JORGE ISAAC GARCIA PAEZ - Biblioteca Digital de Teses e ......JORGE ISAAC GARCIA PAEZ Caracterização de mecanismos de resistência as ... Jorge Isaac Garcia Paez. -- São Paulo,
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JORGE ISAAC GARCIA PAEZ
Caracterização de mecanismos de resistência as
quinolonas e sulfametoxazol/trimetoprima de isolados
clínicos de Stenotrophomonas maltophilia
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para a obtenção do
título de Doutor em Ciências
Programa de Doenças Infecciosas e Parasitárias
Orientador: Dra Silvia Figueiredo Costa
São Paulo 2011
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Paez, Jorge Isaac Garcia Caracterização de mecanismos de resistência as quinolonas e
sulfametoxazol/trimetoprima de isolados clínicos de Stenotrophomonas maltophilia /
Jorge Isaac Garcia Paez. -- São Paulo, 2011.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Programa de Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Orientadora: Silvia Figueiredo Costa.
Descritores: 1.Stenotrophomonas maltophilia 2.Infecções bacterianas
3.Resistência a trimetoprima 4.Sulfametoxazol 5.Fatores de resistência
6.Quinolonas
USP/FM/DBD-301/11
DEDICATÓRIA
Aos meus pais e irmãos, na distancia sempre juntos.
A minhas meninas lindas Gabriela e Clara. A minha luz e inspiração Lorena.
AGRADECIMENTOS
A Dra. Silvia Figueiredo Costa, pela paciência, apoio e orientação exemplar.
A Juliana Ferraz Rosa, pela dedicação a este projeto.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Investigação Médica (LIM-54) da
FMUSP, Inneke van der Heeijden , Liang Fung , Anna Mostachio , Mauro
Giudice, Andréia Alcaia, Camila Risek , Anne Vasquez, Ana Paula Marchi,
Maria Cursino, Denise Rodrigues, Gabriela Ferreira, Jessika Zerbini, Camila
Campi, Bruno Stuart.
A Monica Pavez do Laboratório de microbiologia da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da USP.
A Dr. Antonio Nicodemo, Dr. Antonio Pignatari e Dr. Nilton Lincopan pela
colaboração e sugestões propostas na qualificação.
NORMALIZAÇÃO ADOTADA
Esta dissertação está de acordo com as seguintes normas, em vigor no
momento desta publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals
Editors (Vancouver)
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia Freddi, Maria F.
Crestana, et al 2ª ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação;
2005.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals
indexed in Index Medicus.
SUMÁRIO
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Resumo
Summary
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 1
2 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................... 4
2.1 Taxonomia ......................................................................................... 5
2.2 Microbiologia ...................................................................................... 5
2.3 Epidemiologia ..................................................................................... 6
2.4 Infecções causadas por S. maltophilia ............................................... 8
2.5 Sensibilidade ...................................................................................... 9
2.6 Tratamento ....................................................................................... 14
2.7 Sinergismo ...................................................................................... 21
2.8 Mecanismos de resistência da S. maltophilia ................................... 23
2.9 Justificativa ....................................................................................... 31
3 OBJETIVOS.............................................................................................. 32
4 MÉTODOS ............................................................................................... 34
4.1 Local ............................................................................................... 35
4.2 Amostras bacterianas ..................................................................... 35
4.3 Teste de Sensibilidade .................................................................... 36
4.4 Teste fenotípico para avaliação de efluxo ........................................ 39
4.5 Caracterização de genes de resistência ......................................... 40
4.6. Avaliação do Integron ..................................................................... 43
4.7 Sequenciamento ............................................................................. 44
4.8 Transferencia plasmidial por choque térmico ................................... 44
4.9 Tipagem molecular – Protocolo para caracterização molecular por eletroforese de campo pulsado (PFGE) ..................................... 47
5 RESULTADOS ......................................................................................... 51
5.1 Identificação das cepas de S. maltophilia ........................................ 52
5.2 Dados demograficos ........................................................................ 54
5.3 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos ..................................... 55
5.4 Teste de sensibilidade com inibidores de bomba de efluxo ................ 60
5.5 Reação de amplificação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção dos genes de resistência ao sulfametoxazol/ trimetoprima ..................................................................................... 61
5.6 Sequenciamento dos genes relacionados à resistência para SMX/TMP ......................................................................................... 62
5.7 Análise dos elementos genéticos movéis ......................................... 64
5.8 Reação de amplificação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção dos genes de resistência as quinolonas ........................... 66
5.9 Avaliação de mutações genéticas de genes relacionados à resistência as quinolonas ................................................................. 67
5.10 Avaliação da sequencia genética dos genes qnr ............................. 72
5.11 Avaliação da sequencia genética dos genes da enzima N-acetil transferase aac(6’)-ib-cr ................................................................... 83
5.12 Avaliação da sequencia genética dos genes smeD e smeT ............... 87
5.13 Análise plasmidial de amostra positiva para o gene aaac(6’)-ib-cr .. 87
5.14 Análise da clonalidade dos isolados resistentes ao sulfametoxazol/trimetoprima ............................................................ 88
5.15 Análise da clonalidade dos isolados resistentes ao levofloxacino .... 90
6 DISCUSSÃO............................................................................................. 92
7 CONCLUSÕES ....................................................................................... 105
8 REFERÊNCIAS ...................................................................................... 107
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Reação de PCR para detecção do gene iscr2 em isolados
resistentes a SMX/TMP de S. maltophilia .................................... 62
Figura 2. Representação esquemática da sequencia iscr2 e genes
adjacentes de uma amostra positiva para o gene sul2 de S.
maltophilia .................................................................................... 64
Figura 3. Representação esquemática do integron classe 1 em
amostra de S. maltophilia resistente a SMX/TMP com CIM
de >125 µg/mL ............................................................................. 65
Figura 4. Representação esquemática do integron classe 1 em
amostra de S. maltophilia resistente a SMX/TMP com CIM
de 8 µg/mL ................................................................................... 65
Figura 5. Reação de PCR para detecção do gene smeT em isolados
de S. maltophilia resistentes ao levofloxacino .............................. 66
Figura 6. Reação de PCR para detecção do gene smeT em isolados
resistentes a levofloxacino de S. maltophilia ................................ 88
Figura 7. Representação do perfil de clonalidade obtido a partir do
método de PFGE com a enzima SpeI, de 13 amostras
positivas para o gene sul1 de S. maltophilia com resistência
a sulfametoxazol/trimetoprima. .................................................... 89
Figura 8. Representação do perfil de clonalidade obtido a partir do
método de PFGE com a enzima SpeI, de 18 amostras de S.
maltophilia com resistência ao levofloxacino ............................... 91
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estudos de sensibilidade utilizando a metodologia de
microdiluição em caldo. ............................................................. 12
Tabela 2. Estudos de sensibilidade utilizando a metodologia de
microdiluição em Agar. .............................................................. 13
Tabela 3. Oligonucleotideos iniciadores .................................................... 42
Tabela 4. Oligonucleotideos iniciadores para determinação da posição
do gene sul1 no integron de classe 1 ........................................ 43
Tabela 5. Critérios interpretativos para análise de tipagem molecular ...... 50
Tabela 6. Distribuição dos 106 isolados de S. maltophilia por sítio de
isolamento ................................................................................. 53
Tabela 7. Distribuição das infecções por Stenotrophomonas maltophilia .. 54
Tabela 8. Diagnóstico de base dos pacientes com infecção por
Stenotrophomonas maltophilia................................................... 54
Tabela 9. Sensibilidade de oito antimicrobianos pelo método de
microdiluição de 106 isolados de S. maltophilia. ........................ 55
Tabela 10. Concentrações inibitórias mínimas (CIM50 e CIM90) pelo
método de microdiluíção de 106 isolados de S. maltophilia ...... 55
Tabela 11. Caracteristicas das 23 amostras resistentes a SMX/TMP ......... 57
Tabela 12. Perfil de resistência das 23 amostras de S. maltophilia
resistentes a SMX/TMP ............................................................. 58
Tabela 13. Caracteristicas das 19 amostras resistentes ao levofloxacino ... 59
Tabela 14. Concentração inibitória mínima (CIM) com a presença ou
ausência dos inibidores de efluxo reserpina e CCCP em
amostras sensíveis ou resistentes a levofloxacino. ................... 60
Tabela 15. Avaliação das sequencias genéticas da girase A em 17
amostras de S. maltophilia ......................................................... 72
Tabela 16. Avaliação das sequencias genéticas dos genes qnr de 13
amostras de S. maltophilia ......................................................... 82
RESUMO
Paez JI. Caracterização de mecanismos de resistência as quinolonas e sulfametoxazol/trimetoprima em isolados clínicos de Stenotrophomonas maltophilia [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2011. 121p. Stenotrophomonas maltophilia é um bacilo Gram-negativo, não fermentador, considerado um microorganismo pouco virulento, relacionado principalmente a infecções associadas à assistência a saúde. A S. maltophilia apresenta um padrão de resistência intrínseca à maioria das classes de antibióticos. A droga de escolha para o tratamento das infecções por S. maltophilia é a sulfametoxazol/ trimetoprima (SMX/TMP). Entretanto, estudos atuais relatam o aumento da resistência a esse antibiótico, o que limita assim as opções para terapia efetiva. Outras opções de tratamento são o levofloxacino e a tigeciclina, porém, faltam estudos clínicos e in vitro dessas drogas. A proposta deste estudo foi avaliar os possíveis mecanismos de resistência a SMX/TMP e as quinolonas em isolados clínicos de pacientes internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas e do Hospital A.C. Camargo. Foram avaliadas 106 amostras de S. maltophilia isoladas de pacientes adultos com infecção relacionada à assistência a saúde, internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas da FMUSP e no Hospital de Câncer A.C Camargo durante o período de dezembro de 2008 a dezembro de 2010. A sensibilidade à SMX/TMP foi de 78,3%, para levofloxacino de 82% e 14,2% para cirpofloxacino, para minociclina de 100% e tigeciclina 91,6%. Foi realizado PCR para detecção dos genes sul1, sul2 e dfrA1 para avaliar a resistência à SMX/TMP, os genes int1 e iscr2 para avaliação da presença de elementos genéticos móveis e os genes gyrA, qnr, smeD, smeT e aac(6’)-Ib-cr para avaliação da resistência as quinolonas. Quatorze amostras (13,2%) foram positivas para o gene sul1. Desses isolados, nove amostras apresentavam resistência ao SMX/TMP com CIM50 de 8 µg/mL e CIM90 de 128 µg/mL. Cinco amostras positivas para o gene sul1 foram sensíveis a SMX/TMP com CIM50 de 1 µg/mL e CIM90 de 1 µg/mL. A sequencia do integron1 da amostra com CIM >125 µg/mL mostrou um tamanho aproximado de 4000 pb contendo os genes cassetes aac4 e aadA1 e a região qac/sul1. Uma amostra resistente a SMX/TMP foi positiva para o gene sul2 localizado na transposase-like ISCR 2. Observamos a presença de quatro novos qnr em cepas de S. maltophilia e a presença da enzima aac(6’)-ib-cr em 4 amostras. 100% das cepas foram positivas para o gene do sistema de efluxo smeDEF e 12/38 amostras tiveram o gene smeT do sistema de efluxo smeDEF, ,porém não foi observada mutação nesse gene. Na sequencia de aminoácidos da girase A de 15 amostras resistentes a levofloxacino não observamos mutações relacionadas à resistência a quinolonas. As cepas resistentes a SMX/TMP apresentaram um padrão policlonal. Dezoito amostras resistentes ao levofloxacino apresentaram 14 perfis clonais, distribuídos em 10 clusters. S. maltophilia exibe múltiplos mecanismos de resistência, nesse estudo observamos um grande número de cepas com elementos genéticos móveis carregando o gene sul1 e outros
genes de resistência. A S. maltophilia pode ser um importante reservatório de transmissão de genes de resistência.
Descritores: 1.Stenotrophomonas maltophilia 2.Infecções bacterianas 3.Resistência a trimetoprima 4.Sulfametoxazol 5.Fatores de resistência 6.Quinolonas
SUMMARY
Paez JIG. Characterization of mechanisms of resistance to quinolones and sulfamethoxazole/trimethoprim in clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2011. 121p. Stenotrophomonas maltophilia is a gram-negative, non-fermenter,
considered a low virulent organism, mainly related to healthcare associated
infections. S. maltophilia shows a pattern of intrinsic resistance to many
classes of antibiotics. The drug of choice for the treatment of infections
caused by S. maltophilia is SMX/TMP, however, current studies have
reported increased resistance to this antibiotic, thus limiting the options for
effective therapy. Among the treatment options appear tigecycline and
levofloxacin, but clinical trials and studies in vitro to such drugs are lacking.
The purpose of this study was to evaluate the possible mechanisms of
resistance to SMX/TMP and quinolones in clinical isolates from patients
admitted to the Institute's Central Clinical Hospital and the Hospital A.C
Camargo. We evaluated 106 strains of S. maltophilia isolated from adult
patients with healthcare associated infections, at the Instituto Central do
Hospital das Clínicas and the Cancer Hospital AC Camargo in the period of
December 2008 to December 2010. The sensitivity to SMX/TMP was 78.3%,
82% for levofloxacin, 14,2% for ciprofloxacin, minocycline 100% and for
tigecycline 91.6%. PCR was performed for detection of gene sul1, sul2 and
dfrA1 to evaluate the resistance to SMX/TMP, genes iscr2 int1 was
performed to evaluate the presence of mobile genetic elements and genes
gyrA, qnr, smeD , smeT and aac (6 ')-Ib-cr for evaluation of resistance to
quinolones. Fourteen samples (13.2%) were positive for the gene sul1. In
these isolates, nine samples showed resistance to SMX/TMP with MIC50 of 8
µg/ml and MIC90 of 128 µg/mL. Five strains were positive for sul1 gene and
were susceptible to SMX/TMP with MIC50 of 1 µg/ml and MIC90 of 1 µg/mL.
The sequence of the integron class 1 strain with an MIC> 125 µg/mL showed
an approximate size of 4000 bp containing the gene cassettes aadA1, aac4
and qac/sul1. A strain resistant to SMX/TMP was positive for the gene sul2
located on ISCR2 a transposase-like. We observed the presence of four new
qnr in strains of S. maltophilia and the presence of the enzyme aac (6 ')-ib-cr
in 4 samples. 100% of the strains were positive for the gene of the efflux
system smeDEF and 12/38 samples had the gene smeT repressor of
smeDEF efflux system, however there was no mutation in this gene. In the
amino acid sequence of gyrase A of 15 strains resistant to levofloxacin did
not observe mutations related to resistance to quinolones. Strains resistant to
SMX/TMP had a polyclonal PFGE pattern. Eighteen strains resistant to
levofloxacin showed 14 clonal profiles 14 divided into 10 clusters
S. maltophilia displays multiple mechanisms of resistance. In this study, we
observed a large number of strains with mobile genetic elements carrying the
sul1 gene and other resistance genes. S. maltophilia is may be an important
source for transmission of genes of resistance.
Descriptors: 1-Stenotrophomonas maltophilia 2-Bacterial infections 3-
Trimethoprim resistance 4-Sulfametoxazol 5-Resistencial factors 6-
Quinolones
1 INTRODUÇÃO
Introdução 2
Stenotrophomonas maltophilia é um bacilo Gram-negativo, não
fermentador, considerado um microorganismo pouco virulento, relacionado
principalmente a infecções associadas à assistência a saúde em populações
de alto risco, como pacientes imunodeprimidos e pacientes internados em
unidades de terapia intensiva.
Os principais quadros clínicos descritos em infecções por S. maltophilia
são pneumonia, infecção de corrente sanguínea, infecção de trato urinário e
infecção de tecidos moles. A incidência de colonização/infecção por
S. maltophilia varia em diversos hospitais de 2 a 37,7 casos por 10.000 altas.
Os fatores de risco para colonização ou infecção por S. maltophilia
descritos na literatura são o uso prévio de antimicrobianos de amplo
espectro, uso de cateter venoso central, neutropenia, quimioterapia,
corticoterapia, internações prolongadas, internações em unidade de cuidado
intensivo, internações em unidades de neonatologia, ventilação mecânica,
presença de traqueostomia e doença respiratória crônica de base.
A S. maltophilia apresenta um padrão de resistência intrínseca à
maioria das classes de antibióticos, mediada por produção de enzimas como
-lactamases, enzimas modificadoras de aminoglicosídeos, expressão de
sistemas de efluxo, mutações cromossômicas e expressão de genes de
resistência adquiridos por elementos genéticos moveis, entre outros. A droga
de escolha para o tratamento das infecções por S. maltophilia é a
sulfametoxazol/ trimetoprima (SMX/TMP), entretanto, estudos atuais relatam
Introdução 3
o aumento da resistência a este antibiótico, o que limita as opções para
terapia efetiva. Entre as opções de tratamento aparecem as
fluoroquinolonas, como o levofloxacino e a tigeciclina, porém, faltam estudos
clínicos e de resistência para essas drogas, o que limita a utilização das
mesmas no tratamento das infecções por S. maltophilia.
A proposta deste estudo foi avaliar os possíveis mecanismos de
resistência a SMX/TMP e as quinolonas em isolados clínicos de pacientes
internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas e do Hospital A.C.
Camargo no período de dezembro de 2008 a dezembro de 2010
2 REVISÃO DE LITERATURA
Revisão de Literatura 5
2.1 Taxonomia
Stenotrophomonas maltophilia foi descrita inicialmente como
Pseudomonas maltophilia (Hung e Ryschenkow, 1960). E posteriormente como
membro do gênero Stenotrophomonas, proposto por Palleroni e Bradbury em
1993. Estudos combinando análise fenotípica e genotípica demonstraram uma
grande diversidade genética nesse gênero, são descritas atualmente
oito espécies (S. maltophilia, S. rhizophila, S. Koreensis, S. acidaminiphila,
S. nitritireducens, S. terrae, S. humi, S. chelatiphaga) (Vsileuskaya-Schulz
et al., 2011). Entretanto, apenas a S. maltophilia, até o momento, foi associada
à infecção em humanos.
2.2 Microbiologia
S. maltophilia é um bacilo Gram-negativo, móvel, não fermentador de
glicose, que possui flagelos polares. Reto ou ligeiramente curvo, mede entre
0,5 a 1,5 μm de comprimento. As colônias são lisas, de cor amarela pálida
brilhante ou cinza-lavanda com bordas bem definidas em meio de ágar
sangue, o crescimento é ótimo a 35°C. S. maltophilia é considerada uma
bactéria com pequena atividade metabólica, embora possa metabolizar
alguns substratos como os aminoglicosídeos (Denton e Kerr, 1998).
Revisão de Literatura 6
No ambiente hospitalar S. maltophilia pode ser isolada de diversos
materiais e superfícies, como circuitos ventilatórios, reservatórios de água de
umidificadores de oxigênio, equipamentos para nebulização, máquinas de
diálise, piscinas de hidroterapia, dispensadores de água deionizada,
cateteres venosos, monitores de pressão arterial, máquinas de gelo e
soluções desinfetantes (Denton e Kerr, 1998).
2.3 Epidemiologia
A freqüência das infecções por este agente aumentou nos últimos
anos como conseqüência do maior número de pacientes em risco, devido ao
avanço da terapêutica médica e do uso rotineiro de antibióticos de amplo
espectro (Tan et al., 2008; Falagas et al., 2008).
A incidência de S. maltophilia descrita em diferentes hospitais, incluindo
pacientes colonizados e infectados varia de dois a 37,7 casos por 10.000 altas
(Del Toro et al., 2002; Denton e Kerr, 1998; Morrison et al., 1986). Tan et al.,
(2008) em um hospital terciário em Taiwan, descreveram que a taxa de
infecção por 10.000 admissões aumento de 5,3 em 1999 para 9,8 em 2004.
Del Toro et al., (2002), como parte de um estudo multicêntrico na Espanha,
mostraram taxas de incidência de infecção por S. maltophilia entre 3,4 e 12,1
casos por 10.000 altas. No Hospital das Clínicas da FMUSP a incidência de
infecção de corrente sanguínea por S. maltophilia entre 1999 e 2006 variou de
0,12 a 1,0 (média de 0,55) por 1.000 pacientes-dia (Girão et al.,2008).
