MV-Thai

1

METHOD VALIDATIONMETHOD VALIDATION

การตรวจสอบความใช้�ได้�ของว�ธี�ทด้สอบ

2

ความหมายความหมาย

• METHOD VALIDATION การยนย�นโดยการทดสอบและม�หล�กฐานแสดงว�าว�ธี�ทดสอบเหมาะสมก�บความต้�องการเฉพาะ• METHOD VERIFICATION การยนย�นโดยการทดสอบและม�หล�กฐานแสดงว�าเป็"นไป็ต้ามข้�อก%าหนดท�&ระบ'

3

• ได�ผลท�&ถู*กต้�อง

• เม&อทดสอบซ้ำ%,า ย�งได�ผลท�&ไม�ต้�างก�น

• ใช้�ทดสอบสารท�&ม�ความเข้�มข้�นน�อยๆ ได�

• บอกได�ว�าความเข้�มข้�นต้%&าส'ดท�&ม�ความถู*กต้�องและแม�นย%าเป็"นเท�าไร

ว�ธี�ทดสอบท�&ด�จะต้�องว�ธี�ทดสอบท�&ด�จะต้�อง

4

• บอกได�ถู1งช้�วงความเข้�มข้�นท�&สามารถูทดสอบได�อย�างถู*กต้�อง แม�นย%า โดยท�&ความส�มพ�นธี2ข้องค�าท�&อ�านได�ก�บความเข้�มข้�นม�ความเป็"นเส�นต้รง

• สามารถูทดสอบได�เฉพาะสารท�&ต้�องการทดสอบ โดยไม�ถู*กรบกวนจากสารอ&นท�&อย*�ในต้�วอย�าง

• เม&อเป็ล�&ยนเง&อนไข้ (condition) ในการทดสอบเล3กน�อย ผลไม�แต้กต้�าง

ว�ธี�ทดสอบท�&ด�จะต้�อง (ต้�อ)ว�ธี�ทดสอบท�&ด�จะต้�อง (ต้�อ)

5

ท%าไมจ1งต้�องม�การท%า method validationท%าไมจ1งต้�องม�การท%า method validation

• ข้�อก%าหนดข้อง

ISO/IEC 17025

• ความน�าเช้&อถูอข้องผล

การทดสอบ

• ทราบ conditions ท�&

ใช้�ในการทดสอบ

• ทราบข้�อจ%าก�ดข้องว�ธี�

ทดสอบ

6

ว�ธี�ทดสอบท�&ต้�องท%า method validation ว�ธี�ทดสอบท�&ต้�องท%า method validation

• ว�ธี�ทดสอบท�&ใช้�ไม�ใช้�ว�ธี�มาต้รฐาน

- ห�องป็ฏิ�บ�ต้�การพ�ฒนาข้1,น

เอง

• ว�ธี�ทดสอบท�&ใช้�เป็"นว�ธี�มาต้รฐาน

แต้�

- ม�การใช้�นอกข้อบข้�ายข้อง

ว�ธี�มาต้รฐาน

- ม�การด�ดแป็ลงจากว�ธี�

มาต้รฐาน

7

จะต้�องท%า method validation เม&อไร จะต้�องท%า method validation เม&อไร

• ก�อนน%าไป็ใช้�จร�ง

• เม&อว�ธี�ท�&เคย validate น�,นม�การ

เป็ล�&ยนแป็ลง condition เช้�น เป็ล�&ยน

เคร&องมอ เป็"นต้�น

• เม&อม�การทดสอบนอกข้อบข้�ายจากท�&เคย

validate

8

• เคร&องมอ : ผ�านการสอบเท�ยบและเหมาะสมต้�อการใช้�งาน• ว�ธี�ทดสอบ : เข้�ยนเป็"นลายล�กษณ์2อ�กษร• สารมาต้รฐาน / สารเคม� : ใบร�บรอง สามารถูสอบกล�บได� เหมาะสม • ผ*�ทดสอบ : ความสามารถู ป็ระสบการณ์2 ว�เคราะห2ข้�อม*ล• ต้�วอย�าง• งบป็ระมาณ์

ส�&งท�&ต้�องเต้ร�ยมในการท%า method Validationส�&งท�&ต้�องเต้ร�ยมในการท%า method Validation

9

• Blank : Reagent blank / Sample blank

• Fortified sample / Spiked sample

• Certified reference material (CRM)

• Reference material (RM)

• Interlaboratory comparison / Proficiency testing

ส�&งท�&ใช้�ในการท%า method Validationส�&งท�&ใช้�ในการท%า method Validation

10

• Reagent blank - ทดสอบท'กข้�,นต้อนเช้�นเด�ยวก�บการทดสอบต้�วอย�าง แต้�ไม�ต้�องม�ต้�วอย�าง - interfere จากสารเคม�

BlankBlank

• Sample blank - ว�ต้ถู'ท�&ม� matrix เหมอนก�บต้�วอย�าง แต้�ไม�ม�สารท�&ทดสอบอย*�ในต้�วอย�างน�,น - interfere จาก matrix

11

• Fortified sample เต้�มสารท�&ต้�องการทดสอบลงในต้�วอย�าง

Fortified / Spiked sampleFortified / Spiked sample

• Spiked sample เต้�มสารใดๆ ลงในต้�วอย�าง

12

- ว�สด'หรอสารท�&ม�สมบ�ต้�อย�างใดอย�างหน1&งหรอหลายอย�างซ้ำ1&งได�ร�บการร�บรองโดยว�ธี�ท�&ถู*กต้�องต้ามหล�กว�ช้าการ พร�อมก�บม�ใบร�บรองท�&สามารถูสอบกล�บได�

