Les réactions antigènes-anticorps Cécile Balter Paul Rouzaire Année 2009-2010.
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Les réactions antigènes-anticorps
Cécile Balter
Paul Rouzaire
Année 2009-2010
2
I. PRESENTATION1. A quoi cela va-t-il vous servir ?2. Quels sont les champs d’application ?3. Interactions Ag-Ac4. Quelles techniques utiliser ?
II. IMMUNODOSAGES SANS MARQUEUR1. Agglutination2. Précipitation3. Neutralisation4. Immunochromatographie
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radio immunologie
IV. CONCLUSION
Les réactions antigènes - anticorps :
3
I. PRESENTATION :
1. A quoi cela va-t-il vous servir ?
2. Quels sont les champs d’application ?
3. Interactions Ag-Ac
4. Quelles techniques utiliser ?
4
I. 1. A quoi cela va-t-il vous servir ?
Utilisations pratiques : à faire un diagnostic à interpréter le résultat de ce diagnostic à commenter un bilan biologique
Utilisations plus fondamentales : préparation de réactifs à usage in vitro ou in vivo compréhension de mécanismes fondamentaux compréhension de pathologies
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I. 2. Quels sont les champs d’application ?
Identification et/ou dosage d’un Ag : Identification d’une cellule Identification d’un agent infectieux Identification et/ou dosage d’une protéine Dosage d’une hormone Dosage d’un médicament …
Mise en évidence et/ou titrage d’un Ac : Diagnostic et suivi sérologique d’une infection
Sérologies bactériennes : Fièvretyphoïde, syphilis … Sérologies virales : Hépatites, grippe, rubéole, HIV … Sérologies parasitaires : Toxoplasmose … Contrôle de vaccination
Diagnostic et suivi sérologique d’une maladie auto immune Diagnostic sérologique d’une allergie Suivi d’une grossesse Suivi d’une transplantation …
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I. 3. Interactions Ag/Ac (1/8) :
Entre : L’épitope de l’Ag (ou déterminant antigénique) et le paratope de l’Ac (ou régions de complémentarité : CDR)
Interaction réversible : Pas de modifications irréversibles de l’Ag ou l’Ac Implique plusieurs interactions, non covalentes :
- Liaisons faibles par rapport à
une liaison covalente : un grand
nombre nécessaire
- Liaisons qui opèrent sur une
très courte distance : grande
complémentarité : excellente
spécificité
7
I. 3. Interactions Ag/Ac (2/8) :
Affinité : Force des interactions entre un seul site de fixation de l’Ag sur un Ac et
un seul épitope.
Avidité : Résultante des interactions entre les déterminants multiples et répétés
d’un antigène et les sites de liaisons multiples d’un anticorps.- Meilleure mesure de la capacité de liaison au sein des systèmes
biologiques
- Une forte avidité peut compenser une faible affinité (ex : IgM
pentamériques vs IgG)
Ac polyclonaux vs Ac monoclonaux
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I. 3. Interactions Ag/Ac (3/8) :
Réaction réversible : loi d’action de masse à l’équilibre :
ka[Ag] + [Ac] [Ag - Ac]
kd
A l’équilibre, selon la loi d’action de masse :
[Ag] . [Ac] x ka = [Ag - Ac] x kd
[Ag - Ac] ka = = Ka [Ag] [Ag] kd
Ka = constante d’affinité (ou d’association)
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LA REPRESENTATION DE SCATCHARD : [ Ag - Ac]Ka = [Ag ].[Ac]
Si : F = [Ag] et B = [Ag - Ac]
BKa = F . [Ac]
Si : [Ac]T = concentration totale en anticorps
BKa =
F . ([Ac]T - B)
B
= Ka ([Ac]T - B) F
B
= - Ka.B + Ka.[Ac]T
F
I. 3. Interactions Ag/Ac (4/8) :
10
I. 3. Interactions Ag/Ac (5/8) :
LA REPRESENTATION DE SCATCHARD :
B/F
B[Ac]T
Ka . [Ac]T
Pente = -Ka
11
Conditions physiochimiques :
pH : liaison quand pH
Force ionique : liaison quand force ionique
Température : en général de l’affinité avec température (37°C)
Réactivité croisée :
Si deux Ag différents partagent un épitope identique
Si des Ac spécifiques d’un épitope se fixent à un épitope non apparenté
possédant des propriétés physicochimiques semblables
Rq : souvent observée pour des Ag polysaccharidiques qui contiennent des
