PAOLA ANDREA CARO HERNÁNDEZ Microbióloga Industrial PhD.

PAOLA ANDREA CARO HERNAacuteNDEZPAOLA ANDREA CARO HERNAacuteNDEZMicrobioacuteloga Industrial PhDMicrobioacuteloga Industrial PhD

httpwwwtaringanetpostsciencia-educacion5359230La-ciencias-naturales-en-T_html

iquestCual fue la primera interaccioacuten microbio-hospedador conocida

Margulis L Sagan D Acquiring genomes A theoryof the origins of species New York NYBasic Books2002

Margulis y la teoriacutea endosimbioacutetica

Infect Immun 2000686511-6518Host-pathogen interactionsbasic concepts of microbial commensalism colonizationinfection and disease Casadevall A Pirofski L

Interacciones hospedador-microorganismo en elcontexto de la patogenia microbiana

Traducido y modificado de Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D

Infeccioacuten croacutenica bacteriana

Primer contacto con la ceacutelula hospedadora

Adherencia e invasioacuten

Vida en el medio ambiente

Establecimiento dentro de la ceacutelula hospedadora

Evitando la defensa del hospedador

Establecimiento dentro de la ceacutelula hospedadora

Adaptacioacuten al medioambiente

Extendiendo el nichoModulando la biologiacutea

del hospedador

Extendiendo el nichoMultiplicacioacuten y supervivencia en el nicho de replicacioacuten

Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D

α-Proteobacterias patoacutegenas

Brucella melitensis

Brucella suis

Brucella abortus

Brucella canis

Brucella ovis Brucella neotomae

Brucella cetiBrucella pinnipedialis

Brucella microti

Geacutenero Brucella spp

Factores de virulencia involucrados con la interaccioacuten Brucella-ceacutelula hospedadora

virB

OMPs

Med Microbiol Immunol 2009 Nov198(4)221-38 Epub 2009 Sep 22 Survival of the fittest how Brucella strains adapt to their intracellular niche in the host Roop RM 2nd Gaines JM Anderson ES Caswell CC Martin DW Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N

La envoltura ceacutelular de Brucella spp

Int J Microbiol 20102010124509 Epub 2010 Dec 1Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-12-Glucans in Brucella-Mammalian InfectionsHaag AF Myka KK Arnold MF Caro-Hernaacutendez P Ferguson GP

OMP

B ovisB ovisProteiacutenas de membrana externaProteiacutenas de membrana externa

(OMPs) (OMPs)

Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podriacutean tener mayor relevancia en

el proceso infeccioso

Omp31bOmp31b

Omp25bOmp25b

Omp25dOmp25d

Omp25Omp25cc

Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)

Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31

(Salhi et al 2003)

2525 100100

25b25b 3838 100100

25c25c 3939 6565 100100

25d25d 4141 5858 6060 100100

3131 3030 3535 3737 3636 100100

31b31b 2929 3838 3636 3737 6767 100100

2222 2525 2424 2323 2424 2626 2626 100100

OmpsOmps 2525 25b25b 25c25c 25d25d 3131 31b31b 2222

pIpI 6666 4646 4646 9292 5151 4848 8181

Identidad

Omp25

Omp31

Omp25cOmp25d

Omp25b

Omp31b

Omp22

10 PAM

Omp25Omp25

Omp31Omp31

Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella

Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella

Omp31Omp31 Omp31Omp31bb

Omp25Omp25 Omp25Omp25bb

Omp25Omp25cc

Omp25Omp25dd

Omp2Omp222

B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --

Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004

Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide

Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en

B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot

Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis

Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia

Omp25Omp31

INOacuteCULOceacutelulas

suspensioacuten D O = 6

Adyuvante Incompleto de

Freund

1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA

1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten

Obtencioacuten de suero

Sin adyuvanteAdyuvante

Completo de Freund

Puncioacuten cardiaca

Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea

IPTGE coli

Adsorcioacuten de sueros

kan r

∆omp22

Cepas kanr sacr and amps

Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22

Recombinacioacuten homologa doble

DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante

∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr

∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr

∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr

∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr

∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr

pNV22-1(9347 pb)

sacB

omp22inactivado

kan r

Amp

r

2

RsrII StuI

omp22

1

Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA

pCVD442pNV22-IIII+VI

pb

514842683550

190417661375

Marcador PA 22-I

Δ22

PA 22-I

Δ22

Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica

21762690

pb

PA Δ22

22-I

IV III

Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas

PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-

ComCom

Necesidad de suero + + +

Necesidad de CO2 + + +

Catalasa + + +

Oxidasa - - -

Actividad Ureasa - - -

Aglutinacioacuten Acriflavina + + +

Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +

Tb - - -

Wb - - -

Lisis fagos Iz - - -

RC + + +

Crecimiento en Tionina + + +

presencia de Fucsina - - -

colorantes Safranina - - -

Aglutinacioacuten A - - -

M - - -

Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc

Omp25Omp25dd

Omp2Omp222

B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++

B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom

++ ++ ++ -- ++ -- ++

Western blot

Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species

215

31

kDa

Suero anti-Omp25cMP

Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c

Omp25

Δ25 ComPA Δ25cCom

Omp25

Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species

Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana

bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B

Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero

Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA

Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten

Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)

(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30

B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011

B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005

∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011

∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002

∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015

∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007

∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025

Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N