Qu’est ce que Caenorhabditis elegans ?. Movie crawling worms.

Qu’est ce que Caenorhabditis elegans ?

Movie crawling worms

http://www.wormatlas.org/

http://www.wormatlas.org/

Coupe transversale d’un nématode adulte

46 hr at 20°C

http://www.wormatlas.org/

Cycle de vie de C. elegans

Les différents stades larvaires de C. elegans

http://www.wormatlas.org/

Les males sont minoritaires car issus d’une erreur durant la méiose

Pourquoi utiliser C. elegans comme modèle en biologie ?

Petite taille TransparentTemps de génération rapideLignage cellulaire invariant et identifié

imag

e ta

ken

from

htt

p://

ww

w.D

evge

n.nl

0.1 mm

Lignage cellulaire invariant

959 cellules chez l’hermaphrodite

Reconstruction du système nerveux par coupe sériée en EM

Système nerveux de la larve L1

LocomotionMécanosensationChemosensationThermosensation

Système nerveux de l’hermaphrodite adulte302 neurones…30 % des cellules

Petite taille TransparentTemps de génération rapideLignage cellulaire invariant et identifiéAuto-fertilisationPopulation clonale Congélation

imag

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evge

n.nl

0.1 mm

-80°C

-196°C

Congélation

3 jours

Les souches de C. elegans peuvent êtres conservées par congélation

Petite taille TransparentTemps de génération rapideLignage cellulaire invariant et identifiéAuto-fertilisationPopulation clonale Congélation Carte génétiqueSéquence génomique

imag

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from

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n.nl

0.1 mm

Carte génétique: basée sur les fréquences de recombinaisons

Movie dpy worms

Movie rol worms

Movie wt worms

Carte Physique et Séquence génomique

Distances entres les gènes en nucléotides et annotations selon les

homologies

11 dec 1998

Séquence Génomique

24 mars 2000

15 fev 2001

Le génome de C. elegans

Taille du génome Estimation du nombre de gènes*

Megabases (Mb)

C. elegans

*gènes codant des protéines

42% des gènes de C. elegans ont des homologues dans d’autres especes dont l’Homme

97 Mb 20000Human3000 Mb 32000

Drosophila 160 Mb 13000Yeast (S. cerevisiae) 12 Mb 6000

1-mutagenèse pour phénotype d’intérêtMutagenèse à saturation avec agents mutagènes :-chimique (EMS)-Energie (UV)- physique (transposon)

2-obtention d’un mutantprincipe de crible pour un phénotype donné

3-clonage du gène

GENETIQUE CLASSIQUE forward

Petite taille TransparentTemps de génération rapideLignage cellulaire invariant et identifiéAuto-fertilisationPopulation clonale Congélation Carte génétiqueSéquence génomiqueTransgénèse aisée

imag

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n.nl

0.1 mm

Micro-injection de C. elegans

Plasmides Phages

Cosmides YACs

Lignée transgénique5 jours

1 mm

Une lignée transgénique de C. elegans…

Le trieur de nématodes de U B I

Traitement des objets dans le flux

Embryos

L1 Larvae

L2 Larvae

Adults off-scale

Graphique en Dot Plot

Length

Opti

cal d

en

sity

Exemple de données traitées par le profiler

Double transgenic

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

1 23 45 67 89 111 133 155 177 199 221 243 265 287TOF

GREEN

Petite taille TransparentTemps de génération rapideLignage cellulaire invariant et identifiéAuto-fertilisationPopulation clonale Congélation Carte génétiqueSéquence génomiqueTransgénèse aiséeARN interférence

imag

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from

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evge

n.nl

0.1 mm

ARN double brin correspondant à la GFP

F1

F0

F0

ARN interférence chez C. elegans; inactivation spécifique d’un gène chez l’animal et sa progéniture

Les animaux mangent les bactéries et prennent en charge

les ARN doubles brins

ARN interférence par “nourriture”

Phénotype de perte de fonction dans la progéniture

Timmons and Fire, Nature 1998

GENETIQUE reverse

Génome connu :Analyse globale d ’expression par microarray

Filtres miniatures ou lame de verre (chip) représentant l’ensemble des gènes de C. elegans

Le principe de conservation

Il existe chez tous les êtres vivants des mécanismes communs tels que la production d’énergie, la réplication de l’ADN ou le transport des molécules.