Revisão de Literatura 7
2.3.1 Fatores de risco para infecção ou colonização por S. maltophilia
Os principais fatores de risco para infecção ou colonização por
S. maltophilia descritos são: o uso prévio de antimicrobianos de amplo espectro
(imipenem, ceftazidima, cefepima, metronidazol,ampicilina e gentamicina),
número de dias de uso de antimicrobianos, uso de cateter vascular, uso prévio
de corticóides, ventilação mecânica, presença de traqueostomia, pontuação
alta em avaliação de gravidade de trauma, contusão pulmonar, transporte
médico aéreo, mucosite grave e diarréia (Garcia Paez e Costa, 2008).
2.3.2 Clonalidade
S. maltophilia pode ser isolada em diferentes superfícies no ambiente
hospitalar. A maioria das infecções por esse agente são policlonais e o relato
de surtos por S. maltophilia é raro (Souza Dias et al., 2008; Triptkovic et al.,
2001). S. maltophilia é uma bactéria que apresenta uma diversidade
genética grande, demonstrada por estudos de tipagem molecular que
utilizaram a metodologia de eletroforese em campo pulsado (PFGE)
(Lin, CW et al., 2008; Gulmez et al., 2005; Jumaa et al., 2006; Barbolla et al.,
2004; Valdezate et al., 2001). Schaumann et al., 2008, estudaram 96 cepas
clínicas isoladas em 1998, e observaram 17 clones possivelmente
relacionados e 45 cepas com padrão genotípico diferente. Em outro estudo,
Valdezate et al.,2001, analisaram 139 isolados de pacientes sem fibrose
cística obtidos no mesmo hospital em um período de quatro anos e
Revisão de Literatura 8
mostraram que a maioria das cepas testadas (71,7%) apresentaram
diferentes perfis cromossômicos através da PFGE e que um padrão
genotípico idêntico foi obtido apenas de 15 pacientes (14,3%), diferente de
achados em populações de pacientes com fibrose cística, os quais
apresentam perfis semelhantes. Estudo de diversidade genética da
S. maltophilia por tipagem de sequencia de multiplos lócus (MLST) revela que
existem atualmente sete genogrupos, sendo o principal o genótipo número 6,
(Kaiser et al.,2009). Esses estudos mostram a grande variedade de perfis
genéticos que a S. maltophilia exibe reforçando assim a idéia da ampla
distribuição da espécie no ambiente. Estudos de caracterização molecular
das cepas de S. maltophilia são importantes para desenvolver estratégias de
controle e para tentar diminuir a freqüência de infecções por este agente.
2.4 Infecções causadas por S. maltophilia
As principais infecções causadas por S. maltophilia são pneumonia,
infecção de corrente sanguínea e infecções de pele e anexos. Outras
infecções como infecções de trato urinário, meningites, endocardite,
endoftalmites, conjuntivites, infecções abdominais e artrite séptica também
são descritas. A maioria dessas infecções é relacionada à assistência a
saúde. A descrição de infecções comunitárias é rara (Dignani et al., 2003).
Revisão de Literatura 9
2.5 Sensibilidade
A escolha do melhor antimicrobiano para o tratamento de infecções
por S. maltophilia é um desafio para médicos, devido ao padrão de
resistência intrínseca dessa bactéria e da falta de um consenso global para
determinar a melhor metodologia para a análise da sua sensibilidade
(Nicodemo e Paez, 2008).
Diferentes métodos já foram utilizados, tais como, disco-difusão,
agar-diluição, diluição em caldo e E-test (Denton e Kerr, 1998). O “Clinical
and Laboratory Standards Institute” (CLSI) recomenda a técnica de diluição
em Agar ou diluição em caldo para determinar a sensibilidade de
S. maltophilia para sulfametoxazol/trimetoprima (SMX/TMP), levofloxacino,
ticarcilina/clavulanato, minociclina, ceftazidima e cloranfenicol e a
metodologia de disco-difusão apenas para testar SMX/TMP, levofloxacino e
minociclina (CLSI, 2009).
O E-test tem sido utilizado como uma boa opção para avaliar a
sensibilidade de outros Gram-negativos e em alguns estudos que testaram
cepas de S. maltophilia, esta metodologia também mostrou ótimos
resultado quando comparada com métodos diluicionais, considerados o
padrão-ouro (Gülmez et al., 2010, Nicodemo et al., 2004, Conh e Waites,
2001, Yao et al., 1995). Em contrapartida, vários estudos mostram
discrepâncias nos resultados da sensibilidade por disco-difusão para
colistina, ticarcilina/clavulanato e ciprofloxacino (Gülmez et al.,2010;
Nicodemo et al., 2004,). Nicodemo et al., (2004) demonstraram excelente
Revisão de Literatura 10
correlação entre os métodos diluicionais e o método de difusão em disco
para a avaliação da sensibilidade de isolados de S. maltophilia a diferentes
antibióticos como SMX/TMP, cloranfenicol, doxiciclina, gatifloxacino e
ticarcilina/clavulanato. Entretanto, testes não diluicionais mostraram uma
baixa acurácia para polimixinas. Gülmez et al., 2010, descreveram uma
baixa acurácia do método de disco-difusão para colistina, com mais de 32%
de erros muito graves quando comparado ao método de diluição em ágar
considerado o padrão-ouro.
A sensibilidade de isolados clínicos de S. maltophilia determinada
em diversos estudos que utilizaram a metodologia diluicional em caldo
(Tabela 1) ou em ágar (Tabela 2), mostraram porcentagem de sensibilidade
ao SMX/TMP entre 16% e 98,5%, entretanto, quando excluídas amostras
de pacientes com fibrose cística (San Gabriel et al., 2004, Fadda et al.,
2004) a porcentagem de sensibilidade aumenta para 60,6% a 98,5%.
Levofloxacino apresenta uma sensibilidade por métodos diluicionais entre
60,6% e 86,9% (Tabela 1). São poucos os estudos que avaliam a
sensibilidade de isolados clínicos de S. maltophilia para minociclina, no
entanto, esses estudos mostram uma alta porcentagem de sensibilidade a
essa droga, variando entre 97% e 100% (Milatovic et al.,2003; Betriu et
al.,2002; Valdezate et al.,2001; Vartivarian et al.,1994). Estudos que
avaliam a sensibilidade por métodos diluicionais da S. maltophilia para
tigeciclina demonstram porcentagens de sensibilidade entre 87,7% e 100%,
porém, falta uma padronização na metodologia e nos pontos de corte para
Revisão de Literatura 11
determinar a sensibilidade da droga, dificultando assim, o emprego da
mesma para o tratamento de infecções causadas por este agente (Insa et
al.,2007; Fritsche et al., 2005; Milatovic et al.,2003; Sader et al.,2005(II);
Sader et al.,2005 (III)).
Na tabela 1 e tabela 2, mostramos estudos que avaliaram a
sensibilidade por métodos diluicionais, das principais drogas empregadas
no tratamento de infecções por S. maltophilia.
Revis
ão
de
Lite
ratu
ra
12
Tabela 1. Estudos de sensibilidade utilizando a metodologia de microdiluição em caldo.
Referência Farrell et al., 2010 Gales et al., 2006 Sader et al., 2005III Jones et al., 2003 Vartivarian et al., 1994 Sader et al.,2005 II
Amostras N°1586 N°1256 N°2076 N°1488 N°130 N°203
Antimicrobiano CIM50 CIM90 %S CIM50 CIM90 % S CIM50 CIM90 % S CIM50 CIM90 % S CIM50 CIM90 % S CIM50 CIM90 % S
SMX/TMP ≤0,5 1 96 ≤0,5 1 97 ≤0,5 ≤0,5 95,3 ≤0,5 ≤0,5 92 1 4 75 ≤0,5 1 98
Levofloxacino 1 4 83,4 1 4 86,9 1 4 86,1 1 4 86
Ticarcilina/C 32 >128 39,1 32 128 47,6 16 128 55,7 16 128 86 32 128 43
Ceftazidima 16 >16 4,8 8 >16 52,4 8 >16 52,9 8 >16 54 64 256 15 8 >16 56,9
Minociclina - - - - - - 1 4 97
Ciprofloxacino 2 >2 30,9 - - - 4 32 16 2 >4 29,6
Cloranfenicol
Tigeciclina 0,5 2 95,5 1 2 93,1
PolimixinaB ≤1 >4 64,6 1 8 72,4 2 8 67,6 ≤1 4 84,6
Colistina
Nº:número de amostras; CIM:valor em Mg/L; %S: porcentagem de sensibilidade; SMX/TMP:sulfametoxazol-trimetoprima; T/C:ticarcilina/ e ácido clavulanico.
Revis
ão
de
Lite
ratu
ra
13
Tabela 2. Estudos de sensibilidade utilizando a metodologia de microdiluição em Agar.
Referência Betriu et al., 2002 Betriu et al., 2002I Gulmez 2005 Nicodemo et al., 2004 Travassos et al., 2004 Weiss et al., 2000 Hu et al., 2011
Amostras N° 195 N°52 N°205 N°70 N°39 N°326 N° 34
Antimicrobiano CIM50 CIM90 % S CIM50 CIM90 % S CIM50 CIM90 % S CIM50 CIM90 % S CIM50 CIM90 % S CIM50 CIM90 % S CIM50 CIM90 % S
SMX/TMP 0,06 0,12 98 0,125 0,5 98 2 8 64,4 0,06 0,12 100 ≤0,25 ≤0,25 100 0,5 0,5 98,5 9,5 608 66,7
Levofloxacino 1 8 73 0,5 16 68,6
Ticarcilina/C 4 32 85,1 8 64 100 16 128 59,1 2 32 94,8 8 128 128 256 46,1
Ceftazidima 16 >128 54 64 256 27 32 >16 52,9 16 64 26,3 4 256 60,9
Minociclina 0,25 1 100 10,5 16 74,5
Ciprofloxacino - - - 2 >2 30,9 0,5 2 81,6 4 16 40
Cloranfenicol 4 16 80,3 8 128 45,1
Tigeciclina 1 4 - 1 4 -
PolimixinaB 2 8 67,6 2 4 77,3
Colistina 2 4 75,7
Nº:número de amostras; MIC:valor em Mg/L; %S: porcentagem de sensibilidade; SMX/TMP:sulfametoxazol-trimetoprima; T/C:ticarcilina/ e ácido clavulanico.
Revisão de Literatura
14
2.6 Tratamento
O tratamento de infecções por S. maltophilia é difícil devido à
resistência intrínseca a diversas classes de antimicrobianos, além, da falta
de ensaios clínicos randomizados que avaliem as opções terapêuticas para
o tratamento das infecções por esse agente (Nicodemo e Paez., 2008).
Sulfametoxazol/trimetoprima é considerada a droga de escolha para o
tratamento dessas infecções, outros antibióticos com ação contra
S. maltophilia são ticarcilina-clavulanato, levofloxacino, moxifloxacino,
minociclina, ceftazidima, cloranfenicol, polimixina, colistina e tigeciclina como
monoterapia ou em associação.
Falagas et al., 2008, realizaram uma revisão sistemática de
tratamento em pacientes com infecções por S. maltophilia que não
receberam SMX/TMP. Os autores avaliaram 31 relatos de casos e 5 séries
de casos, somando 49 pacientes. Os autores concluíram que o uso de
ciprofloxacino, ceftazidima ou ticarcilina-clavulanato como monoterapia ou
em associação a outros antimicrobianos são boas opções para o
tratamento destas infecções, com taxa de sucesso entre 66,7 a 85%.
Esse resultado, entretanto, deve ser considerado com muito critério, já que
existe um aumento de resistência a ciprofloxacino na última década.
S. maltophilia apresenta resistência intrínseca a ceftazidima, além da baixa
sensibilidade a essas drogas descrita em diferentes estudos no mundo
(Sander et al (III)., 2005I; Gales et al., 2006).
Revisão de Literatura
15
2.6.1 Sulfametoxazol/trimetoprima
Sulfametoxazol/trimetoprima é considerado o tratamento de primeira
escolha das infecções por S. maltophilia. Entretanto, não existem estudos
clínicos randomizados controlados que avaliem a real eficácia dessa
combinação de antimicrobianos no tratamento das infecções por esse
agente. Um problema recente é o aumento da presença de elementos
genéticos móveis carregando genes de resistência para SMX/TMP em cepas
de S. maltophilia (Hu et al., 2011, Toleman et al., 2007, Barbolla et al.,2004).
Esses achados,entretanto, ainda são controversos. Os quatro maiores
estudos que avaliaram a sensibilidade a SMX/TMP pelo método de
microdiluição em caldo contabilizaram, 6406 amostras, e mostram
sensibilidade entre 92 e 97%, sem um aumento de resistência nos últimos
anos (Farrel et al., 2010, Gales et al., 2006, Sader et al., 2005II, Jones et al.,
2003). Todavia, a resistência a esta combinação é descrita em outras séries.
San Gabriel et al., (2004), analisaram 673 cepas isoladas em pacientes com
fibrose cística nos EUA e evidenciaram resistência de 84%. Previamente,
Valdezate et al., (2001), observaram porcentagem de resistência de 26,2% e
Micozzi et al., (2000), estudaram pacientes oncológicos com bacteremia e
mostraram resistência de 58%. Esses estudos avaliaram população
especifica de pacientes, o que pode explicar resultados tão diferentes.
A dose recomendada de SMX/TMP é de 10 a 20 mg/kg por dia do
componente trimetoprim para obter níveis séricos máximos, ideais para o
tratamento dessas infecções, embora, esta prática limite seu uso devido à
Revisão de Literatura
16
toxicidade do componente trimetoprim, principalmente em pacientes
imunodeprimidos (Falagas et al., 2008).
2.6.2 Quinolonas
As quinolonas, principalmente levofloxacino, moxifloxacino e
ciprofloxacino são opções para o tratamento de infecções por S. maltophilia.
Levofloxacino exibe uma atividade superior a ciprofloxacino com CIM 4
a 8 vezes menores do que a CIM para ciprofloxacino (Sader et al., 2005(III);
Nicodemo et al., 2004; Cantón et al., 2003; Gesu et al., 2003;
Gales et al., 2001).
Farrel et al., 2010, avaliaram a sensibilidade de levofloxacino pelo
método de microdiluição em caldo de 1584 cepas de S. maltophilia isoladas
ao redor do mundo, observaram uma sensibilidade de 83,4%. Gesu et al.,
(2003), compararam a atividade de levofloxacino e ciprofloxacino, e
obtiveram sensibilidade de 124 cepas estudadas de 85,5% e 58,9%
respectivamente. Não existem estudos que avaliem a resistência ao
levofloxacino, entretanto, especialistas relatam o surgimento de resistência
durante o tratamento (Gulmez et al., 2010). Garrison et al., (1996), em um
modelo farmacodinâmico avaliaram ciprofloxacino e levofloxacino e
observaram o aparecimento de mutantes resistentes por pressão seletiva.
Ba et al., (2004) demonstraram que moxifloxacino tem maior poder
bactericida que ciprofloxacino, entretanto, também observaram o
aparecimento de mutantes resistentes a ambas quinolonas. Giamarellos-
Revisão de Literatura
17
Bourboulis et al., (2002 (I)) comprovaram o efeito bactericida de
moxifloxacino contra cepas geneticamente distintas resistentes a SMX/TMP.
Entretanto, para infecções de trato respiratório causadas por cepas com CIM
>2 µg/ml a atividade clínica pode ser limitada devido ao acúmulo de
moxifloxacino no muco do epitélio brônquico e nos macrófagos alveolares.
Neste último caso, monoterapia com moxifloxacino poderia selecionar
mutantes resistentes.
Faltam estudos in vivo que confirmem a eficácia das quinolonas para
o tratamento de infecções por S. maltophilia.
2.6.3 Tigeciclina
A gicilciclina tigeciclina derivada da minociclina, apresenta boa
sensibilidade em estudos in vitro contra cepas de S. maltophilia. Farrel et al.,
2010, avaliaram a sensibilidade pelo método de microdiluição em caldo de
1584 cepas de S. maltophilia de diferentes países, observaram sensibilidade
de 95,5%. Entretanto, seu uso para o tratamento de infecções por S.
maltophilia deve ser muito criterioso, já que não existem estudos clínicos que
confirmem a eficácia da tigeciclina no tratamento de infecções por S.
maltophilia. Petersen et al., 2006 em estudo in vitro de sinergismo,
demonstraram que a tigeciclina apresentou atividade sinérgica com
rifampicina ou SMX/TMP contra cepas de S. maltophilia. Na literatura, foram
descritos dois relatos de casos de pacientes com infecção de tecidos moles
e pneumonia por S. maltophilia tratados com sucesso com tigeciclina,
Revisão de Literatura
18
porém, nenhum dos pacientes recebeu a tigeciclina como monoterapia
(Belvisi et al., 2009, Blanquer et al., 2008). Até o momento não foi descrita a
presença de sistemas de efluxo associados com resistência para tigeciclina
na S. maltophilia, como o sistema de efluxo AcrAB descrito em
Enterobactérias ou o sistema MexXY-OprM descrito na P. aeruginosa.
Gulmez et al., 2010, em estudo in vitro não observaram sinergismo com a
associação de tigeciclina e ticarcilina/clavulanato ou tigeciclina e colistina
contra cepas de S. maltophilia.
Este antibiótico poderá no futuro ser usado em terapia combinada no
tratamento de infecções por esse agente.
2.6.4 Beta-lactâmicos
Antibióticos -lactâmicos em geral têm pequena atividade contra S.
maltophilia, apresentam taxas de resistência invariavelmente altas (Farrel et
al., 2009; Nicodemo et al., 2004). A S. maltophilia exibe resistência
intrínseca aos -lactâmicos. Inibidores de -lactamase, como ácido
clavulânico e, em menor proporção, outros inibidores de -lactamase,
aumentam a sensibilidade da S. maltophilia aos -lactâmicos (Muñoz Bellido
et al., 1997). A combinação mais ativa contra S. maltophilia é a associação
ticarcilina-clavulanato, a qual tem sido recomendada como droga alternativa,
principalmente no tratamento de infecções em pacientes com
contraindicação de uso do SMX/TMP (Falagas et al., 2008; Denton e Kerr,
1998). Vários estudos, entretanto, mostraram uma sensibilidade inferior a
Revisão de Literatura
19
70% para ticarciclina/clavulanato (Farrel et al.,2008; Nicodemo et al.,2004;
Canton et al.,2003). Estudo recente de Farrel et al., 2010, mostrou
sensibilidade pelo método de microdiluição em caldo para
ticarcilina/clavulanato de 34% para 1584 cepas de S. maltophilia isoladas de
diferentes países. Lecso-Bornet e Bergogne-Berezin, (1997), demonstraram
que a única combinação de -lactâmico e inibidor de -lactamase que inibiu
mais de 80% das cepas testadas e apresentou efeito sinérgico em mais de
50% das cepas, foi à associação de ticarcilina-clavulanato, pelo efeito
inibidor maior de ácido clavulânico sobre a enzima L2. Outros estudos
demonstraram a possibilidade de aparecimento de fenótipos
multirresistentes após exposição a essa combinação, dificultando assim a
predição de eficácia clínica (San Gabriel et al., 2004; Carroll et al., 1998;
Vartivarian et al., 1994I). E finalmente, Garrison et al., (1996), demonstraram
que cepas de S. maltophilia tratadas com ticarcilina-clavulanato
apresentaram inibição parcial de crescimento seguida de recrescimento num
modelo farmacodinâmico. Ausência de estudos clínicos randomizados,
problemas na interpretação dos testes de difusão, proporções dos
componentes e diferença na farmacocinética dessas drogas limitam seu uso
em infecções por S. maltophilia (Nicodemo e Paez., 2008); Associações
como ticarcilina-sulbactam, piperacilina-tazobactam e ampicilina-sulbactam
não apresentam uma boa atividade in vitro contra S. maltophilia (Del Toro et
al., 2002; Micozzi et al., 2000; Tsiodras et al., 2000; Traub et al., 1998;
Muñoz Bellido et al., 1997; Vartivarian et al., 1994I; Pankuch et al., 1994;
García Rodríguez et al., 1991I).
