin 20 0.151 ± 0.023 0.223 ± 0.034
(20%)*
0.19 ± 0.017
(19%)*
0.178 ± 0.02
(11%)
0.145 ± 0.001
(21%)***
A50 32.5 Pp +
82.5 Cv
0.166 ± 0.017 0.198 ± 0.021
(29%)***
0.191 ± 0.026
(18 %)*
0.166 ± 0.012
(17 %)*
0.161 ± 0.009
(13 %)*
A100 65 Pp +
165 Cv
0.16 ± 0.012 0.210 ± 0.27
(25%)**
0.178 ± 0.02
(24 %)*
0.178 ± 0.017
(11 %)
0.160 ± 0.010
(13 %)*
A200 130 Pp +
330 Cv
0.163 ± 0.018 0.210 ± 0.015(
25%)**
0.200 ± 0.017
(15 %)
0.181 ± 0.007
(9 %)
0.168 ± 0.007
(9 %)
4.2.9. Carrageenan-induced leukocyte migration in the mouse peritoneal
cavity (peritonitis)
Administration of carrageenan increased the total number of leukocytes in the
peritoneal fluid and oral pre-treatment with different doses of associations did not
significantly reduced leukocyte migration, whereas with dexamethasone (5 mg/kg)
significantly reduced by 75% (3.47 ± 1.2 x 106 cells/ml) (Figure 6).
0
5
10
15
20Vehicle
Dexamethasone 5 mg/kg
A50
A100
A200
*
ns
nsns
Carrageenan-induced peritonitis
75%
Treatments
Nu
mb
er
of
leu
ko
cyte
s
(10
6 c
ell
s/m
L)
Figure 6. Evaluation on total number of leukocytes in the peritoneum in carrageenan-induced peritonitis model
in mice treated orally with the with the association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane
extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses corresponding to 50% + 50%; 100% + 100% and
200% + 200% of the effective dose of each extract in the association. Data expressed by the mean (bars) ±
standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test * p <0.05. The values (%) correspond to the
reduction of the mean in relation to the control group (vehicle - saline).
75
4.2.10. Mechanical allodynia induced by Complete Freund´s Adjuvant (CFA)
For experimental groups treated with a unique dose on day one of assessment
(acute pain), the association A100 showed significant activity after 30 and 60 minutes of
administration, increasing the paw withdrawal threshold (PWT) in 53% and 77% respectively
when compared to the control group (vehicle). The association A200 demonstrated significant
activity after 60 and 90 minutes of administration, increasing the PWT supported by 71% and
79% respectively when compared to the control (vehicle) group. The lower dose administered
was able to increase the PWT, although this did not show significant inhibition when
compared to the vehicle group, as shown in Figure 7 A.
On seventh day of evaluation (chronic pain), the associations in the three doses
administered were significantly effective since the first evaluation, after 30 minutes of
administration. Sample A50 showed activity after 30, 60 and 90 minutes of evaluation,
increasing PWT by 74%, 94% and 92% respectively. A100 showed activity after 30, 60 and 90
minutes of administration, increasing the PWT by 51%, 81% and 87% respectively. A200
demonstrated significant activity after 30, 60 and 90 minutes of administration, increasing the
PWT by 70%, 93% and 83% respectively. All data were compared to the control (vehicle)
group and are shown in Figure 7 B.
76
0
2
4
6
8
Baseline before CFA Acute baseline 30 min post-treatment 60 min post-treatment 90 min post-treatment
A
*53%
****
77%
71%***96%
***79%
Time points - 1 day post CFA injection (acute phase)
Paw
wit
hd
raw
al
thre
sh
old
(g
)
0
2
4
6
8
Chronic baseline 30 min post-treatment 60 min post-treatment 90 min post-treatment
Time points - 7 days post CFA injection (chronic phase)
***84%
***74%
*51%
***70%
*** ***
******
96% 94%
81%93%
******
******
91% 92%
87%
83%
B
VehicleMorphine 5 mg/kgA50A100A200
Paw
wit
hd
raw
al
thre
sh
old
(g
)
Figure 7. Effect on mechanical allodynia induced by complete Freund´s adjuvant by the association of the crude
Pterodon pubescens (Pp)fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses
corresponding to 50% + 50%; 100% + 100% and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the
association at the baseline assessment times and after 30, 60 and 90 minutes of the unique treatment. A. Day 1.
B. Day 7. Data expressed by the mean (bars) ± standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test
* p <0.05; ** p <0.01 and *** p <0.001. The values (%) correspond to the mean increase in relation to the
control group (vehicle - saline).
For the experimental groups treated daily (from day 1 to day 7 and half hour
before the evaluations), on the first day of evaluation (acute pain), A100 presented activity
after 30 minutes of administration, increasing the PWT by 50% when compared to the control
group (vehicle). After 60 minutes of administration A50 showed an increase of 67% while A200
exhibited an increase in PWT of 82% when compared to the control group (vehicle). At 90
minutes, the three associations did not demonstrate significant effect (Figure 8 A).
77
On the seventh day of evaluation (chronic pain), the association at the three doses
administered were significantly effective since the first evaluation and the baseline value was
elevated due to the daily treatment of the samples. Figure 8 B best illustrates the increase in
PWT with the different treatment times and the respective percentages when compared to the
control (vehicle) group.
0
2
4
6
8
10
Baseline before CFA Acute baseline 30 min post-treatment 60 min post-treatment 90 min post-treatment
A
**50%
Time points - 1 day post CFA injection (acute phase) daily treatment
***99%
**67% **
82%
Paw
wit
hd
raw
al
thre
sh
old
(g
)
0
2
4
6
8
10
Chronic baseline 30 min post-treatment 60 min post-treatment 90 min post-treatment
Time points - 7 days post CFA injection (chronic phase) daily treatment
***92%
B
**
*****69%
80%74%
******
***
****** *** *** ***
***
*** ***
***
82%88%
80%
93%84% 92%92%94%
92%
70%72%
119%
Vehicle
Dexamethasone 5 mg/kg
A50A100
A200
Paw
wit
hd
raw
al
thre
sh
old
(g
)
Figure 8. Effect on mechanical allodynia induced by complete Freund´s adjuvant by the association of the crude
Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses
corresponding to 50% + 50%; 100% + 100% and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the
association at the baseline assessment times and after 30, 60 and 90 minutes of the daily treatment. A. Day 1. B.
Day 7. Data expressed by the mean (bars) ± standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test * p
<0.05; ** p <0.01 and *** p <0.001. The values (%) correspond to the mean increase in relation to the control
group (vehicle - saline).
5. Discussion
The World Health Organization has encouraged public investments in medicinal
plants. The world market for herbal medicines generated approximately US $ 27 billion in
78
2014, mainly in Europe, Asia and the United States (Dutra et al., 2016). Many plant
substances, belonging to the most diverse chemical classes, have proven to display anti-
inflammatory activity, such as the anti-inflammatory herbal medicine Acheflan®, a Brazilian
research product that resulted in a product that inhibits inflammatory cytokines and is
indicated for topical use in relieving pain associated with inflammation of muscles and
tendons.
The objective of this study was to evaluate the antinociceptive and / or anti-
inflammatory activity of the association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit
dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil. With the in vivo
experimental models, the acute toxicity, motor performance, antinociceptive and/or anti-
inflammatory activity and the pharmacological effect of the association through the
construction of the isobologram and the combination index were verified.
In the acute toxicity model, the possible toxic effects of 50, 100 and 500 mg/kg doses of the
association of Pp + Cv in a 1: 1 ratio were observed. Acute toxicity test provided preliminary
information on the toxic nature of the material for which no other toxicological information
was available (Asare et al., 2011). The treatment of the animals with the association of the
extracts showed no toxic effects due to the lack of relevant clinical signs in the hippocratic
screening, as well as the absence of death during the observation period. No changes in body
weight were also recorded during the 14 days of observation, demonstrating that the
association of the extracts at the doses evaluated did not appear to interfere with the
metabolism of the animals. In order to completely rule out the toxicity of the association
Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential
oil new chronic toxicity tests with repeated doses need to be performed.
To elucidate whether the Pp + Cv association would cause possible changes in the
motor behavior, the evaluation of the locomotor activity was evaluated in the open field test.
In nociception models the behavioral factor is directly involved, so the study of extracts that
interfere with locomotion could produce a false positive result. The open field test showed
that acute oral treatment with the association at 50, 100 and 500 mg/kg doses each, did not
alter the locomotor performance of the animals when compared to the negative control group
(vehicle) while the treatment with the positive control (pentobarbital 35 mg/kg) significantly
reduced the locomotor activity of the animals (Table 2). With this result, the antinociceptive
effects of Pp + Cv association most probably does not have any effect on the locomotor
system, since the doses tested in the open field experiment did not alter the ambulatory and
rearing activities. Once the preliminary safety characterization of the use of extracts in
79
animals was carried out, the tests were continued to characterize the pharmacological actions.
The distinction between nociception and pain is important when using preclinical
murine models. According to the International Association for the Study of Pain (IASP,
2012), nociception is defined as "the neural processes of coding and processing harmful
stimuli," while pain is "an unpleasant sensory and emotional experience associated with a
tissue injury real or potential". Nociception includes the mechanisms by which harmful
stimuli are detected by the peripheral nervous system, encoded, transferred, and
unconsciously treated by the nervous system. Detection can be ensured by specific molecular
transducers supported by nociceptive neurons whose cell bodies are grouped in the dorsal root
or in the trigeminal ganglia. This afferent signal is treated by complex networks within the
dorsal horn of the spinal cord or the equivalent in the brainstem (Todd, 2010; Barrot, 2012).
In contrast, pain is a subjective and a complex experience, with discriminative sensations and
cognitive components. As such, pain is evaluated and quantified by verbal expression, which
is not possible in rodents. Thus, what is commonly referred to as "pain tests" in rodents, are
nociceptive tests (Barrot, 2012). Among the nociception tests, the stimuli used may be
electrical, thermal, mechanical or chemical (Le Bars et al., 2001) and among the different
nociception models are the acetic acid-induced abdominal writhing test used as a screening
tool for the evaluation of analgesic or anti-inflammatory properties of natural or synthetic
compounds (Spindola et al., 2011). This model characterized by stereotypical behavior of
abdominal constriction involves peripheral nociceptive mechanisms. Most importantly is the
release of biogenic amines (e.g., histamine and serotonin), bradykinin, prostaglandin E2 and
PGF2α which activates visceral nociceptors (Duarte et al., 1988).
In this study, the abdominal writhing induced by acetic acid test was chosen as the
screening model to find the effective doses of the extracts. For Pp extract the effective dose
found was 65 mg/kg and for Cv essential oil an effective dose of 165 mg/kg. With the
effective doses defined, a graphical analysis was performed to evaluate the effect of the
association of the extracts through a mathematical model called isobologram.
Isobolographic analysis is an experimental method applied to the pharmacological
determination of drug interactions, being a convenient tool for the detection of
pharmacological interactions as well as understanding the real nature of these interactions,
regardless of their mechanism of action or the nature of the dose-response relationships
(Tallarida, 2001). In fact, this experimental method allows the evaluation of the concomitant
administration of drugs or extracts in effective doses, allowing further extrapolation of the
results to determine the pharmacological effect resulting from the association (Deckers,
80
2000). Therefore, in the present study, this technique was used to determine the nature of
interaction between the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and
Cordia verbenacea (Cv) essential oil. After the construction of the graphical analysis where
the theoretical and experimental data from the abdominal writhing induced by acetic acid test
were plotted, the graph showed a convex curve of the association of the extracts,
demonstrating a real synergistic effect for Pp + Cv association, where the ED50 of the
experimentally defined mixtures, in addition to showing an inhibition effect greater than 50%
- approximately 65% to 75% (Figure 2), the doses required for 50% inhibition were lower
than theoretically defined values (Figure 3), whereas the theoretical values were 48.75; 32.5
and 16.25 mg/kg for Pp extract and observing experimental values were 16.48; 13.44 and 8.71
mg/kg, demonstrating that the dose concentrations required for a 50% inhibition in abdominal
writhing were approximately 3 to 2 times lower than the doses presented in the additivity line.
Regarding the combinatorial index found, all the associations demonstrated a synergistic
effect, corroborating with data found through isobologram analysis.
The formalin test is a useful tool not only to evaluate the potential of an analgesic
or anti-inflammatory substance but also to elucidate the mechanism of action (Hunskaar &
Hole 1985, Lenardão et al., 2016). This test has a biphasic response of pain: 1) initial or
neurogenic phase: pain is the result of the direct irritant effect on the nociceptors activating
the primary afferent fibers, resulting in the release of neuropeptides like SP and CGRP in
peripheral terminals and central (Tjolsen et al., 1992). This phase lasts 5 minutes after
formalin injection. At this stage the nociceptive response may be inhibited by administration
of opioid agonists such as morphine and by bradykinin B1 and B2 receptor agonists or
antagonists (Hunskaar et al., 1985, Hunskaar & Hole, 1987; Zhang & Ren, 2011). The second
stage or inflammatory phase is characterized by peripheral sensitization through inflammatory
mediators modulated by the spinal cord and begins after 15 minutes of induction by formalin
and remains during the subsequent 45 minutes (Le Bars et al., 2001; Sayyah et al., 2011) and
involves a period of sensitization of nociceptors by inflammatory mediators (serotonin,
histamine and PGE2) released in response to tissue injury, with the onset of inflammatory
pain (Tjolsen et al., 1992).
The analgesic mechanisms of the association were analyzed in the formalin test.
The extracts separately and the associations at five doses tested did not show significate
reduction of the licking time during the neurogenic phase of the test. In the inflammatory
phase, the extracts separately and the five doses tested from the combination reduced the paw
licking time of the animals when compared to the vehicle. The extracts separately showed an
81
inhibition at licking time around 30 to 38% (Figure 4) while the mixture of the extracts
showed an inhibition of licking time around 50 to 70% (Figure 5), demonstrating more
efficacy when the extracts were in association. The results on the second phase point to a
possible anti-inflammatory effect of the association due to the action on the release of
mediators involved with inflammation, such as prostaglandins, histamine, serotonin and
bradykinin and leukotrienes (Santos et al., 2006; Zhang & Ren, 2011). Furthermore, the
association may be acting as a cyclooxygenase inhibitor, since inhibition only of the second
phase of the formalin test is typical of inhibitors of this enzyme (Rosland et al., 1990).