résidus oligosaccahridiques semblables (Ex :Ag des groupes sanguins ABO)
I. 3. Interactions Ag/Ac (6/8) :
12
I. 3. Interactions Ag/Ac (7/8) :
Zone d’équivalence / Phénomène de zone
Sensibilité / Spécificité
- Pour une réaction
- Pour l’interprétation d’un résultat
Courbes ROC
Reproductibilité (CV) / Précision
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I. 3. Interactions Ag/Ac (8/8) :
Détection et/ou dosage d’Ag :
Ag étalons
Ac de référence
Résultats quantitatifs ou qualitatifs
Détection et/ou titrage d’Ac :
Pas de sérum étalon
Ag de référence
Dépistage : résultat qualitatif
Titre : résultat semi quantitatif
Sérums de calibration
Seuil de positivité
Différence IgM / IgG
Ac d’infection / Ac protecteur
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I. 4. Quelles techniques utiliser ?
Techniques possibles :
Méthodes n’utilisant pas de marqueur : observation directe - Immunoprécipitation - Agglutination
- Neutralisation- Immunochromatographie
Méthodes utilisant un marqueur : observation indirecte- Radioimmunologie- Immunoenzymologie- Immunofluorescence
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II. IMMUNODOSAGES SANS MARQUEUR :
1. Agglutination
2. Précipitation
3. Neutralisation
4. Immunochromatographie
16
II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (1) :
a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Applications
Ag : présent à la surface d’une particule
Ac : agglutinines, IgM, liaison multivalente
Réseau tridimensionnel
Sensibilité : de 0,001 à 0,3 mg/L
Lecture : à l’œil
Détections / dosages d’Ag
Détections / titrages d’Ac
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II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (2) : a. Caractéristiques
b. Méthodologiesc. Applications
Agglutination directe : Ag directement particulaire (bactéries,
hématies …)
Agglutination passive, indirecte, conditionnée : Un Ag ou un Ac soluble qui est fixé artificiellement sur une particule inerte (latex …)
Test négatif
Test positif
AcAg
18
II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (3) :
19
_
+
II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (4) :
20
II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (5) : a. Caractéristiquesb. Méthodologies
c. Applications
Exemples :
Groupes sanguins
Test de Coombs direct et indirect
Sérotypage des bactéries
Sérodiagnostic des fièvres typhoïde et paratyphoïde, de la
brucellose
Sérodiagnostic de la Syphilis : THPA / VDRL
…
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II. 2. Réactions de PRECIPITATION (1) :
a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
Ag : Soluble
Ac : Précipitines, Ig polyclonales
Réseau tridimensionnel
Lecture : - Néphélémètre
- Turbidimètre- Oeil
Sensibilité : de 3 à 0,01 mg/L
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II. 2. Réactions de PRECIPITATION (2) : a. Caractéristiques
b. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
Précipitation en milieu liquide :
- Néphélémétrie
- Turbidimétrie
Précipitation en milieu gélifié :
- Immunodiffusion radiale : Mancini
- Immunodiffusion double : Ouchterlony
Techniques d’identification :
- Immunoélectrophorèse
- Immunofixation
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II. 2. Réactions de PRECIPITATION (3) : a. Caractéristiquesb. Méthodologies
c. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
Immunodiffusion radiale : Technique de Mancini :
Plaque de gélose contenant un Ac dans le gel en concentration connue Dépôt de l’Ag à doser dans un puits Diffusion sur plusieurs jours (2-10) Surface du disque généré proportionnelle à la quantité d’Ag
Technique simple, mais technique manuelle Dosage assez précis (CV < 10%) Faibles volumes de spécimens ( qq.mL ) Interférences : hémolyse, lactescence Peu adaptée aux grosses molécules (IgM)
24
Immunodiffusion double : Technique d’Ouchterlony :
