Qrt pcr final
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MÉTODOS DE ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA
QRT-PCR(real time PCR, quantitative pcr)
Real Time PCRTécnica de laboratorio usada para reproducir
segmentos ácidos nucleídos
mediante un proceso cíclico,
que genera gran cantidad de copias
que pueden ser usadas en
estudios o análisis posteriores
PCR
Cuantificación extremadamente
difícil, ya que la PCR da origen a la
misma cantidad de producto
independientemente de la cantidad
inicial de moléculas de DNA presente en
las muestras
Limitaciones
- Higuchi et al- Producto es monitoreado durante el curso de la reacción y no en el punto final (end point)- Sondas fluorescentesQRT-PCR
PCR En Tiempo Real
Técnica de amplificación y cuantificación de ADN y ARNm que utiliza tecnologías fluorescentes para evidenciar la amplificación de una secuencia corta
sistemas fluorescentes
agentes intercalantes
sondas de hidrolisis y de hibridación
sondas Taqman
Sondas molecular Beacons
Sondas FRET
Agentes Intercalantes
Fluorocormos que aumentan su fluorescencia cuando se unen a una
doble cadena de DNA
SYBR Green
Ventajas Desventajas
Facilita las condiciones de
optimización y es mas barato que las sondas especificas
Unión inespecífica a cualquier doble cadena de DNA y
también a los dímeros de cebadores
(fluorescencia inespecífica)
Soluciones
Fundamento: Curva De Fusión
(melting curve)
Diferentes moléculas de DNA de doble cadena
se abren a diferente
temperaturas
Factores
Concentración de guanina y citosina
La longitud de fragmento de amplificación
Estructura secundaria y terciaria
Factores químicos que
hacen parte de los componentes
de reacción
Buen diseño de los cebadores y condiciones optimas de
reacción
Desventajas
SONDAS DE HIDRÓLISIS Y DE HIBRIDACIÓN
1. Las sondas Taqman2. Sondas Molecular Beacons3. Sondas FRET
Sondas TaqMan
Oligonucleótidos lineales que son etiquetados con un fluorocromo donador (reporter) en la porción 5’ como FAM (6-carboxifluoresceína) y un aceptor (quenber) en la porción 3’ como TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
Dependen de la actividad 5’ nucleasa de la Taq ADN polimerasa para su ruptura durante la síntesis de una nueva hebra.
El lugar en el que anilla la sonda
fragmento de amplificación o secuencia blanco
Antes que los cebadores
Señal emitida se genera
Cada amplicon nuevo sintetizado
Sonda Molecular Beacons Oligonucleótidos de cadena simple zona de apareamiento de bases interna No dependen de su hidrólisis para generar la señal fluorescente
Forman una horquilla (harpin)
La emisión de
fluorescencia se da
durante la etapa de
anillamiento
la sonda se linealisa lo
que permite que los
fluorocromos se separen
el donador emita su señal la cual es
detectada por el
equipo.
La sonda FRET
Se compone de dos sondas que se
unen específicamente a
secuencias del ADN blanco.
Una de la sonda lleva una molécula
donadora en su porción 3’ y la otra
lleva un aceptor en su porción 5’
La fluorescencia
emitida es directamente proporcional al aumento de ADN en cada ciclo
Cuando la sondas se
anillan al ADN blanco, estas
se unen
se excitar a la molécula
donadora en una longitud
de onda determinada
se da la trasferencia de energía
hacia el aceptor que absorbe la
energía emitida por el donador y la emite en otra longitud de
onda
Definiciones sobre análisis de Datos
En PCR en tiempo real se deben manejar una serie de conceptos relacionados con el análisis e interpretación de graficas generadas por el software luego de un proceso de amplificación.La curva de amplificación
Componentes
Fase inicial o background
Fase exponencial
Fase de meseta o plateau
Línea base (baseline)
• Nivel basal de la fluorescencia emitida
• Definido durante los primeros ciclos de la PCR
• Programada en cada software de PCR en tiempo real
Umbral (threshold)
• Es el punto de corte de la fluorescencia por encima de la línea base
• A partir de esta línea de corte se calcula los valores de Ct
Ct o CP (threshold cycle)
• Refleja el punto en el cual un numero suficiente de amplicones se ha acumulado dentro de la reacción y se presenta un crecimiento exponencial
Eficiencia de la PCR en tiempo real
Parámetro que permite establecer la confiabilidad de la estimación del numero de copias y se debe calcular para cada reacción.