Il est par conséquent possible d’étudier ces processus en utilisant des organismes modèles faciles à manipuler.

Ces processus étant conservés entres les espèces, les résultats obtenus avec le modèle seront transposables à d’autres êtres vivants tels que l’homme.

Concernant les eucaryotes, il existe des modèles phares tels que la levure, le nématode, la drosophile et la souris.

Quelles sont les domaines de la biologie utilisant C. elegans ?

Neurosciences

C. elegans répond à une grande variété de molécules volatiles ou solubles, il peut être attiré ou repoussé

1-Octanol

Diacetyl

Quelles sont les circuits neuronaux impliqués dans ces comportements ?

Questions

Stratégies

Ablation de certains neurones au laser et étude du comportement

Les neurones chémosenseurs AWA(L/R) sont nécessaires à l’attraction par le diacetyl

Quels sont les récepteurs et les voies de signalisation impliqués ?

Questions

Stratégies

Crible génétique pour obtenir des mutants ne répondant plus au diacetyl

AWA AWB

AWA AWB

AWA AWB

Attiré par

diacétyl

Repoussé par

diacétyl

ODR-10

wt

Mutant odr-10

Ectopic odr-10

Identification de la protéine ODR-10 présente dans les neurones AWA

ODR-10 est le récepteur au diacetylAWB est nécessaire pour répondre au 1-Octanol

Développement

La division cellulaire asymétrique est nécessaire à la

spécification des tissus et des organes

P0 P1 AB

La division cellulaire asymétrique est nécessaire à la spécification des tissus et des organes

Movie wt embryo

La division cellulaire asymétrique est nécessaire à la spécification des tissus et des organes

Comment cette division asymétrique est régulée ?

Questions

Stratégies

Crible génétique pour obtenir des mutants présentant des divisions symétriques

Movies par mutants

Première division symétrique chez les mutants par

La répartition asymétrique de certaines protéines permet la division asymétrique de la

première cellule

PAR-2::dsRED

PAR-6::GFP

La répartition asymétrique de certaines protéines permet la localisation asymétrique de

déterminants cellulaires

L’apoptose ou Mort Cellulaire Programmée (PCD)

(A) (B)

Pour le développement correct des êtres vivants, certaines cellules doivent disparaitre

Les plantes

carcasses

vaisseaux

sève

L’œil

protéine claire cristalline

carcasses

lentille

L’épiderme

kératine

carcasses

corne

L’apoptose est importante pour différents aspects du développement

L’apoptose est nécessaire au maintient de l’intégrité de l’organisme

Rayonnements, Produits oncogènes

Cellule saine répondant aux

signaux extérieurs

Cellule cancéreuse agissant de manière

anarchique

Apoptose

Cellule apoptotique

Cellule en conditions normales

PS PSPS

PSPSPS

PSR

Macrophage

PSPS

PSR

PS

La phagocytose permet d’éliminer les cellules apoptotiques

Reconnaissance des cellules apoptotiques par les cellules phagocytaires

Stress, décision développemental

Chez C. elegans, l’apoptose n’est pas essentielle dans les conditions

de laboratoire

Les neurones HSN disparaissent par apoptose dans l’embryon mâle

Les corps apoptotiques sont facilement détectables dans l’œuf et leur nombre est invariant

Comment l’apoptose est régulé ?