Disque de gélose Diffusion sur plusieurs jours (~2) Méthode qualitative et comparative Interprétation parfois difficileQuantification approximative
II. 2. Réactions de PRECIPITATION (4) : a. Caractéristiquesb. Méthodologies
c. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
25
II. 2. Réactions de PRECIPITATION (5) : a. Caractéristiquesb. Méthodologies
c. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
Technique de Mancini : Technique d’Ouchterlony :
26
Technique de Mancini :
27
Technique d’Ouchterlony :
28
Technique d’Ouchterlony :
29
Electrophorèse en fusée (EID, Technique de Laurell)
– Ac mélangé avec gélose à pH 8,6
– Migration de l’Ag (~3-4h)
– Hauteur de l’arc = [Ag]
– Réfrigérer plaques de migration
Electrosynérèse– Dépôt des Ac et Ag en
puits– Migration à pH 8,0– Migration Ag par
électrophorèse– Migration Ac par
électroendosmose– Sensibilité > IDR– Nombreux faux positifs
II. 2. Réactions de PRECIPITATION (6) : a. Caractéristiquesb. Méthodologies
c. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
30
II. 2. Réactions de PRECIPITATION (7) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifié
d. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
Zone d’excès d’Ac Zone d’excès d’Ag
Zone d’équivalence
Anticorps ajouté
Ac
Pré
cipi
té
Piège majeur : EXCES d’ANTIGENE
Immunserums : Cheval : complexes
immuns maintenus + longtemps en solution
Lapin : limite de détection + basse
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Excès d’antigène :
Solubilisation des complexes Ag-Ac par les Ag libres
Même valeur du signal 2 valeurs différentes de la concentration en
analyte (risque = rendre une valeur normale ou très sous-estimée).
Solutions :
- 2nde addition d’Ag : pas de rebond du signal
- Mesure Vmax et tmax
- Aspect des pics d’immunoprécipitation en flux
continu
II. 2. Réactions de PRECIPITATION (8) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifié
d. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
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II. 2. Réactions de PRECIPITATION (9) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifié
d. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
Immunonéphélémétrie :
Déviation de la lumière par des complexes immuns en milieu
liquide (Cf chimie analytique)
Si échantillons dilués : minimisation de la réflexion et l’auto-
absorption, mais sources de forte intensité et photodétecteurs
sensibles
Problèmes :
- Excès d’Ag
- Diffusion « non immunologique » de la
lumière par particules en suspension ou des substances
lipidiques
- Nécessité d’analyseurs spécialisés
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Immunonéphélémétrie :
ÉchantillonSource lumineuse
Lumière non déviée
Lumière déviée
Cellule photoélectrique
+-
34
II. 2. Réactions de PRECIPITATION (10) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifié
d. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
Immunoturbidimétrie : Absorption de la lumière par des complexes immuns en milieu liquide (Cf
chimie analytique)
Nécessité d’une grande sensibilité des spectrophotomètres
Sur des analyseurs de biochimie
Problèmes :
- Excès d’Ag
- Interférences ictère, hémolyse et hyperlipémie
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IDR EID Néphélométrie Turbidimétrie
Rapidité 48h 3-4h Quelques minutes
Exécution Manuel Automatisé
Interprétation
Délicate Plus FacileValeur chiffrée directe
mais interférences possibles
Sensibilité~ 1 mg/L
EID < IDR Fonction du bruit de fond
→ 1 µg/L (latex)
Précision 8-10% 5% < 5%
II. 2. Réactions de PRECIPITATION (10) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifié
d. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
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II. 2. Réactions de PRECIPITATION (11) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquide
e. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