Certified reference material (CRM)Certified reference material (CRM)

- ม� matrix เช้�นเด�ยวก�บต้�วอย�าง - ม�การระบ'ค�าจร�งและค�าความไม�แน�นอน - ผล�ต้จากหน�วยงานท�&หน�วยให�การร�บรองยอมร�บ

13

- ว�สด'หรอสารท�&ม�สมบ�ต้�อย�างใดอย�างหน1&งหรอหลายอย�างซ้ำ1&งม�ความเป็"นเน,อเด�ยวก�นและจ�ดเต้ร�ยมมาอย�างด� เพ&อใช้�ป็ระเม�นว�ธี�ทดสอบ สอบเท�ยบเคร&องมอ หรอใช้�ในการก%าหนดค�าให�ก�บว�สด'อ&น

Reference material (RM)Reference material (RM)

- ม� matrix เช้�นเด�ยวก�บต้�วอย�าง - ห�องป็ฏิ�บ�ต้�การสามารถูเต้ร�ยมเอง - ผ�านการทดสอบอย�างน�อย 20 ซ้ำ%,า ค%านวณ์ค�าเฉล�&ย และ SD - ม�ป็ร�มาณ์เหมาะสมต้�อการใช้�งานในช้�วงอาย'การเก3บ

14

- การเป็ร�ยบเท�ยบผลการทดสอบระหว�างห�องป็ฏิ�บ�ต้�การ โดยใช้�ต้�วอย�างเด�ยวก�น แต้�อาจจะใช้�ว�ธี�ทดสอบแต้กต้�างก�น

Interlaboratory comparison / Proficiency testingInterlaboratory comparison / Proficiency testing

15

• ห�องป็ฏิ�บ�ต้�การสามารถูเต้ร�ยมต้�วอย�างเอง• จ%านวนห�องป็ฏิ�บ�ต้�การท�&เข้�าร�วมโครงการจะเป็"นเลข้ค�& และม�กไม�เก�น 10 แห�ง• ห�องป็ฏิ�บ�ต้�การท�&เข้�าร�วมโครงการ ควรจะ - ได�ร�บการร�บรอง ISO / IEC 17025 หรอ - ม�แนวทางการด%าเน�นงานต้ามระบบค'ณ์ภาพ หรอ - ม�ความช้%านาญเฉพาะทาง

Interlaboratory comparisonInterlaboratory comparison

16

• ม�หน�วยงานท�&ท%าหน�าท�&จ�ดเต้�ยมต้�วอย�าง ป็ระเม�นผลการทดสอบ และจ�ดส�งผลการป็ระเม�น• ห�องป็ฏิ�บ�ต้�การจะต้�องซ้ำ,อต้�วอย�างมาทดสอบ• จ%านวนห�องป็ฏิ�บ�ต้�การท�&เข้�าร�วมโครงการม�จ%านวน 10 แห�ง ข้1,นไป็• ม�กเป็"นโครงการระด�บนานาช้าต้�

Proficiency testingProficiency testing

17

ว�ธี�การค%านวณ์ในการเต้ร�ยมสารละลาย standardว�ธี�การค%านวณ์ในการเต้ร�ยมสารละลาย standard

18

ป็ระกอบด�วย ต้�วท%าละลาย (solvent) ก�บ ต้�วถู*กละลาย (solute)

บ�งบอกจ%านวนข้องต้�วถู*กละลายท�&ม�อย*�ในสารละลายจ%านวนหน1&งสามารถูบอกได�หลายว�ธี� ได�แก� 1 % , ppm, ppb :- w/w, v/v, w/v 2 . Molarity (Molar = M) :- โมล/ล�ต้ร 3 . Normality (Normal = N) :- กร�มสมม*ลย2/ล�ต้ร 4 . Molality (Molal = m) :- โมล/ต้�วท%าละลาย 1 ก�โลกร�ม

สารละลาย (solution)สารละลาย (solution)

ความเข้�มข้�นข้องสารละลาย (concentration)ความเข้�มข้�นข้องสารละลาย (concentration)

19

สารละลาย 100 ml ม�ต้�วถู*กละลาย 5 กร�ม

สารละลาย 1 ml ม�ต้�วถู*กละลาย 5 ไมโครกร�ม (g) หรอ สารละลาย 1 L ม�ต้�วถู*กละลาย 5 ม�ลล�กร�ม สารละลาย 1 ml ม�ต้�วถู*กละลาย 5 นาโนกร�ม (ng) หรอ สารละลาย 1 L ม�ต้�วถู*กละลาย 5 ไมโครกร�ม (g)

สารละลายเข้�มข้�น 5%สารละลายเข้�มข้�น 5%

สารละลายเข้�มข้�น 5 ppmสารละลายเข้�มข้�น 5 ppm

สารละลายเข้�มข้�น 5 ppbสารละลายเข้�มข้�น 5 ppb

20

สารละลาย 1000 ml ม�ต้�วถู*กละลาย 5 โมล

สารละลาย 1000 ml ม�ต้�วถู*กละลาย 5 กร�มสมม*ลย2

สารละลายเข้�มข้�น 5Mสารละลายเข้�มข้�น 5M

สารละลายเข้�มข้�น 5 Nสารละลายเข้�มข้�น 5 N

สารละลายเข้�มข้�น 5mสารละลายเข้�มข้�น 5m

ม�ต้�วท%าละลาย 1 Kg ม�ต้�วถู*กละลาย 5 โมล

21

จ%านวนกร�มสมม*ลย2 = (นน.สาร /นน.โมเลก'ล )x ป็ระจ' = จ%านวนโมล x ป็ระจ' N = M x ป็ระจ' หรอ M

