Transcript
Oleh : Imanuelle Orchidea (3325 10 2413)
Seminar Pra Skripsi
• Latar Belakang; Identifikasi Masalah; Pembatasan Masalah; Perumusan Masalah; Tujuan Penelitian; Manfaat Penelitian
INTRO (Pendahuluan)
Latar Belakang
Genom S.typhi
Identifikasi Masalah
• Bagaimana mengisolasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dari bakteri Salmonella enterica serovar typhi ?
• Bagaimana mengamplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dari bakteri Salmonella enterica serovar typhi ?
• Bagaimana mengkarakterisasi hasil amplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dari bakteri Salmonella entericaserovar typhi ?
• Bagaimana menentukan urutan nukleotida hasilamplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dari bakteriSalmonella enterica serovar typhi ?
• Apakah gen HSP 70 Salmonella enterica serovar typhimemiliki homologi dengan gen HSP 70 bakteri lain?
Pembatasan dan Perumusan Masalah
• Pembatasan Masalah :
– Isolasi, amplifikasi, ,dan sekuensing gen HSP 70 S.typhi berukuran 1,9 kilobasa.
• Perumusan Masalah :
– Bagaimana mengisolasi, mengamplifikasi, mengkarakterisasi, dan menentukan urutannukleotida gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa daribakteri S.typhi ?
Tujuan dan Manfaat Penelitian
• Tujuan Penelitian
– Memperoleh DNA S.typhi, amplikon, hasilkarakterisasi dan urutan nukleotida gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dari bakteri S.typhi.
• Manfaat Penelitian
– Studi awal untuk mengembangkan vaksin demamtifoid menggunakan gen HSP 70 S.typhi
KAJIAN TEORI
• Gejala :
– demam, pusing, lemah, sakit kepala, hilangnyanafsu makan, dehidrasi, diare, dan terkadangdisertai dengan muntah-muntah.
• Masa inkubasi : 1 minggu
• Lama penyakit : ± 6 minggu
• Kingdom : Bacteria
• Filum : Proteobacteria
• Kelas : Gamma Proteobacteria
• Ordo : Enterobacteriales
• Famili : Enterobacteriaceae
• Genus : Salmonella
• Spesies : Salmonella enterica
• Serotipe : typhi
Salmonella enterica serovar typhi
• 1-3,5 µm x 0,5-0,8 µm
• besar koloni rata-rata 2-4 mm
• Fakultatifanaerob/aerob
Hasil Akhir Proses Fagositosis
(1) Degradasi sebagian besar atau seluruh partikel asing atau mikroorganisme.
(2) Partikel atau mikroorganisme yang resisten terhadap degradasi akan ikut beredar ”berkendaraan” fagosit yang melahapnya.
(3) Tetap tinggal dalam sitoplasma tanpa merugikan atau membunuh fagosit.
• Protein : komponen utama metabolisme sel• STRESS mengganggu sintesis protein• RESPON STRESS Heat Shock Protein
• Heat Shock Protein diklasifikasikan berdasarkan sizemolekulnya
• Chaperone [HSP 70 (DnaK), HSP 40 (DnaJ), dan GrpE) :membantu pelipatan protein yang baru disintesis ke bentukmatur, membantu transpor protein melalui membran, membantu pelipatan kembali protein yang terdenaturasi.
• Chaperonin [HSP 60 (GroEL), HSP 10 (GroES) : berperan padaprotein yang misfolding.
• HSP 70 dan HSP 60 bekerja sama sebagai pemandu dalampelipatan protein
• Ditemukan di sitosol, dan mitokondria
HSP 70 S.typhi
• HSP 70 dikode oleh gen HSP 70 (dnaK).