For the continuity of the tests, the association doses of the extracts that showed
the greatest inhibition of nociception in the models of abdominal writhing induced by acetic
acid test and in the formalin test were chosen. The doses that were chosen corresponded to
50% of the effective dose of each extract in the mixture (32.5 mg/kg Pp + 82.5 mg/kg Cv) –
A50, at 100% of the effective dose of each extract in the mixture (65 mg/kg Pp + 165 mg/kg
Cv) – A100 and 200% of the effective dose of each extract in the mixture (130 mg/kg Pp + 330
mg kg Cv) – A200.
To confirm the possible antinociceptive activity of the association, the tail flick
test that shows a central-medullary action and hot plate, which shows a central-cerebral
action, were performed. Previous studies performed with the ethanolic extract (250 mg/kg
dose) and the dichloromethane crude extract (100-1000 mg/kg dose) of Cordia verbenacea
DC leaves showed no antinociceptive response to nociception models with thermal stimuli
(Bayeux et al., 2002; Roldão et al., 2008). However, these experiments were performed to
analyze if the association of both extracts would be able to produce a positive protective
response against this stimulus.
The tail flick test is one of the oldest nociceptive tests (D'Amour & Smith, 1941)
and results from a spinal reflex (Millan, 2002). The three doses of the association of the
extracts used did not increase the latency time in the tail flick model, however, the positive
control group (morphine 5 mg/kg) showed a significant increase in latency versus thermal
stimulation since the first evaluation (data not shown). With these results, we suggest that the
association Pp + Cv may not demonstrate a central-medullary action.
The hot plate test is a central model, valid for drugs derived from opioids
(Morucci et al., 2012) and is characterized by supraspinal responses through two behavioral
components: paw licking and jumping. Paw licking is suppressed by opioid analgesics,
whereas jumping can be inhibited by less potent analgesics such as acetylsalicylic acid or
paracetamol (Le Bars et al., 2001). According to the results observed, morphine was very
82
active increasing latency time to thermal stimulus, whereas the three doses of the association
did not alter the response time when compared to the vehicle group suggesting that the
antinociceptive effect of the association is not mediated by supraspinal mechanisms. The data
corroborate results found in the first phase of the formalin test, where the association of the
extracts did not demonstrate activity in the neurogenic phase of the model.
Carrageenan-induced paw edema, originally described by Winter et al. in 1962, is
one of the most widely used and highly reproducible models of inflammation for the
screening of novel anti-inflammatory drugs (Vazquez et al., 2015). The inflammatory edema
induced by the injection of carrageenan is the result of sequential and integrated action of
several inflammatory mediators, describing three phases. In the first two hours of
carrageenan-induced paw edema, histamine, serotonin, substance P and bradykinin are
released. In the second stage, which extends from the first or second hour to the sixth hour,
the edematogenic effect is attributed to the elevation of prostaglandin production and
activation of cyclooxygenase-2, in addition to neutrophil migration. In the last phase,
inflammatory mediation depends mainly on the production of cytokines, such as TNF-α, IL-
1α and IL-1β, IL-6 (Iwata et al., 2010; Zhang & Ren, 2011). Our results demonstrated that the
association at the three doses tested was able to significantly inhibit carrageenan-induced
edema from the sixth hour of evaluation, suppressing the acute inflammation, and prolonging
this activity until the 48th hour of paw volume measurement, similar to the effect produced by
the control positive - dexamethasone. These results suggest that the association might act in
the production of inflammatory mediators, due to the significant effect observed in the second
and third stage of the carrageenan-induced paw edema model.
PGE2 is one of the main products of arachidonic acid through the metabolism
of cyclooxygenase (COX) in the response of inflammation and plays a vital role in
inflammation (Blatteis et al., 2005). In this work we explored the possible involvement of this
inflammatory mediator by the paw edema induced by PGE2 test. Therefore, the blockade of
PGE2 receptors is another approach for the development of drugs or alternative therapies for
pain and inflammation (Spindola et al., 2017). Our results demonstrated an inhibition at 15
and 30 minutes after administration of PGE2 with all doses, suggesting the inhibition of this
pathway is also involved in the anti-inflammatory effect of the association. A stronger
significant inhibition with the lowest dose at all evaluated times suggesting a non-dose-
dependent inhibition was also observed.
As the association inhibited the second phase of carrageenan-induced
inflammation (Table 6), we performed the carrageenan-induced peritonitis model to evaluate
83
activity on leukocyte migration. Carrageenan-induced peritonitis is largely employed to test
novel anti-inflammatory therapies, as this allows the evaluation of cellular recruitment, as
well as changes in other inflammatory parameters such as vascular permeability and
cytokine production (Okoye et al., 2013). Concomitantly, exerts a chemotactic effect on
inflammatory cells mediated by a synergistic action between prostaglandins, leukotrienes and
other chemotactic agents (Damasceno et al., 2014). In the carrageenan-induced peritonitis
model, leukocytes migration in the vehicle group was 14.15 ± 2.90 x 106 cells/ml and cell
migration was inhibited by dexamethasone in 75%. The association at the three doses tested
did not inhibit significantly the leukocytes migration in the peritoneal cavity, suggesting that
anti-inflammatory activities of the association are not related to cell recruitment.
Persistent nociception caused by intraplantar administration of CFA is a widely
used nociception model. This is a model of inflammatory pain that has similarity to human
chronic diseases such as rheumatoid arthritis and as severe inflammation in joints (Tjolsen &
Hole, 1997). CFA administration produces a local inflammatory reaction characterized by
erythema, increased local temperature, edema, plasma entrapment, infiltration of
inflammatory cells and the production of inflammatory mediators such as cytokines and
eicosanoids (Ganju et al., 2001). As a result, an injection of CFA causes hyperalgesia and
allodynia, which is mediated by local nociceptor sensitization and by systemic neural and
immune mechanisms (Samad et al., 2004). Mechanical allodynia measure is one of the most
useful method for mimicking clinical conditions with enhanced cutaneous sensitivity such
as neuropathic pain, postoperative pain and inflammation (Gregory et al., 2013). The
evaluation of inflammatory pain at the acute and chronic phase was assessed by the
mechanical allodynia induced by Complete Freund´s Adjuvant (CFA) test. In this study, we
evaluated the associations at two different treatments: one experimental set that received
treatment on the acute and chronic phase evaluation days and another set that received daily
treatment during the seven days of the test. Our results showed that the associations were
effective with this model, showing an increase at the PWT (paw withdrawal threshold), at
acute phase and more effective at chronic phase. The results was more interesting for the
group treated daily, at seventh day of evaluation, where the chronic baseline showed a PWT
greater than 70%, demonstrating that the daily treatment significantly reduced the sensitivity
induced by CFA and with the last treatment, displayed values close to or greater than the
positive control, dexamethasone. According to Burstein et al. (2010), an antinociceptive effect
in the CFA model, occurs by inhibiting the synthesis of proinflammatory mediators, such as
cyclooxygenase 2, interleukin 1β and nitric oxide synthase, via inhibition of nuclear factor k.
84
Authors have also pointed PGE2 as the major mediator responsible for the mechanical
hypersensitivity (Wang et al., 2007). The significantly inhibited chronic inflammation
suggested the association to have a role in the inhibition of proinflammatory mediators and at
PGE2 pathway.
The antinociceptive and anti-inflammatory effects of association of crude
dichloromethane extract from the fruits of Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the essential
oil of Cordia verbenacea DC (Cv) is related to the chemical composition of the plant extract.
Indeed the phytochemical analysis, the association showed an important concentration of
Trans-caryophyllene and α-Humulene. Previous studies suggested some mechanisms of
actions of both compounds (50 mg/kg) via platelet activating factor, bradykinin, prostaglandin
E2 (PGE2), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase (COX-2) expression in
in vivo experiments. α-Humulene has a relationship with edema formation caused by
histamine injection, prevented tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β)
generation whereas (−)-trans-caryophyllene decrease only TNFα release (Fernandes et al.,
2007). Cordia verbenacea essential oil (300–600 mg/kg) has relationship with carrageenan-
induced rat paw edema reduction, myeloperoxidase activity and the mouse edema elicited by
carrageenan, bradykinin, substance P, histamine and platelet-activating factor. The essential
oil significantly decreased TNF-α, without affecting IL-1β production, in carrageenan-
injected rat paws (Passos et al., 2007).
Regarding the compounds present in Pterodon pubescens extract previous studies
from our group suggested some mechanisms of actions. Geranylgeraniol (30 mg/kg) has
relationship with 5-HT3 serotonin receptors and imidazoline I1 receptors. Compound m/z 362
(30 mg/kg) is probably involved with the synthesis or release of serotonin and both
compounds reduce response in the writhing, capsaicin, glutamate and hot-plate tests, with
relationship to vanilloid receptors VR1, and/or glutamate peripheral receptors (Spindola et al.,
2010, Spindola et al., 2011). Compound 404 demonstrated more efficacy on the neurogenic
pain then inflammatory pain of formalin test, suggesting an action related to both central and
peripheral mechanisms (Servat et al., 2012). These studies also suggest that compounds
within the crude Pterodon pubescens Benth. extract may exert a synergistic interactive effect,
since the crude extract (300 mg/kg) containing lower concentrations of geranylgeraniol (34.6
mg/kg) and m/z 362 (4.7 mg/kg) gave statistically the same effect to the pure compounds
when tested separately (300 mg/kg) in writhing experimental model (Spindola et al., 2011).
In the present study, the associations were tested at lower doses and consequently lower
concentrations of active compounds than those tested in these previous studies (Table 5),
85
however, they showed significant effects, especially on inflammatory pain, suggesting a
synergistic effect.
The concept of combination therapy is based on synergistic or additive potential
of two or more drugs to improve therapeutic efficacy (World Health Organization, 2015).
Synergism is a type of pharmacological response obtained from the association of two or
more drugs, which result is greater than the simple sum of the isolated effects of each. Two or
more drugs may be administered in combination primarily to increase efficacy, reduce
individual dosages and possible side effects of each (Ulrich-Merzenich, 2014). Our results
points for a possible synergism between the active compounds at the associations, probably
acting in different pharmacological receptors as studies previously report.
6. Conclusion
The results presented herein demonstrate that the association of crude
dichloromethane extract from the fruits of Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the essential
oil of Cordia verbenacea DC (Cv) promote synergistic antinociceptive and anti-inflammatory
activities, at lower doses than the separate crude extracts, without demonstrating side effects.
The significantly inhibited inflammation suggested the association to have a role in the
inhibition of inflammatory mediators and at PGE2 pathway. Our results points for a possible
synergism between the active compounds at the associations, probably acting in different
pharmacological receptors. Nevertheless, further studies will be necessary to understand the
mechanisms of action underlying the effects of the association.
7. Acknowledgements
We would like to thank to Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) for financial support and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
São Paulo (FAPESP) for grant support and fellowship to RTB (#2013/15709-5; #2015/08600-
2).
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93
6.2. Capítulo 2
Pterodon pubescens and Cordia verbenacea: evaluation of the association
and their active compounds in in vitro wound healing and anti-
inflammatory assays
Artigo em redação para submissão à revista Planta Medica
94
Abstract:
Pterodon pubescens Benth. (sucupira) and Cordia verbenacea DC leaves are
popularly used due to their anti-rheumatic, anti-inflammatory and analgesic actions. In this
study, wound-healing effects of the extracts, association of extracts and their active
compounds (isomers 6α-hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-17β-oate methyl ester and 6α-
acetoxy-7β-hydroxy-vouacapan-17β-oate methyl ester – m/z 404 – C1 and α-Humulene) were
investigated in immortalized human keratinocytes for the first time. As vascular endothelial
growth factor (VEGF) and Interleukin 8 (IL-8) are important angiogenic factors involved in
skin inflammation, we evaluated the extracts and compounds in HaCaT cells stimulated
with the proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor alpha (TNF-α).
For evaluation of the wound gap, a time-lapse microscopy was used. It was shown
that Pterodon pubescens extract (Pp) and Cordia verbenacea essential oil (Cv) exerted
inhibitory effects on cell migration at all tested concentrations (3.125; 6.25 and 12.5 μg/mL)
without affecting cell viability. Their association exerted inhibitory effects on cell migration
at 3.125 and 12.5 μg/mL. For the intermediary concentration (6.25 μg/mL), the cell migration
was significantly higher, at t=24 h, a gap closure of 56.2 % was reached. The C1 exerted
inhibitory effects on cell migration at higher concentrations (12.5 and 25 μM). In lower
concentration (6.25 μM), the wound clousure was significantly higher, at t=24 h, a gap
closure of 71.8 % was reached. The compound α-Humulene improved wound clousure at all
concentrations tested (at t= 24 h: 56.5% for 6.25 μM and 69.5 % for 12.5 μM), and a higher
effect at 25 μM, approximately 88% gap closure after 24 h.
In the TNF-α-stimulated cells, Pp and Cv increased VEGF production in HaCaT
cells concentration-dependently. Association at the higher concentration increased the levels
of VEGF, while the lower concentrations had no effect. C1 increased the levels of VEGF in
higher concentrations, while the lowest concentration had no effect. α-Humulene significantly
decreased the levels of VEGF at the lowest concentration, but significantly increased the
levels of VEGF in higher concentrations. All the different treatments reduced levels of
interleukin 8 in tumor necrosis factor alpha-α-treated immortalized human keratinocytes cells.
In conclusion, Pp, Cv and their association significantly inhibited the proliferation and
migration of human keratinocytes in vitro. C1 also presented antiproliferative and inhibited
migration of HaCaT cells in higher concentrations. Thus, these compounds would have
potential as a local treatment against hyper proliferation-involved skin diseases, for example.
We therefore suggest that α-Humulene might have a dual activity – in higher
concentrations (12.5 and 25 µM) the compound show an anti-inflammatory and angiogenic
95
effect, while in lower concentrations (6.25 µM), exert anti-angiogenic activity by inhibiting
migration, possibly by prevention of VEGF secretion. Finally, treatment with α-Humulene
may be a potential therapeutic strategy to promote wound healing and to prevent
inflammation in a persistent inflammatory condition.
Keywords: Pterodon pubescens Benth.; Cordia verbenacea DC; synergism; wound healing;
anti-inflammatory; time-lapse microscopy
1. Introduction
Wounds are defined as physical injuries that result in an opening or break of the
skin that causes a disturbance in the normal skin anatomy and function (Strodtbeek, 2001).
Normal wound healing is a dynamic series of events involving the coordinated interaction of
blood cells, proteins, proteases, growth factors and extracellular matrix components and are
divided into three phases: inflammatory, proliferative and remodeling (Sinno & Prakash,
2013).