= N / ป็ระจ' M1V1 = M2V2 เฉพาะกรณ์�ป็ฏิ�ก�ร�ยา 1 :1N1V1 = N2V2 ใช้�ได�ท'กกรณ์�

NormalNormal

MolarMolarจ%านวนโมล = นน.สาร / นน.โมเลก'ล

22

กล'�มส*ต้รเคม�ท�&เข้�ยนข้1,น เพ&ออธี�บายการเป็ล�&ยน แป็ลงทางเคม�ข้องสารในอ�ต้ราส�วนอย�างต้%&าท�&ส'ดข้องจ%านวนโมเลก'ลข้องสารเหล�าน�,น โดยเข้�ยนสารท�&เข้�าท%าป็ฏิ�ก�ร�ยาเคม�ไว�ทางด�านซ้ำ�าย และสารท�&เก�ดข้1,นใหม�ไว�ทางด�านข้วา ใช้�เคร&องหมาย +ค�&นระหว�างสารและเข้�ยนล*กศรไว�ระหว�างกลางข้องสาร 2 พวก 2 HCl + Ba(OH)2 BaCl2 + 2H2O

สมการเคม�สมการเคม�

23

กรณ์�หาความเข้�มข้�นข้องสารละลายโดยการไต้เต้รต้กรณ์�หาความเข้�มข้�นข้องสารละลายโดยการไต้เต้รต้

24

สารละลาย HCl 3M จ%านวน 15ml ท%าป็ฏิ�ก�ร�ยาพอด�ก�บสารละลาย Ba(OH)2 จ%านวน 10ml จงหาความเข้�มข้�นข้องสารละลาย Ba(OH)2 เป็"น M และ N

จาก N1V1 = N2V2

HCl 3M = HCl 3 N

2 HCl + Ba(OH)2 BaCl2 + 2H2O

ด�งน�,น N1 = N2V2 / V1 = 3 x 15 / 10 = 4.5 Normalจาก M = N / ป็ระจ' จะได�ว�า M = 4.5 / 2 = 2.25 Molar

25

กรณ์�เต้ร�ยมสารละลายจากข้องเหลว concentrateกรณ์�เต้ร�ยมสารละลายจากข้องเหลว concentrate

26

กรณ์�ท�&สารต้�,งต้�นท�&น%ามาเต้ร�ยมเป็"นข้องเหลวและระบ'ค�าความหนาแน�น ใช้�ส*ต้ร V = 100M(MW) / pdโดยท�& V = ป็ร�มาต้รข้องสารท�&ต้�องใช้�ในการเต้ร�ยม M = ความเข้�มข้�นเป็"น Molar MW = น%,าหน�กโมเลก'ล p = เป็อร2เซ้ำ3นต้2โดยน%,าหน�กข้องสารท�&น%ามาเต้ร�ยม d = ความหนาแน�น (ความถู�วงจ%าเพาะ )ข้องสารท�&น%ามาเต้ร�ยมส*ต้รน�,ใช้�ส%าหร�บเม&อเต้ร�ยมเป็"นสารละลายจ%านวน 1 ล�ต้ร

27

จงค%านวณ์หาป็ร�มาต้รข้อง HCl เข้�มข้�นท�&ต้�องใช้� เพ&อเต้ร�ยมเป็"นสารละลายเข้�มข้�น

01. M จ%านวน 1 ล�ต้ร (MW ข้อง HCl = 36.46, % โดยน%,าหน�ก = 37.5 %, ความหนาแน�น = 1.19 จาก V = 100M(MW) / pd = ( 100 x 0.1 x 36.46 ) / ( 37.5 x 1.19 ) = 8.17 ml

28

กรณ์�เต้ร�ยมสารละลายจากข้องแข้3งกรณ์�เต้ร�ยมสารละลายจากข้องแข้3ง

29

ต้�องการเต้ร�ยมสารละลายโซ้ำเด�ยมคลอไรด2เข้�มข้�น 01. M จ%านวน 2000ml จะต้�องใช้�โซ้ำเด�ยมคลอไรด2หน�กก�&กร�ม (MW = 58 )สารละลายโซ้ำเด�ยมคลอไรด2เข้�มข้�น 01. M หมายถู1งสารละลาย 1000ml ม� NaCl 0.1 โมลสารละลาย 2000ml ม� NaCl 0.1 x 2000 / 1000 = 0.2 โมลNaCl 1 โมล หน�ก 58

กร�มNaCl 0.2 โมล หน�ก 58 x 0.2 = 11.6 กร�ม

หรอใช้�ส*ต้ร W = MW x M x V / 1000 = 58 x 0.1 x 2000 / 1000 = 11.6 กร�ม

30

ต้�องการเต้ร�ยมสารละลาย oxolinic acid เข้�มข้�น 50 ppm จ%านวน 100ml จะต้�องใช้� oxolinic acid ก�&กร�มสารละลาย oxolinic acid เข้�มข้�น 50

ppm หมายถู1งสารละลาย 1ml ม� oxolinic acid 50 gสารละลาย 100ml ม� oxolinic acid 50 x 100 = 5000 g = 5000 /1 0 6 = 0.005 g

