Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc

Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrieLaboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrieÚstav experimentální botanikyÚstav experimentální botaniky

OlomoucOlomouc

http://www.ueb.cas.cz/olomouc1

Pavlína KovářováPavlína Kovářová

Analýza a třídění Analýza a třídění chromozomůchromozomů

Průtokový cytometr

BD FACSVantage (2 lasery, 8 parametrů)

Analýza: Mikrospóry

Protoplasty

Buněčná jádra

Chromozómy

Chloroplasty

Schéma průtokového cytometru

Laser.......

.

.Unášecí tekutina

Regulátortlaku

Průtoková komora

+-

Sběrná zkumavka

Vzorek

Vychylovacídestička

Elektrickýpulz

Vychylovacídestička

DetektorLaser

Vychylovacídestička

Vychylovacídestička

Odpad

Do leva tříděné kapky Do prava

tříděné kapky

Princip třídění

Analýza optických parametrů: fluorescence a rozptyl Společná analýza osmi parametrů Rychlost třídění (102 – 104 chr./ sec)

Materiál používaný k přípravě suspenze chromozomů: Buněčné kultury Protoplasty listového mezofylu Meristemy kořených špičky

Příprava suspenze chromozomů

Extrakce chromozomů

Cytometrická analýza

PřípravaBuněčná synchronizace

Akumulace v metafázi

Barvení chromozomů

Třídění chromozomů

Flow karyotyp

Idiogram

Relativní obsah DNA

Frek

venc

e

Idiogram Flow karyotyp vyjadřuje závislost relativního obsahu DNA na počtu daného typu chromozomů

Detekce strukturálních a početních změn chromozomů v karyotypu

Teoretický flow karyotyp

Flow karyotyp

Relativní intenzita fluorescence

Rela

tivvn

í fre

kven

ce ChineseSpring I

II

III

I: 1D, 4D, 6D; II: 1A, 3A, 6A, 2D, 3D, 5D, 7D; III: 2A, 4A, 5A, 7A, 1B, 2B, 4B, 5B, 6B, 7B

3B

3B

Vrana et al. (2001)

Hexaploidní pšenice (1C = 17 000 Mbp)

Identifikace a určení čistoty tříděné frakce :FISHPRINS PCR

Použití chromozomových linií :Použití chromozomových linií : Translokační linieTranslokační linie Deleční linieDeleční linie Adiční linieAdiční linie

Specifické chromozomové barveníSpecifické chromozomové barvení AT a GC nukletidových bazíAT a GC nukletidových bazí

Diskriminace jednotlivých chromozomů

Kromě chromozomu 3B je v histogramu oddělený pík pro translokační chromozomy 5BL·7BL a 4AL·4AS-5BL, které můžeme snadno třídit. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem.

Třídění translokačních linií u pšenice

„Cappelle Desprez“

Relativní intenzita fluorescence

Rela

tivní

frek

venc

e

3B

I

II

III

„Jubilar“

Relativní intenzita fluorescence

Rela

tivní

frek

venc

e I

II

III

3B

4AL·4AS-5BL

4AL·4AS-5BL

5BL·7BL

5BL·7BL

Kubalakova et al. (2002)

Jednotlivá ramena chromozomů můžeme třídit z ditelosomockych linií nebo z linií nesoucích izochromozomy. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem

„Chinese Spring“ iso5BL

Relativní intenzita fluorescence

Rela

tivní

frek

venc

e

3B

II

III

Třídění chromozomových ramen u pšenice

I

iso5BL

iso5BL

„Chinese Spring“ Dt1BS

Relativní intenzita fluorescence

Rela

tivní

frek

venc

e

3B

I

IIIII1BS

1BS

Kubalakova et al. (2002)

Adiční linie pšenice a žita

Jednotlivé chromozomy žita mohou být tříděny z adiční linie pšenice–žito. Tříděné žitné chromozomy jsou identifikovány FISH s pSc119.2 repeticí a GAA mikrosatelitem.

T. aestivum (21'' + 1'' 6R)

Relativní intenzita fluorescence

Rela

tivní

frek

venc

e

6R3B

6R

II

IIII

Secale cereale „Selgo“

Relativní intenzita fluorescence

Rela

tivní

frek

venc

e 5BL·7BL1R - 6R

Kubalakova et al. (2003)

Kubalakova et al. (2003)

Secale cereale „Adams“

Relativní intenzita fluorescence

Rela

tivní

frek

venc

e

2R - 7R

1R

B

119 Afa

Translokace BS·BL-1RS

5S45S

Afa45S

DAPI

Tato translokace byla detekována u 0.5% tříděných B chromozomů

B

Detekce vzácných strukturálních změn genomu

Průtoková cytometrie umožňuje analýzu velkého množství chromozomů (<103) a tím detekci vzácných strukturálních změn.

“High-resolution” FISH na natažených chromozomech

Valarik et al. (v tisku)

Tříděné chromozomy mohou být nataženy až na 100 x větší délku, než byla ta původní, čímž se výrazně zlepší prostorové rozlišení až o dva řády.

PI

BAC9

17 μm (1x)

1352 µm (79.5x)

42 µm Chromosome 3B(T. aestivum)

Gelová elektroforeza

PCR

1 2 3 4 5 6

TříděníI II III IV

Standartní karyotyp

1 2 3 4

I II

Translokace

5 6

Třídění 102 chromozomů trvá jen několik minut, proto je PCR velmi výhodným nástrojem k fyzickému mapování.

Fyzické mapování pomocí PCR se specifických primerů

Konstrukce chromozomově specifických BAC knihoven

Ligace do defosforylovaného

BAC vektoru

E. coli transformace

Izolace vysokomolekulárni

DNA

Cytometrická analýzaa třídění

I

IIIII

3B

ChineseSpring

2 3 S1kbp

- 2200

- 825

- 225- 50

Kolonie

Uspořádání na 384-jamkové destičky

3 BAC DNA knihovny byly konstruovány z tříděných chromozomů pšenice:

• 3B chromosomově-specifická BAC knihovna

• 1D, 4D, 6D subgenomicka BAC knihovna

• BAC knihovna specifická pro chromozomové rameno 1BS

Šafář et al. (přijato do tisku); Janda et al. (v přípravě)

V BAC knihovně hledáme specifické klony, které mapujeme na mitotických chromozomech pomocí in situ hybridizace.

Filtr po hybridizaci s genomickou DNA

Málo repetitivní BAC

Vysoce repetitivní BAC

BACDAPI

Tříděné 3B chromozomy

Fyzické mapování BAC klonů na tříděné chromozomy

63C11 63B13 63N2 81B7

Závěr

Průtoková cytometrie může být použita ke třídění mitotických chromozomů zemědělsky významných obilovin a leguminóz.

Flow karyotyping je vhodný ke kvantitavní detekci numerických a strukturálních změn chromozomů

Tříděné chromozómy jsou vhodné pro fyzické mapování použitím FISH, PRINS and PCR

Tříděné chromozomy lze využít ke konstrukci chromozomově specifických BAC knihoven

Naše laboratořNaše laboratoř

http://www.ueb.cas.cz/olomouc1