Progression of the inflammatory phase leads to the recruitment of leukocytes,
neutrophils and macrophages, as the production of growth factors and the activation of dermal
and epidermal cells (Demidova-Rice et al., 2013). It is highly regulated and depends upon
proinflammatory mechanisms, which are gradually neutralized by various anti-inflammatory
pathways mediated by factors like interleukin 10 (IL-10), hormones, and neurotransmitters
(Singer & Clark, 1999).
As the inflammatory phase subsides, the proliferative phase of repair begins. At this stage,
growth factors produced by remaining inflammatory cells and migrating epidermal and
dermal cells act to induce and maintain cellular proliferation while initiating cellular
migration and stimulation of keratinocytes, fibroblasts and angiogenesis. Epithelial cells
replace dead cells, while fibroblasts are responsible for the production of collagen,
fibronectin, hyaluronan, glycosaminoglycans, and proteoglycans, which are the major
constituents of the extracellular matrix and confer strength to the skin (Boateng et al., 2008;
Enoch & Leaper, 2007). These events are important for the formation of granulation tissue
while supporting epithelialization (Hart et al., 2012; Pereira & Bártolo, 2016).
As inflammation resolves and the number of leukocytes diminishes, the wound
undergoes a lengthy period of remodeling of the tissue´s architecture and resolution (Gurtner
et al., 2008; Koh & DiPietro, 2011). Completion of the proliferative phase of wound healing
leads to formation of extracellular matrix-rich and vascularized granulation tissue. Maturation
of the keratinocytes leads to a restoration of the epitheliumʼs barrier function (Gurtner et al.,
96
2008).
Vascular endothelial growth factor (VEGF) and interleukin 8 (IL-8) have
important participation in terms of wound healing and its production can be stimulated by the
presence of TNF-α (Wedler et al., 2014).
VEGF is one of the most potent angiogenic growth factors and promotes all steps
in the angiogenic cascade (Brown et al., 2002). Besides being related to angiogenesis, it is
also involved in inflammation, which is closely integrated processes in a number of
physiological and pathological conditions, including psoriasis, rheumatoid arthritis,
arteriosclerosis, and tumor (Presta et al., 2009).
IL-8 is a potent chemotactic factor that attracts neutrophils, basophils and T-cells during the
inflammatory process (Schmidt et al., 1996).
Cells in unhealed wounds constantly produce inflammatory mediators in an uncoordinated
and self-sustaining phase of inflammation that impairs the restoration of anatomic and
functional integrity in the normal period of time (Heinlin et al., 2010; Prantl et al., 2010)
delaying the last objective of the wound healing process, that is the regeneration of the injured
skin without scar formation.
Natural compounds have been used in skin wound care for many years due to
their therapeutic activities, including anti-inflammatory, antimicrobial, and cell-stimulating
properties. The clinical efficacy of these compounds has been investigated through in
vitro and in vivo trials (Pereira & Bártolo, 2016).
Cordia verbenacea DC (Cv), a synonym of Varronia verbenacea (DC) Borhidi
(Trópicos, 2017), is a perennial shrub native to the Atlantic Forest, belonging to the botanical
family Boraginaceae, popularly known as erva baleeira. The leaves are popularly used for
their anti-inflammatory, antimicrobial, anti-rheumatic and healing activities (Michielin et al.,
2009; Dutra et al., 2016). Among the different components found in the essential oil, there is
a main compound with important anti-inflammatory and anti-edematogenic activity, α-
Humulene (Passos et al., 2006) (Figure 1).
Figure 1. Chemical structure of α-Humulene
The plant species Pterodon pubescens Benth. (Pp), a botanical synonym of
97
Pterodon emarginatus Vog., is a tree belonging to the family Leguminosae-Papillonoideae,
popularly known as sucupira, used for the treatment of rheumatism, sore throats, as well as
its use as an anti-inflammatory and analgesic (Dutra et al., 2016). In the literature, a number
of reported pharmacological activities of this species have been described: antinociceptive,
anti-inflammatory, anti-edematogenic, anti-arthritic and other activities (Calixto et al., 2007;
Spindola et al., 2011; Nucci-Martins et al., 2015). Some authors have suggested that
furanoditerpenes possessing vouacapan skeleton (isomers 6α-hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-
17β-oate methyl ester and 6α-acetoxy-7β-hydroxy-vouacapan-17β-oate methyl ester – m/z
404 – C1) are involved with the anti-inflammatory and antinociceptive properties of Pterodon
pubescens fruit crude extract (Servat et.al, 2012) (Figure 2).
Figure 2. Compounds identified with antinociceptive and anti-inflammatory activity isolated from the fruits of
Pterodon pubescens Benth (isomers m/z 404 – C1).
In previous study, the association of both extracts showed a synergic effect and
interesting activities as anti-inflammatory. The word synergy is derived from the Greek word
synergo'z, which means "working together" and its search in the field of pharmacology refer
to the elucidation and quantification of the action of drugs administered in combination
(Sucher, 2014). The best efficacy of combinations of compounds or extracts can be
understood that the synergistic effects are multi-target where the association acts not only on a
single target but on several targets and thus cooperates in a synergistic manner (Ulrich-
Merzenich, 2014).
Bearing in mind the promising anti-inflammatory activities of association of
Pterodon pubescens Benth (Pp) and Cordia verbenacea DC (Cv) as previous report, the aim
of this study was to investigate the effect of the Association of both extracts on cell migration
assays and anti-inflammatory potential (VEGF and IL-8) in comparison to the separate
extracts and their major isolated compounds, α-Humulene and compound m/z 404 (C1).
O
R
R
1
2
3 45
67
8
9
10
1112
13
14
15
17
18
O
OH
O
O
R
O
OHOH
OH
OH
O
OH
OH
CO2CH3
O
OAc
OH
O
OH
OAc
CO2CH3
O
OAc
OH
CO2CH3
O
OH
OH
CH2OH
6α-hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-17β-oate methyl ester
6α-acetoxy-7β-hydroxy-vouacapan-17β-oate methyl ester
98
2. Material and Methods
2.1. Plant material and extraction
Fruits of Pterodon pubescens Benth were collected from Ponto Chique (MG –
Brazil - coordinates 16 ° 38'23.3 "S 45 ° 03'54.0 " W). The dried specimen was deposited at
the Herbarium of the University of Campinas (Unicamp) under number 179739.
Leaves of Cordia verbenacea DC were collected in CPQBA – Unicamp experimental field
(Multidisciplinary Center for Chemical, Biological and Agricultural Researches – Paulínia –
SP - Brazil). The dried specimen was deposited at Herbarium of the University of Campinas
(Unicamp) under number 112744. The plant materials received authorization to use the
Brazilian genetic resources under number 010829/2014-8.
The extraction process of Pterodon pubescens Benth fruits was carried out in
stainless steel tank with mechanical stirring using dichloromethane as liquid extractor. The
fruits were ground with dry ice to increase the contact surface providing a higher extraction
yield. The plant material (kg) by volume of organic solvent (l) ratio was a 1: 3 by performing
three extractions of 1.5 hours each, a total of 4.5 hours (3 times 1.5 h) at room temperature
renewing the solvent at each step. The partial extracts were filtered, combined and
concentrated under vacuum by rotary evaporation system at 40°C (Büchi RE 120). The
extract was stored in amber bottle and stored at room temperature. Cordia verbenacea DC
leaves’ essential oil was obtained by steam distillation technique, carried out during a 1.5 to 2
hours period. Therefore, crushed fresh leaves were used in stainless steel vat with capacity for
1500 l. The oil was separated from the water initially in the annex to the florentine vase vat
and afterwards in a separating funnel, followed by the use of anhydrous sodium sulfate to
remove residual traces of water. The oil was stored in a freezer until use.
2.1.2. Isolation of voucapan
The isomers voucapan 6α-hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-17β-oate methyl ester
and 6α-acetoxy-7β-hydroxyvouacapan-17β-oate methyl ester (m/z 404) and 6α,7β-
dihydroxyvouacapan-17β-oate methyl ester (m/z 362) from crude dichloromethane extract
from the fruits of Pterodon pubescens Benth. were isolated by column chromatography (25 x
500 mm), using solvent gradient of hexane and ethylacetate as previously described (Spindola
et al., 2009). The purified compounds of data were compared to previously identified
compounds by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Mass Spectrometry (MS).
2.1.3. GC–MS analysis
The GC–MS (Gas chromatography–mass spectrometry) analysis was carried out
with an Agilent 5975 GC–MS system. HP5 column (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm film
99
thickness) was used with helium as carrier gas (1.0 ml/min). GC oven temperature was kept at
60 °C for 3 minutes and programmed to 240 °C at a rate of 3 °C/ min, and kept constant at
240 °C for 5 minutes and then programmed to 240 °C at a rate of 1 °C/min. Split ratio was
adjusted at 40:1. The injector temperature was set at 250 °C. Mass spectra were recorded at 70
eV. Mass range was from m/z 100 to 600.
2.1.4. GC analysis essential oil quantification
The GC (Gas chromatography) analysis was carried out using an Agilent 6890N
GC system. FID (Flame ionization detector) temperature was 250 °C. To obtain the same
elution order with GC–MS, simultaneous auto-injection was done on a duplicate of the same
column applying the same operational conditions. Quantifications were accomplished using
analytical standard α-Humulene, trans-Caryophyllene and geranylgeraniol (Sigma Aldrich
Saint Louis USA).
2.1.5. HPLC analysis voucapan compounds
The HPLC-DAD system (Shimadzu) consisted of C18 reverse phase column
(Gemini -C18 250 mm × 4.6 mm x 5µm) with 10 µL sample inject. The mobile phase was a
mixture of 70:30 Acetronitrile: water with 0.1% acetic acid (v:v). The flow rate and UV
wave-length were set at 1 mL/min and 220 nm, respectively.
2.2. In vitro experiments
2.2.1. Cell culture
Human non-tumorigenic HaCaT keratinocytes (Cell Line Services, Eppelheim,
Germany) were maintained in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) high glucose
1× supplemented with 1% (v/v) Penicillin 10.000 U/mL/Streptomycin 10.000 μg/mL and 10%
(v/v) heat inactivated fetal bovine serum (FBS) at 37 °C in a humidified atmosphere
containing 5% CO2. Experiments were conducted at approximately 80–90% confluence and
carried out between passages 43 and 52.
2.2.2. ATP Assay
The CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability assay was carried out according
to the manufacture´s protocol. The following alterations were made: cells were grown in a
transparent, sterile 96-well plate at a density of 2.5 x 105 cells/mL. After an incubation period
of 24 h (37º C, 5% CO2), cells were washed with PBS, subsequently treated accordingly with
100 μL solution and incubated for another 24 h. The following concentrations of the extracts
and compounds were tested: for the separated extracts Pp, Cv and Association (Pp + Cv -
ratio ½ : ½) 50; 25; 15; 10; 5; 1 and 0.5 μg/mL and for the isolated compounds 50; 25; 12.5;
6.25; 3.125; 1.5625 and 0.78125 μM. 100 μL of CellTiter-Glo® reagent was then added to
100
each well resulting in a 1:1 dilution. The sample plates were agitated for 2 minutes by an
orbital shaker and incubated for 10 minutes at room temperature. 100 μL of each well was
then transferred to a white, opaque sterile 96-well plate and immediately read by a microplate
reader (SpectraMAX L, Molecular Devices).
2.2.3. Cell proliferation assay
The assay was conducted according to the manufacture´s protocol. 100 μL of a
HaCaT cells suspension was seeded into sterile 96-well plates at a concentration of 2.5 × 105
cells/mL. After an incubation time of 24 h (37°C, 5% CO2), the medium containing 10% FBS
was discarded and the plate was washed with 200 μL/well PBS. Pterodon pubescens Benth.
(Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) and the Association (Pp + Cv - A - ratio ½ : ½) were tested
in concentrations of 25; 12.5; 6.25; 3.125 and 1.5625 μg/mL and the isolated compounds were
tested in concentrations of 50; 25; 12.5; 6.25 and 3.125 µM, respectively. After incubation
period of 24 h with the samples, BrdU reagent (10 μM, 10 μL) was added into all wells except
the unstained control. After discarding the medium, 200 μL of a fixing/denaturing solution
was added and incubated for another 30 minutes. Subsequently, the liquid was exchanged by
the primary anti-BrdU monoclonal antibody and incubated for 1 hour. Subsequently, the
unbound antibody was washed off and horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse
IgG was added, which binds to the detector antibody. Finally, 50 µL of 3,3´,5,5´´-
tetramethylbenzidine (TMB) substrate were added and converted by the peroxidase conjugate
and the reaction was stopped by 2.5 N sulfuric acid stop solution before the plate was read at a
wavelength of 450 nm using a plate reader (Spectramax i3x Multimode detection plataform,
Molecular Devices).
2.2.4. Cell migration assay (wound-healing scratch assay)
After positioning the cell culture inserts in the 12-well dishes, the HaCaT cells
were inoculated in a concentration of 2.5 × 105 cells/mL into the wells. After an incubation
time of 24 hours, the cells reached confluence, and the inserts were removed causing a gap of
450 μm. The wells were washed with 1 mL PBS, aspirated and the wells were charged with 1
mL of the test extracts, association and compounds.
The wells were charged with the test compounds accordingly to the different
concentrations. The extracts, association and isolated compounds were dissolved in DMEM
containing 0.1% DMSO. DMEM supplemented with 2% FBS was used as a positive control
and 0% FBS + 0.1% DMSO (DMEM without supplements) was used as a control. Long-term,
time-lapse imaging was performed using the Olympus IX83 automated inverted microscope
platform for live cell imaging. The image magnification was adjusted to 10×. The pictures of
101
five specific moments at 0, 6, 12, 18, and 24 h after the addition of the treatment were
analyzed by using the Olympus software package cellSens Dimension 1.81®. To calculate the
size of the gaps over time, post-analysis of the snapshots were conducted by utilizing the
software Image J including the wound healing tool macro© and the area of the cell-free gap
was measured based on the number of pixels. Therefore, detected spaces were converted into
percentages; 0% refers to no movement of cells and 100% depicts a total gap closure.
Pterodon pubescens Benth. (Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) and the Association (A “Pp +
Cv - A - ratio ½ : ½”) were tested in concentrations of 12.5; 6.25 and 3.125 μg/mL and the
compounds were tested in concentrations of 25; 12.5 and 6.25 µM, respectively.