Genom S.typhi
Gen HSP 70
• Nama sistematik : STY0012
• Nama gen : dnaK
• GeneID : 1246523
• Tipe gen : protein coding gene
• Lokasi : kromosom S.typhi 11594-13510 lokus STY0012
• Massa Molekul : 69,231.03------638 aa
• Minute/Centisome (%): 0.24
• Produk : protein DnaK (HSP 70)
• ATGGGTAAAA TTATTGGTAT CGACCTGGGT ACTACCAACT CTTGTGTAGC GATTATGGAT
• GGAACGCAGG CACGCGTGCT GGAGAACGCC GAGGGCGATC GCACTACGCC TTCTATCATT
• GCTTATACCC AGGATGGTGA AACTCTGGTT GGTCAGCCGG CTAAACGTCA GGCAGTGACA
• AACCCGCAAA ACACCCTGTT TGCGATTAAA CGCCTGATTG GCCGCCGCTT CCAGGACGAA
• GAAGTTCAAC GTGACGTTTC TATCATGCCG TACAAAATCA TCGGCGCCGA CAACGGCGAC
• GCATGGCTTG ATGTGAAAGG TCAGAAAATG GCGCCGCCGC AGATTTCTGC CGAAGTGCTG
• AAGAAAATGA AGAAAACGGC TGAAGATTAT CTGGGCGAAC CGGTAACTGA AGCGGTTATC
• ACCGTACCGG CTTACTTTAA CGATGCGCAG CGTCAGGCTA CCAAAGATGC TGGTCGTATC
• GCGGGGCTGG AAGTTAAACG TATCATCAAC GAACCGACTG CCGCAGCGCT GGCTTACGGT
• CTGGATAAAG AAGTCGGCAA CCGTACTATC GCGGTTTACG ACCTCGGTGG TGGTACTTTC
• GATATCTCTA TTATCGAAAT CGACGAAGTT GATGGCGAAA AAACCTTTGA AGTTCTGGCA
• ACCAACGGTG ATACCCACCT GGGTGGTGAA GACTTCGATA CCCGCCTGAT CAACTACCTC
• GTTGACGAGT TTAAGAAAGA TCAGGGCATC GACCTGCGTA ACGATCCGCT GGCCATGCAG
• CGCCTGAAAG AAGCCGCAGA AAAAGCCAAA ATCGAGCTGT CTTCTGCGCA GCAGACCGAC
• GTGAACCTGC CGTACATTAC CGCAGATGCC ACCGGTCCGA AACACATGAA CATCAAAGTG
• ACCCGTGCGA AACTGGAAAG CCTGGTTGAA GATCTGGTGA ACCGTTCTAT CGAGCCGCTG
• AAAGTCGCAC TGCAGGACGC TGGCCTGTCC GTGTCTGATA TCAACGACGT GATCCTCGTC
• GGCGGTCAGA CCCGTATGCC AATGGTGCAG AAAAAAGTGG CTGAGTTCTT CGGTAAAGAG
• CCGCGTAAAG ACGTTAACCC GGACGAAGCT GTGGCTATCG GCGCAGCGGT ACAGGGCGGC
• GTATTGACCG GTGATGTGAA AGACGTACTG CTGCTGGACG TTACCCCGCT GTCTCTGGGT
• ATCGAAACGA TGGGTGGCGT GATGACTCCG CTTATCACCA AAAACACCAC CATCCCGACC
• AAGCACAGCC AGGTGTTCTC TACTGCGGAA GACAACCAGT CTGCGGTAAC CATCCATGTG
• CTGCAGGGTG AGCGTAAACG TGCGTCTGAT AACAAATCTC TGGGTCAGTT CAACCTGGAT
• GGCATCAACC CGGCGCCGCG CGGTATGCCG CAGATCGAAG TCACCTTCGA TATCGATGCT
• GACGGTATCC TGCACGTCTC CGCGAAAGAT AAAAATAGCG GTAAAGAGCA GAAGATCACT
• ATCAAGGCGT CTTCTGGTCT GAACGAGGAA GAAATTCAGA AAATGGTTCG CGATGCAGAA
• GCGAACGCTG AATCCGACCG TAAGTTCGAA GAGCTGGTTC AGACCCGTAA CCAGGGTGAC
• CATCTGCTGC ACAGCACCCG TAAGCAGGTT GAAGAAGCAG GCGATAAACT GCCGGCTGAT
• GACAAAACCG CTATCGAGTC TGCGCTGAGC GCGCTGGAAA CTGCCCTGAA AGGCGAAGAT
• AAAGCCGCTA TCGAAGCGAA AATGCAGGAG CTGGCGCAGG TTTCCCAGAA ACTGATGGAA
• ATCGCTCAGC AGCAACATGC GCAGCAGCAG GCTGGCTCCG CCGACGCTTC TGCAAACAAT
• GCGAAAGATG ACGACGTTGT CGACGCTGAG TTTGAAGAAG TAAAAGATAA AAAATAA
• Perusakkan dan pembuangan dinding sel,
• Lisis sel
• Pembuangan debris sel, serta
• Pemisahan DNA dari protein dan RNA.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Primer
• Primer HSP 70 F : 5’-GGA TCC GGT AAA ATT ATT GGT ATC GAC-3’.