Revisão de Literatura
20
A ceftazidima é a cefalosporina mais ativa contra cepas de
S. maltophilia. Entretanto, as taxas de resistência são altas, como descritas
por diferentes autores (Farrel et al., 2008; Nicodemo et al., 2007;
Lanzafame et al., 2006; Gulmez et al.,2005; Jones et al., 2003;
Betriu et al., 2002(II); Del Toro et al., 2002).
Vários especialistas não recomendam o uso de -lactâmicos
isoladamente no tratamento de infecções por S. maltophilia, devido ao risco
de indução de resistência por produção de -lactamases cromossômicas
(Nicodemo e Paez., 2008; Del Toro et al., 2002)
2.6.5 Tetraciclinas
A minociclina apresenta uma alta atividade in vitro contra cepas de S.
maltophilia. Estudos de sensibilidade mostram resistência menores de 10%
(Farrel et al., 2008; Valdezate et al.,2004; Betriu et al., 2002(II)). Cantón et
al., (2003) estudaram 47 cepas de S. maltophilia em pacientes com fibrose
cística e mostraram percentagem de resistência menor de 1% para
dicloxacilina e minociclina. Os relatos de uso de minociclina, entretanto, são
escassos. Harada et al., 2008, descreveram o relato de caso de um paciente
submetido a transplante de fígado que evoluiu com choque séptico secundário
a infecção de corrente sanguínea de origem biliar por S. maltophilia.
O paciente recebeu SMX/TMP e minociclina associados à terapia de
absorção de endotoxina com “toraymyxin” com boa resposta após 17 dias de
tratamento. Carroll et al., (1998) sugerem que SMX/TMP ou minociclina
Revisão de Literatura
21
deveriam ser associados a qualquer outro esquema terapêutico no
tratamento de infecções graves por S. maltophilia.
2.6.6 Polimixinas
O uso de polimixinas para o tratamento de infecções por
S. maltophilia também é limitado. Os principais problemas para o uso das
polimixinas são a falta de estudos clínicos controlados, além da falta de
recomendações para a interpretação dos testes de sensibilidade in vitro.
Gales et al., (2001) e Nicodemo et al., (2004), recomendam a utilização de
métodos diluicionais, por considerarem o método de disco-difusão como não
confiável. Wood et al., 2008, descreveram um caso clínico de paciente com
pneumonia associada à ventilação mecânica sem resposta ao uso de
SMX/TMP após 48 dias de tratamento, sendo então iniciada doxiciclina
endovenosa e colistina por nebulização com boa resposta clínica e
laboratorial após 14 dias de tratamento.
2.7 Sinergismo
S. maltophilia exibe alta resistência intrínseca à maioria dos agentes
antimicrobianos. Alguns autores justificam a combinação de antimicrobianos
principalmente para o tratamento de infecções graves causadas por esse
agente (Falagas et al.,2008, Nicodemo e Paez., 2008; Zelenitsky et al.,2005;
Revisão de Literatura
22
Carrol et al.,1998). Muder et al. 1996, demonstraram em um estudo de
coorte prospectivo que avaliou 91 pacientes com infecção de corrente
sanguínea por S. maltophilia que pacientes que receberam tratamento com
associação de antibióticos tiveram mortalidade menor que aqueles que
receberam monoterapia. Os autores sugerem que o uso de SMX/TMP
associado à ticarcilina/clavulanato ou a uma cefalosporina de terceira
geração pode ser mais eficaz que monoterapia. Zelenitsky et al., (2005)
avaliaram a atividade de SMX/TMP isoladamente ou em associação com
ceftazidima, ciprofloxacino e gentamicina. Todas as associações de
antimicrobianos foram superiores a monoterapia com SMX/TMP na redução
da carga bacteriana (P<0,0001). Traub et al., (1998), mostraram que as
associações de rifampicina e polimixina B com SMX/TMP ou ceftazidima
foram altamente bactericidas contra cepas de S. maltophilia. Guiamarellos-
Bourboulis et al., (2002(II)), estudaram o sinergismo de colistina-rifampicina
e colistina-SMX/TMP em 24 cepas resistentes a SMX/TMP e mostraram que
em 24 horas o sinergismo para colistina-rifampicina foi de 62,5% e para
colistina-SMX/TMP foi de 41,7%. Segundo os autores a polimixina facilitaria
a entrada de rifampicina ou SMX/TMP na parede bacteriana. Muñoz Bellido
et al., (1996) mostraram atividade da combinação SMX/TMP-polimixina B,
tanto para cepas resistentes a SMX/TMP quanto para cepas sensíveis.
Muñoz Bellido et al., (1997), observaram que a associação aztreonam-
clavulanato-ticarcilina foi duas a quatro vezes mais ativa que aztreonam-
clavulanato. Gould e Milne, (1997), demonstraram que a combinação de
piperacilina-tazobactam e ciprofloxacino mostrava-se amplamente variável
Revisão de Literatura
23
na resposta contra cepas de S. maltophilia. Combinações de antimicrobianos
parecem ser superiores a monoterapia no tratamento de infecções por
S. maltophilia, principalmente por cepas multiresistentes e infecções em
pacientes graves. Entretanto, a falta de estudos clínicos que comprovem a
eficácia clínica dessa estratégia limita seu uso na pratica clínica.
2.8 Mecanismos de resistência da S. maltophilia
S. maltophilia exibe um padrão intrínseco de multirresistência a várias
classes de antibióticos como -lactâmicos, carbapenêmicos, quinolonas,
aminoglicosídeos e tetraciclinas (Looney et al., 2009).
Os principais mecanismos de resistência intrínseca da S. maltophilia
são a expressão de sistemas de efluxo e de -lactamases. A S. maltophilia
também tem a capacidade de apresentar resistência horizontal por aquisição
de genes cassetes de resistência através da aquisição de integrons,
transposons e plasmídios (Hu et al. 2011).
Crossman et al., 2008, descreveram o genoma completo de uma cepa
clínica de S. maltophilia K279 com tamanho de 4,851.126 pb, a qual contem
nove sistemas de efluxo e múltiplos genes de resistência para antimicrobianos
e metais pesados. Os sistemas de efluxo descritos nesse estudo foram,
o SmeABC, SmeDEF, SmeVWX (50% de identidade com o sistema
MexEF-OprN da Pseudomonas aeruginosa), SmeYZ (59% de identidade com o
sistema AdeAB do Acinetobacter baumannii), SmeGH (49% de identidade com
Revisão de Literatura
24
o sistema AcrAB da Morganella morganii), SmeLJK (50% de identidade com o
sistema MtdABC da E. coli e os sistemas SmeMN e SmeOP com menos de
30% de similaridade com proteínas de efluxo descritas na literatura em
enterobactérias, entretanto só a atividade dos sistemas SmeDEF e SmeABC foi
até o momento avaliada em isolados de S. maltophilia.
2.8.1 Resistência a SMX/TMP
A droga de escolha para o tratamento de infecções por S. maltophilia
é a SMX/TMP, entretanto, estudos recentes descreveram um aumento da
presença de elementos genéticos móveis que carregam genes de
resistência para a SMX/TMP em cepas de S. maltophilia (Hu et al., 2011,
Toleman et al., 2007).
Os mecanismos de resistência a SMX/TMP na S. maltophilia são
pouco conhecidos. Até o momento é descrito que o principal mecanismo de
resistência é a aquisição de genes que interferem na atividade do
sulfametoxazol (Barbolla et al., 2004).
A aquisição e expressão do gene sul1 é o principal mecanismo de
resistência a sulfametoxazol descrito até o momento. Esse gene está
localizado na região conservada 3’ de integrons de classe 1, os quais estão
localizados em plasmídios com tamanho entre 2,1KB a 54,2 KB (Hu et
al.,2011, Toleman., 2007). O gene sul2 presente em transposases-like,
chamadas sequencias de inserção da região comum (ISCR) localizadas em
plasmídios ou no cromossomo da bactéria também pode diminuir a
Revisão de Literatura
25
sensibilidade da S. maltophilia a SMX, porém, faltam estudos que confirmem
que a aquisição desse gene pode ser um mecanismo de resistência a SMX
na S. maltophilia. Outro mecanismo de resistência descrito recentemente na
S. maltophilia é a presença de genes da enzima dehidrofolato redutase
(dfrA), dfrA12, dfrA13, dfr17 que conferem resistência ao trimetoprim,
localizados nos integrons de classe 1 e carreados por plasmídios (Hu et al.,
2011). Entretanto, não existem estudos que demonstrem que a transferência
desses genes altere a CIM para a TMP na S. maltophilia. Até o momento foram
descritos junto ao gene sul1 em cepas com resistência a SMX/TMP os gene
cassettes, qac/sul1, aacA4-qac/sul, aacA7-orf1-aadA5-qac/sul, dfrA12-aadA2,
aacA4-catB8-aadA1, aadB-aadA4, aacA4, aadA5, aadA5, aadA1, aadB-aac
(6’)-II-blaCARB-8, arr3-dfrA. A presença desses genes pode também conferir
resistência para aminoglícosídeos, quinolonas, cloranfenicol e quaternário de
amônio. Entretanto, nos estudos que descrevem os elementos genéticos
citados acima, faltam dados em relação à associação da alteração da CIM
em cepas que sofreram transformação. Toleman et al, (2007) estudaram 55
cepas clínicas, geneticamente não relacionadas, das quais 25 eram
resistentes a SMX/TMP. Dezessete possuíam o gene sul1 localizado na
região 3’ do integron de classe 1. O autor descreveu que cepas sensíveis
não continham o gene sul1. Em sete cepas positivas para o gene sul1 o
integron foi analisado, duas amostras (Brasil e Alemanha) apresentavam a
integrase 1 e o gene qac/sul. Duas amostras (Chile e EUA) continham
integrase 1, o gene cassette aacA4 e o complexo qac/sul. Duas amostras do
México continham os genes das enzimas modificadoras de aminoglicosídeos
Revisão de Literatura
26
aacA5 e aadA7, uma ORF com atividade desconhecida e o complexo
qac/sul1. O autor descreve que o gene sul2 foi expresso em 9 amostras
resistentes, localizado nas sequencias de inserção ISCR2 e ISCR3.
O seqüenciamento dos genes que sofreram a transformação na E. coli
TOP10, mostrou que o gene sul2 estava localizado, em cinco amostras na
ISCR2 e em duas amostras na ISCR3, porém não foi descrito dados em
ralação a alterações na CIM nas cepas transformadas. Hu et al., 2011 no
Taiwan, relatam a presença dos genes dfrA17-aadA5, dfrA12-aadA2, aacA4-
catB8,-aadA1, aadB-aadA4, aacA4, aadA5, aadA1, aadB-aac(6´)II-blacarb-8,
arr-dfrA em 30 amostras resistentes a SMX/TMP, entretanto não descrevem
a alteração da CIM nas amostras estudadas.
2.8.2 Resistência a quinolonas
A resistência as quinolonas na S. maltophilia é determinada pela
associação de múltiplos mecanismos de resistência, como a expressão de
sistemas de efluxo, baixa permeabilidade da membrana e possivelmente
mutações nas topoisomerases. Entretanto, não existem estudos que avaliem
a resistência ao levofloxacino, o qual é considerado uma boa opção
terapêutica no tratamento de infecções por S. maltophilia. O principal
mecanismo de resistência as quinolonas é a expressão do sistema de efluxo
smeDEF. A expressão desse sistema leva ao aumento da CIM para
norfloxacino, ofloxacino, ciprofloxacino e outros antimicrobianos, como
tetraciclinas, cloranfenicol, eritromicina (Alonso e Martinez, 2000). Porém
Revisão de Literatura
27
não é descrito na literatura se esse sistema interfere com a atividade do
levofloxacino. A alteração na expressão da proteína de membrana smeC
aumenta a CIM para ácido nalidixico, norfloxacino e ciprofloxacino,
aminoglicosídeos e alguns -lactâmicos, fazendo parte do sistema smeABC
ou como integrante de outro sistema de efluxo não identificado (Li et al.,
2002). Al-Hamad et al., 2009, descreveram o sistema de efluxo SmrA na
S. maltophilia, por meio de transferência genética, os autores mostraram que
a expressão desse sistema diminui a sensibilidade para norfloxacino,
ciprofloxacino e ofloxacino. Alterações nos sítios alvos da girase (gyrA) na
topoisomerase IV têm sido investigadas, porém, o único estudo que avalia
possíveis mutações na gyrA em cepas resistentes quando comparadas a
cepas sensíveis não mostrou diferença nas sequencias dessas regiões.
O autor descreve, que cepas com CIM maiores para ciprofloxacino
apresentaram aumento da sensibilidade quando expostas ao CCCP e
reserpina, demonstrando assim, que a diminuição da entrada de droga por
ação da bomba de efluxo pode evitar que a bactéria sofra mutação no sítio
alvo, nesse caso na gyrA. (Valdezate et al., 2002).
Estudos recentes descreveram a presença de genes de resistência as
quinolonas mediados por plasmídio (qnr) na S. maltophilia. Esses genes
foram inicialmente descritos em 1998 na Klebsiella pneumoniae e foram
classificados em 3 grupos (qnr A, qnrB, qnrS). Os genes qnr protegem a
DNA gyrase e a topoisomerase da ação inibitória das quinolonas e estão
localizados em plasmídios. Esses genes podem diminuir a sensibilidade as
quinolonas, principalmente ao ácido nalidixico e ciprofloxacino. A importância
Revisão de Literatura
28
dos genes qnr na S. maltophilia ainda não esta bem estabelecida,
entretanto, os genes qnr podem ajudar a estabilizar ou selecionar mutações
nas regiões determinantes de resistência a quinolonas (QRDR) da DNA
gyrase e topoisomerase, além de, servir como reservatório para a
disseminação de resistência mediada por plasmídio entre as enterobactérias
(Gordon et al., 2010). Existem na atualidade 27 genes qnr descritos na
S. maltophilia, porém são associados à diminuição da sensibilidade do
ciprofloxacino, sem afetar o levofloxacino (Gordon et al., 2010; Shimizu et
al., 2008, Sanchez et al.,2008). Ainda faltam estudos que determinem a
verdadeira importância dos genes qnr na disseminação da resistência entre
isolados de S. maltophilia.
2.8.3 Resistência aos -lactâmicos
O principal mecanismo de resistência intrínseca aos β-lactâmicos é
mediado pela produção de duas β-lactamases cromossômicas induzíveis, a
metalo-β-lactamase L1 pertencente à classe B de Ambler e a serina-beta-
lactamase L2 da classe A de Ambler (Saino et al., 1982; Crowder et al., 1998).
A metalo-β-lactamase L1 hidrolisa todos os -lactâmicos excluindo
monobactams, não sendo inibida pelo inibidor de β-lactamase ácido
clavulânico. (Walsh et al., 1994). A serino-β-lactamase L2 é uma
cefalosporinase que hidrolisa aztreonam e é inibida pelo ácido clavulânico e
parcialmente por outros inibidores de β-lactamase (Walsh et al., 1997).
Revisão de Literatura
29
As β-lactamases de espectro ampliado (ESBL) já foram identificadas
em cepas de S. maltophilia. Avison et al., 2000, identificaram o primeiro caso
de uma cepa de S. maltophilia com o gene blaTEM. Al Naiemi et al., 2006,
avaliaram uma cepa de S. maltophilia de um paciente com fibrose cística
cujo sequenciamento identificou a presença do gene blaCTX-M-1 , blaSHV-1 e
blaTEM-116. Confirmando assim, que cepas dessa espécie podem trocar
determinantes de resistência a β-lactâmicos com outras espécies, tornando
a S. maltophilia um reservatório de genes de resistência para
antimicrobianos β-lactâmicos no ambiente hospitalar. É importante ressaltar
que os testes fenotípicos para detecção de β-lactamases de espectro
ampliado (ESBL) de S. maltophilia podem apresentar resultados falsos
positivos pela inibição da serino-β-lactamase L2.
A resistência aos carbapenêmicos é mediada principalmente
pela indução da metalo-β-lactamase L1 cromossômica, entretanto,
outros mecanismos podem estar presentes, como alterações em proteínas
ligadoras de penicilina como sugerido por Akova et al., (1991).
Esses autores descreveram que cepas mutantes com expressão basal de
β-lactamase L1 foram oito a 16 vezes mais sensível a meropenem que ao
imipenem, possivelmente por aumento da permeabilidade ao meropenem e
possíveis diferenças nos alvos de membrana.
2.8.4 Resistência aos aminoglicosídeos
A S. maltophilia é intrinsecamente resistente aos aminoglicosídeos.
A expressão de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos é o principal
Revisão de Literatura
30
mecanismo de resistência a essa classe de antimicrobianos. O genoma da
S. maltophilia K279a, por exemplo, contem os genes das enzimas aacA2,
aacA3, aacA6 e de dois genes de fosfotrasferases que conferem resistência
à estreptomicina. As enzimas modificadoras de aminoglicosídeos são
principalmente cromossômicas, entretanto, estudos recentes relatam a
presença de enzimas modificadoras de amonoglicosídeos em genes
cassettes de integrons da classe 1. Li et al., (2002), demonstraram que
cepas que expressam a enzima acetiltransferase aac(6´)-Iz têm
sensibilidade de 4 a 16 vezes menores para amicacina, tobramicina,
netilmicina e sisomicina. Lambert et al., (1999), em um estudo prévio,
determinaram que cepas produtoras da enzima aac(6´)-Iz apresentavam
CIM para gentamicina menor quando comparada a amicacina, netilmicina e
tobramicina. Okasaki et al., (2004), caracterizaram a enzima aph (3’)-IIa, em
estudos de transformação em cepas de E. Coli, os autores demonstraram a
transferência de resistência para amicacina, neomicina, paramomicina,
porém não observaram diminuição da sensibilidade para gentamicina.
Vários estudos demonstram a capacidade da S. maltophilia de alterar o
tamanho do polissacarídeo-O e o conteúdo de fosfatos do lipopolissacarideo
(LPS) a diferentes temperaturas, dificultando assim a ligação e/ou entrada
dos aminoglicosídeos através da membrana externa (Rahmati-Bahram et al.,
1995; Vanhoof et al., 1995; Rahmati-Bahram et al.,1997).
Revisão de Literatura
31
2.9 Justificativa
A S. maltophilia é uma bactéria que expressa múltiplos mecanismos
de resistência cromossômicos e adquiridos a varias classes de
antimicrobianos. Esses mecanismos são pouco conhecidos e estudados no
Brasil. O principal problema dos estudos de resistência dessa bactéria é a
dificuldade de correlacionar a expressão dos genes de resistência com a
alteração da sensibilidade.
A importância de conhecer os mecanismos de resistência para
SMX/TMP e quinolonas, além da falta de estudos específicos na literatura,
levaram-nos a propor este estudo.
3 OBJETIVOS
Objetivo
33
Avaliar os mecanismos de resistência a sulfametoxazol/trimetoprima e
as quinolonas
Descrever o padrão de resistência das cepas estudadas
Descrever a clonalidade das cepas resistentes a sulfametoxazol/
trimetoprima e as quinolonas
4 MÉTODOS
Métodos
35
4.1 Local
O estudo foi realizado no Laboratório de Investigação Médica LIM-54 do
Departamento de Moléstias Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo (ICHC-FMUSP).
4.2 Amostras bacterianas
Foram avaliadas 106 amostras de S. maltophilia isoladas de pacientes
adultos com infecção relacionada à assistência a saúde, internados no
Instituto Central do Hospital das Clínicas da FMUSP e no Hospital de Câncer
A.C Camargo durante o período de dezembro de 2009 a dezembro de 2011.
Dados demográficos e clínicos dos pacientes como idade, sexo,
doença de base, internação em unidade de terapia intensiva, uso prévio de
SMX/TMP e quinolonas e óbito foram avaliados.