2.2.5. Anti-inflammatory activity
The experimental setup including the TNF-αconcentration was chosen according
to Park et al. 2010, with some modifications. For unstimulated samples, cells were seeded
into 12-well plates at a density of 2.5 × 105 cells/mL. After an incubation time of 24 h (37°C,
5% CO2), DMEM was discarded and the cells were washed with 1 mL/well PBS and samples
were added as following: Pterodon pubescens Benth. (Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) and
the Association (Pp + Cv - A - ratio ½ : ½) in concentrations of 12.5; 6.25 and 3.125 μg/mL
and the isolated compounds in concentrations of 25; 12.5 and 6.25 µM, respectively.
Hydrocortisone (10 µM) and LY294002 (10 µM) were used as control. To assess the basal
secretion of VEGF or IL-8 in keratinocytes, DMEM with 0% FBS was applied as a control. In
contrast, all wells of the stimulated cells were supplemented with TNF-α 20 ng/mL and
substances accordingly and incubated for 24 h. Supernatants were stored in sterile
microcentrifuge tubes and deep-frozen (− 20°C) immediately. The VEGF and IL-8 Enzyme
Linked ImmunonoSorbent Assay (ELISA) were exerted according to manufacturersʼ
instructions (PeproTech®). Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader
(SpectraMax M2e).
2.3. Data analysis
Data are shown as the mean ± SD. All experiments were performed at a minimum
in triplicate. Statistical analysis of the data was carried out by one-way analysis of variance
(ANOVA) followed by Dunnettʼs multiple comparison test using the software package
GraphPad Prism (version 6.01, GraphPad Software, Inc.). In all cases, differences were
considered significant if p < 0.05.
3. Results
3.1. Plant extraction
For the crude dichloromethane Pterodon pubescens fruits extract 1500 g of
102
ground fruits were placed in a stainless steel tank with mechanical stirring. The extraction
process provided approximately 675 g, representing 45% yield.
Cordia verbenacea DC essential oil was obtained by means of the steam
distillation technique for 1 ½ to 2 hours, using crushed fresh leaves using a stainless steel set
containing 1500 L capacity providing the essential oil in 0.34% yield.
3.2. Phytochemical analysis
Quantifications were accomplished using analytical standard α-Humulene, trans-
Caryophyllene and geranylgeraniol (Sigma Aldrich Saint Louis USA). The peak area
calculated from HPLC chromatograms was correlated linearly with compound m/z 404
concentrations in the range of 17–2180 µg/mL (R2= 0.999) and compound m/z 362 range of
8.7-1117 µg/mL (R2= 0.999). The peak area calculated from FID chromatograms was
correlated linearly with α-Humulene concentrations in the range of 15–1000 µg/mL (R2=
0.9996), trans-Caryophyllene 20-1300 µg/mL (R²=0.9971) and geranylgeraniol 19-1230
µg/mL (R²=0.9995). The percentage amounts of the separated compounds were calculated in
samples test (Table 1).
Table 1. Percentage amounts of active compounds present at crude Pterodon pubescens fruits extract and Cordia
verbenacea DC essential oil
Extract
trans-
Caryophyllene
(% w/w)
α-Humulene
(% w/w)
Geranylgeraniol (%
w/w)
Voucapane
362
(% w/w)
Voucapane
404
(% w/w)
P. pubescens extract 4.54 ±0.51 0.64 ±0.04 0.21 ±0.01 6.55 ± 0.83 14.61 ± 1.25
C. verbenacea
essential oil 4.03 ±0.08 1.23 ±0.03 0.12 ±0.01 - -
3.3. ATP Assay
All the extracts and compounds tested did not show a significant effect on cell
viability compared to the untreated control (Figure 3).
103
0
25
50
75
100
125
150
Control 0.5 1 5 10 15 25 50
Pterodon pubescens [µg/mL]
Ce
ll V
iab
ility
[%
of
co
ntr
ol]
0
25
50
75
100
125
150
Control 0.5 1 5 10 15 25 50
Cordia verbenacea [µg/mL]
Ce
ll V
iab
ility
[%
of
co
ntr
ol]
0
25
50
75
100
125
150
Control 0.5 1 5 10 15 25 50
Association [µg/mL]
Ce
ll V
iab
ility
[%
of
co
ntr
ol]
0
25
50
75
100
125
150
Control 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 25 50
C1 [µM]
Ce
ll V
iab
ility
[%
of
co
ntr
ol]
0
25
50
75
100
125
150
Control 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 25 50
-Humulene [µM]
Ce
ll V
iab
ility
[%
of
co
ntr
ol]
Figure 3. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (C), C1 (D) and α-Humulene
(E) on the cellular ATP level. Results are expressed as the mean ± SD of triplicates.
3.4. Cell proliferation assay
In this study, proliferative effects of the samples were examined on HaCaT cell
line at five concentrations (1.5625, 3.125, 6.25, 12.5 and 25 μg/mL for the extracts and
Association and 3.125, 6.25, 12.5, 25 and 50 µM for the isolated compounds). The
proliferation rate of keratinocytes was determined using the BrdU assay. Proliferation in
HaCaT cells decreased with the concentrations tested of Pp. At a concentration of 25 μg/mL,
A B
C D
E
104
BrdU incorporation was inhibited by approximately 40%. For Cv, proliferation decreased
from the concentration of 3.125 μg/mL. At a concentration of 25 μg/mL, BrdU incorporation
was inhibited by 35%. Association and C1 decreased proliferation for all concentrations
tested. α-Humulene in lower concentrations (3.125 – 6.25 µM) did not significantly decreased
proliferation. In higher concentrations (12.5 – 50 µM), BrdU incorporation was inhibited by
approximately 50% (Figure 4).
0
20
40
60
80
100
120
Control 1.5625 3.125 6.25 12.5 25
***
***
*** ***
***
Pterodon pubescens [µg/mL]
Brd
U in
co
rpo
ratio
n [
% o
f co
ntr
ol]
0
20
40
60
80
100
120
Control 1.5625 3.125 6.25 12.5 25
***
******
***
Cordia verbenacea [µg/mL]
Brd
U in
co
rpo
ratio
n [
% o
f co
ntr
ol]
0
20
40
60
80
100
120
Control 1.5625 3.125 6.25 12.5 25
******
****** ***
Association [µg/mL]
Brd
U in
co
rpo
ratio
n [
% o
f co
ntr
ol]
0
20
40
60
80
100
120
Control 3.125 6.25 12.5 25 50
*** ******
******
C1 [µM]
Brd
U in
co
rpo
ratio
n [
% o
f co
ntr
ol]
0
20
40
60
80
100
120
Control 3.125 6.25 12.5 25 50
** ** **
-Humulene [µM]
Brd
U in
co
rpo
ratio
n [
% o
f co
ntr
ol]
Figure 4. BrdU incorporation in de novo synthesized cellular DNA by Pterodon pubescens extract (A), Cordia
verbenacea essential oil (B), Association (C), C1 (D) and α-Humulene (E). DMSO 0.1% was used as a control
group. Results are expressed as the mean ± SD of triplicates; ** p < 0.01, and *** p < 0.001 vs. untreated
control.
A B
C D
E
105
3.5. Cell migration assay (wound-healing scratch assay)
The effects of extracts, association and compounds on the migration of HaCaT
cells were tested in an in vitro wound-healing model, in which a gap in the cell layer had been
created by placing silicone inserts into 12-well plates. The migration process started with the
removal of the inserts. Cell migration was observed for 24 h, and pictures were taken every 30
min. For better data presentation, the 24-h observation period was divided into five time
points (0, 6, 12, 18, and 24 h) and described below separated by each sample tested. All the
figures showed representative images and gap closure values only from a single experiment.
All values presented in graphics are the results of triplicates and are presented as the mean ±
SD.
DMEM supplemented with 2% FBS was used as a positive control, because it
provides a mixture of most factors needed for cell proliferation and maintenance such as
growth factors, hormones, trace elements, lipids, and attachment and spreading factors. The
addition of 2% FBS to the medium significantly increased cell migration over a period of 18 h
resulting in a 89.4 ± 9.8% gap closure and for a period of 24 h gap closure were 98.7 ± 1.0%
(Figure 5).
A clear difference was observed between cells treat with DMEM + 2% FBS and
DMEM + 0.1% DMSO without any supplementation. The non-supplemented control, at t=18
h, a gap closure of 28.4 ± 1.3% was reached and for t= 24 h, were 43.8 ± 3.5% closed (Figure
5).
LY294002, a phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor and the strongest among the
references in terms of inhibition of cell migration, was used as a negative control. At t=24 h, a
gap closure of 5.9 ± 0.3% was reached.
106
0 h 6 h 12 h 18 h 24 h
2%
FBS
0 %
34%
88%
100%
100%
0.1
%
D
M
S
O
0 %
10%
20%
30%
43%
LY
29
400
2 1
0 µ
M
0%
0%
0%
3%
6%
Figure 5. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging interval snapshots
of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a
representative experiment. HaCaT cells were treated with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2%
FCS) and LY294002 (10 μM).
0
20
40
60
80
100
2% FBS 10 M
6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24
Incubation time [h]
0.1% DMSO
LY294002
***
***
***
***
Ga
p c
losu
re (
%)
Figure 6. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were taken every hour
during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h. Gap
size was calculated by using Image J software including the wound healing tool macro. Detected spaces were
converted into percentages; 0% refers to no movement of cells (open gap), 100% depicts a total gap closure.
Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. ***p < 0.001 vs. untreated
group 0.1% DMSO.
107
3.5.1. Pterodon pubescens
Pterodon pubescens crude extract exerted inhibitory effects on cell migration at
all tested concentrations (at t= 24 h: 25.2 ± 2.9% for 3.125 μg/mL, 21.4 ± 6.8% for 6.25
μg/mL and 41.3 ± 2.5% for 12.5 μg/mL) in comparison to the untreated control (at t=24 h
43.8 ± 3.5%).
0 h 6 h 12 h 18 h 24 h
3,12
5
µg/
mL
0%
4%
10%
21%
28%
6,25
µg/
mL
0%
4%
8%
16%
28%
12,5
µg/
mL
0%
10%
14%
27%
41%
Figure 7. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging interval snapshots
of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a
representative experiment. HaCaT cells were treated with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2%
FCS) and Pterodon pubescens extract (3.125, 6.25 and 12.5 μg/mL).
However, multiple post hoc comparisons between groups revealed a significant
difference between the 12.5 μg/mL and 3.125 and 6.25 μg/mL of Pterodon pubescens groups
(p < 0.01), indicating a weaker cell migration inhibitory effect in higher concentrations.
108
0
20
40
60
80
100
2% FBS 3.125 g/mL 6.25 g/mL 12.5 g/mL
6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24
Incubation time [h]
0.1% DMSO
Pterodon pubescens
***
***
***
***
#
#
#
Ga
p c
losu
re (
%)
Figure 8. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were taken every hour
during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h. Gap
size was calculated by using Image J software including the wound healing tool macro. Detected spaces were
converted into percentages; 0% refers to no movement of cells (open gap), 100% depicts a total gap closure.
Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. ***p < 0.001 vs. untreated
group 0.1% DMSO. #p < 0.1 vs. 3.125 and 6.25 µg/mL Pterodon pubescens extract.
3.5.2. Cordia verbenacea
Cordia verbenacea essential oil exerted inhibitory effects on cell migration at all
tested concentrations (at t= 24 h: 32.3 ± 3.2% for 3.125 μg/mL, 15.7 ± 2.3% for 6.25 μg/mL
and 31.5 ± 10.5% for 12.5 μg/mL) in comparison to the untreated control (at t=24 h 43.8 ±
3.5%).
109
0 h 6 h 12 h 18 h 24 h
3,12
5
µg/
mL
0%
6%
16%
26%
32%
6,25
µg/
mL
0%
3%
7%
11%
18%
12,5
µg/
mL
0%
4%
15%
27%
37%
Figure 9. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging interval snapshots
of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a
representative experiment. HaCaT cells were treated with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2%
FCS) and essential oil of Cordia verbenacea (3.125, 6.25 and 12.5 μg/mL).
In multiple post hoc comparisons between groups revealed a significant difference
between the 6.25 μg/mL and 3.125 and 12.5 μg/mL of Cordia verbenacea groups (p < 0.01),
indicating a stronger cell migration inhibitory effect in this concentration.
0
20
40
60
80
100
2% FBS 3.125 g/mL 6.25 g/mL 12.5 g/mL
6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24
Incubation time [h]
0.1% DMSO
Cordia verbenacea
***
***
***
***
#
Ga
p c
losu
re (
%)
Figure 10. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were taken every hour
during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h. Gap
size was calculated by using Image J software including the wound healing tool macro. Detected spaces were
converted into percentages; 0% refers to no movement of cells (open gap), 100% depicts a total gap closure.
Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. ***p < 0.001 vs. untreated
group 0.1% DMSO. #p < 0.1 vs. 3.125 and 12.5 µg/mL Cordia verbenacea essential oil.
110
3.5.3. Association
The association of the crude extract of Pterodon pubescens and essential oil of
Cordia verbenacea exerted inhibitory effects on cell migration at 3.125 and 12.5 μg/mL tested
concentrations (at t= 24 h: 28.6 ± 1.3% for 3.125 μg/mL and 46.3 ± 10.7% for 12.5 μg/mL) in
comparison to the untreated control (at t=24 h 43.8 ± 3.5%). For 6.25 μg/mL, the cell
migration was significantly higher, at t=24 h, a gap closure of 56.2 ± 11.0% was reached.
0 h 6 h 12 h 18 h 24 h
3,12
5
µg/
mL
0%
5%
15%
22%
30%
6,25
µg/
mL
0%
13%
32%
48%
68%
12,5
µg/
mL
0%
10%
26%
46%
57%
Figure 11. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging interval
snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the momentum at 0, 6, 12, 18, and
24 h of a representative experiment. HaCaT cells were treated with the control (DMSO 0.1%), the positive
control (2% FCS) and association of Pterodon pubescens extract and essential oil of Cordia verbenacea (3.125;
6.25 and 12.5 μg/mL).
Multiple post hoc comparisons between groups revealed a significant difference
between the 3.125 μg/mL and 6.25 and 12.5 μg/mL of Association groups (p < 0.01),
indicating a stronger cell migration inhibitory effect in lower concentrations.
111
0
20
40
60
80
100
2% FBS 3.125 g/mL 6.25 g/mL 12.5 g/mL
Incubation time [h]
0.1% DMSO
Association
***
***
***
***
*
**
##
*
6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24
Ga
p c
losu
re (
%)
Figure 12. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were taken every hour
during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h. Gap
size was calculated by using Image J software including the wound healing tool macro. Detected spaces were
converted into percentages; 0% refers to no movement of cells (open gap), 100% depicts a total gap closure.
Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. *p < 0.1, **p < 0.01, ***p
< 0.001 vs. untreated group 0.1% DMSO. #p < 0.1 vs. 6.25 and 12.5 µg/mL Association.
The results from the cell migration assays by the extracts and the association were
also compared. Only the concentration of 6.25 μg/mL of Association showed a significant
difference when compared to the extracts separately presenting a higher cell migration.
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
P te ro d o n p u b e s c e n s 6 .2 5 g/m L C o rd ia v e rb e n a c e a 6 .2 5 g /m L A s s o c ia t io n 6 .2 5 g/m L
6 1 2 1 8 2 4 6 1 2 1 8 2 4 6 1 2 1 8 2 4
In c u b a t io n t im e [h ]
Ga
p c
los
ure
(%
)
* * *
* * *
* * *
Figure 13. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were taken every hour
during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h. Gap
size was calculated by using Image J software including the wound healing tool macro. Detected spaces were
converted into percentages; 0% refers to no movement of cells (open gap), 100% depicts a total gap closure.
Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. ***p < 0.001 vs. Pterodon
pubescens and Cordia verbenacea.
112
3.5.4. C1
The C1 exerted inhibitory effects on cell migration at 12.5 and 25 μM tested
concentrations (at t= 24 h: 11.6 ± 2.7% for 12.5 μM and 14.7 ± 2.1% for 25 μM) in
comparison to the untreated control (at t=24 h 43.8 ± 3.5%). Interestingly, for 6.25 μM, the
cell migration was significantly higher, at t=24 h, a gap closure of 71.8 ± 1.8% was reached.
0 h 6 h 12 h 18 h 24 h
6.25
µM
0%
8%
29%
53%
73%
12.5
µM
0%
2%
5%
7%
13%
25
µM
0%
2%
3%
5%
14%
Figure 14. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging interval
snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the momentum at 0, 6, 12, 18, and
24 h of a representative experiment. HaCaT cells were treated with the control (DMSO 0.1%), the positive
control (2% FCS) and C1 (6.25; 12.5 and 25 μM).
113
0
20
40
60
80
100
2% FBS 6.25 M 12.5 M 25 M
6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24
Incubation time [h]
0.1% DMSO
C1
***
***
***
***
***
***
***
Ga
p c
losu
re (
%)
Figure 15. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were taken every hour
during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h. Gap
size was calculated by using Image J software including the wound healing tool macro. Detected spaces were
converted into percentages; 0% refers to no movement of cells (open gap), 100% depicts a total gap closure.
Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. ***p < 0.001 vs. untreated
control (0.1% DMSO).
3.5.5. α-Humulene
The compound α-Humulene exerted significant effects on cell migration at all
concentrations tested (at t= 24 h: 56.5 ± 1.3% for 6.25 μM and 69.5 ± 7.5% for 12.5 μM), and
a higher effect at 25 μM, where value was on the level of treated control (approximately 88%
gap closure after 24 h). This was the only treatment that demonstrated significant cell
migration activity at all as concentrations tested.
114
0 h 6 h 12 h 18 h 24 h
6.25
µM
0%
9%
21%
49%
58%
12.5
µM
0%
15%
43%
67%
78%
25
µM
0%
7%
38%
73%
98%
Figure 16. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging interval
snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the momentum at 0, 6, 12, 18, and
24 h of a representative experiment. HaCaT cells were treated with the control (DMSO 0.1%), the positive
control (2% FCS) and α-Humulene (6.25; 12.5 and 25 μM).
0
20
40
60
80
100
2% FBS 6.25 M 12.5 M 25 M
6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24
Incubation time [h]
0.1% DMSO
-Humulene
***
***
***
***
**
***
***
***
***
******
Ga
p c
losu
re (
%)
Figure 17. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were taken every hour
during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h. Gap
size was calculated by using Image J software including the wound healing tool macro. Detected spaces were
converted into percentages; 0% refers to no movement of cells (open gap), 100% depicts a total gap closure.
Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. **p < 0.01, ***p < 0.001
vs. untreated control (0.1% DMSO).
115
3.7. Anti-inflammatory activity
To investigate the effect of the extracts, association and compounds in TNF-α-
induced VEGF expression, HaCat cells were treated with TNF-αand the various treatments
for 24 hours. The results were compared to the TNF-α-stimulated group. Pterodon pubescens
(A) and Cordia verbenacea (B) increased TNF-α-stimulated VEGF production in HaCaT
cells concentration-dependently. Association (C) at the higher concentration increased
significantly the levels of VEGF, while the lower concentrations had no effect on the TNF-α-
stimulated VEGF production. C1 (D) increased significantly the levels of VEGF in higher
concentrations, while the lowest concentration had no effect on TNF-α-stimulated VEGF
production. α-Humulene (E) was the only treatment that significantly decreased the levels of
VEGF at the lowest concentration, but significantly increased the levels of VEGF in higher
concentrations.
0
50
100
150
200
250
Control + TNF-
Control
P. pubescens + TNF-
Hydrocortison + TNF-
12.5 6.25 3.125 3.6
***
***+++
***
[µg/mL]
VE
GF
[p
g/m
L]
0
50
100
150
200
250
Control + TNF-
Control
C. verbenacea + TNF-
Hydrocortison + TNF-
12.5 6.25 3.125 3.6
***
***
***+++
***
[µg/mL]
VE
GF
[p
g/m
L]
0
50
100
150
200
250
Control + TNF-
Control
Association + TNF-
Hydrocortison + TNF-
12.5 6.25 3.125 3.6
***
***
+++
[µg/mL]
VE
GF
[p
g/m
L]
0
50
100
150
200
250Control
Control + TNF-
C1 + TNF-
Hydrocortison + TNF-
25 12.5 6.25 10 10
+++
***
***LY 294002 + TNF-
*** ***
[µM]
VE
GF
[p
g/m
l]
0
50
100
150
200
250Control
Control + TNF-
-Humulene + TNF-
Hydrocortison + TNF-
25 12.5 6.25 10 10
+++
***
***
***
LY 294002 + TNF-
*** ***
[µM]
VE
GF
[p
g/m
l]
Figure 18. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (C), C1 (D), α-Humulene
(E), LY 294002 and hydrocortisone on TNF-α-induced (20 ng/mL) VEGF secretion in HaCaT cells. VEGF
secretions were quantified by corresponding ELISA kits. Results are expressed as the mean ± SD of triplicates.
*** p < 0.001 vs. TNF-α-stimulated group; +++ p < 0.001 vs. untreated control group.
To investigate the effect of the extracts, association and compounds in TNF-α-
A B
C D
E
116
induced IL-8 expression, HaCat cells were treated with TNF-α and the various treatments for
24 hours. The results were compared to the TNF-α-stimulated group. All the different
treatments significantly decreased the levels of IL-8 (Figure 19).
0
10
20
30
40Control
Control + TNF-
P. pubescens + TNF-
Hydrocortison + TNF-
12.5 6.25 3.125 3.6
*** *** ******
+++
[µg/mL]
IL-8
[p
g/m
l]
0
10
20
30
40Control
Control + TNF-
C. verbenacea + TNF-
Hydrocortison + TNF-
12.5 6.25 3.125 3.6
+++
*** ***
******
[µg/mL]
IL-8
[p
g/m
l]
0
10
20
30
40Control
Control + TNF-
Association + TNF-
Hydrocortison + TNF-
12.5 6.25 3.125 3.6
+++
******
***
***
[µg/mL]
IL-8
[p
g/m
l]
0
10
20
30
40Control
Control + TNF-
C1 + TNF-
Hydrocortison + TNF-
25 12.5 6.25 10
+++
***
***
*****
[µM]
IL-8
[p
g/m
l]
0
10
20
30
40Control
Control + TNF-
-Humulene + TNF-
Hydrocortison + TNF-
25 12.5 6.25 10
+++
***
*********
[µM]
IL-8
[p
g/m
l]
Figure 19. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (C), C1 (D), α-Humulene
(E) and hydrocortisone on TNF-α-induced (20 ng/mL) IL-8 secretion in HaCaT cells. IL-8 secretions were
quantified by corresponding ELISA kits. Results are expressed as the mean ± SD of triplicates. ** p < 0.01, and
*** p < 0.001 vs. TNF-α-stimulated group; +++ p < 0.001 vs. untreated control group.
Discussion
Acute wounds are a common health problem, with 11 million people affected
(Singer & Dagum, 2008). More than 7 million chronic skin ulcers caused by pressure, arterial
or venous insufficiency and diabetes mellitus each year in the United States are affected by
abnormal wound healing (Sinno & Prakash, 2013). This translates to annual costs of $9
billion in attempt to reduce the major disability and consequent death of such severe skin
injury (Ashcroft et al., 2002).
In the present study, the cell line HaCaT, an immortalized human keratinocyte cell, was used
A B
C D
E
117
for the evaluation of wound healing and anti-inflammatory activities of the extracts, their
association and their major isolated compounds α-Humulene and compound m/z 404 (C1).
ATP assay was chosen to assess cell viability. Subsequent measuring of the ATP levels
provided information about the survival and death rate of the cells under the influence of the
corresponding substances (Wedler et al., 2016). All the extracts, association and compounds
did not show a significant effect on cell viability at the concentration range tested when
compared to the untreated control (Figure 3). ATP is a marker for cell viability because of its
presence in metabolically active cells levels decrease rapidly when the cells undergo necrosis
or apoptosis (Reid et al., 2004).
Next, we examined the ability of the tested samples to induce keratinocyte
proliferation using the BrdU incorporation assay. Cell proliferation is an important step for
the epidermal renewal. BrdU incorporation allowed us to determine the rate of DNA synthesis
and cell proliferation activity (Bosq & Bourhis, 1997). Our results showed a decrease in
proliferation of HaCaT cells with the treatment of the Pp extract and their isolated compound
C1 and the association of Pp + Cv. At all the concentrations tested for these samples, the
BrdU incorporation was inhibited by 40 ~ 60%. For Cv extract, proliferation decreased as the
concentrations was increase (3.125 to 25 μg/mL). At concentration of 25 μg/mL, BrdU
incorporation was inhibited by 35%. Interestingly, α-Humulene in lower concentrations
(3.125 – 6.25 µM) had only weak antiproliferative effects, but in higher concentrations (12.5
– 50 µM), BrdU incorporation was inhibited by approximately 50% (Figure 4).
Antiproliferative effects of crude ethanolic extract of Pterodon pubescens have
been reported earlier in melanoma (SK MEL 37) cells. An isolated compound with vouacapan
skeleton (vouacapan-6α, 7β, 14β, 19-tetraol; IC=32 µM) also exhibited antiproliferative
effects in this cell line (Vieira et al., 2008). Another study demonstrated an antiproliferative
effect for another isolated compound from Pterodon pubescens. The compound 6α-acetoxy-
7β-hydroxy-vouacapan, that has the vouacapan skeleton as the C1 tested in this study, showed
high selectivity for cell line of prostate cancer (PC-3) (Spindola et al., 2009). The C1 tested in
this study has the same vouacapan skeleton that the previous studies. It can be suggested that
this structure exerted antiproliferative effects.
Previous study compared the supercritical fluid extract and ethanolic extract of
Cordia verbenacea in antiproliferative in vitro and antitumor in vivo assays. Supercritical
extract was more effective as antiproliferative and cytotoxic against cancer cells line (MCF-7)
and in vivo assays (Parisotto et al., 2012). Despite being another extract and another cell line,
the essential oil of Cordia verbenacea also showed antiproliferative effects in HaCaT cells.
118
The effects on in vitro wound healing were evaluated by cell migration assay
using a long-term, time-lapse microscopy. This is an accurate and reproducible model to study
wound healing by monitoring cell migration over an extended period.
As positive control, medium supplemented with 2% FBS was used, leading to
98.7 ± 1.0% gap closure after 24 h. As expected, the addition of FBS resulted in a significant
acceleration of the gap closure process, and thus implied that the experimental protocol
provided reliable results (Figure 5). LY294002, a phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor,
showed a gap closure of 6%. In previous study, it was demonstrated that the LY294002
clearly inhibited cell migration compared to the control group (Wedler et al., 2016).
The effects of Pterodon pubescens extract and Cordia verbenacea essential oil on cell
migration are comparable to cells treated with the medium and 0.1% of DMSO. As shown in
Figures 7 and 8, the extracts did not affect cell migration in any concentration tested, since the
values remained on the level of untreated control after 24 h.
For the association of extracts, synergistic response was expected according to
previous study. However, this effect was not observed at the cell migration assay. All the
concentrations tested exerted inhibitory effects on cell migration (Figure 9).
For C1, only at the lowest concentration (6.25 μM), the cell migration was
significantly higher, a gap closure of 71.8% was reached after 24 h of treatment (Figure 14).
Of all samples tested in this study, only α-Humulene exerted significant effects on
cell migration at all concentrations tested. Wound closure was improved by 56%; 69% and
88% after 24 h of treatment, respectively, in the presence of 6.25; 12.5 and 25 μM. Higher
concentrations stimulated cell migration without considerable toxic effects as seen on ATP
assay.
It is known that the inflammatory phase is one of the most important stages in the
healing process. Therefore, the inhibition of proinflammatory mediators may be an effective
therapeutic approach to regulate the progression of the wound-healing process (Wedler et al.,
2014).
Several natural compounds and plant extracts have been previously reported to
have anti-inflammatory effects in activated keratinocytes (Kao et al., 2009; Kim et al., 2012;
Park et al., 2010; Wedler et al., 2016).
VEGF and IL-8 play an important role in skin inflammation and are produced by
activated keratinocytes (Takematsu & Tagami, 1993; Viac et al., 1997). VEGF is also
produced by most inflammatory cells including eosinophils, lymphocytes, macrophages, and
neutrophils (Taichmann et al., 1997) and play key roles at three phases of wound healing
119
(Stone & Bhimji, 2017). Both mediators are overexpressed in skin diseases that are associated
with aberrant angiogenesis (Pietrazk et al., 2008; Smith et al., 2007; Xia et al., 2003).
In the present study, we demonstrate that Pp, Cv, Association of extracts and C1,
boosts the production of VEGF (Figure 18). Pp and Cv presented an increased response
concentration-dependently. Association and C1 also presented an increased response in higher
concentrations. These samples seem to possess potent angiogenic effects, despite presenting
antiproliferative and anti-migratory responses. In the inflammatory response mediated by
TNF-α to IL-8 in HaCaT cells, all the different treatments significantly decreased the levels of
IL-8 (Figure 19).