• Primer HSP 70 R : 5’-AAG CTT TTA TCT TTT ACT TCT TCA AAC TC-3’.
Karakterisasi Hasil Isolasi dan Produk PCR
• Menggunakan elektroforesis gel agarosa
Tujuan Operasional• Memperoleh biakan bakteri Salmonella enterica
serovar typhi dalam medium padat dan cair
• Memperoleh DNA Salmonella enterica serovar typhi
• Memperoleh amplikon gen HSP 70 S.typhi denganPolymerase Chain Reaction
• Mendapatkan hasil karakterisasi gen HSP 70 S.typhimenggunakan elektroforesis gel agarosa
• Memperoleh gen HSP 70 S.typhi terpurifikasi danurutan nukleotida gen HSP 70 S.typhi berukuran 1,9 kilobasa
Tempat dan Waktu Penelitian
• Tempat : Laboratorium Biokimia-BioteknologiFMIPA UNJ . dan Laboratorium MikrobiologiFMIPA UNJ,
• Waktu : Desember 2013-Maret 2014.
Metode : EKSPLORATIF
INSTRUMENTASI PENELITIAN
Peralatan dan Bahan yang Dibutuhkan
• Pembiakkan bakteri :– petri dish, pipet serologi, gelas kimia, tabung
reaksi,labu erlenmeyer, tabung reaksi, hot plate stirrer, jarum ose steril, pembakar bunsen, autoklaf, orbital shaker, dan laminar airflow.
– akuades , medium Salmonella-Shigella Agar danNutrient Broth
• Pembuatan glycerol stock:– Pipet serologi, pipet mikro, tabung ependorf steril– Glycerol, overnight culture S.typhi
• Isolasi genom S.typhi– tabung mikro 1.5 mL, Pipet mikro dengan tip steril,
berukuran 0.5-10 µL, 20-200 µL, dan 100-1000 µL, mikrosentrifuse, vortex, water bath 37oC dan 80oC, laminar airflow, dan lemari pendingin
– Overnight culture S.typhi , kit Wizard (Promega), etanol70%, dan isopropanol.
• Amplifikasi Gen HSP 70 S.typhi– tabung mikro steril 100 µL, pipet mikro 0.2-20 µL
dengan tip steril, thermal cycler, lemari pendingin.
– genom bakteri, kit PCR, dan primer.
Peralatan dan Bahan yang Dibutuhkan
Peralatan dan Bahan yang Dibutuhkan
• Karakterisasi dan Purifikasi Produk PCR
– kit elektroforesis gel agarosa, kit purifikasi, pipetmikro 0.2-20 µL dengan tip steril, UV transluminator, dan alat dokumentasi.