Immunoélectrophorèse (IEP, Grabar et Williams) Séparation des protéines par électrophorèse dans un gel d'agarose
Puis double diffusion contre des Ac spécifiques (~48h)
Méthode qualitative +++ et comparative
Faible coût
Quantification approximative
Personnel formé et expérimenté
Phénomène de zone si excès d’Ag
Cercle de précipitation avec cryoglobulines ou IgM polymérisées
Technique de référence pour m.e.e Ig monoclonale
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II. 2. Réactions de PRECIPITATION (11) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquide
e. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
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II. 2. Réactions de PRECIPITATION (12) :
Immunofixation : Séparation des protéines par électrophorèse dans un gel d'agarose (sur
plusieurs pistes)
Dépôt d’antisérums monospécifiques, individuellement sur chaque piste de
migration
Coloration des complexes immuns précipités
Dilution du sérum en fonction de la concentration en Ig totalespour limiter effet de
zone
Interférences analytiques : fibrinogène, lipides / hémolyse
Problèmes si cryoglobuline ou IgM polymérisée
Rapidité (<2h) et Facilité de lecture (plusieurs Ig MC)
Sensibilité > à l’IEP (mais attention aux erreurs par excès)
a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquide
e. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
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Immunofixation :
IgM Kappa
40
Immunofixation :
IgG et IgA Lambda
41
II. 2. Réactions de PRECIPITATION (13) :
Immunosoustraction : Mise en contact protéines et Ac spécifiques fixés sur billes de sépharose
Électrophorèse capillaire de zone (gel de PAA) sur les surnageant
Moins sensible que l’IF (pic étroit individualisable) => risque de faux négatifs
Automatisée
SPE Anti-IgG Anti-Kappa
a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquide
e. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
42
IEP IF IS
Rapidité ~ 48h < 4h ~ 30min
ExécutionPersonnel
expérimentéSimple
AutomatisableAutomatisé
Interprétation Subjective Assez facile Facile
Sensibilité ++ +++ +
Qualitatif Oui Oui Oui
Semi -quantitatif
Oui Non ±
Coût + +++ +++
II. 2. Réactions de PRECIPITATION (13) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquide
e. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications
43
II. 2. Réactions de PRECIPITATION (14) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identification
f. Applications
Dosage des protéines sériques :
– IgG, IgM, IgA
– Albumine
– CRP
– Haptoglobine …
Identification de :
– Ig monoclonale
– …
Recherche d’Ac :
– FR
– ASL
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II. 3. Réactions de NEUTRALISATION (1) :
Ag :
- enzyme (SLO)
- hémagglutinine virale / rubéole, grippe …
Ac :
- neutralisant
- IgA ou autres
- protecteur
Sensibilité :
- environ 1mg/L
45
II. 3. Réactions de NEUTRALISATION (2) :
Application :
Détection et titrage d’Ac anti Streptolysine O (ASLO) (Cf bactériologie)
(http://stl_bjb.ac-dijon.fr/biohum/bhaslo.htm)
Lyse des hématies
L’hémoglobine intra-
érythrocytaire est rejetée dans
le milieu
Action de la SLO sur les hématies :
Détection des ASLO par neutralisation :
Sérum qui contient des ASLO
Sérum qui ne contient pas d’ASLO
+
+
NEUTRALISATION
Pas de neutralisation
+
+
Pas de lyse des hématies, les SLO sont neutralisées
Lyse des hématies
SLOHématies
+
46
II. 3. Réactions de NEUTRALISATION (2) :
Puis dilutions successives du serum pour titrage des ASLO :
47
II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (1) :
Test de Détection Rapide
Technique sandwich
Recherche d’Ag :
- Streptocoque du groupe A
- Détection de toxines bactériennes
- Recherche de Plasmodium
- Recherche de médicaments
- Détection d’hormone
- …
Recherche d’Ac :
- Syphilis
- Maladie de Lyme
- Maladie coeliaque
- Ac anti tétanique
- …
48
migration
dépôt Contrôle migration
Si Ac+Si Ac+
CCAg
conjugué à particules d’or ou coloréAc Ac (sérum) ?(sérum) ?