31

กรณ์�เต้ร�ยมสารละลายจากสารละลายความเข้�มข้�นต้�างๆกรณ์�เต้ร�ยมสารละลายจากสารละลายความเข้�มข้�นต้�างๆ

32

ต้�องการเต้ร�ยมสารละลาย oxolinic acid เข้�มข้�น 01. ppm จ%านวน 25ml จะต้�องใช้�สารละลาย oxolinic acid เข้�มข้�น 10 ppm ก�& ml และก�& l จาก M1V1 = M2V2 0.1 x 25 = 10 x V2 V2 = 0.1 x 25 / 10 = 0.25 ml จาก 1 ml = 1000 lด�งน�,น 025. ml = 1000 x 0.25 = 250 l

33

กรณ์�เต้ร�ยม fortified sample ท�&ความเข้�มข้�นต้�างๆกรณ์�เต้ร�ยม fortified sample ท�&ความเข้�มข้�นต้�างๆ

34

ต้�องการเต้ร�ยม fortified sample ท�&ความเข้�มข้�น 10 g / g โดยในว�ธี�การทดสอบฮี�สต้าม�น จะต้�องใช้�ต้�วอย�าง 5 กร�มต้�องการเต้ร�ยม fortified sample ท�&ความเข้�มข้�น 1 0 g / g หมายความว�า ต้�วอย�าง 1 กร�ม จะม�ฮี�สต้าม�น 10 gด�งน�,น ต้�วอย�าง 5 กร�ม จะม�ฮี�สต้าม�น 10 x 5 = 50 g

น�&นคอ จะต้�องเต้�มฮี�สต้าม�นจ%านวน 50 g ลงไป็ในต้�วอย�าง 5 กร�ม

35

ซ้ำ1&งการเต้�มฮี�สต้าม�น ท%าได�หลายอย�าง เช้�น - เต้�มสารละลายฮี�สต้าม�นเข้�มข้�น 50 g / ml จ%านวน 1 ml ลงในต้�วอย�าง 5 กร�ม หรอ - เต้�มสารละลายฮี�สต้าม�นเข้�มข้�น 500 g / ml จ%านวน 0.1 ml ลงในต้�วอย�าง 5 กร�ม เป็"นต้�นโดยค%านวณ์จากสารละลายฮี�สต้าม�นเข้�มข้�น 50 0 g / ml หมายความว�า ม�ฮี�สต้าม�น 500 g ในสารละลาย 1 ml ด�งน�,น ม�ฮี�สต้าม�น 50 g ในสารละลาย 1 x 50 / 500 ml = 0.1 ml = 100 l

36

1. ช้�&งโซ้ำเด�ยมไฮีดรอกไซ้ำด2 80 กร�ม ละลายน%,าและป็ร�บป็ร�มาต้รเป็"น 500 ml อยากทราบความเข้�มข้�นเป็"นโมลาร2ข้องสารละลายน�, (น%,าหน�กโมเลก'ลข้องโซ้ำเด�ยมไฮีดรอกไซ้ำด2 = 40)

แบบฝึ>กห�ดการเต้ร�ยมสารละลายแบบฝึ>กห�ดการเต้ร�ยมสารละลาย

2. ช้�&งกรดเบนโซ้ำอ�ก 1 กร�ม ละลายด�วยเมธีานอลและป็ร�บป็ร�มาต้รเป็"น 100 ml อยากทราบความเข้�มข้�นเป็"น ppm ข้องสารละลายน�,

37

3. ม�สารละลายคลอแรมฟิ@น�คอลเข้�มข้�น 2 ppb อย*� 3 ml ต้�องการเต้ร�ยมเป็"นสารละลายคลอแรมฟิ@น�คอลเข้�มข้�น 0.3 ppb จ%านวน 10 ml จะต้�องใช้�สารละลายคลอแรมฟิ@น�คอลเข้�มข้�น 2 ppb ก�& ml4. จะเต้ร�ยม fortified sample ท�&ความเข้�มข้�น 02. g / g ได�อย�างไร (ในว�ธี�การทดสอบ oxolinic acid จะต้�องใช้�ต้�วอย�าง 5 กร�ม)

แบบฝึ>กห�ดการเต้ร�ยมสารละลายแบบฝึ>กห�ดการเต้ร�ยมสารละลาย

38

รายการท�&ต้�อง Validate (Performance characteristic)

รายการท�&ต้�อง Validate (Performance characteristic)

39

• Range ช้�วงความเข้�มข้�นท�&สามารถูทดสอบได�อย�างถู*กต้�องและแม�นย%า

• Linearity ความส�มพ�นธี2ระหว�างค�าท�&อ�านได�ก�บความเข้�มข้�นในช้�วงท�&ก%าหนด

Range & LinearityRange & Linearity

40

• ทดสอบ reagent blank 1 ซ้ำ%,า

• ทดสอบ fortified sample blank 6 ความเข้�มข้�น ๆ ละ 1 ซ้ำ%,า

• เข้�ยนกราฟิระหว�างความเข้�มข้�น (แกน X) ก�บค�าท�&อ�านได� (แกน Y)

• correlation coefficient (r) 0.995

Range Range

41

RangeRange

x

x x

x

xx

x

1 2 3 4 5 6 7

ค�าท�&อ�านได�

ความเข้�มข้�น

42

แบบฝึ>กห�ด Rangeแบบฝึ>กห�ด Range

ความเข้�มข้�นท�&

เต้�ม(ug/g)