– produk PCR, DNA Ladder (Promega), Loading Dye 6x (Promega), buffer Tris Asetat EDTA 1x (Promega), gel agarosa 2 % (1 gram agarosa dan50 mL buffer TAE 1x), etidium bromide 0.1% (Promega )
PROSEDURPENELITIAN
1. Pembiakkan bakteri S.typhi pada medium padatdan cair
2. Pembuatan glycerol stock bakteri S.typhi
3. Isolasi genom bakteri S.typhi dengan kit Wizard dan Karakterisasinya
4. Penyiapan primer gen HSP 70
5. Amplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa
6. Karakterisasi hasil amplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kilobasa dengan elektroforesis gel agarosa
7. Purifikasi hasil amplifikasi gen HSP 70 dengan kit
8. Sekuensing dengan metode dideoxy Sanger
Pembiakkan S.typhi pada Medium Padat
Sterilisasi peralatan gelas(petri dish, erlenmeyer,
pipet,dll)
Petri dish steril
Membuat medium agar, dituangkan ke dalam petri dish,
dibiarkan mengeras
Biakan S.typhi pada agar miring
Digoreskan secara zig-zag padamedium agar steril
Inkubasi selama 16-18 jam pada 37oC
Diambil dengan jarum ose steril
dilakukan dalam laminar airflow
Pembiakan S.typhi pada Medium Cairdan Pembuatan Glycerol Stock
Biakan S.typhi pada SS Agar
Dicelupkan ke dalam 5 ml Medium cair Nutrien
Broth steril
Inkubasi selama 16-18 jam pada 37oC dengan aerasi
shaker 150 rpm
Overnight culture bakteriS.typhi dalam medium cair
Diambil dengan jarum ose steril
800 µL Overnight culture bakteri S.typhi dalam
medium cair
+
200 µL filter-sterilized glycerol
Dimasukkan ke tabung eppendorf 1 ml
Dihomogenkan laluDisimpan pada suhu -80oC
Isolasi genom bakteri S.typhi dengankit Wizard dan karakterisasinya
1 ml Overnight culture S.typhi
tabung mikrosentrifuse eppendorf steril 1,5 ml
Sentrifugasi 2 menit pada 13,000-16,000 g
Pellet sel Supernatan
+ 600 µL Nuclei Lysis Solution
Beaker glass berisidesinfektan
Dihomogenkan dengan pemipetan naik turun
Diinkubasi pada 80oC
Setelah homogen
Didinginkan
+3 µL RNase Solution
Tabung ditutup, dibolak-balikkan 2-5x
Diinkubasi pada 37oC selama 15-60 menit
Didinginkan kembali pada suhu kamar
+200 µL Protein Precipitation Solution
Divortex 20 detik Diinkubasi 5 menit dalam es
Sentrifugasi 3 menit pada 13,000-16,000 g
Pellet sel/ residu proteinSupernatan
Supernatan
Tabung eppendorf steril berisi isopropanol pada suhu kamar
Dibolak-balik hingga benang-benang DNA nampak
Sentrifugasi 2 menit pada 13,000-16,000 g
SupernatanPellet DNA
Dicuci dengan 600 µL etanol 70%
Tabung ditutup, dibolak-balikkan 2-5x
Dikeluarkan
Tabung dikeringkan
Sentrifugasi 2 menit pada 13,000-16,000 g (dapat diulang 2-3x)
Pellet DNA Supernatan
Pellet DNA
Dikeringanginkan 10-15 menit
+100 µL DNA Rehydration Solution
inkubasi 60 menit, pada 65o
homogenisasi selama inkubasi dengan tapping the tubeatau dapat juga diinkubasi semalam pada suhu kamar atau pada suhu 4oC
Hasil Isolasi DNA disimpan pada suhu 2-8oC