4.2.1 Identificação bacteriana
Todas as cepas foram identificadas no laboratório do hospital de
origem e encaminhadas para o LIM-54. As amostras foram reidentificadas no
LIM-54 pelo método manual API20 NE (bioMérieux, França), Com leitura em
24 e 48 horas.
Métodos
36
4.3 Teste de Sensibilidade
O teste de sensibilidade in vitro para S. maltophilia foi realizado pelo
método de microdiluição em caldo de acordo com as recomendações do
manual M100-S19 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2009).
Foram calculadas as CIM50 e CIM90 dos antibióticos testados.
4.3.1 Antimicrobianos
Os seguintes antimicrobianos foram testados: Sulfametoxazol/
trimetoprima (Sigma, EUA), Levofloxacino (Fluka, Alemanha), ticarcilina-
ácido clavulanico (Sigma, EUA), cloranfenicol (Fluka, EUA), minociclina
(Sigma, EUA), tigeciclina “tygacil®” (Wyatt, EUA), ceftazidima (Sigma, EUA)
e ciprofloxacino (Sigma, EUA)
4.3.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pelo
método de microdiluição em caldo.
A determinação da CIM foi realizada seguindo a metodologia
recomendada pelo CLSI os seguintes passos foram seguidos:
4.3.2.1 Preparo da solução estoque do antimicrobiano
Os antimicrobianos testados apresentavam em seu rótulo as
seguintes informações: número do lote, prazo de validade e a potência
expressa em UI/mg ou g/mg. A solução estoque de antimicrobiano foi
Métodos
37
preparada a uma concentração final de 10mg/mL. Para cada antimicrobiano
foi empregado o solvente adequado, conforme os procedimentos
padronizados pelo CLSI. Para calcular a quantidade necessária do
antimicrobiano utilizamos a seguinte fórmula:
Peso (mg) = Volume (mL) X Concentração (g/mL)
Potência (g/mg)
4.3.2.2 Número de diluições
As concentrações testadas abrangem os cortes descritos na Tabela 2B-
4 do documento M100-S19 do CLSI, de 0,125g/mL a 256,0g/mL. A solução
inicial de 256,0g/mL foi obtida a partir da solução estoque de concentração
igual a 10.000g/mL. Foram realizadas diluições do antimicrobiano com o
diluente adequado para cada antimicrobiano seguindo a recomendação do
CLSI. Para Tigeciclina a solução inicial utilizada foi de 32g/mL seguindo a
recomendação da “United States Food and Drug Administration” (USFDA).
4.3.2.3 Preparo das diluições na microplaca de 96 poços
Um volume de 50L de meio de cultura caldo Mueller-Hinton Cátion
Ajustado (CMHCA) foi aplicado em todos os poços da microplaca, exceto na
coluna 1. Foi acrescentado 100L da diluição a 256,0g/mL ou 32g/mL
(tigeciclina) em todos os poços da coluna 1. Com uma pipeta multicanal foi
feita a diluição seriada do antimicrobiano pipetando 50L do primeiro poço
Métodos
38
da linha A (A1) para o segundo poço da linha A (A2). A mistura foi bem
homogeneizada e em seguida foi pipetado 50L do poço A2 para o A3.
Este procedimento foi realizado até o poço A11, tendo este um volume final
de 100L, o qual foi designado como controle de esterilidade (não foram
acrescentadas células bacterianas neste poço, com a finalidade de verificar
a possível ocorrência de contaminação durante a diluição do
antimicrobiano). O último poço de cada linha (A12-H12) foi utilizado como
controle de crescimento bacteriano, ou seja, foram inoculados 50L de meio
de cultura MHCA mais 50L da suspensão bacteriana (diluída 1:100).
4.3.2.4 Preparo da suspensão bacteriana
Foi preparada uma suspensão bacteriana na escala 0,5 de McFarland
(~1,5 x 108 UFC/mL) por espectrofotometria, com densidade óptica de 0,08 a
0,1 em comprimento de onda de 625nm. Esta suspensão foi diluída 1:100
em solução fisiológica ou CMHCA (~1,5 x 106UFC/mL).
4.3.2.5 Inoculação da suspensão bacteriana
Foi adicionado 50 L da suspensão bacteriana diluída nos poços 1 a
10 e no poço 12 de todas as colunas (A a H). Após o preparo das diluições,
a inoculação foi realizada num intervalo máximo de 30 minutos.
Após semeadura, as placas foram homogeneizadas por movimento rotatório.
Foram incubadas a 35° ± 2o C por 20 a 24 horas (CSLI., 2009).
Métodos
39
4.3.2.6 Controle de qualidade
De acordo com os critérios do CLSI, foram utilizadas como cepas
controle, as cepas E. coli ATCC® 25922 e P.aeruginosa ATCC® 27853.
4.3.2.7 Leitura das CIMs
A leitura das placas foi realizada em local iluminado, com auxílio de um
espelho para leitura de microplacas e de uma luminária. A CIM foi determinada
de acordo com a observação macroscópica de crescimento bacteriano nos
poços da microplaca por dois pesquisadores e por espectrofotometria utilizando
um comprimento de onda de 625nm nos casos de dúvida.
4.4 Teste fenotípico para avaliação de efluxo
Para investigar a presença de mecanismo de efluxo foi realizada a CIM
de ciprofloxacino e levofloxacino adicionando 0,5 µg/mL de carbonil cianeto
m-clorofenilhidrazona (CCCP) (Sigma, EUA) ou 10 µg/mL de reserpina
(Sigma, EUA). O teste foi considerado positivo se a CIM para a quinolona
avaliada na presença do inibidor, reserpina ou CCCP apresentasse uma
diminuição de 4 vezes em relação a CIM sem o inibidor.
Métodos
40
4.5 Caracterização de genes de resistência
Para investigar a presença de genes relacionados a resistência para
SMX/TMP e quinolonas foram realizadas as amplificações desses genes
pela técnica de PCR qualitativa com primers específicos para os genes sul1,
sul2, dfrA1 para TMP/SMX e smeD, smeT, aac6’-Ib-cr, qnrMR, qnrM, qnrA,
qnrB, qnrS, gyrA para quinolonas. Para os genes qnr A, qnrB, qnrS foi
realizado PCR multiplex. Para a detecção de elementos genéticos moveis
foram realizados os PCR para os genes da integrase 1 (int1) e da sequencia
de inserção (ISCR1).
4.5.1 Extração do DNA
Foi utilizando o Kit de extração Illustra bactéria “Genomicprep mini spin
KIT” (General Electric, Buckinghamshire, UK) seguindo as recomendações
do fabricante.
4.5.2 Preparo da mistura da reação
O Mix foi composto por 5 µL de tampão taq 10X, 1,5Mm de MgCl2 a
50mM, 200µM de dNTP mix, 1,25U de Taq DNA polimerase (Invitrogen,
EUA) e 10nM de primer.(reverse e forward).
Métodos
41
4.5.3 Parâmetros da amplificação em cadeia da polimerase dos genes
de resistência
Sul1: TA:64°C com 33 ciclos (45 seg-94°C/45 seg-64°C/2 min-72°C);
Sul2: TA: 64°C com 30 ciclos (45 seg-94°C/45 seg-64°C/2 min-72°C);
GyrA: TA: 54°C com 30 ciclos (1 min-94°C/1min-64°C/1 min-72°C);
QnrMR: TA: 54°C com 30 ciclos (1 min-94°C/1min-54°C/1 min-72°C);
QnrM: TA: 54°C com 30 ciclos (1 min-94°C/1min-64°C/1 min-72°C);
Int1: TA: 55°C com 30 ciclos (1 min-94°C/1min-55°C/1:30 min-72°C);
Aac-6’: TA: 55°C com 34 ciclos (45 seg-94°C/45 seg-55°C/45 seg-72°C);
dfrA1: TA: 52°C com 30 ciclos (45 seg-94°C/45 seg-52°C/1 min-72°C);
smeD: TA: 58°C com 35 ciclos (30 seg-94°C/1min-58°C/1:30 min-72°C);
smeT: TA: 58°C com 35 ciclos (30 seg-94°C/1min-58°C/1:30 min-72°C);
qnrA,B,S multiplex: TA:54°C com 30 ciclos (1 min-94°C/1min-54°C/1 min-72°C).
4.5.4 Preparo do gel e análise do DNA
O produto amplificado foi analisado por gel de eletroforese (1,5%
de agarose e 5uL de corante Syber green) a 70V por 60 minutos. Para
cada gel foi utilizado um peso molecular de 100 pb para determinar o
peso molecular dos produtos da PCR. Após a corrida o gel foi fotografado
em câmera de UV.
Métodos
42
4.5.5 Oligonucleotideos iniciadores (“Primers”)
Os primers utilizados e seus respetivos produtos amplificados estão
descritos na tabela 3.
Tabela 3. Oligonucleotideos iniciadores
Mecanismo de Resistência
Gene Sequência de oligoneucleotideos Iniciadors (5’-3’)
Tamanho do amplicon (pb)
Referência/ Nº GenBank
Sulfametoxazol Sul1 ATGGTGACGGTGTTCGGCATTCTGA
CTAGGCATGATCTTAACCCTCGGTCT
840 Toleman et al., 2006 AJ313522
Sulfametoxazol Sul2 GAATAAATCGCTCATCATTTTCGG
CGAATTCTTGCGGTTTCTTTCAGC
810 Toleman et al., 2006 AJ313522,
Integron Int1 TTCGAATGTCGTAACCGC
CGAGGCATAGAC TGT AC
457 Toleman et al., 2006 AF318072
ISCR Iscr2 CACTGGCTGGCAATGTCTAG CTTTGGACCGCAGTTGACTC
Toleman et al., 2006 AJ313522
Trimetoprima dfrA1 AGC TGT TCA CCT TTG GC
CCT GAA ATC CCC AGC AA
425 Toleman et al., 2006 AF455254
Quinolonas smeD CCAAGAGCCTTTCCGTCAT
CTCGGACTTCAGCGTGAC
150 Alonso et al., 2004 AJ252200
Quinolonas gyrA CGCGACGGCCTGAAGCCGGTGCA
TAGTTGGGCTGGAAATCGAC
335 Valdezate et al.,2004 AF302140
Quinolonas smeT GCAGCCTCGTTCACGCCTC ATGGCCCGCAAGACCAAAGAG
940 Sanchez et al., 2002 AJ316010
Quinolonas Aac(6’)-ib-cr
TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA
CTCGAATGCCTGGCGCGTGTTT
482 Park et al., 2006 EU597467
Quinolonas qnrA AGAGGATTTCTCACGCCAGG
TGCCAGGCACAGATCTTGAC
580 Robicsek et al., 2006 DQ303920
Quinolonas qnrB GGMATHGAAATTCGCCACTG
TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA
264 Robicsek et al., 2006 DQ303921
Quinolonas qnrS GCAAGTTCATTGAACAGGGT
TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG
428 Robicsek et al., 2006 DQ303920
Quinolonas qnrMR CATGGCATGGAATCCCGAT
TGATGTCTAGGCACCAC
660 Sanchez et al., 2008 EU681383
Quinolonas qnrM CTTGGCATGGAATCCCTGAT
TGATGCCTACGGCACCAC
660 Sanchez et al., 2008 AM743169
Métodos
43
4.6 Avaliação do Integron
Para determinar a posição do gene sul1 dentro do integron foi
realizada a determinação da configuração do integron pela técnica “Step by
Step”. Os oligonucleotideos iniciadores utilizados foram, int1, aad1, qac,
sul1. A metodologia de PCR quantitativa descrita anteriormente foi utilizada
para a avaliação do posicionamneto do gene sul1.
4.6.1 Parâmetros da amplificação em cadeia da polimerase do integron
Int1/qac: TA:56°C com 32 ciclos (45 seg-94°C /30 seg-56°C/ 1:30 min-72°C);
Int1/sul1: TA:56°C com 32 ciclos (45 seg-94°C /30 seg-56°C/ 1:30 min-72°C);
Int1/aad1: TA:54°C com 32 ciclos (45 seg-94°C /30 seg-56°C/ 1:30 min-72°C);
aad1/sul1: TA:56°C com 32 ciclos (45 seg-94°C /30 seg-56°C/ 1:30 min-72°C);
4.6.2 Oligonucleotideos iniciadores (“Primers”) (Tabela 4)
Tabela 4. Oligonucleotideos iniciadores para determinação da posição do
gene sul1 no integron de classe 1
Gene Sequência de oligoneucleotideos
Iniciadors (5’-3’)
Tamanho do
amplicon (pb)
Referência/
Nº GenBank
sul1 ATGGTGACGGTGTTCGGCATTCTGA
CTAGGCATGATCTTAACCCTCGGTCT
840 Toleman et al., 2006
AJ313522
int1 CCGTAGAAGAACAGC 457 Toleman et al., 2006
AF318072
qac GTTGCGATTACTTCG 320 Levesque et al., 1996
AJ313522
aad1 CGCCGAAGTATCGACTCAAC
GACTACCTTGGTGATCTCGC
450 Toleman et al., 2006
AJ313522
Métodos
44
4.7 Sequenciamento
Após a amplificação do gene por meio da PCR, pelo menos um dos
produtos gerados para cada reação foi submetido a uma nova reação de PCR
com os oligonucleotídeos de interesse para seqüenciamento do gene. O gene
amplificado foi purificado usando o kit “GFXTM PCR DNA and Gel Band
Purification” (GE healthcare, EUA) conforme instruções do fabricante.
A quatificação do DNA foi estimada através de uma corrida de eletroforese em
gel de agarose a 2% com peso Low DNA Mass Ladder (invitrogem, EUA).
O sequenciamento foi realizado no setor de sequenciamento do
genoma humano da USP utilizando o sistema de análise de DNA ABI 3730
DNA Analyser (Applied Biosystem, EUA). As reações de sequenciamento
foram feitas utilizando o BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit.
As sequências foram analisadas pelo software BioEdit v7.0.9. A sequencia
genética foi comparada com banco de dados disponível na internet
(BLAST – http://www.ncbi.nlm.nhi.gov/blast/).
4.8 Transferencia plasmidial por choque térmico
4.8.1 Produção da cepa receptora E. coli DH10B e E. coli TOP10
As amostras foram semeadas em caldo Luria bertoni (LB) ou caldo
Muller Hinton e incubadas “overnight”. Posteriormente foram aliquotados
100µL da amostra em 100mL do caldo LB e incubardo por 3 horas a 37°C
Métodos
45
em agitação constante. Foi transferido o caldo com bactéria para tubo estéril
de 50mL e mantido no gelo por 10 min. A cultura foi centrifugada a 2700g
por 10min a 4ºC e descartado o sobrenadante. O pellet foi suspenso em
30mL de MgCl2-CaCL2 gelado. E novamente foi centrifugado a 2700g por
10min a 4ºC. Foi descartado o sobrenadante e suspenso de novo em 2mL
de CaCl2 0,1M gelado para cada 50mL. A amostra da célula receptora
pronta foi aliquotada e estocada a -70° C.
4.8.2 Extração de plasmideo por lise alcalina para transformação
As seguintes soluções foram utilizadas:
4.8.2.1 Soluções utilizadas
Solução I : 2mg/mL de lisozima, 50mM de glicose, 10mM de CDTA ou EDTA
e 25mM Tris-HCL.
Solução II: 0,2 M de NaOH e 1% de SDS.
Solução III: 3 M de acetato de sódio com pH de 4,8 corrigido com ácido
acético glacial.
4.8.2.2 Procedimento
As amostras foram incubadas em caldo LB por 18 horas. Foitransferido
0,5mL da amostra para tubo eppendorf e centrifugada por 15 seg a 10.000g.
Após, o sobrenadante foi removido. Ao pellet foi adicionado 100µL da solução I
Métodos
46
por cada eppendorf misturando lentamente. A amostra foi incubada a 0° C por
30 min. Após foi adicionado rapidamente 200µL da soloução II e misturado no
vortex. Foram Adicionados 150µL da solução III e misturado por inversão.
Posteriormente a amostra foi incubada a 0° C por 60 minutos e centrifugada
por 5 minutos a 10.000g. Posteriormente, foram transferidos para outro tubo
400 µL do sobrenadante e adicionado 1mL de etanol gelado incubando
a -20°C por 30 min. O precipitado coletado foi centrifugado por 2 minutos.
O sobrenadante foi removido por aspiração. O pellet foi dissolvido em 100 µL
do 0,1M de acetato de Sodio e 0,05 TRIS e novamente precipitado com
200 µL de etanol gelado e incubação a -20°C por 10 minutos. Posteiromente
foi centrifugado por 2 min e o sobrenadante removido por aspiração.
Novamente o pellet foi dissolvido em 100ul do 0,1M acetato/0,05TRIS e
novamente precipitado com 200ul de etanol. O produto da transformação foi
suspenso em 40 ul de água Milli-Q.
4.8.3 Transformação da bactéria competente E.coli DH10B ou E. coli TOP 10
Foram aliquotados 50 µL do caldo de suspensão da E. coli
competente + 10µL do DNA plasmidial (50ng). Após, foram incubados no
gelo por 20-30 minutos. Foram transferidos para o banho-maria a 42°C por
90 segundos e levado no gelo por 2 minutos. Após foram Adicionados
950µL do caldo LB para cada tubo. As amostras foram incubadas por 10 min
a 37°C sob agitação continua. Foram Transnsferidos 100-300-500 µL para
cada placa com antibiótico adequado (Levofloxacino) + 20mM MgSO4 e
Métodos
47
incubar por 24-48 horas. A leitura das placas foi realizada por observação
direita. Uma colônia de crescimento foi semeada em caldo LB “overnight”
para realizar a CIM da amostra transformada.
4.9 Tipagem molecular – Protocolo para caracterização
molecular por eletroforese de campo pulsado (PFGE)
A análise molecular foi feita pela técnica de eletroforese de campo
pulsado, de acordo com os protocolos descritos por Kaufmann et al, (1998).
4.9.1 Preparo da suspensão bacteriana
As bactérias foram repicadas em meio ágar sangue de carneiro 5%
(AS) e incubadas por 18 a 24h, em temperatura de 35°C 2o C. Três a cinco
colônias foram transferidas para tubos contendo 3mL de caldo e incubados
a 35°C 2oC, “overnight”. Foram transferidos aos microtubos, previamente
pesados e identificados, cerca de 2mL do caldo com crescimento bacteriano.
Os microtubos foram centrifugados por 20 minutos a 11.000 rpm.
O sobrenadante foi desprezado e, em seguida, o sedimento foi lavado três
vezes com 1 mL de solução fisiológica estéril. Após a última lavagem, o
sobrenadante foi desprezado e o microtubo foi pesado em balança analítica.
A massa bacteriana foi calculada e, em seguida, foi adicionado um volume
adequado de solução de EDTA 25mM pH 8,0, para obter uma suspensão
bacteriana de concentração final de 100g/L.
Métodos
48
4.9.2 Preparo dos blocos de agarose
O banho-maria foi ajustado para temperatura de 56°C. Após a
fundição da agarose low melting (2% em TBE 0,5X) esta foi deixada no
banho-maria a 56°C. Os microtubos foram identificados com os números das
amostras e foi adicionado 300µL de tampão TEM. A esse tampão foram
adicionados 5uL da suspensão bacteriana a 100µg/µL. Os microtubos foram
homogeneizados e colocados no banho-maria a 56°C. Foi adicionado 30µL
de lizosima (20mg/mL). E após, foi adicionado 340µL de agarose e
homogeneizado. Essa mistura foi distribuída nos moldes e deixada por 15
minutos a 4°C.
4.9.3 Etapa de extração do DNA bacteriano
Foram distribuídos 2 mL de tampão EC nos pocinhos de uma placa de
cultura de células (24 poços). Os bloquinhos de agarose foram removidos
dos moldes e colocados nos pocinhos contendo tampão EC. Foram
incubados por 5h a 37°C, sob agitação suave. O tampão EC foi retirado e
em cada pocinho foi adicionado 2 mL de tampão CHEF-TE. Retirado o
tampão CHEF-TE e novamente adicionado 2 mL deste tampão. Foi deixada
a temperatura ambiente, sob agitação suave por 30 minutos. E após,
retirado o tampão CHEF-TE. Os bloquinhos foram cobertos com 2mL de
tampão ES e foi adicionado 100µL de proteinase K (20mg/mL) por pocinho e
homogeneizado. Foi realizad uma incubação a 50°C “overnigth”. Retirado o
Métodos
49
tampão ES, foram realizadas cinco lavagens com 2 mL de tampão CHEF-TE.
