KULIAH 5. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Almawati 1

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Almawati 2

Kromatografi secara umum adalah suatu metode pemisahan cuplikan diantara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi mengunakan Fase diam berupa zat padat sedangkan fase gerak berupa zat cair yang dialirkan dengan dengan bantuan tekanan dan hasilnya dideteksi dengan instrumentasi.

Almawati 3

JENIS KROMATOGRAFI KOLOM• Kromatografi Adsorbsi, komponen yg

dipisahkan scr selektif teradsorbsi pd permukaan adsorben yg dipakai u/bhn isian kolom.

• Kromatografi Partisi, komponen mngalami partisi antara lapisan cairan tipis pd penyangga padat yg bertindak sbg fase stasioner & eluen yg bertindak sbg fase gerak (mobil).

JENIS KROMATOGRAFI KOLOM• Kromatografi Pertukaran Ion, memisahkan

komponen yg berbentuk ion yg terikat pd penukar ion sbg fase stasioner scr selektif akan terlepas/terelusioleh fase mobil.

• Kromatografi Filtrasi Gel, kolom diisi dg gel yg permeabel sbg fase stasioner, dan pemisahan berlangsung spt proses pengayakan yg didasarkan pd ukuran molekul dr komponen yg dipisahkan.

The 4 basic liquid chromatography modes are named according to the mechanism involved:

 1. Liquid/Solid Chromatography (adsorption chromatography)

A. Normal Phase LSC

B. Reverse Phase LSC

 2. Liquid/Liquid Chromatography (partition chromatography)

A. Normal Phase LLC

B. Reverse Phase LLC

 3. Ion Exchange Chromatography

 4. Gel Permeation Chromatography (exclusion chromatography)

FOUR BASIC LIQUID CHROMATOGRAPHY

Almawati 7

MOBILE PHASE LIQUID

Liquid-LiquidChromatography (Partition)

Liquid-SolidChromatography (Adsorption)

Liquid Solid

Normal Phase Reverse Phase Normal Phase Reverse Phase

Mobile Phase - NonpolarStationary phase - Polar

Mobile Phase - PolarStationary phase - Nonpolar

FORMAT

STATIONARYPHASE

Types of ChromatographyTypes of Chromatography

Almawati 9

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah gravitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Almawati 10

HPLC FASE NORMAL (Kolom dan pelarut)

a. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

b. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

a. ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.

b. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Almawati 13

Schematic of an HPLC instrument

Almawati 14

HPLC secara Sederhana

Almawati 15

Instrumentation• Instruments

required:– Mobile phase

reservoir– Pump– Injector– Column– Detector – Data system

Almawati 16

INSTRUMENTASI

1. Pompa, merupakan salah satu bagian terpenting dalam sistem KCKT dan berfungsi untuk mengalirkan fase gerak ke dalam kolom. Pompa ada 2 jenis, yaitu: pompa tekanan tetap dan pompa volume tetap

2. Injektor, berfungsi untuk memasukkan cuplikan ke dalam kolom. Injektor pada HPLC terdiri atas injektor septum dan autoinjektor.

3. Kolom, merupakan jantung dari KCKT yang berfungsi sebagai alat untuk memisahkan masing-masing komponen. Kolom umumnya terbuat dari baja tahan karat dengan diameter 2-6 mm dan panjang 10-30 cm.

Almawati 17

4. Detektor, berfungsi untuk mendeteksi komponen yang ada pada eluat dan mengukur jumlahnya. Detektor ada beberapa macam, diantaranya:a. Detektor UVb. Detektor Elektrokimiac. Detektor Indeks Biasd. Detektor Konduktivitase. Detektor Fotometrikf. Detektor Fluoresen

5. Integrator, berfungsi mengubah sinyal kromatografi menjadi bentuk angka secara otomatis dan sangat tepat

6. Recorder, untuk mencatat sinyal yang ditangkap oleh detektor

Almawati 18

HPLC adalah metode analisa fisikokimia yang merupakan teknik kromatografi dengan fase gerak dan fase diam padatan.

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.

HPLC menggunakan partikel/material yang berukuran sangat kecil, yang dipadatkan dalam kolom sehingga memberikan luas permukaan yang lebih besar untuk berinteraksi antara fase diam dan molekul yang melintas.

Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Almawati 19

Keuntungan HPLC:1. Mudah2. Analisis cepat dengan kepekaan yang tinggi3. Resolusi baik4. Dapat digunakan bermacam-macam detektor5. Kolom dapat digunakan kembali6. Pemisahan molekul baik.