When cells were pretreated with α-Humulene (12.5 and 25 µM), the secretion of
VEGF was increased, comparable to TNF-α-stimulated group. However, when the cells were
treated with lower concentrations of the compound (6.25 µM), presented an inhibition in
VEGF levels. α-Humulene had the strongest reduced in IL-8 production, concentration-
dependently, with better results than the hydrocortisone, suggestion a strong anti-
inflammatory activity. IL-8 inhibition by α-Humulene was not due to a general cytotoxic
effect, since cell viability in all cultures remained constant throughout the incubation period in
the presence the compound tested.
The effect of α-Humulene on cell migration seems be related with VEGF, as this
growth factor is the most prevalent signaling molecule that is specific for endothelial cells,
and it particularly stimulates cell migration and proliferation (Frank et al., 1995; Wilgus et al.,
2005), as the higher concentrations (12.5 – 25 µM) demonstrated a gap closure of almost 90%
and high levels of VEGF.
This compound also has an anti-inflammatory action, as presented a strong anti-
inflammatory activity, inhibiting IL-8 stimulated by TNF-α in HaCaT cells. Pharmacological
studies performed with Cordia verbenacea have validated the anti-inflammatory activity,
attributing this effect to the presence of α-Humulene and trans-caryophyllene isolated from
the plant, which inhibited significantly the expression of cyclooxygenase (COX-1 and COX-
2) and NO synthase (Fernandes et al., 2007). This study is in line with our own data.
To our knowledge, no data have been published previously on the effects of Pp,
Cv, C1 and α-Humulene on cell migration and on the secretion of VEGF and IL-8.
Despite the α-Humulene being one of the major active compound in Cordia
verbenacea essential oil and is present expressively in the crude extract of Pterodon
pubescens, both extracts have not demonstrated activity in cell migration. The moderate anti-
inflammatory effects of both extracts in TNF-α-induced production of IL-8 can be related to
120
the presence of this compound. A synergic response was expected to the association of both
extracts, however it is was not seen on the assays here presented, indicating that the synergic
effect of association previously reported are related to another mechanism of action.
We therefore suggest that α-Humulene might have a dual activity – in higher
concentrations (12.5 and 25 µM) the compounds show an anti-inflammatory and angiogenic
effect, while in lower concentrations (6.25 µM), exert anti-angiogenic activity by inhibiting
migration, possibly by prevention of VEGF secretion.
In conclusion, the Pp extract, Cv essential oil and their association significantly
inhibited the proliferation and migration of human keratinocytes in vitro. C1 also presented
antiproliferative and inhibited migration of HaCaT cells in higher concentrations. Thus, these
compounds would have potential as a local treatment against hyper proliferation-involved
skin diseases, for example. Finally, treatment with α-Humulene may be a potential therapeutic
strategy to promote wound healing and to prevent inflammation in a persistent inflammatory
condition.
Acknowledgements
We would like to thank to Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo (FAPESP) for grant support and fellowship to RTB (#2015/08600-2, #2016/23816-4)
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human psoriasis. Blood, 102: 161–168, 2003.
126
7. DISCUSSÃO GERAL
A Organização Mundial da Saúde tem incentivado investimentos públicos em
plantas medicinais. O mercado mundial de fitomedicamentos gerou cerca de 27 bilhões de
dólares em 2014, principalmente na Europa, Ásia e Estados Unidos (Dutra et al., 2016).
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), para a transformação de uma
planta em medicamento deve-se visar à preservação da integridade química e farmacológica
do vegetal, garantindo a constância de sua ação biológica e a segurança de utilização, além de
valorizar o seu potencial terapêutico. Portanto, a produção de medicamentos fitoterápicos
requer, necessariamente, estudos prévios envolvendo aspectos botânicos, agronômicos,
químicos, estudos farmacológicos e toxicológicos, além do desenvolvimento de metodologias
analíticas e tecnológicas, para garantia da padronização do medicamento fitoterápico.
Nosso grupo de pesquisas estuda a espécie Pterodon pubescens Benth. desde
(1999), com abordagens de pesquisas na área tecnológica, química e farmacológica para
obtenção de dados pré-clínicos de segurança, eficácia e reprodutibilidade que contribuam para
a produção de um medicamento fitoterápico. Em um dos trabalhos publicados, observou-se
que as doses utilizadas dos compostos ativos isolados desta espécie tinham atividade
farmacológica semelhante ao extrato bruto, onde no extrato bruto havia uma menor
concentração destes compostos, sugerindo um efeito sinérgico entre os componentes desta
planta (Spindola et al., 2011). A partir deste estudo, surgiu o projeto de associar a Pterodon
pubescens Benth. com a Cordia verbeancea DC, para observar se este efeito sinérgico
ocorreria com a associação de uma outra espécie vegetal, tendo como objetivo avaliar a
atividade antinociceptiva e/ou anti-inflamatória da associação.
Para caracterização da segurança da associação, os possíveis efeitos tóxicos da
administração das associações foram observados através do teste de toxicidade aguda. Esta é
uma avaliação importante no início da pesquisa para fornecer subsídios sobre o modo de ação
tóxico da substância testada e determinante para a continuidade da pesquisa de produtos
naturais (Brito, 1994). O tratamento dos animais com a associação de Pp + Cv na proporção
de 1:1 nas doses de 50, 100 e 500 mg/kg, não evidenciou efeitos tóxicos pela ausência de
sinais clínicos relevantes no screening hipocrático, bem como ausência de morte durante o
período de observação. Também não foram registradas alterações do peso corporal durante os
14 dias de observação, demostrando que a associação dos extratos nas doses avaliadas não
pareceu interferir no metabolismo dos animais.
Outro parâmetro analisado neste experimento foi o peso relativo de alguns órgãos
(coração, pulmão, baço, rins, fígado, ovários e úteros), obtidos pela razão entre o peso do
127
órgão e o peso corpóreo total do animal. Este parâmetro também não evidenciou nenhuma
alteração significativa quando comparado com o grupo controle (veículo). Durante a análise
macroscópica dos órgãos dos animais tratados com a associação dos extratos não foram
observados alterações na coloração quando comparados aos órgãos do grupo controle. É
recomendada a realização de novos testes de toxicidade crônica com doses repetidas para
descartar completamente o efeito tóxico da associação.
Para elucidar se a associação do extrato bruto de Pterodon pubescens Benth. (Pp)
e do óleo essencial de Cordia verbenacea DC (Cv) causaria possíveis alterações no
comportamento motor, foi realizada a avaliação da atividade locomotora através do teste de
campo aberto (open field). Modificações no desempenho motor que o animal possa vir a
sofrer, é proveniente de uma ação miorelaxante ou sedativa, podendo induzir a um grande
número de erros em estudos sobre drogas que atuam na nocicepção central e periférica
(Millan, 2002). Nos modelos de nocicepção o fator comportamental está diretamente
envolvido, portanto o estudo de extratos que interfiram na locomoção poderia produzir um
resultado falso positivo.
O teste de campo aberto demonstrou que o tratamento agudo por via oral com a
associação dos extratos nas doses de 50, 100 e 500 mg/kg, não alterou o desempenho
locomotor dos animais quando comparado ao grupo controle negativo (veículo) enquanto o
tratamento com o controle positivo (pentobarbital 35 mg/kg) reduziu significativamente a
atividade locomotora dos animais. Uma vez realizada a caracterização preliminar de
segurança do uso da associação dos extratos em animais, iniciou-se os testes para caracterizar
as ações farmacológicas.
Dentre os diferentes modelos de nocicepção encontra-se o teste de contorções
abdominais induzidas por ácido acético utilizado como uma ferramenta de rastreio para a
avaliação de propriedades analgésicas ou anti-inflamatórias de compostos naturais ou
sintéticos (Spindola et al., 2012). Quando injetado por via intraperitoneal, o ácido acético
induz de forma indireta o aparecimento de contorções abdominais, agindo através da liberação
de mediadores endógenos que estimularão os neurônios nociceptivos sensíveis (Fischer et al.,
2008). O estímulo produzido pelo ácido acético causa nocicepção por um mecanismo que
envolve eicosanóides e aminas simpatomiméticas, que também estão envolvidas na
hiperalgesia induzida por estímulos inflamatórios, como os da carragenina. Além disso, a
liberação de prostaglandinas e aminas simpatomiméticas são secundária à liberação de
citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, IL-1β e IL-8, o que demonstra a relação entre
as vias inflamatórias e nociceptivas (Ribeiro et al, 2000).
128
Neste trabalho, o teste de contorção abdominal induzido por ácido acético foi
escolhido como modelo de triagem para encontrar as doses efetivas do extrato bruto de
Pterodon pubescens Benth. (Pp) e do óleo essencial de Cordia verbenacea DC (Cv).
Para o extrato de Pp a dose efetiva encontrada foi de 64,2 mg/kg e para o óleo
essencial de Cv de 165,4 mg/kg. Para melhor cálculo e administração das doses, foram
fixadas para o Pp a dose efetiva de 65 mg/kg e para o Cv de 165 mg/kg.
Roldão et al., 2008 demostraram que o extrato etanólico de folhas de Cordia
verbenacea na dose de 250 mg/kg por via oral, não exibiu atividade analgésica no teste de
contorção abdominal induzida por ácido acético. Entretanto, estudos realizados com o extrato
diclorometânico mostrou dose dependência (100-1000 mg/kg), onde a dose de 1000 mg/kg
inibiu em 65% o número de contorções quando comparado ao grupo controle (Bayeux et al.,
2002). A dose efetiva encontrada para o óleo essencial de Cordia verbenacea neste trabalho
foi de 165 mg/kg, sendo menor do que as descritas anteriormente, provavelmente ao fato do
óleo essencial possuir compostos que apresentam maior atividade analgésica e anti-
inflamatória, como por exemplo, o alfa-Humuleno (Fernandes et al., 2007).
Com as doses efetivas definidas, foi realizada uma análise gráfica para avaliar o
efeito da mistura dos extratos através de um modelo matemático denominado isobolograma.
A análise isobolográfica é um método experimental aplicável na determinação farmacológica
de interações entre fármacos sendo uma ferramenta conveniente na detecção de interações
farmacológicas bem como na compreensão da real natureza dessas interações,
independentemente do seu mecanismo de ação ou da natureza das relações dose-resposta
(Tallarida, 2001). De fato, este método experimental permite a avaliação da administração
concomitante de fármacos ou extratos vegetais em doses efetivas, permitindo uma posterior
extrapolação dos resultados obtidos para a determinação do efeito farmacológico resultante da
mistura (Deckers, 2000). Portanto, no presente estudo, utilizou-se esta técnica para determinar
a natureza de interação entre o extrato bruto de Pterodon pubescens Benth. (Pp) e do óleo
essencial de Cordia verbenacea DC (Cv).
Após a construção da análise gráfica onde foram plotados os dados teóricos e
experimentais oriundos do teste de contorção abdominal induzida por ácido acético, o gráfico
mostrou uma curva convexa da associação dos extratos, comprovando real efeito sinérgico da
mistura de Pp + Cv, onde as DE50 das misturas definidas experimentalmente, além de
mostrarem um efeito na inibição maior que 50% - em torno de 65% a 75%, as doses
necessárias para a inibição de 50% se mostraram inferiores aos valores definidos
teoricamente, onde os valores teóricos foram de 48,75; 32,5 e 16,25 mg/kg para o extrato de
129
Pp e os valores experimentais foram de 16,48; 13,44 e 8,71 mg/kg para o extrato de Pp,
demonstrando que as concentrações das doses necessárias para uma inibição de 50% nas
contorções abdominais foram em torno de 3 a 2 vezes menores que as doses apresentadas na
linha de aditividade. Em relação ao índice combinatório encontrado, todas as associações
demostraram um efeito sinérgico, corroborando com os dados encontrados através do
isobolograma.
O teste da formalina é uma ferramenta útil não só para avaliar o potencial de uma
substância analgésica ou anti-inflamatória, mas também para elucidar o mecanismo de ação
(Hunskaar & Hole, 1985; Lenardão et al., 2016). É também um dos modelos mais utilizados
em ensaios de dor e que mais se assemelha a dor clínica (Tjolsen et al., 1992).
Os mecanismos analgésicos da mistura foram analisados no teste de formalina que
envolve duas fases com respostas distintas. A primeira fase ocorre bem rapidamente e é mais
sensível a fármacos opióides. Isso se deve à dor exclusivamente neurogênica com excitação
de fibras nervosas Aδ mielinizadas e fibras C não mielinizadas (Mcnamara et al., 2007). As
associações nas três doses testadas e também os extratos separadamente não apresentaram
redução do tempo de lambida durante a fase neurogênica do teste.
A segunda fase, mais tardia do teste de formalina, envolve um período de
sensibilização dos nociceptores por parte dos mediadores inflamatórios (serotonina, histamina
e PGE2) liberados em resposta à lesão tecidual, com o aparecimento da dor de origem
inflamatória (Tjolsen et al., 1992). Na fase inflamatória do teste, as três doses testadas da
associação reduziram o tempo de lambida da pata dos animais quando comparados ao veículo.
O resultado sobre a segunda fase aponta para um possível efeito anti-inflamatório da
associação devido a sua ação sobre a liberação de mediadores envolvidos com inflamação,
tais como prostaglandinas, histamina, serotonina e bradicinina e leucotrienos (Santos et al,
2006; Zhang & Ren, 2011). Em adição, é sugerido que a associação possa estar agindo como
um inibidor de ciclooxigenases, já que uma inibição somente da segunda fase do teste da
formalina é característica típica de inibidores desta enzima (Rosland et al., 1990).
Para a continuidade dos testes de atividade antinociceptiva e anti-inflamatória,
foram escolhidas as doses de associação dos extratos que apresentaram maior inibição da
nocicepção nos modelos de contorção abdominal induzida por ácido acético e no teste de
formalina. As doses que foram escolhidas correspondem a 50% da dose efetiva de cada
extrato na associação (A50 = 32,5 mg/kg de Pp + 82,5 mg/kg de Cv), a 100% da dose efetiva
de cada extrato na associação (A100 = 65 mg/kg de Pp + 165 mg/kg de Cv) e a 200% da dose
efetiva de cada extrato na associação (A200 = 130 mg/kg de Pp+ 330 mg/kg de Cv).
130
Para confirmar a possível atividade antinociceptiva da associação dos extratos
foram realizados os testes de retirada de cauda (tail flick), que mostra uma ação central-
medular, e placa quente (hot plate), que mostra uma ação central-cerebral.