C
Ag fixé Ac fixé
II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) :
49
migration
dépôt Contrôle migration
Si Ac-Si Ac-
C CAg conjugué à particules d’or ou coloréAc Ac (sérum) ?(sérum) ?
Ag fixéAc fixé
C
II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) :
50
migration
dépôt Contrôle migration
Si Ag+Si Ag+
C
C
Ac conjugué à particules d’or
Ag Ag (sérum) ?(sérum) ?
C
Ac fixé Ad fixé
II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) :
51
migration
dépôt Contrôle migration
Si Ag -Si Ag -
C
C
Ac conjugué à particules d’or
Ag Ag (sérum) ?(sérum) ?
C
Ac fixé Ag fixé
II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) :
52
Nég Pos
II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) :
Ininter-prétable
53
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
1. Principes et méthodologies de
base
2. ELISA
3. Immunofluorescence
4. Radioimmunologie
54
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
Réaction Ag-Ac avec Ag ou Ac marqué par un traceur
Différenciation traceur libre / traceur lié ([Ag-Ac])
- Signal mesuré après séparation (phase
hétérogène)
- Modification du signal (phase homogène)
Nombreuses techniques en fonction
- de la nature du traceur (isotopique, enzymatique,
luminescent, fluorescent)
- du procédé : indirect, compétitif ou sandwich
55
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
Procédé sandwich : (IRMA, IEMA, IFMA, ICMA)- En excès d’Ac- Réaction totale- Signal croissant avec la concentration d’Ag à doser
Avantages :- Sensibilité, précision , spécificité et domaine de mesure +
++- Praticabilité accrue
Mais :- Seulement pour les Ag de MM élevée (2 sites
antigéniques)- Effet crochet pour les concentrations élevées- Superspécificité, Ac hétérophiles (anti-Ig animales du
réactif)
Lavage Lavage Lavage
EE EE
S S
Puits avec l’Ac adsorbé
Ajout de l’Ag à doser
Ajout de l’Ac secondaire
conjugué à un enzyme
Ajout du substrat de l’enzyme et mesure
de l’intensité de coloration
[Ag]
Signal fraction
liée
56
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
Effet crochet : Chute paradoxale du signal mesuré en présence d'une forte concentration
de l'Ag à doser et obtention d'une courbe en cloche.
Même valeur du signal 2 valeurs différentes de la concentration en
analyte (risque = rendre une valeur normale ou très sous-estimée).
Solution : diluer
EE
EE
57
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
Procédé compétitif : (RIA, EIA, FIA, CLIA)- En défaut d’Ac- Réaction à l’équilibre- Signal décroissant avec la concentration d’Ag à doser
Avantages :- Pour tous les Ag (même les haptènes)- Phase homogène possible (FPIA, EMIT)
Mais :- Domaine de mesure restreint- Mauvaise précision, spécificité moindre, moins praticable
Lavage Lavage
E
S
Incubation de l ’Ac avec l’Ag
à doser Placer le mélange Ag-Ac dans un puits avec l’Ag adsorbé
Ajout de l’Ac secondaire
conjugué à un enzyme
Ajout du substrat de l’enzyme et mesure
de l’intensité de coloration
[Ag]
Signal fraction
liée
E
58
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
Procédé indirect : (IF, ELISA)- Signal croissant avec la concentration d’Ac à doser
Avantages :- Etude des classes et sous classes des Ac
Mais :- Problème d’expression des résultats
Lavage Lavage Lavage
EE EE
S S
Puits avec l’Ag adsorbé
Ajout de l’As spécifique à
doser
Ajout de l’Ac secondaire
conjugué à un enzyme
Ajout du substrat de l’enzyme et mesure
de l’intensité de coloration
[Ac]
Signal fraction
liée
59
Traceur Avantages Inconvénients
Radioactif