Kerugian HPLC:1. Hanya untuk senyawa yang dapat larut dalam fase gerak2. Mahal3. Perlu perawatan

Almawati 20

POMPAPompa yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan, antara lain:

1. Dapat memompakan fase gerak secara konstan (0,1 –10 ml/menit)

2. Dapat memberikan tekanan yan cukup tinggi3. Memberikan fluktuasi tekanan yang cukup

tinggi4. Memberikan ganguan (derau) yang rendah5. Cara kerja sederhana6. Cukup lembam terhadap pelarut-pelerut yang

umum digunakan

SOLVENTSPolar Solvents

Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile

 Non-polar Solvents

N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane

Almawati 22

Fase Gerak

Fungsi fase gerak membawa analit untuk masuk dan keluar dari kolom.

Pertimbangan pada pemilihan fase gerak, antara lain:

1. Sifat dan polaritas analit/sampel2. Polaritas pelarut

Almawati 23

Detektor

Pertimbangan pemilihan detektor, antara lain:1. Sensitivitas2. Linieritas3. Reprodusibel4. Mudah dioperasikan5. Mudah perawatan

1.1. Ultraviolet Detector Ultraviolet Detector 200-400nm 200-400nm 254 nm 254 nm

2.2. Reflective Index DetectorReflective Index DetectorUniversal DetectorUniversal Detector

DetectorsDetectors

Urutan Prioritas Pemilihan Detektor

• Detektor UV (254 atau 280 nm)• Detektor UV-Vis• Detektor Fluoresensi• Detektor Universal: - Indeks Bias- Elektrokimia

Urutan Fungsi Analisis Detektor

• Kuantitatif1.Kadar Besar: Detektor UV-Vis2.Kadar Kecil: Detektor Fluoresensi• Preparatif: Detektor UV-Vis• Kualitatif: - Detektor UV-Vis

- Detektor Fluoresensi - Gabung dengan SM

Almawati 27

Almawati 28

Diagram alir HPLC

Almawati 29

KOLOM

Kolom dapat dibagi atas 2 kelompok, antara lain:• Kolom Analitik: diameter dalam 2-6mm, panjang

kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom.- Untuk kemasan pellicular, panjang yang

digunakan adalah 50-100cm. - Untuk kemasan Mikropartikulat, panjang 10-

30cm. Dewasa ini ada yang hanya 5 cm

• Kolom Preparatif: umumnya memiliki diameter 6mm atau lebih besar dan panjang kolom 25-100cm.

KOLOM• Panjang 10-25 cm dan diameter 4,5-5,0 mm

yg diisi dg fase stationer berukuran rata-rata 5-10mm dr bahan stainless steel

• Pengisi Kolom dapat berupa: Oktil Silan(C8), Okta Desil Silan (C18), silica, senyawa Sianida dan senyawa lain.

Almawati 33

KOLOMPertimbangan pemilihan Kolom,

antara lain:1.Sifat analit2.Isi Kolom3.Efisiensi Kolom4.Panjang Kolom5.Diameter kolom6.Tekanan dalam Kolom7.Informasi dari pustaka,kolega dan

produsen

Almawati 34

Injector port & hplc Syringe

Almawati 35

Almawati 36

Almawati 37

Almawati 38

Almawati 39

Column

• Small (~10 µm) silica or polymer particles containing a network of uniform pores

• Two types (diameters of 5 ~ 10 µm)– Polymer beads– silica-based particles

Almawati 40

Almawati 41

Almawati 42

Colomn TubingGuard Colomn

Almawati 43

Almawati 44

Almawati 45

Disposable membrane disc syringe filter

Almawati 46

Almawati 47

Analisa KuantitatifPerhitungan kuantitatif penggunaan HPLC, terdapat beberapa metode, antara lain:

1. Eksternal Standarkonsentrasi sampel = luas area sampel X konsentrasi standar

luas area standar

2. Internal Standarrasio luas puncak = luas puncak sampel

Luas puncak Internal standar

konsentrasi larutan sampel dapat dihitung dengan menggunakan persamaan pada perhitungan menggunakan eksternal standar

Almawati 48

3. Adisipada cara ini ditambahkan sejumlah tertentu standar pada sampel, hal ini dilakukan bila kadar sampel terlalu rendah.

METODE PENGUKURANa. Metode Tinggi Puncakb. Metode Luas Area Puncak

- Metode Segitiga- Metode Planimetri- Metode Potong dan Timbang- Metode Integrator

Almawati 49

Kromatogram

Almawati 50

Metode segitiga

Almawati 51

Almawati 52

Dapat juga dihitung rasio peak B terhadap peak A dengan menggunakan area

Almawati 53

Almawati 54

YouTube - hplc autosampler.mp4

YouTube - HPLC.flv