A primeria lavagem não tem incubação e as demais foram feitas em
intervalos de 1 hora. Após a última lavagem, o tampão CHEF-TE foi trocado
e a placa foi guardada sob refrigeração.
4.9.4 Etapa de restrição enzimática
Foram adicionados 300µL de tampão DNS nos pocinhos que foram
usados, em uma placa de cultura de 96 pocinhos. Com auxílio de uma
espátula e bisturi, o bloquinho de agarose foi pego e cortado ao meio.
Os pedaços foram colocados no pocinho contendo DNS. Retirado o tampão
DNS, foram realizadas 5 lavagens com tampão DNS, com incubações de 1
hora por lavagem em temperatura ambiente. Retirado o tampão DNS foi
adicionada 1U da enzima Spe1-fast (Fermentas-EUA) por amostra,
adicionado o tampão da enzima. Incubando por 7 minutos a 37°C e
posteriormente inativada com solução CHEF-TE gelado.
4.9.4 Preparo do gel
Os blocos tratados foram aplicados em gel de agarose a 1% (em TBE
0,5X). A eletroforese foi realizada no sistema CHEF-DRIII (Bio-Rad,
Richmond, CA, USA) e o tampão de corrida utilizado (2 litros de TBE 0,5X)
acrescido de 200L de tiouréa 0,5M.
Métodos
50
4.9.5 Condição da corrida
As condições de corrida foram de 5 a 90 segundos (switch time inicial-
final), 6 V/cm (corrente elétrica) e período de corrida de 19 horas. Após a
eletroforese, o gel foi corado com solução de brometo de etídio (1g/mL) por
30 minutos, descorado em água destilada por mais 30 minutos e fotografado
sob luz ultravioleta.
4.9.6 Interpretação dos resultados
O polimorfismo molecular dos perfis gerados pela PFGE foi analisado
de acordo com critérios propostos por Tenover et al, 1997, para
caracterização molecular de bactérias (Tabela 5).
Tabela 5. Critérios interpretativos para análise de tipagem molecular
Interpretação microbiológica baseada
nos resultados de tipagem
Número de diferenças genéticas comparadas com
um determinado isolado
Número de fragmentos diferentes comparados
ao padrão de determinado isolado
Correlação epidemiológica
Indistinguíveis 0 0 Isolado faz parte do surto isolado
Estreitamente relacionados 1 2-3 Provavelmente faz parte do surto
Possivelmente relacionados 2 4-6 Possivelmente faz parte do surto
Diferentes 3 ≥7 Isolado não faz parte do surto
5 RESULTADOS
Resultados
52
Foram identificados por meio dos registros de infecção hospitalar da
CCIH do Instituto Central do HC-FMUSP, do registro de culturas do
laboratório central do Instituto Central do HC, da CCIH do Hospital A.C.
Camargo um total de 118 culturas positivas para S. maltophilia no período de
dezembro de 2008 a dezembro de 2010. Cento e duas amostras do IC-HC e
quinze amostras do Hospital AC Camargo.
Doze culturas foram excluídas do estudo, nove amostras foram
excluídas por não serem S. maltophilia na reidentificação, duas amostras
não apresentaram crescimento e uma amostra foi isoladada de criança.
5.1 Identificação das cepas de S. maltophilia
Na reidentificação pela metodologia API-20 NE (bioMiéurex-França),
nove amostras não foram confirmadas como S. maltophilia, sendo três
amostras identificadas como Bulkhorderia cepacia, duas amostras
identificadas como Aeromonas hydrophila, dois amostras identificadas como
Pseudomonas luteola, uma amostra identificada como Acinetobacter
baumannii, uma cepa identificada como Delftia acidovorans e uma amostra
identificada como Pseudomonas aeruginosa. Essas amostras foram
excluídas do estudo.
Resultados
53
A tabela 6 mostra a distribuição dos isolados de S. maltophilia de
acordo ao sítio de infecção.
Tabela 6. Distribuição dos 106 isolados de S. maltophilia por sítio de
isolamento
Amostras Número de amostras Porcentagem
Sangue periférico 28 26,4%
Sangue CVC 21 19,8%
Ponta de cateter 3 2,8%
Secreção traqueal 28 26,4%
LBA 3 2,8%
Líquido pleural 1 0,9%
Urina 11 10,3%
Osso 2 1,8%
Liquído ascítico 1 0,9%
Líquido biliar 1 0,9%
Outros 7 6,6%
Total 106 100%
CVC:cateter venoso centra; LBA:lavado broncoalveolar.
Resultados
54
5.2 Dados demograficos
A idade média dos pacientes foi de 57 anos. Sesenta e dois (58%)
dos pacientes com infecção por S. maltophilia foram do sexo masculino.
Tabela 7. Distribuição das infecções por Stenotrophomonas maltophilia
ICS:infecção de corrente sanguínea; CVC:cateter venoso central; ITR:infecção de trato respiratório, ITU:infecção de trato urinario.
Os pacientes apresentavam diversos diagnósticos de base (Tabela 8).
Tabela 8. Diagnóstico de base dos pacientes com infecção por
Stenotrophomonas maltophilia
Diagnóstico n=106 %
Tumor órgão sólido 11 10,3
Neoplasia hematológica 15 14,1
Doença respiratória crônica 40 37,7
Aids 1 0,9
Insuficiência renal crônica 10 9,4
Doença cardiovascular 7 6,6
Trauma 6 5,6
Outros 16 15,6
Infecção n=106 (%)
ICS Primária 15 14,1
ICS relacionada ao CVC 32 30,1
ITR 37 34,9
ITU 11 10,3
Osteomielite 2 1,8
Sinusite 1 0,9
Outras 8 7,5
Resultados
55
5.3 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
Foram determinadas as CIM dos antimicrobianos, pelo método de
microdiluição em caldo, para 106 isolados de S. maltophilia (Tabela 9).
Tabela 9. Sensibilidade de oito antimicrobianos pelo método de microdiluição
de 106 isolados de S. maltophilia.
Antimicrobiano R S I
Sulfametoxazol /trimetoprima 23(21,6%) 83 (78,3%) -
Levofloxacino 14 (13,3%) 87 (82%) 5 (4,7%)
Ceftazidima 72 (68%) 22 (20,7%) 12(11,3%)
Minociclina 0 (0,0%) 105 (99%) 1 (1%)
Ciprofloxacino 62 (58,5%) 15(14,2%) 29 (27,3%)
Cloranfenicol 33 (31,1%) 33 (31,1%) 40 (37,8%)
Ticarcilina-Ácido. Clavulanato 25 (23,6%) 29 (27,4%) 52 (49%)
Tigeciclina 2 (1,8%) 97 (91,6%) 7 (6,6%)
Foram determinadas as CIM50 e CIM90 dos antimicrobianos, pelo
método de microdiluição em caldo, para 106 isolados de S. maltophilia
(Tabela 10).
Tabela 10. Concentrações inibitórias mínimas (CIM50 e CIM90) pelo método de
microdiluíção de 106 isolados de S. maltophilia
Antimicrobianos CIM50 g/L CIM90 g/L
Sulfametoxazol/ trimetoprima 1 32
Levofloxacino 1 4
Ceftazidima 64 ≥128
Minociclina ≤0,25 2
Ciprofloxacino 4 32
Cloranfenicol 16 64
Ticarcilina- Ácido clavulanato 32 128
Tigeciclina 1 2
Resultados
56
As 23 amostras resistentes a SMX/TMP foram isoladas de 21
pacientes (91,3%) do Hospital das Clínicas e 2 (8,6%) pacientes do Hospital
A.C Camargo (Tabela 11). Nove (17,4%) amostras foram isoladas em
secreção traqueal, seis (26%) foram isoladas de amostra de sangue
periferica, quantro (17,4%) amostras de cateter venoso central, uma (4,3%)
amostra de osso, uma amostra de lavado bronco alveolar, uma amostra de
urina e uma amostra de bile. Dezenove (82,6%) das amostras foram
isoladas em pacientes com uso prévio de SMX/TMP, 9 (39,1%) pacientes
tinham doença oncológica, 7 (22,5%) pacientes eram de unidade de terapia
intensiva e 7 (22,5%) pacientes estavam internados na enfermaria no
momento da infecção, porém tinham passagem prévia por unidade de
terapia intensiva. As 23 amostras apresentaram, resistência a outros
antimicrobianos (Tabela 12). Das amostras resistentes a SMX/TMP
nenhuma amostra apresentou resistência a minociclina. Duas (8,6%)
amostras apresentaram resistência intermediaria para tigeciclina. Doze
(52%) amostras apresentaram resistência para levofloxacino. Uma (4,3%)
amostra apresentou resistência para sete antimicrobianos testados exceto
minociclina. Essa amostra foi isolada de secreção traqueal de um paciente
com infecção de trato respiratório e que recebeu vários antimicrobianos
antes do isolamento da S. maltophilia, entretanto, o paciente não evoluiu
para óbito.
Resultados
57
Tabela 11. Caracteristicas das 23 amostras resistentes a SMX/TMP
Cepa Hospital Amostra SMX/TMP prévio
Integron Sul-1 R/SMX/TMP
1 HC LBA + - - 8
2 A.C Camargo
Cateter + + + 8
3 A.C Camargo
Cateter + + + >128
4 HC Sangue + - - 8
5 HC Osso - + - 16
6 HC Sangue + + - 8
7 HC Sangue - - - 16
8 HC S. traqueal + + - 32
9 HC S. traqueal + + - 8
10 HC S. traqueal + - - 8
11 HC Sangue + - - 4
12 HC Cateter + + + 32
13 HC Cateter + - - 32
14 HC bile - - - 16
15 HC S. traqueal + + - 16
16 HC S. traqueal + - - 4
17 HC S. traqueal + - - 16
18 HC Sangue + - + 32
19 HC Urina - - + 8
20 HC S. traqueal + - + 4
21 HC Sangue + - + 128
22 HC S. traqueal + + + 8
23 HC S. traqueal + - + 128
R/SMX/TMP: CIM da sulfametoxazol/trimetoprima, HC:Hospital das Clínicas da FMUSP,
LBA:lavado bronco alveolar, S. traqueal:secreção traqueal.
Resultados
58
Tabela 12. Perfil de resistência das 23 amostras de S. maltophilia resistentes a
SMX/TMP
Amostra Resistência
S/T Levo CAZ CIP ClO TIG T/C
1 + + + + + +
2 + + + + +
3 + + + + +
4 + + + + + +
5 + + + + +
6 + + + + +
7 + + + + +
8 + + + +
9 + + + + + +
10 + + + + +
11 + + + + +
12 + + + +
13 + + + + +
14 + + + + + +
15 + + + + +
16 + + + +
17 + + + + + + +
18 + + + + + +
19 + + + + +
20 + + + + + +
21 + + + + + +
22 + + + +
23 + + + +
S/T:Sulfametoxazol/trimetoprima; Levo:levofloxacino; CAZ:ceftazidima;
CLO:cloranfenicol; TIG:tigeciclina; T/C:ticarcilina/clavulanato.
A resistência ao levofloxacino foi observada em 19 amostras (Tabela
13), sendo 14 (13,3%) resistentes e cinco (4,7%) intermediarias. Seis
(33,3%) amostras resistêntes foram isoladas em pacientes com uso prévio
Resultados
59
de levofloxacino. Seis (33,3%) das amostras foram isoladas em sangue, seis
(33,3%) amostras foram de secreção traqueal, três (16,6%) amostras de
cateter, duas (11,1%) amostras de lavado bronco alveolar e uma amostra
(5,5%) amostra de urina. Oito (42,1%) pacientes tinham doença oncológica,
11 (58%) pacientes eram de unidade de terapia intensiva e 7 (22,5%)
pacientes estavam internados na enfermaria no momento da infecção,
porém tinham passagem prévia por unidade de terapia intensiva.
Tabela 13. Caracteristicas das 19 amostras resistentes ao levofloxacino
Cepa Hospital Amostra Levo prévio R/Levo
1 HC LBA - 4
2 HC LBA - 8
3 HC Sangue + 32
4 HC S. Traqueal - 8
5 HC Cateter + 16
6 HC Cateter - 4
7 HC S. Traqueal + 8
8 HC Sangue - 16
9 HC Sangue - 4
10 HC Urina + 64
11 HC Cateter + 16
12 HC S. traqueal - 8
13 HC S, traqueal - 8
14 HC Sangue - 4
15 HC Sangue - 8
16 HC S. traqueal - 4
17 HC S. traqueal - 16
18 HC Sangue + 32
19 HC Urina - 8
Levo prévio:uso de levofloxacino préviamente, R/levo: CIM de levofloxacino, HC:Hospital das Clínicas da FMUSP, LBA:lavado bronco alveolar, S. traqueal:secreção traqueal.
Resultados
60
5.4 Teste de sensibilidade com inibidores de bomba de
efluxo
A CIM para levofloxacino e ciprofloxacino em 15 cepas resistentes ao
levofloxacino não foi alterada na presença de reserpina ou carbonil cianeto
m-clorofenilhidrazona. Para levofloxacino a CIM90 sem a presença do
inibidor foi de 16 µg/mL e a CIM50 foi de 8 µg/mL e para ciprofloxacino CIM90
foi de 64 µg/mL e CIM50 de 32 µg/mL. Na presença do inibidor a CIM90 foi de
16 µg/mL e CIM50 foi de 8 µg/mL e para ciprofloxacino CIM90 de 32 µg/mL e
CIM50 de 16 µg/mL.
Entre essas cepas, foram testados dois isolados sensiveis ao
levofloxacino (amostra 15 e 32) que ficaram resistentes na vigência do
tratamento com esse antimicrobiano (amostra 16 e 33) (Tabela 14).
Tabela 14. Concentração inibitória mínima (CIM) com a presença ou ausência
dos inibidores de efluxo reserpina e CCCP em amostras sensíveis
ou resistentes a levofloxacino.
Amostra CIM µg/mL
cipro cipro/
reserpina
cipro/
CCCP
Levo levo/
reserpina
levo/
CCCP
15 16 8 4 1 0,5 1
16 >128 128 64 32 16 8
32 32 32 16 1 0,5 0,5
33 64 32 8 16 16 8
Cipro:ciprofloxacino; levo:levofloxacino, CCCP: carbonil cianeto
m-clorofenilhidrazona
Resultados
61
5.5 Reação de amplificação em cadeia da polimerase (PCR)
para detecção dos genes de resistência ao
sulfametoxazol/trimetoprima
Foi realizado PCR para deteção dos genes sul1, sul2 e dfrA1 para
avaliar a resistência a SMX/TMP das 106 amostras e os genes int1 e iscr2
para avaliação da presença de elementos genéticos móveis nas amostras
resistentes.
Quatorze amostras (13,2%) foram positivas para o gene sul1. Desses
isolados, nove amostras apresentavam resistência a SMX/TMP com CIM50 de
8 µg/mL e CIM90 de 128 µg/mL. Cinco amostras positivas para o gene sul1
foram sensíveis a SMX/TMP com CIM50 de 1 µg/mL e CIM90 de 1 µg/mL.
Entre as cepas negativas para o gene sul1, 14/96 (15,2%) amostras
apresentaram resistência a SMX/TMP com CIM50 de 8 µg/mL e CIM90 de
32 µg/mL.
Das amostras negativas para o gene sul1 com resistência a
SMX/TMP foi observada a presença do gene sul2 em uma amostra (0,9%),
que apresentou CIM de 16 µg/mL, nenhuma cepa sensível a SMX/TMP foi
positiva para o gene sul2.
Em relação ao gene dfrA1, das 106 cepas testadas, apenas uma
amostra sensível a SMX/TMP foi positiva, exibindo CIM de 0,25 µg/mL.
Vinte e uma amostras (19,8%) foram positivas para o gene da
integrase 1 (int1). Sete amostras positivas para o gene sul1 foram positivas
para o gene da int1 com CIM50 de 8 µg/mL e CIM90 de 128 µg/mL. Quatorze
Resultados
62
amostras positivas para o gene int1 foram negativas para o gene sul1,
exibindo CIM50 de 2 µg/mL e CIM90 de 16 µg/mL.
A sequencia de inserção da região comum (ISCR2) foi avaliada nas
amostras resistentes a SMX/TMP, sendo identificada apenas na cepa
positiva para o gene do sul2 (Figura 1).
pm – peso molecular; coluna 1, 2 e 19 – controles de esterilidade; coluna 3 –amostra
positiva; colunas 4 a 18 – amostras negativas.
Figura 1. Reação de PCR para detecção do gene iscr2 em isolados resistentes
a SMX/TMP de S. maltophilia
5.6 Sequenciamento dos genes relacionados à resistência
para SMX/TMP
Para cada gene estudado pelo menos uma amostra positiva foi
seqüenciada e após confirmação do gene, essa amostra foi usada como
controle positivo para reação de PCR do gene em questão.
Resultados
63
Para confirmar a presença do gene sul1, foi realizado o
seqüenciamento de uma amostra resistente e outra cepa sensível ao
SMX/TMP, com CIM de 8 µg/mL e 0,5 µg/mL respectivamente.
As sequencias obtidas apresentaram, tamanho de 755 pb e o
alinhamento realizado no programa ClustaW mostrou que as sequencias
foram idênticas a sequencia do gene sul1 de P. aeruginosa depositada no
GenBank n° HQ634775.2.
Na análise do alinhamento das sequencias de aminoácidos não
observamos diferenças nas amostras avaliadas.
Em relação ao gene sul2, a amostra positiva para o gene sul2 foi
seqüenciada obtendo uma sequencia de 730 pb. Na comparação com a
sequencia do gene sul2 de A. baumannii depositada no GenBank
n°FN293019.1 a amostra mostrou identidade de 100% com a sequencia
controle. Na amostra sul2 positiva foi realizada PCR para o gene iscr2 cujo
produto amplificado foi posteriormente foi sequenciado. O alinhamento da
sequencia foi realizado pelo programa ClustaW. Obtivemos uma sequencia
de 1713pb da sequencia de inserção ISCR2 (IS-92-like). O alinhamento das
sequencias mostrou identidade de 100% com a sequencia do plasmídio
pMTSm4 de uma amostra de S. maltophilia depositada no GenBank
n°AM182030. Essa sequencia de inserção esta localizada a 190pb de
distância do gene sul2.
A cepa positiva para a enzima dfrA1 pela técnica de PCR também foi
seqüenciada. A análise da sequencia mostrou 100% de identidade com a
sequencia da dfrA1 localizada no integron de classe I de uma cepa de
Resultados
64
Proteus mirabilis NF915770 depositada no GenBank n°HQ880252. Não foi
observada a presença de int1 ou iscr2 nessa amostra.
5.7 Análise dos elementos genéticos movéis
A esquematização dos genes sequenciados da cepa positiva para o
gene sul2 e iscr2, mostrou uma sequencia de 1713pb correspondente ao
gene iscr2, seguida de uma região de 184pb que representa o pseudogene
da mutase fosfoglucosamina (glmM) e adjacente se localizou o gene sul2 de
730pb (Figura 2)
Figura 2. Representação esquemática da sequencia iscr2 e genes adjacentes
de uma amostra positiva para o gene sul2 de S. maltophilia
A pesquisa da conformação de integrons em cepas positivas para o
gene sul1 foi realizada em duas amostras positivas para o gene sul1 e int1.
Amostra 1 com CIM para SMX/TMP de >125 µg/mL e a amostra 2 com CIM
de 8 µg/mL.
iscr2 (1700pb) glmM 200pb Sul2 730pb
CACTGGCTGGCAATGTCTAG
CTTTGGACCGCAGTTGACTC
Resultados
65
A sequencia do integron1 da amostra com CIM >125 µg/mL mostrou
um tamanho aproximado de 4000 pb contendo os genes cassetes aac4 e
aadA1 e a região qac/sul1 (Figura 3).