Fluorescence

intensity

Reagent

blank 10 81 152 183 255 3910 6625 14950 297100 583

ทดสอบ reagent blank, sample blank และ fortified sample blanks ท�&ความเข้�มข้�นต้�างๆ ความเข้�มข้�นละ

1 ซ้ำ%,า ผลเป็"นด�งต้าราง ให�ต้รวจสอบช้�วงความเข้�มข้�นท�&เป็"นเส�นต้รง

43

• ทดสอบ reagent blank 3 ซ้ำ%,า

• ทดสอบ fortified sample blank 6 ความเข้�มข้�น ๆ ละ 3 ซ้ำ%,า (ภายในช้�วง range)

• เข้�ยนกราฟิระหว�างความเข้�มข้�น (แกน X) ก�บค�าท�&อ�านได� (แกน Y)

• correlation coefficient (r) 0.995

LinearityLinearity

44

LinearityLinearity

x

x

x

xx

x

1 2 3 4 5 6 7

ค�าท�&อ�านได�

ความเข้�มข้�น

x

xx

x

xx

xx

xxx

xx

45

แบบฝึ>กห�ด Linearityแบบฝึ>กห�ด Linearity

ความเข้�มข้�นท�&

เต้�ม(ug/g)

Fluorescence intensity

ซ้ำ%,าท�& 1 ซ้ำ%,าท�& 2 ซ้ำ%,าท�& 3Reagen

t blank 0 1 1

0 9 7 81 13 14 152 19 19 183 25 25 255 40 38 3910 64 65 6625 147 148 14950 293 289 297100 594 592 583

ทดสอบ reagent blank, sample blank และ fortified sample blanks ท�&ความเข้�มข้�นต้�างๆ ความเข้�มข้�นละ 3ซ้ำ%,า ผลเป็"นด�งต้าราง ให�ต้รวจสอบความเป็"นเส�นต้รง

46

• ค�าท�&แต้กต้�างจากค�าอ&นๆ ในกล'�มข้�อม*ล• ทดสอบโดยใช้� Grubb’s test Tn = ( Xn –

X ) / SDโดยท�& Xn = ค�าท�&สงส�ย X = ค�าเฉล�&ยข้องกล'�มข้�อม*ล

SD = ค�าเบ�&ยงเบน

มาต้รฐานข้องกล'�มข้�อม*ลถู�า Tn < Tc แสดงว�าไม�แต้กต้�าง

OutlierOutlier

47

ต้�วอย�าง Outlierต้�วอย�าง Outlier

ผลการทดสอบฮี�สต้าม�น 11 ซ้ำ%,า เป็"นด�งน�, 35, 34, 37, 42, 31, 36, 34, 37, 36, 35 และ 34 ppm จงหาว�าม�ค�าใดเป็"น outlier หรอไม�ค�าเฉล�&ย = 35.5 ppm SD = 2.7 ppm Tc ท�& 11 ซ้ำ%,า = 2.23 ค�าสงส�ย = 31 และ 42 ppmTn = ( 31 – 35.5 ) / 2.7 = 1.66 ด�งน�,น 31 ไม�เป็"น outlierTn = ( 42 – 35.5 ) / 2.7 = 2.36 ด�งน�,น 42 เป็"น outlier

48

Accurate

Precise

Inaccurateprecise

Accurateimprecise

Inaccurateimprecise

Relationship between accuracy and precision Relationship between accuracy and precision

49

Accuracy / Trueness Accuracy / Trueness

• การแสดงความใกล�เค�ยงก�นระหว�างค�าเฉล�&ยข้องผลการทดสอบท�&ได� ( X ) ก�บค�าอ�างอ�ง ( ) ข้องต้�วอย�างน�,น