3H, 125I, 57Co - Faible encombrement stérique- Signal d’émission direct, spontané et spécifique- Précision, LD basses
- Législation- Gestion des risques, déchets, commandes- Peut être automatisée
Enzymatique
HRP, PAL, G6PD
- Pas d’appareillage spécialisé- Simplicité du marquage
- LD moins bonnes- Très dépendant des conditions opératoires - Faible dynamique du signal - Automatisable
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
60
Traceur Avantages Inconvénients
Fluorescent
Fluorescéine4MUP£
Chélates de lanthanides (Eu)
- Facilité de marquage- Stabilité du traceur- Précision, LD basses
- Quenching- Conventionnels : *LD peu favorables *Interférences *Faible dynamique du signal
Luminescent
LuminolEsters acridiumDioxétanesSels de Ru
- Stabilité du traceur- Signal très spécifique- Acquisition rapide et grande dynamique du signal
- Quenching- Signal fugace- Appareillage spécialisé
Rq : 4MUP : 4 methyl umbelliferyl phosphate
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
61
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur lequel une enzyme a été fixée
Marqueurs :
- Phosphatase alcaline, peroxydase
- Ag ou Ac marqué par une enzyme
Révélation par un :
- Substrat chromogène : spectrophotomètre
- Substrat luminogène : chimiluminescence
Phase hétérogène
Sensibilité : environ 0,00001 mg/L
Résultats qualitatifs, semi quantitatifs ou quantitatifs
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III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
Méthodologies :
ELISA indirect
ELISA compétitif
ELISA sandwich
Chimioluminescence
Techniques dérivées :
- Western Blot
- ELISPOT
- Immuno peroxydase
1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
63
ELISA par compétitionRecherche d’un Ac
P
P signal
[Ac] à doser
Ac marqués à la phosphatase alcaline
Ac à doser
P
Lecture spectrophotométrique
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
64
ELISA indirectRecherche d’un Ac
E
EE
Ag fixé sur le support (cupule)
Ac recherché
Ac anti Ig totales ou de classe marqué par une enzyme
Révélation substrat chromogène
E
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
65
ELISA sandwichRecherche d’un Ag
E
E
Ac spécifiques de l’Ag recherché
Ag recherché
Ac spécifiques de l’Ag recherché
Ac anti Ig marqués par une enzyme
Révélation Révélation substrat substrat chromogènechromogène
E
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
66
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
Technique dérivée : Immunotransfert = immuno-empreinte = Western Blot :
Séparation par électrophorèse sur gel de PAA (+ résolutif)
Transfert sur une membrane (de nitrocellulose, par exemple)
Dépôt d'un Ac spécifique, suivi d'un second Ac marqué par une enzyme
Pour l’analyse et l’identification des Ac
Technique longue
Sensibilité +++ (20 µg/mL)
Faible coût, interprétation facile
1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
67
Western BlotWestern Blot
Ag fixés sur le support
Ac recherchés
Ac de chèvre anti IgG marqués à la phosphatase alcaline
P
PM
P
P P P P P
P P P P P P
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
68
Western Blot HIV1
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
69
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
Ac anti histones
1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
70
Ac Anti ribosomes
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
71
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
Technique dérivée : ELISPOT Dénombrement au sein d’une suspension hétérogène des cellules sécrétant
des Ac spécifiques ou des cytokines.