Figura 3. Representação esquemática do integron classe 1 em amostra de S.
maltophilia resistente a SMX/TMP com CIM de >125 µg/mL
A sequencia da amostra com CIM de 8 µg/mL teve um tamanho
aproximado de 2000 pb (Figura 4) e contem o gene cassete aadA1 e a
região terminal qac/sul1.
Figura 4. Representação esquemática do integron classe 1 em amostra de S.
maltophilia resistente a SMX/TMP com CIM de 8 µg/mL
Int1
PR-1 PR-2
att-1 qac1 qac/sul1 Aac4 aadA1
Int1
PR-1 PR-2
att-1 aadA1 qac/sul1
Resultados
66
5.8 Reação de amplificação em cadeia da polimerase (PCR)
para detecção dos genes de resistência as quinolonas
A deteção de genes de resistência do sistema de efluxo smeDEF e de
seu promotor foi realizado pela deteção dos genes smeD e smeT em 106
isolados de S. maltophilia. Noventa e seis (90,5%) amostras apresentaram o
gene smeD. O gene do promotor smeT foi pesquisado em 38 amostras, 12
(31,5%) foram amostras sensíveis ao levofloxacino. Apenas quatro amostras
foram negativas, todas resistentes ao levofloxacino, porém não houve
correlação entre o perfil de resistência e a presença do gene smeT (Figura 5).
pm – peso molecular; coluna 1 e 2 – controles de esterilidade; coluna 3 –controle positivo; colunas 4 a 10 – amostras positivas; coluna 11 amostra negativa.
Figura 5. Reação de PCR para detecção do gene smeT em isolados de
S. maltophilia resistentes ao levofloxacino
Resultados
67
A pesquisa do gene codificador da enzima aac(6’)-ib-cr foi realizada
por PCR em 106 amostras. Sessenta e sete (63,2%) foram positivas. Para
as amostras positivas a CIM50 foi de 1 µg/mL e a CIM90 foi de 8 µg/mL e para
as amostras negativas as CIM50 foi 1 µg/mL de e a CIM90 foi de 4 µg/mL.
Em relação aos genes qnr, das 106 amostras testadas não foi
observada a presença dos genes qnrA, qnrB ou qnrS. O mesmo aconteceu
com o gene especifico para S. maltophilia qnrM. Entretanto, o gene qnrSM
foi positivo em 83 (78,3%) das cepas estudadas.
5.9 Avaliação de mutações genéticas de genes
relacionados à resistência as quinolonas
Foram avaliadas sequencias genéticas dos genes gyrase A, da
enzima aac(6’)-ib-cr e dos genes qnr.
5.9.1 Avaliação de mutações genéticas de gene da girase A (gyrA)
Foi realizado o seqüenciamento de 17 amostras, 15 resistentes a
levofloxacino e duas amostras sensíveis que posteriormente apresentaram
resistência após o inicio do tratamento com levofloxacino. O seqüenciamento
das 17 amostras foi comparada com a sequencia do gene gyrA de S.
maltophilia sensível ao levofloxacino depositada no GenBank n° AJ409325.
Na análise comparativa da sequencia de nucleotídeos observamos
mutações pontuais nas posições: 106, 129, 144, 159, 162, 165, 171, 183,
Resultados
68
189, 204, 225 (Tabela 15). As amostras com CIM de 16 µg/mL apresentaram
um número maior de mutações pontuiais, porém, não observamos alteração
na sequencia de aminoácidos. As sequencias das duas amostras sensíveis
foram 100% idênticas com a sequencia controle.
A seguir a descrição das sequencias da gyrA em 15 amostras
resistentes a levofloxacino em comparação com a cepa controle (cont), As
mutações pontuais aparecem em vermelho,
Cont - 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45 1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A8 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45 1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A10 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N L P T F K S A R I V G 15
A12 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A14 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A16 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A18 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A20 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A22 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A24 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A26 1 GCG CAC AGC AAC aAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A28 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A30 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A32 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A34 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
A36 1 GCG CAC AGC AAC AAG CCC TAC TTC AAG TCG GCG CGT ATC GTC GGT 45
1 A H S N K P Y F K S A R I V G 15
Resultados
69
Cont -46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTC TAC 90 16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A8 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A10 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K T H P H G D Q S V Y 30
A12 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A14 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A16 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A18 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A20 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A22 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A24 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A26 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A28 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A30 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTA TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A32 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A34 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
A36 46 GAC GTC ATC GGT AAG TAC CAC CCG CAT GGC GAT CAG TCG GTG TAC 90
16 D V I G K Y H P H G D Q S V Y 30
Cont 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGT TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A8 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGT TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A10 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGT TAC ATG 135
31 A T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A12 91 GAC ACG CTG GTG CGC TTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGC TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A14 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGT TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A16 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTC GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGT TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
Resultados
70
A18 91 GAC ACG CTG GTG CGC TTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGC TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A20 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGT TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A22 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGT TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A24 91 GAC ACG CTG GTG CGC TTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGC TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A26 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGC TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A28 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGC TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A30 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGT TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A32 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGC TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A34 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGT TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
A36 91 GAC ACG CTG GTG CGC CTG GCA CAG CCG TTC TCG CTG CGC TAC ATG 135
31 D T L V R L A Q P F S L R Y M 45
Cont 136 CTG GTC GAT GGC CAG GGT AAC TTC GGC TCC ATC GAT GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A8 136 CTG GTC GAT GGC CAG GGT AAC TTC GGC TCC ATC GAT GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A10 136 CTG GTC GAT GGC CAG GGT AAC TTC GGC TCC ATC GAT GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A12 136 CTG GTC GAC GGC CAG GGT AAC TTC GGT TCG ATC GAC GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A14 136 CTG GTC GAT GGC CAG GGT AAC TTC GGC TCC ATC GAT GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A16 136 CTG GTC GAT GGC CAG GGT AAC TTC GGC TCC ATC GAT GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A18 136 CTG GTC GAC GGC CAG GGT AAC TTC GGT TCG ATC GAC GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A20 136 CTG GTC GAT GGC CAG GGT AAC TTC GGC TCC ATC GAT GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A22 136 CTG GTC GAT GGC CAG GGT AAC TTC GGC TCC ATC GAT GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A24 136 CTG GTC GAC GGC CAG GGT AAC TTT GGT TCG ATC GAC GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A26 136 CTG GTC GAC GGC CAG GGT AAC TTT GGT TCG ATC GAC GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
Resultados
71
A28 136 CTG GTC GAC GGC CAG GGT AAC TTT GGT TCG ATC GAC GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A30 136 CTG GTC GAT GGC CAG GGT AAC TTC GGC TCC ATC GAT GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A32 136 CTG GTC GAT GGC CAG GGT AAC TTC GGC TCC ATC GAT GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A34 136 CTG GTC GAT GGC CAG GGT AAC TTC GGT TCG ATC GAC GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
A36 136 CTG GTC GAC GGC CAG GGT AAC TTT GGT TCG ATC GAC GGC GAC TCC 180
46 L V D G Q G N F G S I D G D S 60
Cont 181 GCC GCG GCA ATG CGA TAC ACC GAA GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A8 181 GCC GCA GCA ATG CGA TAC ACC GAA GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A10 181 GCC GCG GCA ATG CGA TAC ACC GAA GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A12 181 GCT GCA GCA ATG CGA TAC ACC GAG GCG CGC ATG TCG CGC 219
61 A A A M R Y T E A R M S R
A14 181 GCC GCG GCA ATG CGA TAC ACC GAA GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A16 181 GCC GCG GCA ATG CGA TAC ACC GAA GCG CGC ATG TCG CGT CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A18 181 GCT GCA GCA ATG CGA TAC ACC GAG GCG CGC ATG TCG CGC 219
61 A A A M R Y T E A R M S R
A20 181 GCC GCG GCA ATG CGA TAC ACC GAA GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A22 181 GCC GCG GCA ATG CGA TAC ACC GAA GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A24 181 GCT GCA GCA ATG CGA TAC ACC GAG GCG CGC ATG TCG CGC CCT GGC 225
61 A A A M R Y T E A R M S R P G 75
A26 181 GCT GCG GCG ATG CGA TAC ACC GAG GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A28 181 GCT GCG GCG ATG CGA TAC ACC GAG GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A30 181 GCC GCG GCA ATG CGA TAC ACC GAA GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A32 181 GCC GCG GCG ATG CGA TAC ACC GAA GCG CGC ATG TCG CGC CTC GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A34 181 GCC GCG GCG ATG CGA TAC ACC GAG GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
A36 181 GCT GCG GCG ATG CGA TAC ACC GAG GCG CGC ATG TCG CGC CTG GCG 225
61 A A A M R Y T E A R M S R L A 75
Resultados
72
Na tabela 15, mostramos o número e posição da alteração de
nucleotídeos e a CIM da amostra avaliada.
Tabela 15. Avaliação das sequencias genéticas da girase A em 17 amostras
de S. maltophilia
Amostra CIM levo
Posição da mutação
8 8 G189A
10 4
12 4 T106C T129C C162T C165T T171C C183T G189A A204G
14 4
16 4
18 4 T106C T129C C162T C165T T171C C183T G189A A204G
20 4
22 8
24 16 T106C T129C T144C C159T C162T C165T T171C C183T G189A A204G G225C
26 16 T129C T144C C159T C162T C165T T171C C183T A204G
28 16 T129C T144C C159T C162T C165T T171C C183T A204G
30 8
32 8
34 16 C162T C165T T171C C183T G189A A204G
36 8 T129C T144C C162T C165T T171C C183T G189A A204G
38 2
40 1
CIM em µg/mL
5.10 Avaliação da sequencia genética dos genes qnr
Para avaliação dos genes qnr foi realizado o seqüenciamento de 13
cepas positivas para o gene qnrMR. Seis amostras foram sensíveis ao
levofloxacino (amostras 7, 9, 11, 14, 31, 39) e sete amostras resistentes ao
Resultados
73
levofloxacino (amostras 33, 35, 37, 41, 45, 47, 49. As mutações na
sequencia de aminoácidos são apresentadas na tabela 9.
A seguir a descrição das sequencia das amostras estudadas
comparadas com as sequencias controle do gene Smqnr1 (sensível a
levofloxacino) GenBank n°AB430839 e a sequencia controle do gene
Smqnr13 (resistente a levofloxacino) GenBank n°FJ596753. As diferenças
de aminoácido aparecem em vermelho.
Smqnr1 G A D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr13 G A D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr9 G A D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr11 G A D Q Y T R P E S G R P A V 15
Smqnr14 G A D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr7 G V D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr31 G A D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr33 G A D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr35 G A D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr37 G V D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr39 G A D Q Y T G H K V V E Q Q F 15
Smqnr41 G V D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr45 S A D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr47 G V D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
Smqnr49 G V D Q Y T G Q K V V D Q Q F 15
-------------------------------------------------------------------------------------------------
Resultados
74
Smqnr1 H E C D F S G A D L T G T E F 30
Smqnr13 H E C D F S G V D L T G T E F 30
Smqnr9 H K C D F S G A D L T G T E F 30
Smqnr11 P * V R F F R C R P D R H R V 30
Smqnr14 H E C D F S G A D L T A T E F 30
Smqnr7 H E C D F S G A D L T G T E F 30
Smqnr31 H E C D F S G V D L T A T E F 30
Smqnr33 H E C D F S G A D L T G T E F 30
Smqnr35 H E C D F S G A D L T A T E F 30
Smqnr37 H E C D F S G A D L T G T E F 30
Smqnr39 H E C D F S G A D L T A T E F 30
Smqnr41 H E C D F S G A D L T G T E F 30
Smqnr45 H E C D F S G A A L T G T E F 30
Smqnr47 H E C D F S G A D L T G T E F 30
Smqnr49 H E C D F S G A D L T G T E F 30
------------------------------------------------------------------------------------------------
Smqnr1 I N C S F Y D A D T R A G C R 45
Smqnr13 I N C S F Y D A D S R T G C R 45
Smqnr9 I N C S F Y D A D S R A G C R 45
Smqnr11 H Q L Q L L R C R Q P Q R L P 45
Smqnr14 I N C S F Y D A D S R S G C R 45
Smqnr7 I N C S F Y D A D S R A G C R 45
Smqnr31 I N C S F Y D A D S R A G C R 45
Smqnr33 I N C S F Y D A D T R A G C R 45
Smqnr35 I N C S F Y D A D S R S G C R 45
Resultados
75
Smqnr37 I N C S F Y D T D S R A G C R 45
Smqnr39 I N C S F Y D A D S R S G C R 45
Smqnr41 I N C S F Y D A D S R A G C R 45
Smqnr45 I N C S F Y D A N S R A G C R 45
Smqnr47 I N C S F Y D A D S R A G C R 45
Smqnr49 I N C S F Y D A D S R A G C R 45
-----------------------------------------------------------------------------------------------
Smqnr1 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr13 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr9 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr11 L Q W R H I E G G Q L P Q L R 60
Smqnr14 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr7 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr31 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr33 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr35 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr37 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr39 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr41 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr45 F N G A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr47 F N D A T L K E A S F R S C D 60
Smqnr49 F N G A T L K E A S F R S C D 60
--------------------------------------------------------------------------------------------
Resultados
76
Smqnr1 I S M C H F S F I K A L G L E 75
Smqnr13 I S M C H F N F V K A L G L E 90
Smqnr9 I S M C H F N F I K A L G L E 75
Smqnr11 H Q H V P L Q L H Q G A G P G 75
Smqnr14 I S M C H F N F I K A L G L E 75
Smqnr7 I S M C H F N F I K A L G L E 75
Smqnr31 I S M C H F N F V K A L G L E 75
Smqnr33 I S M C H F S F I K A L G L E 75
Smqnr35 I S M C H F N F I K A L G L E 75
Smqnr37 I S M C H F N F I K A L G L E 75
Smqnr39 I S M C H F N F I K A L G L E 75
Smqnr41 I S M C H F N F I K A L G L E 75
Smqnr45 I S M C H F N F I K A L G L E 75
Smqnr47 I S M C H F N F I K A L G L E 75
Smqnr49 I S M C H F N F I K A L G L E 75
--------------------------------------------------------------------------------------------
Smqnr1 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Smqnr13 I S E C R A Q G A D F S G A S 90
Smqnr9 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Smqnr11 D Q R V P R A G C G F Q Q R Q 90
Smqnr14 I S E C R A Q G A D S S N A S 90
Smqnr7 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Smqnr31 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Smqnr33 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Smqnr35 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Resultados
77
Smqnr37 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Smqnr39 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Smqnr41 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Smqnr45 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Smqnr47 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
Smqnr49 I S E C R A Q G A D F S N A S 90
-----------------------------------------------------------------------------------------------
Smqnr1 F M N Q I T T R S W F C S A F 105
Smqnr13 F M N Q I T P R S G F C S A F 105
Smqnr9 F M N Q I T T R S G F C S A F 105
Smqnr11 L H E P D H H A Q L V L Q R L 105
Smqnr14 F M N Q I T T R S W F C S A F 105
Smqnr7 F M N Q I T T R S W F C S A F 105
Smqnr31 F M N Q I T P R S G F C S A F 105
Smqnr33 F M N Q I T T R S W F C S A F 105
Smqnr35 F M N Q I T T R S W F C S A F 105
Smqnr37 F M N Q I T T R S W F C S A F 105
Smqnr39 F M N Q I T T R S W F C S A F 105
Smqnr41 F M N Q I T T R S W F C S A F 105
Smqnr45 F M N Q I T K R S W F C S A F 105
Smqnr47 F M N Q I T T R S W F C S A F 105
Smqnr49 F M N Q I T T R S W F C S A F 105
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Smqnr1 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr13 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Resultados
78
Smqnr9 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr11 H Q E V E P A L C Q F L A G H 120
Smqnr14 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr7 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr31 I K K S N L R Y A N F S R A T 120
Smqnr33 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr35 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr37 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr39 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr41 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr45 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr45 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
Smqnr49 I K K S N L R Y A N F S R V T 120
-----------------------------------------------------------------------------------------------
Smqnr1 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr13 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr9 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr11 A G E M R T V G E P L G R C K 135
Smqnr14 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr7 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr31 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr33 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr35 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr37 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr39 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Resultados
79
Smqnr41 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr45 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr47 L E K C E L W E N R W D G A N 135
Smqnr49 L E K C E L W E N R W D G A N 135
-------------------------------------------------------------------------------------------------
Smqnr1 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr13 V S G A S F A G S D L S G G Q 165
Smqnr9 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr11 R Q R R Q L C R L G P V R W P 150
Smqnr14 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr7 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr31 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr33 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr35 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr37 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr39 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr41 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr45 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
Smqnr49 V S G A S F A G S D L S G G Q 150
--------------------------------------------------------------------------------------------------
Smqnr1 F E G I D W N S A N F T D C D 165
Smqnr13 F E G V D W N S A N F T D C D 180
Smqnr9 F E G I D W N S A N F T D C D 165
Smqnr11 V R G N R L E Q R Q L H R L R 165
Smqnr14 F E G I D W N S A N F T D C D 165
Smqnr7 F E G V D W N S A N F T D C D 165
Resultados
80
Smqnr31 F E G V D W N S A N F T D C D 165
Smqnr33 F E G I D W N S A N F T D C D 165
Smqnr35 F E G I D W N S A N F T D C D 165
Smqnr37 F E G V D W N S A N F T D C D 165
Smqnr39 F E G I D W N S A N F T D C D 165
Smqnr41 F E G V D W N S A N F T D C D 165
Smqnr45 F E G I D W N S A N F T D C D 165
Smqnr47 F E G V D W N S A N F T D C D 165
Smqnr49 F E G V D W N S A N F T D C D 165
---------------------------------------------------------------------------------------------
Smqnr1 L T R S E L G E L D L R S T N 180
Smqnr13 L T H S E L G E L D L R S T N 195
Smqnr9 L T N S E L G E L D L R R T N 180
Smqnr11 P D Q F R S G R X G P A Q H Q 180
Smqnr14 L T N S D L G E L D L R S T N 180
Smqnr7 L T N S E L G E L D L R S T N 180
Smqnr31 L T H S E L G A L D L R S T N 180
Smqnr33 L T N S E L G E L D L R S T N 180
Smqnr35 L T N S D L G E L D L R S T N 180
Smqnr37 L T N S E L G K L D L R S T N 180
Smqnr39 L T N S D L G E L D L R S T N 180
Smqnr41 L T N S E L G E L D L R S T N 180
Smqnr45 L T N S E L G E L D L R S T N 180
Smqnr47 L T N S E L G E L D L R S T N 180
Smqnr49 L T N S E L G E L D L R S T N 180
------------------------------------------------------------------------------------------------
Resultados
81
Smqnr1 L R G A T L D V Q Q V A L L M 195
Smqnr13 L R G A T L D L Q Q V A L L M 195
Smqnr9 L R G A T L D V Q Q V
Smqnr11 P A W R H A G C P A G A L *
Smqnr14 L R G A T L D V Q Q V A L L M 195
Smqnr7 L R G A T L D V Q Q V A L L M
Smqnr31 L R G A T L D V Q Q V
Smqnr33 L R G A T L D V Q Q V A L
Smqnr35 L R G A T L D V Q Q V A R
Smqnr37 L R G A T L D V Q Q V
Smqnr39 L R G A T L D V Q Q V A L
Smqnr41 L R G A T L D V Q Q V A L * E
Smqnr45 L R G A T L D V Q Q V A L
Smqnr47 L R G A T L D V Q Q
Smqnr47 L R G A T L D V Q Q V A L
As sequencias foram alinhadas com 27 sequencias de genes Smqnr
disponíveis no GenBank (Shimizu et al.,2010 e Gordon et al.,2010).
As amostras 7, 37, 41, 47, 49 descritas acima, foram idênticas a sequencia
do gene Smqnr6 disponível no GenBank n°AB430849.1. A sequencia da
amostra 9 foi idêntica a sequencia do gene qnr n°EU681372. A sequencia da
amostra 14 foi idêntica a sequencia do gene Smqnr4 disponível no GenBank
n°AB430842. A sequencia da amostra 35 foi igual a sequencia do gene
Resultados
82
Smqnr12 disponível no GenBank n°FJ596752. As amostras 11, 31, 33 e 45
foram diferentes as sequencias disponíveis no GenBank.