Questions

Stratégies

Crible génétique pour obtenir des mutants conservant des cellules devant mourir au cours du développement

Crible génétique pour obtenir des mutants présentant un excès de corps apoptotiques

EGL-1

CED-9 CED-4

CED-3

CED-3

Bcl-2 Apaf-1

Pro-Caspase 9

Caspase 9

Phase d’initiation de la mort cellulaire

BH3

Phase d’initiation de la mort cellulaire: rôle des caspases initiatrices

Dégradation des protéines, cytosquelettes, organisation cellulaire

Phase d’exécution

Dégradation de l’ADN Dégradation des protéines

Phagocytose des corps apoptotiques

nucléases protéases

Voies génétiques de l’apoptose chez C. elegans

Source: wormbook.org

Voies génétiques de l’apoptose chez les mammifères

Virus, Cellules cancéreuses et apoptose

Bcl-2

Bcl-2

Translocation du gène Bcl-2 dans une région enhancer pour la production d ’anticorpsex : certaines leucémies de type B

Bcl-2Bcl-2

Bcl-2

Bcl-2

Bcl-2si

tumeur agressive

Apaf-1

Inhibition de l ’expression du gène codant pour Apaf-1ex : mélanome (le plus dangereux des cancers de la peau)

siApaf-1

tumeur agressive

Bcl-2Bcl-2

Bcl-2 Bcl-2

Apaf-1

Apaf-1

Apaf-1Apaf-1

Apaf-1

L’ARN interférence, première observation

?

Transgene silencing…

Lié au nombre de copies du transgène

Les travaux chez C. elegans ont montré que les siRNA provoquent la dégradation des

mRNA correspondant

D’autres ARN particuliers, les microARN (miARN) sont impliqués dans le développement chez C. elegans

La transcription des gènes lin-4 et let-7 produit des ARN non-codants

Les miARN régulent d’autres ARNm

Les miARN se fixent sur les 3’UTR des ARNm

Cette interaction bloque la traduction de l’ARNm

Les implications de l’ARN interférence

Inactivation spécifique d’un gène par introduction d’ARN double brins…

Etude de ce gène en laboratoire

Thérapie génique

Thérapie antivirale (les virus se défendent de l’ARNi donc…)

Pathogen Host

Virulence factors Defence mechanisms

Gram-positive bacteria:Bacillus thuringiensisEnterococcus faecalisListeria monocytogenesMicrobacterium nematophilumStaphylococcus aureusStreptococcus pneumoniae

Fungi:Arthrobotrys sp.Candida albicansCryptococcus neoformansDrechmeria coniosporaDuddingtonia flagransPaecilomyces lilacinus

Gram-negative bacteria:

Acinetobacter baumanniiAeromonas hydrophilaAgrobacterium tumefaciensBurkholderia cepaciaB. thailandensisB. pseudomalleiErwinia christamthemiE. carotovora carotovoraEscherichia coli (EPEPC & EHEC)

Pseudomonas aeruginosaP. fluorescensSalmonella typhimuriumShewanella frigidimarinaS. massaliaSerratia marcescensVibrio choleraeYersinia spp.

Known pathogens of C. elegans

VIRUSES

How to use C. elegans to study virulence?

Forward genetic screens for attenuated mutants

Screening protocol

Synchronized worms

96, 24 or 6 well plates

Identification of less virulent clones

n individual clones

Infection

Bank of bacterialMutants (transposon)

2000 mutants screened in C. elegans 8 mutants

Decreased virulence in:

Arabidopsis 6

PA14 Universal virulence factors

7

Wax moth 6

Mahajan-Miklos et al. (2000) Mol. Microbiol.

C. elegans to identify new antimicrobials

Candidate genesGenetic screens

Microarrays

Host

Defence mechanisms?

Antifungal innate immunity

Drechmeria coniospora spores adhere to the nematode cuticle

Drechmeria coniospora spores adhere to the nematode cuticle

0

50

100

0 12 24 36 48 60

Time (Hours)

% w

orm

s a

live

D. coniospora kills worms

0

50

100

0 12 24 36 48 60

Time (Hours)

% w

orm

s a

live

Microarrays

nlp and Caenacin peptide genes are induced

Couillault et al. 2004

Antimicrobial peptide genes

+ NLP-31

Induction of nlp-29 after Drechmeria infection

Pathogen

GFPpnlp-29RFPpcol-12

constitutive inducible

Is7 transgenic strain

InfectedNon-infected

Control

Blocking induction of pnlp-29::gfp

tir-1 (RNAi)