Karakterisasi Hasil Isolasi Genom S.typhi
Hasil Isolasi genom bakteri
Elektroforesis gel agarosa 1% dengan pewarna etidium bromide 0,1%
Dikarakterisasi dengan
Tahap Pembuatan Gel Agarosa 1 %
25 ml Tris Asetat EDTA 10x + 225 ml akuades
Buffer TAE 1x bubuk agarosa
Diambil 40 ml Ditimbang 0,4 gram
40 ml Buffer TAE 1x + 0,4 g bubuk agarosa
dididihkan didinginkan hingga 60oC
+ 2 µL etidium bromida
Larutan agarosa
Dituang ke dalam baki gel agarosa yang dilengkapi comb
Dibiarkan hingga gel menjadi padat
Comb diambil dengan hati-hati dari gel agarosa
Baki gel agarosa
Direndam dalam
Tahapan elektroforesis
300 ml larutan buffer TAE 1x
Tangki elektroforesis Baki gel agarosa
Dimasukkan ke
Sumur
Sumur 1
5 µL DNA genom bakteri + 2 µL Loading Dye Buffer 1x
5 µL DNA Ladder 100 bp + 1 µL Loading Dye Buffer 6x + 4 µL akuabides steril
Perangkat elektroforesis siap
Dialiri listrik 100V 30’ / 80V, 60’ / 70V, 90’
Hasil divisualisasi dengan UV transluminator 260 nm
Penyiapan Primer
• Primer HSP 70 F : 5’-GGA TCC GGT AAA ATT ATT GGT ATC GAC-3’.
• Primer HSP 70 R : 5’-AAG CTT TTA TCT TTT ACT TCT TCA AAC TC-3’.
Dimasukkan ke
Amplifikasi gen HSP 70 berukuran 1,9 kb
Pasangan primer HSP 70 @ 1,25 µL+Master Mix PCR 12,5 µL+Nuclease free water 9 µL+Sampel DNA genom bakteri 1 µL
Tabung PCR
Thermal cycler (35 siklus)
Denaturasi (95oC, 1 menit)
Annealing(57,5oC, 1menit)
Elongasi(72oC, 1menit)
Pemantapan produk(72oC, 1menit)
Karakterisasi Hasil Amplifikasi Gen HSP 70 Berukuran 1,9 Kb
Gen HSP 70 S.typhi 1,9 kb produk PCR
Elektroforesis agarosa 2%
(dibuat sesuai prosedur sebelumnya, takaran agarose gel dilipatduakan)
Pewarna EtBr 0,1%
Elektroforesis dilakukan pada 80 Volt selama 1jam
Visualisasi dengan lampu UV 260 nm
Purifikasi Hasil Amplifikasi Gen HSP 70 dengan Kit
Tabung eppendorf kosong Ditimbang, didapatkan mo
Gel agarosa berisi DNA Dipotong, dimasukkan ke tabungeppendorf kosong, ditimbang,
diperoleh m1Berat gel = m1-m0
+membrane binding solution 10 µL : 10 mg gel
Divortex periodik, inkubasi 10 menit @50-65oC
Sentrifugasi pada suhu kamar Larutan gel
Larutan gel SV minicolumn pada collection tube Inkubasi 1 menit
Sentrifugasi pada 16,000 gSV minicolumn dipindahkan dari Collection tube
Cairan pada Collection tube dibuang SV minicolumn dipasang lagi
Kolom dicuci dengan 500µL membrane wash solution dalam EtOH 95%
Sentrifugasi 1 menit pada 16,000 g
Collection tube dikosongkan, sentrifugasi 60s
SV minicolumn dipindah ke eppendorf tube steril
+50µL nuclease free waterDiinkubasi 1menit, Sentrifugasi 1 menit
pada 16,000 g
SV minicolumn dikeluarkan, eppendorf tube berisi DNA disimpan pada suhu -21 – 4oC
Sekuensing dengan metode dideoxySanger
• Keterangan : Sampel dikirim ke Macrogen, Korea untuk disekuensing
Sekuensing dengan automated sequencer
Kromatogram hasil sekuensing
Analisis ke bentuk FASTA
Analisis BLAST
Vielen Dank für Alles !
top related