Tabela 16. Avaliação das sequencias genéticas dos genes qnr de 13 amostras
de S. maltophilia
Amostra CIM levo
CIM
Cipro
Posição da mutação
9 0,5 2 S67N W100G R168N
11 1 32 R168N
14 <0,25 0,5 G27A G27A A42S S67N R168N
7 1 8 A2V S67N R168N
31 1 16 A23V G27A G27A S67N T97P W100G R168N
33 16 64 R168N
35 16 64 A42S S67N R168N
37 8 32 S67N R168N
39 0,5 2 Q8H D13E G27A A42S S67N R168N
41 8 16 A2V S67N R168N
45 8 2 D39N S67N R168N
47 8 32 A2V D24A S67N R168N
49 4 32 A2V S67N R168N
Em relação a CIM das amostras seqüenciadas, não observamos uma
associação entre mutações de aminoácidos e o perfil de resistência.
Entretanto, observamos que cepas com CIM de levofloxacino de 16 µg/mL
apresentaram um número menor de mutações.
As sequencias das amostras 11, 9, 14 e 7 foram depositadas no
GenBank com número de acesso HQ711556.1, HQ711555.1, HQ711554.1,
HQ711553.1 respetivamente.
Resultados
83
5.11 Avaliação da sequencia genética dos genes da enzima
N-acetil transferase aac(6’)-ib-cr
Foram realizados quatro sequenciamentos de duas amostras com
resistência ao ciprofloxacino e duas amostras sensíveis ao ciprofloxacino.
Foi considerada positiva para a variante cr a amostra que apresentasse
alteração no códon TRP102ARG. Nas quatro amostras testadas foi
observada a mutação do aminoácido para arginina no códon 102.
A seguir a descrição das sequencias de 4 amostras de S. maltophilia
comparadas com as sequencias controle para aac(6’)-ib-cr (controle CR)
(GenBank nº HQ438047.1) e sequencia controle para aac(6’)-ib (controle IB)
(GenBank n° HQ170514).
Controle CR ATG ACT GAG CAT GAC CTT GCG ATG CTC TAT GAG TGG CTA AAT CGA 45
1 Met Thr Glu His Asp Leu Ala Met Leu Tyr Glu Trp Leu Asn Arg 15
Controle IB ATG ACT GAG CAT GAC CTT GCG ATG CTC TAT GAG TGG CTA AAT CGA 45
1 Met Thr Glu His Asp Leu Ala Met Leu Tyr Glu Trp Leu Asn Arg 15
Amostra7 ATG ACT GAG CAT GAC CTT GCG ATG CTC TAT GAG TGG CTA AAT CGA 45
1 Met Thr Glu His Asp Leu Ala Met Leu Tyr Glu Trp Leu Asn Arg 15
Amostra58 ATG ACT GAG CAT GAC ctt gcg atg ctc taT GAG TGG CTA AAT CGA 45
1 Met Thr Glu His Asp Leu Ala Met Leu Tyr Glu Trp Leu Asn Arg 15
Amostra56 ATG ACT GAG CAT GAC cTT GCG ATG CTC TAT GAG TGG CTA AAT CGA 45
1 Met Thr Glu His Asp Leu Ala Met Leu Tyr Glu Trp Leu Asn Arg 15
Amostra54 ATG ACT GAG CAT GAC ctt gcg atg ctc tat gag tgg cta aat cga 45
1 Met Thr Glu His Asp Leu Ala Met Leu Tyr Glu Trp Leu Asn Arg 15
----------------------------------------------------------------------------
Resultados
84
Controle CR TCT CAT ATC GTC GAG TGG TGG GGC GGA GAA GAA GCA CGC CCG ACA 90
16 Ser His Ile Val Glu Trp Trp Gly Gly Glu Glu Ala Arg Pro Thr 30
Controle IB TCT CAT ATC GTC GAG TGG TGG GGC GGA GAA GAA GCA CGC CCG ACA 90
16 Ser His Ile Val Glu Trp Trp Gly Gly Glu Glu Ala Arg Pro Thr 30
Amostra7 TCT CAT ATC GTC GAG TGG TGG GGC GGA GAA GAA GCA CGC CCG ACA 90
16 Ser His Ile Val Glu Trp Trp Gly Gly Glu Glu Ala Arg Pro Thr 30
Amostra58 TCT CAT ATC GTC GAG TGG TGG GGC GGA GAA GAA GCA CGC CCG ACA 90
16 Ser His Ile Val Glu Trp Trp Gly Gly Glu Glu Ala Arg Pro Thr 30
Amostra56 TCT CAT ATC GTC GAG TGG TGG GGC GGA GAA GAA GCA CGC CCG ACA 90
16 Ser His Ile Val Glu Trp Trp Gly Gly Glu Glu Ala Arg Pro Thr 30
Amostra54 tct cat ATC GTC GAG TGG TGg GGC GGA GAA GAA GCA CGC CCG ACA 90
16 Ser His Ile Val Glu Trp Trp Gly Gly Glu Glu Ala Arg Pro Thr 30
----------------------------------------------------------------------------
ControleCR CTT GCT GAC GTA CAG GAA CAG TAC TTG CCA AGC GTT TTA GCG CAA 135
31 Leu Ala Asp Val Gln Glu Gln Tyr Leu Pro Ser Val Leu Ala Gln 45
ControleIB CTT GCT GAC GTA CAG GAA CAG TAC TTG CCA AGC GTT TTA GCG CAA 135
31 Leu Ala Asp Val Gln Glu Gln Tyr Leu Pro Ser Val Leu Ala Gln 45
Amostra7 CTT GCT GAC GTA CAG GAA CAG TAC TTG CCA AGC GTT TTA GCG CAA 135
31 Leu Ala Asp Val Gln Glu Gln Tyr Leu Pro Ser Val Leu Ala Gln 45
Amostra58 CTT GCT GAC GTA CAG GAA CAG TAC TTG CCA AGC GTT TTA GCG CAA 135
31 Leu Ala Asp Val Gln Glu Gln Tyr Leu Pro Ser Val Leu Ala Gln 45
Amostra56 CTT GCT GAC GTA CAG GAA CAG TAC TTG CCA AGC GTT TTA GCG CAA 135
31 Leu Ala Asp Val Gln Glu Gln Tyr Leu Pro Ser Val Leu Ala Gln 45
Amostra54 CTT GCT GAC GTA CAG GAA CAG TAC TTG CCA AGC GTT TTA GCG CAA 135
31 Leu Ala Asp Val Gln Glu Gln Tyr Leu Pro Ser Val Leu Ala Gln 45
----------------------------------------------------------------------------
ControleCR GAG TCC GTC ACT CCA TAC ATT GCA ATG CTG AAT GGA GAG CCG ATT 180
46 Glu Ser Val Thr Pro Tyr Ile Ala Met Leu Asn Gly Glu Pro Ile 60
ControleIB GAG TCC GTC ACT CCA TAC ATT GCA ATG CTG AAT GGA GAG CCG ATT 180
46 Glu Ser Val Thr Pro Tyr Ile Ala Met Leu Asn Gly Glu Pro Ile 60
Amostra7 GAG TCC GTC ACT CCA TAC ATT GCA ATG CTG AAT GGA GAG CCG ATT 180
46 Glu Ser Val Thr Pro Tyr Ile Ala Met Leu Asn Gly Glu Pro Ile 60
Amostra58 GAG TCC GTC ACT CCA TAC ATT GCA ATG CTG AAT GGA GAG CCG ATT 180
46 Glu Ser Val Thr Pro Tyr Ile Ala Met Leu Asn Gly Glu Pro Ile 60
Amostra56 GAG TCC GTC ACT CCA TAC ATT GCA ATG CTG AAT GGA GAG CCG ATT 180
46 Glu Ser Val Thr Pro Tyr Ile Ala Met Leu Asn Gly Glu Pro Ile 60
Amostra54 GAG TCC GTC ACT CCA TAC ATT GCA ATG CTG AAT GGA GAG CCG ATT 180
46 Glu Ser Val Thr Pro Tyr Ile Ala Met Leu Asn Gly Glu Pro Ile 60
Resultados
85
ControleCR GGG TAT GCC CAG TCG TAC GTT GCT CTT GGA AGC GGG GAC GGA TGG 225
61 Gly Tyr Ala Gln Ser Tyr Val Ala Leu Gly Ser Gly Asp Gly Trp 75
ControleIB GGG TAT GCC CAG TCG TAC GTT GCT CTT GGA AGC GGG GAC GGA TGG 225
61 Gly Tyr Ala Gln Ser Tyr Val Ala Leu Gly Ser Gly Asp Gly Trp 75
Amostra7 GGG TAT GCC CAG TCG TAC GTT GCT CTT GGA AGC GGG GAC GGA TGG 225
61 Gly Tyr Ala Gln Ser Tyr Val Ala Leu Gly Ser Gly Asp Gly Trp 75
Amostra58 GGG TAT GCC CAG TCG TAC GTT GCT CTT GGA AGC GGG GAC GGA TGG 225
61 Gly Tyr Ala Gln Ser Tyr Val Ala Leu Gly Ser Gly Asp Gly Trp 75
Amostra56 GGG TAT GCC CAG TCG TAC GTT GCT CTT GGA AGC GGG GAC GGA TGG 225
61 Gly Tyr Ala Gln Ser Tyr Val Ala Leu Gly Ser Gly Asp Gly Trp 75
Amostra54 GGG TAT GCC CAG TCG TAC GTT GCT CTT GGA AGC GGG GAC GGA TGG 225
61 Gly Tyr Ala Gln Ser Tyr Val Ala Leu Gly Ser Gly Asp Gly Trp 75
----------------------------------------------------------------------------
ControleIC TGG GAA GAA GAA ACC GAT CCA GGA GTA CGC GGA ATA GAC CAG TTA 270
76 Trp Glu Glu Glu Thr Asp Pro Gly Val Arg Gly Ile Asp Gln Leu 90
ControleIB TGG GAA GAA GAA ACC GAT CCA GGA GTA CGC GGA ATA GAC CAG TCA 270
76 Trp Glu Glu Glu Thr Asp Pro Gly Val Arg Gly Ile Asp Gln Ser 90
Amostra7 TGG GAA GAA GAA ACC GAT CCA GGA GTA CGC GGA ATA GAC CAG TTA 270
76 Trp Glu Glu Glu Thr Asp Pro Gly Val Arg Gly Ile Asp Gln Leu 90
Amostra58 TGG GAA GAA GAA ACC GAT CCA GGA GTA CGC GGA ATA GAC CAG TTA 270
76 Trp Glu Glu Glu Thr Asp Pro Gly Val Arg Gly Ile Asp Gln Leu 90
Amostra56 TGG GAA GAA GAA ACC GAT CCA GGA GTA CGC GGA ATA GAC CAG TCA 270
76 Trp Glu Glu Glu Thr Asp Pro Gly Val Arg Gly Ile Asp Gln Ser 90
Amostra54 TGG GAA GAA GAA ACC GAT CCA GGA GTA CGC GGA ATA GAC CAG TTA 270
76 Trp Glu Glu Glu Thr Asp Pro Gly Val Arg Gly Ile Asp Gln Leu 90
ControleIC CTG GCG AAT GCA TCA CAA CTG GGC AAA GGC TTG GGA CGA AAG CTG 315
91 Leu Ala Asn Ala Ser Gln Leu Gly Lys Gly Leu Gly Arg Lys Leu 105
ControleIB CTG GCG AAT GCA TCA CAA CTG GGC AAA GGC TTG GGA ACC AAG CTG 315
91 Leu Ala Asn Ala Ser Gln Leu Gly Lys Gly Leu Gly Thr Lys Leu 105
Amostra7 CTG GCG AAT GCA TCA CAA CTG GGC AAA GGC TTG GGA CGA AAG CTG 315
91 Leu Ala Asn Ala Ser Gln Leu Gly Lys Gly Leu Gly Arg Lys Leu 105
Amostra58 CTG GCG AAT GCA TCA CAA CTG GGC AAA GGC TTG GGA CGA AAG CTG 315
91 Leu Ala Asn Ala Ser Gln Leu Gly Lys Gly Leu Gly Arg Lys Leu 105
Amostra56 CTG GCG AAT GCA TCA CAA CTG GGC AAA GGC TTG GGA CGA AAG CTG 315
91 Leu Ala Asn Ala Ser Gln Leu Gly Lys Gly Leu Gly Arg Lys Leu 105
Amostra54 CTG GCG AAT GCA TCA CAA CTG GGC AAA GGC TTG GGA CGA AAG CTG 315
91 Leu Ala Asn Ala Ser Gln Leu Gly Lys Gly Leu Gly Arg Lys Leu 105
ControleIC GTT CGA GCT CTG GTT GAG TTG CTG TTC AAT GAT CCC GAG GTC ACC 360
106 Val Arg Ala Leu Val Glu Leu Leu Phe Asn Asp Pro Glu Val Thr 120
ControleIB GTT CGA GCT CTG GTT GAG TTG CTG TTC AAT GAT CCC GAG GTC ACC 360
106 Val Arg Ala Leu Val Glu Leu Leu Phe Asn Asp Pro Glu Val Thr 120
Resultados
86
Amostra7 GTC CGA GCT CTG GTT GAG TTG CTG TTC AAT GAT CCC GAG GTC ACC 360
106 Val Arg Ala Leu Val Glu Leu Leu Phe Asn Asp Pro Glu Val Thr 120
Amostra58 GTT CGA GCT CTG GTT GAG TTG CTG TTC AAT GAT CCC GAG GTC ACC 360
106 Val Arg Ala Leu Val Glu Leu Leu Phe Asn Asp Pro Glu Val Thr 120
Amostra56 GTT CGA GCT CTG GTT GAG TTG CTG TTC AAT GAT CCC GAG GTC ACC 360
106 Val Arg Ala Leu Val Glu Leu Leu Phe Asn Asp Pro Glu Val Thr 120
Amostra54 GTT CGA GCT CTG GTT GAG TTG CTG TTC AAT GAT CCC GAG GTC ACC 360
106 Val Arg Ala Leu Val Glu Leu Leu Phe Asn Asp Pro Glu Val Thr 120
ControleIC AAG ATC CAA ACG GAC CCG TCG CCG AGC AAC TTG CGA GCG ATC CGA 405
121 Lys Ile Gln Thr Asp Pro Ser Pro Ser Asn Leu Arg Ala Ile Arg 135
ControleIC AAG ATC CAA ACG GAC CCG TCG CCG AGC AAC TTG CGA GCG ATC CGA 405
121 Lys Ile Gln Thr Asp Pro Ser Pro Ser Asn Leu Arg Ala Ile Arg 135
Amostra7 AAG ATC CAA ACG GAC CCG TCG CCG AGC AAC TTG CGA GCG ATC CGA 405
121 Lys Ile Gln Thr Asp Pro Ser Pro Ser Asn Leu Arg Ala Ile Arg 135
Amostra58 AAG ATC CAA ACG GAC CCG TCG CCG AGC AAC TTG CGA GCG ATC CGA 405
121 Lys Ile Gln Thr Asp Pro Ser Pro Ser Asn Leu Arg Ala Ile Arg 135
Amostra56 AAG ATC CAA ACG GAC CCG TCG CCG AGC AAC TTG cGa GCG ATC CGA 405
121 Lys Ile Gln Thr Asp Pro Ser Pro Ser Asn Leu Arg Ala Ile Arg 135
Amostra54 AAG ATC CAA ACG GAC CCG TCG CCG AGC AAC TTG CGA GCG ATC CgA 405
121 Lys Ile Gln Thr Asp Pro Ser Pro Ser Asn Leu Arg Ala Ile Arg 135
ControleIC TGC TAC GAG AAA GCG GGG TTT GAG AGG CAA GGT ACC GTA ACC ACC 450
136 Cys Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Glu Arg Gln Gly Thr Val Thr Thr 150
ControleIB TGC TAC GAG AAA GCG GGG TTT GAG AGG CAA GGT ACC GTA ACC ACC 450
136 Cys Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Glu Arg Gln Gly Thr Val Thr Thr 150
Amostra7 TGC TAC GAG AAA GCG GGG TTT GAG AGG CAA GGT ACC GTA ACC ACC 450
136 Cys Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Glu Arg Gln Gly Thr Val Thr Thr 150
Amostra58 TGC TAC GAG AAA GCG GGG TTt GAG AGG CAA GGT ACC GTA ACC ACC 450
136 Cys Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Glu Arg Gln Gly Thr Val Thr Thr 150
Amostra56 TGC TAC GAG AAA GCG GGG TTt GAG AGG CAA GGT ACC GTA ACC ACC 450
136 Cys Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Glu Arg Gln Gly Thr Val Thr Thr 150
Amostra54 TGC TAC GAG AAA GCG GGG TTt GAG AGG CAA GGT ACC GTA ACC ACC 450
136 Cys Tyr Glu Lys Ala Gly Phe Glu Arg Gln Gly Thr Val Thr Thr 150
Resultados
87
5.12 Avaliação da sequencia genética dos genes smeD e smeT
Para avaliação do gene do repressor smeT do sistema de efluxo
smeDEF, foi realizado o sequenciamento de uma amostra positiva com CIM
de 8µg/mL para levofloxacino. O resultado do seqüenciamento foi idêntico
quando comparado com a sequencia do gene smeT de S. maltophilia
depositada no Genbank n°AJ316010. O gene smeD foi avaliado em duas
amostras resistentes ao ciprofloxacino, a sequencia obtida foi idêntica a
sequencia de S. maltophilia smeD positiva depositada no GenBank n°
AJ252200.
5.13 Análise plasmidial de amostra positiva para o gene
aaac(6’)-ib-cr
Foram avaliadas 4 amostras positivas para o gene da enzima aac(6’)-
ib-cr para determinar a localização da enzima. A transferência plasmidial foi
negativa para as amostras estudadas. Como controle positivo para a reação
da transferência foi utilizada uma cepa de K. pneumoniae KPC positiva.
Resultados
88
01 02 03 04 05 06 07 08 09
Coluna 01 – peso molecular; coluna 2 – controles de esterilidade; coluna 3, 4, 7, 8, 9 –controle positivos; colunas 5 e 6 – amostras de S. maltophilia; coluna 11.
Figura 6. Reação de PCR para detecção do gene smeT em isolados resistentes a
levofloxacino de S. maltophilia
5.14 Análise da clonalidade dos isolados resistentes ao
sulfametoxazol/trimetoprima
Utilizando os critérios estabelecidos por Tenover et al., (1997), na
análise visual dos perfis de DNA gerados pela técnica de PFGE, foram
avaliadas 13 amostras positivas para o gene sul1, sendo 9 cepas resistentes
Resultados
89
a SMX/TMP e 4 amostras sensíveis. Foram observados 13 padrões clonais
diferentes. Foi observada a presença de um mesmo clone em duas
infecções diferentes no mesmo paciente. Todas as amostras apresentaram
um perfil genético diferente independente da CIM para SMX/TMP.
Pm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Pm
Coluna 1- Peso molecular, colunas 1 até 14 amostras com clonalidade não relacionada. Coluna 11 e 12 amostras do mesmo paciente, isolada em datas diferentes. Figura 7. Representação do perfil de clonalidade obtido a partir do método de
PFGE com a enzima SpeI, de 13 amostras positivas para o gene sul1 de S.
maltophilia com resistência a sulfametoxazol/trimetoprima.
Resultados
90
5.15 Análise da clonalidade dos isolados resistentes ao
levofloxacino
Foram avaliadas 18 amostras resistentes ao levofloxacino. Utilizando
os critérios estabelecidos por Tenover et al., (1997), na análise visual dos
perfis de DNA gerados pela técnica de PFGE, foram obtidos 14 perfis
distribuídos em dez clusters. O clone principal (16,6%) foi designado como a
letra A e os demais com as consecutivas letras do alfabeto. Para os mesmos
perfis relacionados ao clone, foram designados pela letra correspondente e
um número.