• ท�,ง X และ เป็"นค�าเฉล�&ยข้องกล'�มข้�อม*ล แต้กต้�างก�นท�&

เป็"นค�าเฉล�&ยข้องกล'�มข้�อม*ลใหญ� (ป็ระช้ากร ) เช้�น ทดสอบ 50 ซ้ำ%,า

•X เป็"นค�าเฉล�&ยข้องกล'�มข้�อม*ลเล3ก (ต้�วอย�าง ) เช้�น ทดสอบ 10 ซ้ำ%,า

50

Accuracy / Trueness Accuracy / Trueness

x1

x2x3

x4

x5

x6x

i

N = 50 = (x1 + x2 + … + x50) / 50

n = 10X = (x1 + x2 + … + x10) / 10

51

• ทดสอบ CRM 10 ซ้ำ%,า ค%านวณ์ค�าเฉล�&ยได� = X1

• ทดสอบ reagent blank 10 ซ้ำ%,า ค%านวณ์ค�าเฉล�&ยได� = X2

• ค�าเฉล�&ยข้อง CRM ท�&ทดสอบได� ( X3 ) = X1 – X2

• ป็ระเม�น accuracy ได� 2 ว�ธี� ได�แก� 1. ใช้�ค�า % recovery 2. ใช้�ค�า t - test

Accuracy / Trueness Accuracy / Trueness

52

• ใช้�ค�า % recovery % recovery = ( X3

) x 100 /

Accuracy / Trueness Accuracy / Trueness

ความเข้�มข้�น % recovery

1 g/kg 50-120

>1 g/kg 0.01 mg/kg 60-120

>0.01 mg/kg 0.1 mg/kg 70-110

>0.1 mg/kg 80-110

53

• ใช้�ค�า t - test t = ( X3 - ) / ( SD /

n1/2 ) ; df = n - 1

Accuracy / Trueness Accuracy / Trueness

• ป็ระเม�นว�าผลการทดสอบไม�แต้กต้�างจากค�าอ�างอ�ง

( ม� accuracy ) เม&อ t < tc

54

ต้�วอย�าง Accuracy / Trueness ต้�วอย�าง Accuracy / Trueness

CRM ข้องการทดสอบแคดเม�ยมม�ค�าระบ'ใน certificate เท�าก�บ 1.5 g /g เม&อได�ทดสอบด�วยว�ธี�ข้องห�องป็ฏิ�บ�ต้�การจ%านวน 10 ซ้ำ%,า พบว�า ม�ค�าเฉล�&ยข้องแคดเม�ยมเท�าก�บ 1.0 g /g และ SD เท�าก�บ 0.35 g /g ผลการทดสอบ reagent blank เท�าก�บ 0 ให�หาว�า accuracy ข้องว�ธี�ทดสอบน�,ด�หรอไม�

55

ต้�วอย�าง Accuracy / Trueness ต้�วอย�าง Accuracy / Trueness

% recovery = ( 1.0 – 0 ) x 100 / 1.5 = 67 %

เกณ์ฑ์2การยอมร�บท�&ความเข้�มข้�น 1.5 ppm = 80 – 110 %

แสดงว�า accuracy ไม�ด� t = ( 1.0 – 1.5 ) / ( 0.35 / 101/2 ) = 4.52 ; df = 10 – 1 = 9

ค�า tc ท�& 95% = 2.26 น�&นคอ t > tc

แสดงว�า accuracy ไม�ด�

56

แบบฝึ>กห�ด Accuracy / truenessแบบฝึ>กห�ด Accuracy / trueness

ซ้ำ%,าท�&ความเข้�มข้�นReagent

blank (ug/g)

ความเข้�มข้�น CRM

(ug/g)

1 0 1.0232 0 1.0573 0 1.0284 0 1.1265 0 0.9906 0 0.9847 0 1.0118 0 1.0509 0 1.06610 0 1.02911 0 1.035

ทดสอบ reagent blank และ CRM อย�างละ 1 1 ซ้ำ%,า ผลเป็"นด�งต้าราง ให�ต้รวจสอบ outlier และ accuracy ข้องว�ธี�การทดสอบน�, ความเข้�มข้�นข้อง CRM = 1.022 ppm

57

• ทดสอบ sample blank 10 ซ้ำ%,า ค%านวณ์ค�าเฉล�&ยได� = X1

• ทดสอบ fortified sample blank ท�&ความเข้�มข้�นอย�างน�อย 3 ความเข้�มข้�น ๆ ละ 10 ซ้ำ%,า

• ป็ระเม�น accuracy โดยใช้�ค�า % recovery % recovery = ( conc. FS – X1 ) x

100 / ค�าท�& fortify conc. FS = ความเข้�มข้�นข้อง fortified

sample ท�&ทดสอบได�

Accuracy / Recovery Accuracy / Recovery

58

แบบฝึ>กห�ด Accuracy / Recoveryแบบฝึ>กห�ด Accuracy / Recovery

ซ้ำ%,าท�&ความเข้�มข้�นsample

blank (ug/g)

ความเข้�มข้�น fortified sample blank (ug/g)

1 1.3 45.72 1.3 44.53 1.3 45.64 1.5 45.15 1.4 46.16 1.5 45.87 1.1 45.18 1.3 44.59 1.6 45.210 1.5 44.611 1.8 44.3

ทดสอบ sample blank และ fortified sample blank ท�&ความเข้�มข้�น 50 ppm อย�างละ 1 1 ซ้ำ%,า ผลเป็"นด�งต้าราง ให�ต้รวจสอบ outlier และ accuracy ข้องว�ธี�การทดสอบน�,

59

Precision Precision

• การแสดงความใกล�เค�ยงก�นระหว�างข้�อม*ลท�&ได�จากการทดสอบซ้ำ%,า • ม� 2 ป็ระเภท ได�แก�

- Repeatability

- Reproducibility

60

Repeatability Repeatability

- เป็"น precision ข้องผลการทดสอบท�&ได�จากการท%าซ้ำ%,าโดยห�องป็ฏิ�บ�ต้�การเด�ยวก�น ผ*�ทดสอบคนเด�ยวก�น เคร&องมอเด�ยวก�น ภายในระยะเวลาท�&ใกล�เค�ยงก�น

- ซ้ำ%,าในสภาพท�&เหมอนก�น

61

Reproducibility Reproducibility

- เป็"น precision ข้องผลการทดสอบท�&ได�จากการท%าซ้ำ%,าโดยห�องป็ฏิ�บ�ต้�การ หรอผ*�ทดสอบ หรอเคร&องมอ หรอระยะเวลาท�&แต้กต้�างก�น

- ซ้ำ%,าในสภาพท�&ต้�างก�น

62

Precision Precision

• การหา precision ท%าเช้�นเด�ยวก�บการหา accuracy น�&นคอ1. ทดสอบ reagent blank และ

CRM อย�างละไม�น�อยกว�า 10 ซ้ำ%,า 2. ทดสอบ sample blank และ fortified sample blank อย�างน�อย 3 ความเข้�มข้�น ๆ ละไม�น�อยกว�า 10 ซ้ำ%,า • ป็ระเม�น precision