Sensibilité +++ (10-5)
Elimination des cellules et Lavage
E
Puits avec l’Ac anti-cytokine
adsorbé
Ajout de l’Ac anti-cytokine
conjugué à un enzyme
S NS
SNS
Ajout de la population de
cellules à tester
S
Ajout du substrat de l’enzyme et
dénombrement des spots
Puits vu de dessus
Spot = emplacement de la cellule sécrétrice
1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
72
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
Technique dérivée : ELISPOT
1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
73
1 : Ag ?2 : Ac spécifique3 : Anti Ig4 : Avidine-biotine-peroxydase
Technique dérivée : Immunopéroxydase
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
74
Ag :– Recherche d’Ag
bactériens, viraux fongiques, parasitaires
– Dosages hormonaux– Dosages de
médicaments– …
Ac :– Auto immunité– Sérologies
bactériennes– Sérologies virales– Sérologies parasitaires– IgE spécifiques– …
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
Applications de l’ELISA :
1. Principes et méthodologies de base
2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
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III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA
3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
IF : IMMUNOFLUORESCENCE : Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur lequel un produit fluorescent a
été fixé
Marqueurs :
- fluorescéine, rhodamine, phycoérythrine
- Ag ou Ac marqué par un produit fluorescent
Phase hétérogène
Révélation au microscope à fluorescence
Utilisation de banques d’images
Sensibilité : environ 0,1 mg/L
Résultats qualitatifs ou semi quantitatifs
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III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
IF : IMMUNOFLUORESCENCE : IF directe : détection d’Ag surtout
IF indirecte : détection d’Ac surtout
- Ac anti isotype
- Protéine A
IF sandwich
Techniques dérivées :
Cytométrie en flux = FACS
Technique Multiplex
Microscopie confocale
1. Principes et méthodologies de base2. ELISA
3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
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III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA
3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
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III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA
3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
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III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA
3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
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III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA
3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
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Cytométrie en Flux = CMF
– Numération des cellules exprimant un Ag au sein d’une suspension hétérogène
– Ac monoclonaux conjugués à des fluorochromes
– Analyse multiparamétrique :
• taille (petits angles)
• granulosité (à 90°)
• intensité de fluorescence de plusieurs fluorochromes différents / seuil de positivité
– Plusieurs milliers de cellules en quelques secondes
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA
3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie
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Cytométrie en Flux / Principes
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
LentilleLentille
Poubelle
Tube collecteur 1 Tube collecteur 2
Plaque + Plaque -
Laser Photodiode
Suspension cellulaire
Liquide de gaine
PMT 2
PMT 1
PMT 3
Filtres dichroïques
Taille (FSC)
Granulosité (SSC)Filtres
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Cytométrie en Flux
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
Cytométrie en Flux / Expression des résultats
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
Cytogramme en 2 dimensions
Sélection d’une population à analyser
Ly T CD8+Ly T CD8-
Ly CD8+ CD3-
Cytométrie en Flux
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
Histogramme Histogramme avec superposition d’un
marquage spécifique et anticorps de contrôle
(irrelevant)
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Principe : Combinaison d’une détection de fluorescence en cytométrie sur des billes
spécifiques d’un analyte. Utilisation de différentes billes, repérables chacune par leur intensité de
fluorescence rouge et orange. Pour chaque type de bille on réalise un immunodosage en fluorescence d’un
analyte.
Technique Multiplex
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :
Incubation du milieu avec le mélange de billesLavage, incubation avec le système de révélationPassage des billes sur un « cytomètre »
spécifique
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RIA = RADIO IMMUNOASSAY
Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur le quel un radio-isotope a été fixé
Marqueurs :
-125 I,3H
- Ag ou Ac marqué par un radio-isotope
Révélation par comptage
Sensibilité: environ 0,00001 mg/L
Phase hétérogène
Résultats quantitatifs
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence
4. Radioimmunologie
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Méthodologies : RIA indirect : Ac
Ac anti isotype
Protéine A
RIA compétitif : Ag et Ac
RIA sandwich : Ag et Ac
III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence
4. Radioimmunologie
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IV. CONCLUSIONS :
Nombreuses techniques possibles : Pièges Limites Avantages
Choix de la technique en fonction de : Sensibilité Spécificité Matériel dont on dispose Prix de revient Nombre de tests
Automatisation ou coup par coup Temps Nature du prélèvement Ag ou Ac Classe des Ig Rendu du résultat : qualitatif, quantitatif ou semi quantitatif …
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