Estudos anteriores realizados com o extrato etanólico (dose de 250 mg/kg) e o
extrato bruto diclorometânico (dose de 100 – 1000 mg/kg) de folhas de Cordia verbenacea
DC separadamente, não mostraram resposta antinociceptiva para modelos de nocicepção com
estímulos térmicos (Bayeux et al., 2002; Roldão et al., 2008). Contudo, estes experimentos
foram realizados com a mistura para observar se a associação de ambos seria capaz de
produzir uma resposta protetora positiva frente a este estímulo.
O teste de retirada de cauda é um dos mais antigos testes nociceptivos (D'Amour & Smith,
1941). O parâmetro analisado é a latência, em segundos, do reflexo da ponta da cauda do
animal após a exposição a um estímulo térmico (Lenardão et al., 2016). A retirada da cauda é
um reflexo espinhal, mas está sujeita a influências supra-espinhais que podem afetar este
reflexo (Yaksh & Rudy, 1978; Millan, 2002). As três doses empregadas da associação dos
extratos A50, A100 e A200 não aumentaram o tempo de latência ao estímulo térmico no modelo
de retirada de cauda, no entanto o grupo controle positivo (morfina 5 mg/kg) mostrou
significativo aumento da latência desde a primeira avaliação.
O teste da placa quente (hot plate) é um modelo central, válido para fármacos
derivados de opióides (Morucci et al., 2012) e é caracterizado por respostas supraespinhais
através de dois componentes comportamentais: a lambida de pata e o salto. A lambida de pata
é suprimida por analgésicos opióides, enquanto que o salto pode ser inibido por analgésicos
menos potentes, como ácido acetilsalicílico ou paracetamol (Le Bars et al., 2001). Este
modelo experimental é objetivo, fácil de ser desenvolvido, além de prover medidas de
respostas nociceptivas supraespinhais, semelhante a dor humana, mediada por respostas
supraespinhais que se diferem dos reflexos nociceptivos espinhais (Gunn et al., 2011; Barrot,
2012). De acordo com os resultados obtidos a morfina mostrou-se bastante ativa aumentando
o tempo de latência ao estímulo térmico, enquanto as três doses da associação não alteraram o
tempo de resposta quando comprados ao grupo veículo, mostrando que o efeito
antinociceptivo da associação não é mediado por mecanismos supraespinhais. Os dados
complementam o que foi apresentado no teste de retirada de cauda, e corroboram com os
resultados encontrados na primeira fase do teste de formalina, onde a associação dos extratos
não demonstrou atividade na fase neurogênica do modelo.
O edema de pata induzido por carragenina, descrito originalmente por Winter et
al., 1962, é um dos modelos de inflamação mais utilizados e altamente reprodutíveis para o
131
rastreio de novas drogas com ação anti-inflamatória, como os produtos naturais, sendo o
edema utilizado como parâmetro desta resposta (Fehrenbacher et al., 2012; Vazquez et al.,
2015). A carragenina é um mucopolissacarídeo derivado de algas marinhas denominadas
Chondrus, que causa uma inflamação do tipo adaptativa, não produz efeitos sistêmicos e
proporciona alto grau de reprodutividade (Boleta-Ceranto et al, 2005).
Os sinais cardinais da inflamação, tais como edema, hiperalgesia e eritema, são
desenvolvidos imediatamente após a injeção subplantar de carragenina, como resultados da
ação de agentes pró-inflamatórios, tais como bradicinina, histamina, prostaglandinas,
tromboxanos, espécies reativas de oxigênio que podem ser gerados no local da lesão ou por
infiltração das células (Di Rosa et al., 1971; Salvemini et al., 1996; Guay et al., 2004;
Vazquez et al., 2015).
O edema inflamatório induzido pela injeção de carragenina é resultante da ação
sequencial e integrada de vários mediadores inflamatórios e sua sequência de eventos é bem
delineada, descrevendo três fases. Nas duas primeiras horas do edema de pata induzido por
carragenina ocorrem à liberação de histamina, serotonina, substância P e bradicinina-
dependente. Na segunda etapa, que se estende da primeira ou segunda hora até a sexta hora,
atribui-se o efeito edematogênico à elevação da produção de prostaglandinas e ativação da
ciclooxigenase-2, além da migração de neutrófilos. Na última fase, a mediação inflamatória
depende principalmente da produção de citocinas, como TNF-α, IL-1α e IL-1β, IL-6
(Salvemini et al., 1996; Iwata et al., 2010; Zhang & Ren, 2011). As três associações testadas
foram capaz de inibir significativamente o edema induzido por carragenina a partir da sexta
hora de avaliação e prolongar esta atividade até a 48ª hora da mensuração do volume da pata,
assemelhando-se ao efeito produzido pelo controle positivo – dexametasona. Estes resultados
sugerem que a associação possa estar agindo na produção de mediadores inflamatórios,
devido ao efeito significativo observado na terceira etapa do modelo de edema de pata
induzido por carragenina.
Em estudo anterior, Passos et al., 2007 demonstraram que o tratamento por via
oral do óleo essencial de Cordia verbenacea (150-600 mg/kg) reduziu o edema de pata
induzido por carragenina e também em modelos de edema de pata induzido por vários
mediadores da inflamação, incluindo histamina, bradicinina, substância P e fator de ativação
plaquetário (PAF). A dose de 600 mg/kg do óleo mostrou-se significativa inibindo o edema
na primeira, segunda e quarta hora após a injeção da carragenina. A administração da dose de
150 mg/kg do óleo essencial, entretanto, não apresentou efeito significativo no edema de pata
induzido por carragenina quando comparado ao grupo controle. Diferentemente dos
132
resultados exibidos neste trabalho, a associação dos extratos inibiu o edema de pata induzido
por carragenina a partir de 4 horas após a injeção de carragenina, na maior dose utilizada (330
mg/kg de Cordia). Provavelmente, esta inibição da fase inicial do edema, deve-se a elevada
dose utilizada (600 mg/kg), já que a dose de 150 mg/kg não demostrou atividade. Estudos
sugerem que a atividade anti-inflamatória do óleo essencial de Cordia verbenacea esteja
relacionada com a diminuição de níveis de TNF-α, porém, esta ação anti-inflamatória não está
relacionada com a capacidade de inibição da produção de prostaglandinas (PGE2), inibição da
atividade de COX-1 e COX-2 in vitro e redução de níveis de IL-1β (Passos et al., 2007).
A PGE2 é um dos principais produtos do ácido araquidônico através do
metabolismo da ciclooxigenase (COX) na resposta da inflamação e desempenha um papel
vital na inflamação (Blatteis et al., 2005). Neste trabalho, exploramos o possível
envolvimento deste mediador inflamatório através do modelo de edema de pata induzido por
PGE2, onde o bloqueio dos receptores de PGE2 pode ser uma abordagem para o
desenvolvimento de drogas ou terapias alternativas para dor e inflamação (Spindola et al.,
2017). Nossos resultados demonstraram uma inibição aos 15 e 30 minutos após a
administração de PGE2 com todas as doses administradas, sugerindo que a inibição dessa via
também está envolvida no efeito anti-inflamatório da associação.
Devido à inibição da segunda fase no modelo de pata induzida por carragenina,
foi realizado o modelo de peritonite induzida por carragenina para avaliar a atividade da
associação na migração de leucócitos. A peritonite induzida por carragenina é amplamente
empregada para testar novas terapias anti-inflamatórias, pois permite a avaliação do
recrutamento celular, bem como mudanças em outros parâmetros inflamatórios, como
permeabilidade vascular e produção de citoquinas (Okoye et al., 2013). Concomitantemente,
exerce um efeito quimiotáctico em células inflamatórias mediadas por uma ação sinérgica
entre prostaglandinas, leucotrienos e outros agentes quimiotáticos (Damasceno et al., 2014).
No modelo de peritonite induzida por carragenina, a associação nas três doses testadas não
inibiu significativamente a migração de leucócitos na cavidade peritoneal, sugerindo que as
atividades anti-inflamatórias da associação não estão relacionadas ao recrutamento de células.
A nocicepção persistente causada pela administração intraplantar de CFA é um
modelo de nocicepção amplamente utilizado. O CFA é composto por óleo de parafina
contendo mono-oleato de manitol como um surfactante em suspensão com uma micobactéria
(Mycobacterium tuberculosis ou Mycobacterium butyricum) morta. A administração de CFA
na cauda ou nas patas de ratos, camundongos ou coelhos produz um processo inflamatório
intenso, que se desenvolve rapidamente e pode persistir por várias semanas (Billiau &
133
Matthys, 2001). Este ensaio constitui um modelo de dor inflamatória que tem similaridade
com doenças crônicas humanas tais como artrite reumatóide e as inflamações severas nas
articulações (Tjolsen & Hole, 1997). A administração de CFA produz reação inflamatória
local caracterizada por eritema, aumento da temperatura local, estravasamento plasmático,
infiltração de células inflamatórias, associado com a produção de vários mediadores
inflamatórios e nociceptivos tais como citocinas, neurotrofinas e eicosanoides (Ganju et al.,
2001). Em conseqüência, a injeção de CFA causa hiperalgesia e alodínia, que é mediada pela
sensibilização local do nociceptor e por mecanismos sistêmicos neurais (como a
sensibilização central) e imunes (como o aumento dos níveis locais e séricos de citocinas)
(Samad et al., 2004).
Neste estudo, avaliamos as associações em dois tratamentos diferentes: um grupo
experimental que recebeu tratamento nos dias de avaliação de fase aguda e crônica e outro
grupo que recebeu tratamento diário ao longo dos sete dias do teste. Nossos resultados
mostraram que as associações foram efetivas neste modelo, mostrando um aumento no limiar
da retirada de pata, tanto na fase aguda e com maior eficácia na fase crônica. Os resultados
foram mais interessantes para o grupo tratado diariamente, no sétimo dia de avaliação, onde a
avaliação basal mostrou um aumento no limiar da retirada de pata superior a 70%,
demonstrando que o tratamento diário reduziu significativamente a sensibilidade induzida
pelo CFA e com o último tratamento, mostrou valores próximos ou superiores ao controle
positivo, dexametasona. De acordo com Burstein et al., 2010, um efeito antinociceptivo no
modelo CFA, ocorre inibindo a síntese de mediadores pró-inflamatórios, como a
ciclooxigenase 2, interleucina 1β e óxido nítrico sintase, por meio da inibição do fator nuclear
k. A PGE2 também participa como o principal mediador responsável pela hipersensibilidade
mecânica (Wang et al., 2007). Com a inflamação crônica significativamente inibida, sugere-se
que a associação tenha um papel na inibição de mediadores pró-inflamatórios e na via PGE2.
Os efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios da associação do extrato bruto dos
frutos de Pterodon pubescens Benth. (Pp) com o óleo essencial de Cordia verbenacea DC
(Cv) estão relacionado à composição química do extrato vegetal. Na análise fitoquímica, a
associação mostrou uma importante concentração de Trans-Cariofileno e α-Humuleno.
Estudos anteriores sugeriram alguns mecanismos de ação de ambos os compostos (50 mg/kg)
através do fator ativador de plaquetas, bradicinina, prostaglandina E2 (PGE2), indução de
sintetase de óxido nítrico induzível (iNOS) e expressão de ciclooxigenase (COX-2) em testes
in vivo (Fernandes et al., 2007).
Em relação aos compostos presentes no extrato da Pterodon pubescens, estudos
134
anteriores do nosso grupo sugeriram alguns mecanismos de ação. O geranilgeraniol (30
mg/kg) tem relação com receptores de serotonina 5-HT3 e receptores de imidazolina I1. O
composto m/z 362 (30 mg/kg) provavelmente está envolvido com a síntese ou liberação de
serotonina e ambos os compostos reduziram a resposta nos testes de contorção, capsaicina,
glutamato e placa quente, com relação aos receptores vaniloid VR1 e/ou receptores periféricos
de glutamato (Spindola et al., 2010, Spindola et al., 2011).
O composto m/z 404 demonstrou mais eficácia na dor neurogênica, do que na dor
inflamatória do teste de formalina, sugerindo uma ação relacionada aos mecanismos central e
periférico (Servat et al., 2012). Estes estudos também sugeriram que os compostos presentes
no extrato de Pterodon pubescens Benth. podem exercer um efeito sinérgico, uma vez que o
extrato bruto (300 mg/kg) contendo concentrações menores de geranilgeraniol (34,6 mg/kg) e
m/z 362 (4,7 mg/kg) apresentou o mesmo efeito dos compostos puros quando testados
separadamente (300 mg/kg) no modelo de contorção abdominal induzido por ácido acético
(Spindola et al., 2011).
No presente estudo as associações foram testadas em doses mais baixas e,
conseqüentemente, menores concentrações de compostos ativos do que as testadas nestes
estudos anteriores, no entanto, apresentaram efeitos significativos, especialmente na dor
inflamatória, sugerindo um efeito sinérgico.
O conceito de terapia combinada é baseado no potencial sinérgico ou aditivo de
dois ou mais medicamentos para melhorar a eficácia terapêutica (Organização Mundial da
Saúde, 2015). O sinergismo é um tipo de resposta farmacológica obtida a partir da associação
de dois ou mais fármacos, o que resulta ser maior do que a soma simples dos efeitos isolados
de cada um. Dois ou mais fármacos podem ser administrados em combinação principalmente
para aumentar a eficácia, reduzir as dosagens individuais e os possíveis efeitos colaterais de
cada um (Ulrich-Merzenich, 2014). Nossos resultados apontam para um possível sinergismo
entre os compostos ativos nas associações, provavelmente atuando em diferentes receptores
farmacológicos como estudos anteriormente relatados.
Devido aos resultados promissores do efeito sinérgico e da ação anti-inflamatória
da associação nos estudos in vivo, estudos in vitro, utilizando linhagem celular imortalizada
de queratinócitos humanos (HaCaT), foram realizados com os extratos separadamente, a
associação dos extratos e seus principais compostos ativos, composto m/z 404 (C1) e α-
Humuleno, com o objetivo de investigar a ação destas amostras em teste de cicatrização in
vitro (migração celular) e o potencial anti-inflamatório (VEGF e IL-8), já que a cicatrização
de feridas e a inflamação estão diretamente relacionadas.
135
As feridas são definidas como lesões físicas que resultam em uma abertura ou
ruptura da pele que causa um distúrbio na anatomia e função normal da pele (Strodtbeek,
2001). A cicatrização normal de feridas é uma série dinâmica de eventos que envolvem a
interação coordenada de células sanguíneas, proteínas, proteases, fatores de crescimento e
componentes da matriz extracelular e são divididos em três fases: inflamatória, proliferativa e
remodelação (Sinno & Prakash, 2013).