โดยใช้� HORRAT

• precision ด� เม&อ HORRAT < 2

63

HORRAT (Horwitz’s ratio) = %RSD / predicted RSD

%RSD = ( SD / X ) x 100

HORRATHORRAT

Predicted RSD :

repeatability :- PRSD = 0.66 x 2 (1 - 0.5log C)

reproducibility :- PRSD = 2 (1 - 0.5log C)

C = concentration ratio

เช้�น 10 ppm = 10 x 10-6 = 10-5

10% = 10 x 10-2 = 0.1

64

ต้�วอย�าง Precisionต้�วอย�าง Precision

CRM ข้องการทดสอบแคดเม�ยมม�ค�าระบ'ใน certificate เท�าก�บ 1.5 g /g เม&อได�ทดสอบด�วยว�ธี�ข้องห�องป็ฏิ�บ�ต้�การจ%านวน 10 ซ้ำ%,า พบว�า ม�ค�าเฉล�&ยข้องแคดเม�ยมเท�าก�บ 1.0 g /g และ SD เท�าก�บ 0.35 g /g ผลการทดสอบ reagent blank เท�าก�บ 0 ให�หาว�า precision ข้องว�ธี�ทดสอบน�,ด�หรอไม�

65

%RSD = ( 0.35 / 1.0 ) x 100 = 35HORRAT (Horwitz’s ratio) = 35 / 10.56

= 3.31

ต้�วอย�าง Precisionต้�วอย�าง PrecisionC = concentration ratio

X = 1.0 ppm = 1.0 x 10-6 = 10-6 = 0.000001

Predicted Horwitz RSD :

repeatability :- PRSD = 0.66 x 2 ( 1 - 0.5 log 0.000001 )

= 10.56

precision ไม�ด� เน&องจาก HORRAT > 2

66

แบบฝึ>กห�ด Precisionแบบฝึ>กห�ด Precision

ซ้ำ%,าท�&ความเข้�มข้�นsample

blank (ug/g)

ความเข้�มข้�น fortified sample blank (ug/g)

1 1.3 45.72 1.3 44.53 1.3 45.64 1.5 45.15 1.4 46.16 1.5 45.87 1.1 45.18 1.3 44.59 1.6 45.210 1.5 44.611 1.8 44.3

ทดสอบ sample blank และ fortified sample blank ท�&ความเข้�มข้�น 50 ppm อย�างละ 1 1 ซ้ำ%,า ผลเป็"นด�งต้าราง ให�ต้รวจสอบ outlier และ precision ข้องว�ธี�การทดสอบน�,

67

LOD และ LOQLOD และ LOQ

Limit of Detection ( LOD )

ความเข้�มข้�นต้%&าส'ดท�&ว�ธี�ทดสอบน�,นๆ สามารถูต้รวจพบได�Limit of Quantitation ( LOQ )

ความเข้�มข้�นต้%&าส'ดท�&ว�ธี�ทดสอบน�,นๆ สามารถูทดสอบและรายงานผลได� โดยม� accuracy และ precision ท�&ยอมร�บได�

68

69

LODLOD

ส%าหร�บการว�เคราะห2เช้�งป็ร�มาณ์ สามารถูท%าได� 3 ว�ธี� ได�แก�1. กรณ์� sample blank ม�ค�า - ทดสอบ reagent blank ≥ 10 ซ้ำ%,า ค%านวณ์ค�าความเข้�มข้�นเฉล�&ย ( X1 )

- ทดสอบ sample blank ≥

10 ซ้ำ%,า ค%านวณ์ค�าความเข้�มข้�นเฉล�&ย ( X2 )

- LOD = ( X2 – X1 ) + 3 SD

70

LODLOD

2. กรณ์� sample blank ไม�ม�ค�า - ทดสอบ fortified sample blank ท�&ความเข้�มข้�นน�อยๆ ≥ 10 ซ้ำ%,า - LOD = 3 SD

71

LODLOD

3. ใช้� fortified sample blank 3 ความเข้�มข้�น - ทดสอบ fortified sample blank ท�&ระด�บความเข้�มข้�นภายใน range 3 ความเข้�มข้�น ๆ ละ ≥ 10 ซ้ำ%,า - ค%านวณ์ SD ข้องแต้�ละความเข้�มข้�น - เข้�ยนกราฟิระหว�างความเข้�มข้�น (แกน X) ก�บ SD (แกน Y)

- จ'ดต้�ดแกน Y คอค�า So

- LOD = 3 So

72

LODLOD

xSo

1 2 3 4 5 6 7

SD

ความเข้�มข้�น

x

x

LOD = 3 So

73

LODLOD

ส%าหร�บการว�เคราะห2เช้�งค'ณ์ภาพ สามารถูท%าได�ด�งน�, - ทดสอบ fortified sample blank ท�&ระด�บความเข้�มข้�นต้�างๆ ระด�บละ 10 ซ้ำ%,า - ต้รวจสอบผล positive และผล negative - LOD = ความเข้�มข้�นต้%&าส'ดท�&ให�ผล positive ท�,ง 10 ซ้ำ%,า

74

LODLOD

ความเข้�มข้�น ผลทดสอบ ( ppm )positive : negative

200 10 : 0

100 10 : 0

75 5 : 5

50 1 : 9

LOD = 100 ppm

75

แบบฝึ>กห�ด LODแบบฝึ>กห�ด LOD

ซ้ำ%,าท�&ความเข้�มข้�นreagent

blank (ug/g)

ความเข้�มข้�นsample

blank (ug/g)