Directamente en el software.
Debe estar entre el 90 y el 100%
Doble de moléculas de DNA que en el ciclo anterior
Estrategias de Cuantificación
Establecer un numero relativo
de copias cuando se utiliza un gen
de referencia.
cuantificación relativa (expresión de un gen determinado en un momento estableció
del ciclo celular)
cuantificación absoluta (numero exacto de copias
de un gen)
Cuantificación RelativaMétodo mas sensible para la detección y cuantificación de
niveles de expresión de genes a partir de muestras pequeñas
de tejido
Depende de una RT-PCR en tiempo real (retro transcripción o kinetic RT-PCR)
mide el cambio relativo en los niveles de expresión de
ARNm y se basa en comparar los niveles de
expresión de una muestra problema frente a un gen
constructivo
Cuantificación Absoluta
Son altamente reproducibles y permiten generar datos específicos y sensibles.
Controles y Contaminación
Control Negativo de Extracción
•Muestra negativa a la que se realiza todo el proceso de extracción.•No debe generar curva de amplificación.
Control Positivo de Reacción
•Muestra positiva a la que se realiza todo el proceso de extracción.•Debe generar curva de amplificación.
Control sin DNA (NTC) con solo
mezcla de reacción.
•Es muy importante incluir los NTCs siempre en cada reacción para asegurar que lo que se esta midiendo no corresponde a algún tipo de contaminación.
Instrumentación
El equipo necesario:1. Termociclador2. Lector de fluorescencia3. Filtros 4. Fuente lumínica (lámpara halógena, LED
o un laser)
TERMOCICLADOR• Permite el análisis de los datos
para reportar la cuantificación, análisis de curvas de fusión y la discriminación alélicas
LECTOR DE FLUORESCENCIA• Es una seria de componentes que
colectan la luz a través de varios dispositivos ópticos que permiten el paso y la salida de la luz visible sobre el tubo de reacción gracias a un grupo de filtros que detectan todo el rango de la luz visible.
FUENTE LUMINICA • Genera las longitudes de onda
requeridas para excitar los fluorocromos utilizados en la PCR
Aplicaciones• Identificar pequeñas
mutaciones o polimorfismos en genes
causantes de enfermedades heredadas.
1.
•La utilización de las curvas de fusión para el genotipaje, ya
que cada fragmento generado tendría diferente tamaño y
por ende, diferente Tm.
2.
•En la detención de patógenos de importancia medica, con gran
énfasis en ensayos cuantitativos para virus, bacterias, levaduras
y parásitos protozoos.
3.
• En oncología ya que se requiere de pequeñas
cantidades de tejido y es útil en ensayos de amplificación y
expresión de genes, duplicación y delección
genética
4.
• en la detección de mutaciones puntuales,
diagnostico, seguimiento y respuesta
al tratamiento.
5.
• Monitorización para la seguridad de alimentos, bioterrorismo, en la área de biotecnología, etc.
6.VIDEO
Conclusiones
Permite obtener resultados reproducibles, confiables, rápidos y ofrece gran cantidad de aplicaciones.
Facilita la cuantificación de ADN y ARN sea mas precisa ya que se utilizan curvas estándar y los resultados se basan en la obtención de los valores de Ct
Algunas complicaciones se pueden solucionar si se tiene un experimento diseñado y realizado rigurosamente y con lo controles adecuados.
Articulo de Aplicacion
Detección cuantitativa del virus psorosis de cítricos mediante RT–PCR tiempo real
Quantitative diagnosis of citrus psorosis virus by real time RT–PCR
Implementar un protocolo de RT–PCR tiempo real para la detección del CPsV y determinar concentración viral en hojas de árboles de naranja Mars afectados por psorosis en el Estado de Nuevo León (NL), México.
¡Gracias!
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