As células presentes em feridas não cicatrizadas produzem constantemente mediadores
inflamatórios em uma fase de inflamação não coordenada e autossustentável que prejudica a
restauração da integridade anatômica e funcional no período normal de tempo (Heinlin et al.,
2010; Prantl et al., 2010), atrasando o último objetivo do processo de cicatrização de feridas,
que é a regeneração da pele ferida sem a formação de cicatrizes.
Neste estudo, o ensaio de ATP (adenosina trifosfato) foi escolhido para avaliar a
viabilidade celular. A medição subseqüente dos níveis de ATP fornece informações sobre a
taxa de sobrevivência e mortalidade das células sob a influência das substâncias
correspondentes (Wedler et al., 2016). Todos os extratos, associação e compostos não
mostraram efeito significativo na viabilidade celular no intervalo de concentração testado
quando comparado ao controle não tratado. O ATP é um marcador para a viabilidade celular
devido à sua presença nos níveis metabolicamente ativos das células, que diminuem
rapidamente quando as células sofrem necrose ou apoptose (Reid et al., 2004).
Em seguida, foi avaliada a capacidade das amostras testadas para induzir a
proliferação de queratinócitos usando o ensaio de incorporação de BrdU (5-bromo-2'-
desoxiuridina). A proliferação celular é um passo importante para a renovação epidérmica. A
incorporação de BrdU permite determinar a taxa de síntese de DNA e atividade de
proliferação celular (Bosq & Bourhis, 1997). Nossos resultados mostraram uma diminuição
na proliferação celular com o tratamento do extrato Pp e seu composto isolado C1 e a
associação de Pp + Cv. Em todas as concentrações testadas para essas amostras, a
incorporação de BrdU foi inibida em 40 ~ 60%. Para o extrato Cv, a proliferação diminuiu à
medida que as concentrações aumentaram (3,125 a 25 μg/mL). Na concentração de 25 μg/mL,
a incorporação de BrdU foi inibida em 35%. O α-Humuleno em concentrações mais baixas
(3.125-6.25 μM) apresentou efeitos antiproliferativos menores, mas em maiores
concentrações (12,5 - 50 μM), a incorporação de BrdU foi inibida em aproximadamente 50%.
Os efeitos antiproliferativos do extrato etanólico bruto de Pterodon pubescens
foram relatados anteriormente em células de melanoma (SK MEL 37). O composto isolado
com esqueleto vouacapânico (vouacapano-6α, 7β, 14β, 19-tetraol, IC = 32 μM) também
136
apresentou efeito antiproliferativo nesta linha celular (Vieira et al., 2008). Outro estudo
demonstrou efeito antiproliferativo para outro composto isolado de Pterodon pubescens. O
composto 6α-acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano, que possui o esqueleto vouacapânico como o
C1 testado neste estudo, mostrou alta seletividade para linhagem celular de câncer de próstata
(PC-3) (Spindola et al., 2009). O C1 testado neste estudo possui o mesmo esqueleto
vouacapânico que os estudos anteriores, onde sugere-se que essa estrutura possua efeitos
antiproliferativos.
Estudo anterior comparou o extrato por fluído supercrítico e o extrato etanólico de
Cordia verbenacea em ensaios antiproliferativos in vitro e antitumoral in vivo. O extrato
supercrítico foi mais eficaz como antiproliferativo e citotóxico contra linhagens de células
tumorais (MCF-7) e ensaios in vivo (Parisotto et al., 2012). Apesar de ser outro extrato e outra
linhagem celular, o óleo essencial da Cordia verbenacea também mostrou efeitos
antiproliferativos em células HaCaT.
Os efeitos na cicatrização de feridas in vitro foram avaliados pelo ensaio de
migração celular utilizando um microscópio de tempo real. Este é um modelo preciso e
reprodutível para estudar a cicatrização de feridas monitorando a migração celular durante um
período prolongado.
Como controle positivo, utilizou-se meio suplementado com 2% de FBS (soro
fetal bovino), levando a um fechamento da ferida em 98,7 ± 1,0% após 24 h. Como esperado,
a adição de FBS resultou em uma aceleração significativa do processo de fechamento de das
feridas e, portanto, implicou que o protocolo experimental forneceu resultados confiáveis. O
LY294002, um inibidor de fosfatidilinositol-3-quinase, mostrou uma porcentagem de
fechamento de 6%. Em estudo anterior, foi demonstrado que o LY294002 inibiu claramente a
migração celular em comparação com o grupo controle (Wedler et al., 2016).
Os efeitos do extrato de Pp e do óleo essencial de Cv na migração celular são
comparáveis às células tratadas com o meio e 0,1% de DMSO. Os extratos não afetaram a
migração celular em qualquer concentração testada, uma vez que os valores permaneceram
semelhantes ao controle não tratado após 24 horas.
Para a associação dos extratos, uma resposta sinérgica era esperada de acordo com
o estudo anterior. No entanto, este efeito não foi observado no ensaio de migração celular.
Todas as concentrações testadas (3,25 – 12,5 µg/ml) exerceram efeitos inibitórios sobre a
migração celular.
Para o composto C1, apenas na menor concentração avaliada (6,25 μM), a
migração celular foi significativamente maior, apresentando uma porcentagem no fechamento
137
da ferida de 71,8 após 24 horas de tratamento.
De todas as amostras testadas neste estudo, apenas o α-Humulene exerceu efeitos
significativos sobre a migração celular em todas as concentrações testadas. O fechamento da
ferida foi de 56%; 69% e 88% após 24 horas de tratamento, respectivamente, na presença de
6,25; 12,5 e 25 μM. Concentrações mais elevadas estimularam a migração celular sem efeitos
tóxicos consideráveis como observado no ensaio de ATP.
Sabe-se que a fase inflamatória é um dos estágios mais importantes no processo
de cicatrização. Portanto, a inibição de mediadores pró-inflamatórios pode ser uma
abordagem terapêutica efetiva para regular a progressão do processo de cicatrização de feridas
(Wedler et al., 2014).
O VEGF e a IL-8 desempenham um papel importante na inflamação da pele e são
produzidos por queratinócitos ativados (Takematsu & Tagami, 1993; Viac et al., 1997). O
VEGF também é produzido pela maioria das células inflamatórias, incluindo eosinófilos,
linfócitos, macrófagos e neutrófilos (Taichmann et al., 1997) e desempenham papéis
fundamentais nas três fases da cicatrização de feridas (Stone & Bhimji, 2017). Ambos os
mediadores são super expressos em doenças da pele que estão associadas à angiogênese
aberrante (Pietrazk et al., 2008; Smith et al., 2007; Xia et al., 2003).
No presente estudo, demonstramos que o extrato de Pp, o óleo essencial de Cv, a
associação dos extratos e C1, impulsionaram a produção de VEGF. Pp e Cv apresentaram
uma resposta aumentada dos níveis de VEGF dependente da concentração. A associação e C1
também apresentaram uma resposta aumentada em concentrações mais elevadas. Essas
amostras parecem possuir potentes efeitos angiogênicos, apesar de apresentar respostas
antiproliferativas e anti-migratórias. Na resposta inflamatória mediada por TNF-α a IL-8 em
células HaCaT, todos os diferentes tratamentos diminuíram significativamente os níveis de
IL-8.
Quando as células foram pré-tratadas com α-Humuleno (12,5 e 25 μM), a
secreção de VEGF foi aumentada, comparável ao grupo sem tratamento e estimulado por
TNF-α. No entanto, quando as células foram tratadas com concentrações mais baixas do
composto (6,25 μM), apresentou uma inibição nos níveis de VEGF. O α-Humuleno
apresentou a maior redução na produção de IL-8, concentração dependente, com resultados
mais expressivos do que a hidrocortisona, sugerindo uma forte atividade anti-inflamatória.
Esta inibição não está relacionada a um efeito citotóxico geral, uma vez que a viabilidade
celular em todas as concentrações testadas permaneceu constante ao longo do período de
incubação.
138
O efeito do α-Humuleno na migração celular parece estar relacionado com o
VEGF, pois este fator de crescimento é a molécula de sinalização mais prevalente e específica
para células endoteliais e particularmente estimula a migração e proliferação celular (Frank et
al., 1995; Wilgus et al., 2005), uma vez que as concentrações mais elevadas (12,5-25 μM)
demonstraram um fechamento da ferida de quase 90% e níveis elevados de VEGF.
Este composto também possui ação anti-inflamatória, apresentando uma forte
atividade anti-inflamatória, inibindo a IL-8 estimulada pelo TNF-α em células HaCaT.
Estudos farmacológicos realizados com Cordia verbenacea validaram a atividade anti-
inflamatória, atribuindo esse efeito à presença do α-Humuleno e Trans-Cariofileno isolados
da planta, que inibiu significativamente a expressão da ciclooxigenase (COX-1 e COX-2) e
NO sintase (Fernandes et al., 2007).
Para o nosso conhecimento, nenhum dado foi publicado anteriormente sobre os
efeitos do extrato de Pp, óleo essencial de Cv, C1 e α-Humuleno sobre a migração celular e
sobre a secreção de VEGF e IL-8.
Apesar do α-Humuleno ser um dos principais compostos ativos no óleo essencial
da Cordia verbenacea e está presente em quantidades expressiva no extrato bruto da Pterodon
pubescens, ambos os extratos não demonstraram atividade na migração celular. Os efeitos
anti-inflamatórios moderados de ambos os extratos na produção induzida por TNF-α de IL-8
podem estar relacionados à presença deste composto. Uma resposta sinérgica da associação de
ambos os extratos era esperada, no entanto, não foi observado este efeito nos testes realizados
in vitro, indicando que o efeito sinérgico da associação anteriormente relatada pode estar
relacionado a outro mecanismo de ação.
139
8. CONCLUSÃO
O presente trabalho apresentou novos dados aos estudos com as espécies vegetais
Pterodon pubescens Benth. e Cordia verbenacea DC, contribuindo com parâmetros de
eficácia, segurança e reprodutibilidade, necessários para viabilizar o desenvolvimento de um
produto final.
Os resultados aqui apresentados demonstram que a associação do extrato bruto
dos frutos de Pterodon pubescens Benth. (Pp) com o óleo essencial de Cordia verbenacea DC
(Cv) possui atividades antinociceptivas e anti-inflamatórias sinérgicas, em doses mais baixas
do que os extratos brutos separados, sem demonstrar efeitos colaterais. A inflamação
significativamente inibida sugeriu que a associação tenha um papel na inibição de mediadores
inflamatórios e na via da Prostaglandina E2. Nossos resultados apontam para um possível
sinergismo entre os compostos ativos nas associações, provavelmente atuando em diferentes
receptores farmacológicos. No entanto, estudos adicionais serão necessários para
compreender os mecanismos de ação subjacentes aos efeitos da associação.
Na atividade cicatrizante in vitro, o extrato bruto dos frutos de Pterodon
pubescens Benth. (Pp), o óleo essencial de Cordia verbenacea DC (Cv) e associação de
ambos, inibiram significativamente a proliferação e migração de queratinócitos humanos in
vitro. C1 também apresentou atividade antiproliferativa e inibiu a migração das células
HaCaT em concentrações mais elevadas. Assim, estes compostos apresentam um potencial
uso como um tratamento local contra doenças cutâneas que apresentam hiperproliferação, por
exemplo.
Os estudos in vitro demonstraram a potencial atividade do composto α-Humuleno
na migração de queratinócitos. Sugere-se que o α-Humuleno pode ter uma atividade dupla -
em concentrações mais elevadas (12,5 e 25 μM), os compostos apresentam efeito anti-
inflamatório e angiogênico, enquanto em concentrações mais baixas (6,25 μM), exercem
atividade anti-angiogênica inibindo a migração celular, possivelmente pela prevenção da
secreção de VEGF.
Na atividade anti-inflamatória in vitro, todas as amostras demonstraram inibição
pela via da Interleucina-8, onde o α-Humuleno demonstrou maior atividade. O tratamento
com α-Humuleno pode ser uma estratégia terapêutica potencial para promover a cicatrização
de feridas e para prevenir a inflamação em uma condição inflamatória persistente
140
9. PERSPECTIVAS FUTURAS
Para a compreensão de como a associação dos extratos está agindo na resposta
anti-inflamatória, testes in vitro serão realizados com os extratos separadamente, a associação
e também seus compostos ativos.
Durante este trabalho de doutorado, a padronização e implantação de um modelo
in vitro para a investigação de propriedades anti-inflamatórias, utilizando o macrófago da
linhagem RAW 264.7, foi um dos objetivos iniciais e ainda encontra-se em fase de
desenvolvimento devido à dificuldade de padronização deste modelo.
Posteriormente estes experimentos serão realizados para a dosagem dos níveis de
óxido nítrico e determinação dos níveis de citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF, IL-17A e
IL-10) por citometria de fluxo.
Em adição, um dos compostos testados durante o estágio de pesquisa no
exteriror, demonstrou grande eficácia no teste de cicatrização in vitro (α-Humuleno). Para
complentar o estudo e determinar a ação cicatrizante do composto, serão realizados o teste
de cicatrização in vivo em ratos e a histologia dos tecidos.
141
10. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Dados da presente tese de doutorado contribuíram para elaboração de um pedido
de patente depositado junto a INOVA-UNICAMP no Instituto Nacional de Propriedade
Intelectual (INPI). O trabalho do grupo de pesquisas com a associação da Pterodon pubescens
e da Cordia verbenacea resultou no processo “Composição e formulação a base de
extratos/óleos essenciais de Pterodon pubescens benth. e Cordia verbenacea DC, e usos”.
Processo número: BR 102015012438-4 A2 (Anexo 3). Esta patente também foi depositada
internacionalmente, processo número: PCT/BR2016/000018 (Anexo 4). Este trabalho também
resultou na submissão de uma publicação para a revista Journal of Etnopharmacology, com o
título “Synergistic effect of Pterodon pubescens and Cordia verbenacea plant extracts
association in antinociception and anti-inflammatory experimental models” (Anexo 5).
142
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12. ANEXOS
Anexo 1: Comitê de Ética em Experimentação Animal (nº 3181-1)
160
Anexo 2: Comitê de Ética em Experimentação Animal (nº 4392-1)
161
Anexo 3: Depósito de Patente Nacional
162
Anexo 4: Depósito de Patente Internacional
163
Anexo 5: Submissão de artigo a Journal of Etnopharmacology
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