1 1.3 5.72 1.3 4.53 1.3 5.64 1.5 5.15 1.4 6.16 1.5 5.87 1.1 5.18 1.3 4.59 1.6 5.210 1.5 4.611 1.8 4.3

ทดสอบ reagent blank และ sample blank อย�างละ 1 1 ซ้ำ%,า ผลเป็"นด�งต้าราง ให�หา LOD

76

Predicted LOQ Predicted LOQ

1. กรณ์� sample blank ม�ค�า - ทดสอบ reagent blank ≥ 10 ซ้ำ%,า ค%านวณ์ค�าความเข้�มข้�นเฉล�&ย ( X1 )

- ทดสอบ sample blank ≥

10 ซ้ำ%,า ค%านวณ์ค�าความเข้�มข้�นเฉล�&ย ( X2 )

- Predicted LOQ = ( X2 – X1 ) + 10 SD

สามารถูท%าได� 2 ว�ธี� ได�แก�

77

2. กรณ์� sample blank ไม�ม�ค�า - ทดสอบ fortified sample blank ท�&ความเข้�มข้�นน�อยๆ ≥ 10 ซ้ำ%,า - Predicted LOQ = 10 SD

Predicted LOQ Predicted LOQ

78

LOQ LOQ

- ทดสอบ sample blank ≥ 10 ซ้ำ%,า - ทดสอบ fortified sample blank ท�&ม�ความเข้�มข้�นเท�าก�บ Predicted LOQ ≥ 10 ซ้ำ%,า - ต้รวจสอบ outlier, accuracy และ precision ข้อง fortified sample blank

79

LOQ LOQ

Accuracy Precision

P-LOQ LOQ

x

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Accuracy Precision

LOQ

P-LOQ x

80

แบบฝึ>กห�ด Predicted LOQแบบฝึ>กห�ด Predicted LOQ

ซ้ำ%,าท�&ความเข้�มข้�นreagent

blank (ug/g)

ความเข้�มข้�นsample

blank (ug/g)

1 1.3 5.72 1.3 4.53 1.3 5.64 1.5 5.15 1.4 6.16 1.5 5.87 1.1 5.18 1.3 4.59 1.6 5.210 1.5 4.611 1.8 4.3

ทดสอบ reagent blank และ sample blank อย�างละ 1 1 ซ้ำ%,า ผลเป็"นด�งต้าราง ให�หา predicted LOQ

81

แบบฝึ>กห�ด LOQแบบฝึ>กห�ด LOQ

ซ้ำ%,าท�&

ความเข้�มข้�นsample

blank (ug/g)

ความเข้�มข้�น fortified sample blank (ug/g)

1 5.7 14.52 4.5 15.83 5.6 16.14 5.1 15.35 6.1 14.06 5.8 16.07 5.1 14.18 4.5 14.09 5.2 15.710 4.6 16.311 4.3 14.2

ทดสอบ sample blank และ fortified sample blank ท�&ความเข้�มข้�น 10 ppm อย�างละ 1 1 ซ้ำ%,า ผลเป็"นด�งต้าราง ให�ต้รวจสอบว�าท�&ความเข้�มข้�นน�,เป็"น LOQ หรอไม�

82

Specificity / Selectivity Specificity / Selectivity

• ทดสอบโดย - เต้�มสารรบกวนลงในต้�วอย�าง - น%าไป็ว�เคราะห2 - ต้รวจสอบว�าสารรบกวนเหล�าน�,นท%าให�ผลการทดสอบแต้กต้�างไป็จากเด�มหรอไม�

83

• ความสามารถูข้องว�ธี�ทดสอบท�&จะต้รวจว�ดได�เฉพาะส�&งท�&ต้�องการ

SpecificitySpecificity

SelectivitySelectivity

• ความสามารถูข้องว�ธี�ทดสอบท�&สามารถูแยกส�&งท�&ต้�องการออกจากส�&งเจอป็นอ&น

84

Specificity

Selectivity

85

Robustness Robustness เป็"นค'ณ์สมบ�ต้�ท�&แสดงว�าว�ธี�ทดสอบม�ความคงทนต้�อการเป็ล�&ยนแป็ลงสภาวะข้องการทดสอบ เช้�น อ'ณ์หภ*ม� pH เวลาท�&ใช้� เป็"นต้�นRuggedness Ruggedness เป็"นค'ณ์สมบ�ต้� reproducibility ข้องการทดสอบ ภายใต้�สภาวะการทดสอบป็กต้� เช้�น เป็ล�&ยนผ*�ทดสอบ เป็ล�&ยนว�นท�&ทดสอบ เป็"นต้�น ผลการทดสอบย�งคงเด�ม

86

Robustness / Ruggedness Robustness / Ruggedness

- ทดสอบต้�วอย�าง ( CRM ) โดยเป็ล�&ยนแป็ลงป็Bจจ�ยคร�,งละ 1 ป็Bจจ�ย เช้�น เป็ล�&ยนระยะเวลาท�&ใช้�ในการท%าป็ฏิ�ก�ร�ยา - ป็ระเม�นจาก accuracy และ precision

87

• ว�ต้ถู'ป็ระสงค2• ข้อบข้�าย• เอกสารอ�างอ�ง•Performance

characteristic•Tool• ว�ธี�การทางสถู�ต้�• ข้�อม*ล• ว�เคราะห2ข้�อม*ล• สร'ป็

ร*ป็แบบรายงานการท%า method validation ร*ป็แบบรายงานการท%า method validation