Dos 18 isolados analisados, três (16,6%) foram agrupados no padrão
A. Duas amostras foram idênticas (padrão A1) e uma amostra foi
considerada possívelmente relacionada (padrão A2). Outras três (16,6%)
amostras foram agrupadas no padrão B, sendo os três isolados
provalvemente relacionados.
Duas amostras foram classificadas como padrão C1 e C2
(possívelmente relacionadas). Em relação a CIM não houve diferença de
perfil de sensibilidade em relação a clonalidade. Todas as amostras foram
provenientes do Hospital das Clínicas, exceto uma amostra do Hospital A.C
Camargo (figura 8).
Resultados
91
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Coluna 1- Peso molecular, coluna 2 cepa padrão B1, coluna 3 e 5 cepa padrão A1, Coluna 4
e 13 cepa padrão C, coluna 6 cepa padrão B2, coluna 7 cepa padrão D, coluna 8 cepa
padrão A2, coluna 9 cepa padrão E, coluna 10 cepa padrão F (A.C Camargo), coluna 11
cepa padrão G, coluna 12 cepa padrão H, coluna 14 cepa padrão I, coluna 16 cepa padrão
J, coluna 17 cepa padrão K, coluna 18 cepa padrão L.
Figura 8. Representação do perfil de clonalidade obtido a partir do método de
PFGE com a enzima SpeI, de 18 amostras de S. maltophilia com resistência ao
levofloxacino
6 DISCUSSÃO
Discussão
93
Stenotrophomonas maltophilia é considerada um patógeno
oportunista que exibe resistência intrínseca a múltiplas classes de
antimicrobianos o que dificulta a escolha do antibiótico para o tratamento das
infecções causadas por este agente.
A associação de SMX/TMP ainda é a primeira escolha no tratamento
das infecções por S. maltophilia. Entretanto, nos últimos anos tem sido
descrito o aumento de cepas resistentes a SMX/TMP. Como já comentado
previamente essa resistência esta associada à presença do gene sul1 em
integrons da classe 1 e a presença de cepas com o gene sul2 em estruturas
transposase-like e os genes de resistência ao trimetoprim como os genes da
dehidrofolato redutase (Toleman et al. 2007; Hu et al., 2011). O real aumento
da resistência a essa droga, entretanto, ainda é controverso. (Farrell et
al.,2010, Sader et al., 2005(III)).
Nas 106 cepas estudadas observamos sensibilidade a SMX/TMP de
83,6% com CIM50 1µg/mL e CIM90 de 32µg/mL. O estudo SENTRY, avaliou
cepas na última década e mostrou que a sensibilidade apresentada nas
diversas publicações sempre foi maior que 95% (Farrell et al., 2010; Sader et
al., 2005 (III); Gales et al., 2004). Farrell et al., 2010, avaliaram 1,586 cepas
coletadas entre 2003 e 2008, e mostraram sensibilidade aSMX/TMP de 96%
com CIM50 0,5µg/mL e CIM90 de 1µg/mL, sendo a sensibilidade das cepas
isoladas na América Latina de 95,5%. Hu et al.,2011, em estudo
multicêntrico na China, avaliaram 102 cepas. Os autores observaram uma
Discussão
94
resistência a SMX/TMP de 30,4% com CIM50 9,5µg/mL e CIM90 de
608µg/mL. Segundo o autor o SMX/TMP é a droga de escolha para o
tratamento empírico de infecções por S. maltophilia nesses hospitais,
podendo esse fato explicar a alta resistência a essa droga. A sensibilidade a
SMX/TMP foi alta, entretanto, observamos uma sensibilidade ao SMX/TMP
menor que para outros medicamentos como minociclina, tigeciclina e
levofloxacino. Hu et al., 2011 em estudo multicêntrico também encontraram
sensibilidade maior para minociclina e levofloxacino do que para SMX/TMP.
Também observamos que das 23 cepas resistentes a SMX/TMP,
19 cepas (82,6%) foram isoladas de pacientes com uso prévio de SMX/TMP.
Não existem dados na literatura em relação ao uso prévio de SMX/TMP e
desenvolvimento de resistência para esse antimicrobiano.
Levofloxacino é uma opção para o tratamento de infecções por
S. maltophilia, principalmente em paciente com contraindicação de uso do
SMX/TMP. No presente estudo a sensibilidade das 106 cepas ao
levofloxacino foi de 82% com CIM50 1µg/mL e CIM90 de 4µg/mL. Farrell et al.,
2010 avaliaram 1586 cepas e observaram resistência ao levofloxacino de
83,4% com CIM50 1µg/mL e CIM90 de 4µg/mL. Seis de 19 cepas foram
isoladas em pacientes com uso prévio de levofloxacino, entretanto, não
existem dados na literatura da importância desse achado. Carrol et al., 1998,
sugerem que o levofloxacino não deve ser usado como monoterapia pelo
risco de indução de mutantes, entretanto, os autores deixam claro que essa
opinião é pessoal e que faltam estudos para esclarecer essa hipótese.
Nós observamos dois casos de infecções por S. maltophilia que foram
Discussão
95
tratadas com levofloxacino com dose de 500mg/dia e que desenvolveram
resistência na vigência de tratamento.
A resistência para ciprofloxacino no presente estudo foi de 58,5% com
CIM50 4µg/mL e CIM90 de 32µg/mL. Travassos et al.,2004, estudaram
39 amostras de S. maltophilia é observaram uma sensibilidade ao
ciprofloxacino de 81,6%. Sader et al., 2005I., analisaram 2076 amostras de
S. maltophilia e observaram uma sensibilidade de 30,9%. Falagas et al.,
2008, em uma revisão sistemática de tratamento de infecções por
S. maltophilia sugere que ciprofloxacino poderia ser utilizado em associação
com outras drogas para o tratamento dessas infecções. Entretanto, o
aumento da CIM do ciprofloxacino nas últimas década contraindica a sua
utilização no tratamento de infecções por S. maltophilia (Sader et al.,2005
(II); Sader et al., 2005(III); Gulmez et al.,2004; Weiss et al.,2000)
Curiosamente, observamos uma sensibilidade a minociclina de 100%
com CIM50 ≤0,5µg/mL e CIM90 de 2µg/mL. Este achado pode ser decorrente
do fato desta droga não ser comercializada no Brasil. Em diferentes estudos
a sensibilidade para minociclina é superior a 92% (Valdezate et al.,2001;
Betriu et al., 2002 (I); Vartivarian et al.,1994). Entretanto, Hu et al. 2011
avaliaram 102 cepas e mostraram uma sensibilidade menor a minociclina de
74,5% com CIM50 0,5µg/mL e CIM90 de 16µg/mL. Apesar de a minociclina
apresentar boa sensibilidade para cepas de S. maltophilia, por ser uma
droga bacteriostática, não ser disponível por via intravenosa, não ser
disponível no Brasil e também devido à falta de estudos clínicos com esse
medicamento o seu uso na prática clínica é limitado.
Discussão
96
Em relação à tigeciclina, observamos resistência de apenas 8,4% nas
106 cepas estudadas com CIM50 1µg/mL e CIM90 de 2µg/mL. Farrell et al.,
2011, avaliaram 1,586 cepas e observaram sensibilidade de 95,5% com CIM50
0,5µg/mL e CIM90 de 2,0µg/mL. Não existe padronização de metodologia e
ponto de coorte para determinar a sensibilidade a essa droga. Atualmente,
para avaliação de sensibilidade a tigeciclina é utilizado o ponte de corte
para Enterobactérias recomendado pela USFDA (Farrell et al. 2010).
Existe também a dificuldade da realização da CIM com tigeciclina devido à
instabilidade da droga. Os estudos de tratamento de infecções causadas por
S. maltophilia com tigeciclina são limitados a relatos de casos, nos quais, a
tigeciclina foi associada a alguma das drogas preconizadas para o tratamento
dessas infecções (Belvici et al. 2009). S. maltophilia apresenta boa
sensibilidade a tigeciclina, porém, os poucos estudos com esse medicamento
limitam seu uso no tratamento de infecções por esse agente.
A sensibilidade das 106 cepas estudas a ticarcilina e ácido clavulânico
foi de 27,4%. Farrell et al., 2010 estudaram 1586 cepas e observaram uma
sensibilidade a esse medicamento de 39,1%. Hu et al., 2011, em 102 cepas
estudadas observaram uma sensibilidade a ticarcilina/clavulanato de 46,1%.
Esse medicamento não é utilizado nos hospitais de origem das cepas
avaliadas. No Brasil, Nicodemo et al. 2004, avaliaram 74 cepas e observaram
uma resistência para ticarcilina/clavulanato de 59,1%. Estudos atuais
mostram um decréscimo da sensibilidade a ticarcilina/clavulanato de ±20 a 30%
(Hu et al. 2011; Farrell et al., 2010; Fedler et al., 2006).
Discussão
97
Principalmente, na literatura americana a ceftazidima é considerada
como medicamento de escolha para o tratamento de infecções por
S. maltophilia. No nosso estudo observamos uma resistência a ceftazidima
de 79,3%. Farrell et al., em 1586 isolados observaram uma sensibilidade de
4,1%. No entanto, Falagas et al. 2008, realizaram uma revisão sistemática
de tratamento para infecções por S. maltophilia excluindo a SMX/TMP.
Os autores encontraram 31 relatos de casos e cinco séries clínicas e
concluíram que a ceftazidima, o ciprofloxacino e a ticarcilina/clavulanato em
uso isolado ou em associação com outros antimicrobianos seriam as
principais opções para o tratamento de infecções em pacientes com contra
indicação para o uso do SMX/TMP. Entretanto, os autores salientam que a
revisão sistemática teve importantes limitações principalmente pela
heterogeneidade da população estudada e ausência de padronização dos
testes de sensibilidades dos estudos avaliados.
Nós observamos que uma amostra apresentou resistência as setes
drogas testadas exceto a minociclina. Esta amostra era de origem
respiratória de um paciente com doença pulmonar de base. É importante
ressaltar que não existe relato na literatura de cepas exibindo esse perfil de
multirresistência.
Em relação aos mecanismos de resistência a SMX/TMP, observamos
que 14 (13,2%) das amostras foram positivas para o gene sul1 e desses
isolados nove (8,4%) foram resistentes a SMX/TMP. Barbolla et al., 2004,
estudaram 31 isolados clínicos não relacionados e observaram a presença
do gene sul1 em 3 (9,6%) cepas resistentes a SMX/TMP. Toleman et al.
Discussão
98
2007, analisaram 55 cepas resistente a SMX/TMP e observaram a presença
do gene sul1 em 17 (30%) cepas resistentes ao SMX/TMP. Hu et al., 2011.,
estudaram 102 cepas e mostraram a presença do gene sul1 em 52 (50,9%)
isolados. Os autores observaram que 27 (26,4%) amostras positivas para o
gene sul1 foram sensíveis a SMX/TMP. Na avaliação da presença do gene
da integrase 1, observamos que 21 amostras (19,8%) foram positivas para
esse gene, das quais sete apresentaram o gene sul1 junto. Essas amostras
apresentaram CIM50 de 8 µg/mL e CIM90 de 128 µg/mL, maior que as CIM
das cepas sem essa associação de genes. Hu et al., em 102 cepas
estudadas observaram a presença do gene da int1 em 66 (64,7%) amostras,
48 (47%) dessas amostras foram positivas para o gene sul1, entretanto, o
autor não descreve se as cepas positivas para os genes sul1 e int1
apresentaram CIM maiores do que cepas sem essa associação de genes.
Surpreendentemente, 14/96 das amostras (15,2%) foram resistentes a
SMX/TMP e negativas para o gene sul1. Entre essas amostras, uma foi
positiva para o gene sul2 e nas restantes (13 amostras) nenhum dos três
mecanismos estudados foi observado. Este é o primeiro estudo brasileiro
que identifica a presença de genes sul1 e sul2 em isolados de S. maltophilia
resistentes a SMX/TMP. Os genes sul1, sul2 em integrons ou em regiões
móveis do cromossomo da S. maltophilia parecem ser mecanismos
importantes de resistência nesta bactéria, entretanto, a presença de cepas
resistentes a SMX/TMP e negativas para os genes sul e cepas sensíveis a
SMX/TMP e positivas para esses genes levantam a hipótese que outros
mecanismos não estudados também sejam responsáveis pela resistência a
Discussão
99
SMX/TMP. No nosso estudo, observamos ainda a presença do gene da
enzima dehidrofolato redutase A1 (dfrA1) em uma cepa sensível a SMX/TMP,
exibindo CIM de 0,25 µg/mL. Hu et al., 2011, em 106 cepas estudadas
observaram a presença de genes dfr em 16 (15,8%) cepas. Os autores
descrevem que todas as cepas foram resistentes e todas foram positivas
para o gene da integrase 1. Em Enterobactérias, mutações cromossômicas
na deiidropteroato sintetase (DHP) alteram a sensibilidade a sulfametoxazol
(Houivinem et al. 1995), porém, na S. maltophilia são necessários estudos
que avaliem alterações cromossômicas da enzima deiidropteroato sintetase
que possam explicar a resistência a SMX/TMP sem a presença de genes de
resistência carregados por elementos genéticos móveis.
Em relação aos elementos genéticos móveis, 21 amostras (19,8%)
foram positivas para o gene da integrase 1, como dito anteriormente, as
cepas que apresentaram este gene associado ao gene sul1 apresentaram
CIM maior que cepas que não tiveram esta associação. Nosso estudo
investigou a localização do gene sul1 em duas amostras. Na amostra com
CIM >125 µg/mL para SMX/TMP observamos um integron de
aproximadamente 4000pb contendo os genes cassetes aac4 e aadA1 e o
complexo terminal qac/sul1. Em uma cepa com CIM de 8 µg/mL identificamos
o integron de 2000 pb contendo o gene cassete aadA1 e a região terminal
qac/sul1. Os integrons foram semelhantes à integrons descritos por
Toleman et al. 2007 e por Barbolla et al. 2004.
Toleman et al, (2007) estudaram 55 cepas clínicas de S. maltophilia
geneticamente não relacionadas, 25 resistentes a SMX/TMP. Dezessete
Discussão
100
possuíam o gene sul1 localizado na região 3’ do integron de classe 1.
As cepas sensíveis não apresentaram o gene sul1. Em 7 cepas o integron
foi analisado, 2 amostras (Brasil e Alemanha) apresentavam a integrase 1 e
o gene qac/sul1. Duas amostras (Chile e EUA) continham entre a integrase 1
e o qac/sul1 o gene cassette aacA4. Duas amostras do México continham
antes do gene qac/sul, 2 genes modificadores de aminoglicosídeos (aacA5 e
aadA5) e uma ORF com atividade desconhecida. Barbolla et al.,2004
estudaram 3 amostras na Argentina e obtiveram três integrons na seguinte
conformação: a int-1/catB2/qacE/sul1/orf5, integron com int1/aac(6’)-
ib/ant(3’’)-Ia/qacE/sul1/orf5 e um integron composto pela int1/aac(3)-
1a/orfP/orfP/orfQ/ant(3’’)-Ia/qacE/sul1/orf5.
Nós identificamos uma amostra positiva para o gene sul2 que foi
positiva para o gene ISCR2. Para determinar se o sul2 estava próximo a
esse elemento genético móvel realizamos o seqüenciamento total da ISCR2,
e observamos que adjacente ao ISCR2 estava localizado o pseudogene da
fosfoglucomutase de 200pb e adjacente a este estava o gene sul2. Toleman
et al. 2007 mostraram que o gene sul2 foi expresso em 9 amostras
resistentes a SMX/TMP, este gene estava localizado nas sequencias de
inserção ISCR2 e ISCR3, com uma amostra com a mesma configuração de
uma amostra descrita no nosso estudo.
Esses resultados confirmam a importância da presença de elementos
genéticos móveis na disseminação da resistência em isolados de
S. maltophilia.
Discussão
101
Sistemas de efluxo são os mecanismos mais estudados de resistência
a quinolonas na S. maltophilia (Alonzo e Martinez., 2000). Em nosso estudo,
o teste fenotípico com reserpina e com CCCP foi negativo em todas as
amostras testadas. Valdezate et al., 2002, estudaram 29 cepas de
S. maltophilia e observaram que a CIM na presença de CCCP teve uma
redução maior do que 4 vezes em apenas 6 amostras. Nosso estudo
mostrou que todas as cepas de S. maltophilia estudadas possuem o gene
smeD do sistema de efluxo smeDEF e em 12/38 (31,5%) o gene repressor
smeT do sistema de efluxo smeDEF foi positivo. Sánchez et al., 2002
estudaram o gene repressor do sistema de efluxo smeDEF, denominado
smeT o qual é homologo do sistema AcrR descrito na E. coli. O repressor
smeT esta localizado a 210pb do sistema de efluxo. Os autores compararam
a sequencia do smeT da cepa sensível D457 e da cepa multirresistente
D457R e observaram uma diferenca na sequencia que leva a substituíção de
Leu166Gln. Os autores observaram que em cepas com essa mutação o
sistema de efluxo não é reprimido pelo smeT, levando a resistência para
quinolonas. No estudo da sequencia genética do smeT não observamos
mutação na posição 166 da sequencia de aminoácidos.
Outro mecanismo importante de resistência as quinolonas em
bactérias gram-negativas são as mutações na girase A na posição 83
(Ser → Leu, Trp, Phe ou Tyr e Thr →Ile) e na posição 87 (Asp→Asn, Gly,
His, Val ou Tyr) (Valdezate et al., 2002). Em nosso estudo avaliamos as
mutações na gyrase A em 15 cepas resistentes ao levofloxacino, entretanto,
não observamos alterações nas sequencias de aminoácidos das amostras
Discussão
102
estudadas. Na análise comparativa da sequencia de nucleotídeos
observamos mutações pontuais nas posições: 106, 129, 144, 159, 162, 165,
171, 183, 189, 204, 225. As amostras com CIM de 16 µg/mL apresentaram
um número maior de mutações pontuais. Valdezate et al., 2002, estudaram
32 amostras de S. maltophilia e observaram mutações na sequencia de
aminoácidos nas posições 70, 113, 119 e 124 quando comparadas a
sequencias de enterobactérias, entretanto, o significado dessas mutações
não foi esclarecido. Aparentemente existem mecanismos de resistência
prévios ao contato das quinolonas com as regiões de resistências nas
topoisomerases que dificultariam a mutação das girases.
Os genes de resistência as quinolonas mediados por plasmídios (qnr)
foram recentemente descritos na S. maltophilia (Shimizu et al., 2008).
Em nosso estudo não observamos amostras positivas para os genes qnr A,
qnrB e qnrS descritos em Enterobactérias (Jacoby et al.,2008). Entretanto,
83 (78,3%) amostras estudadas, foram positivas para o gene qnrMR.
Esse gene tem similaridade maior de 70% com genes qnr do grupo B da
classificação dos qnr descrita por Jacoby et al., 2008. Não observamos
relação na presença de qnr e elevação da CIM para ciprofloxacino ou
levofloxacino. Em 13 amostras seqüenciadas observamos que quatro
amostras foram idênticas a sequencia do Smqnr6 descrita por Shimizu et al.,
2008 no Japão. Uma amostra foi idêntica ao gene Smqnr4 descrito pelo
mesmo autor (Shimizu et al. 2008). Uma amostra foi idêntica a sequencia de
qnr ainda não classificada descrita na Espanha por Sanchez et al., 2008,
uma amostra foi idêntica a sequencia do gene smqnr12 descrita por Gordon
Discussão
103
et al. 2010. E finalmente, quatro amostras foram diferentes das sequencias
de qnr depositadas no GenBank até hoje, podendo ser novos qnr ainda não
descritos. Aparentemente, os genes qnr não estão envolvidos na resistência
as quinolonas na S. maltophilia, porém, a presença desses genes nessa
bactéria alerta para a possibilidade de transmissão horizontal para outras
bactérias, principalmente as Enterobactérias.
A enzima aac(6’)-ib-cr é uma enzima aac(6’)-ib com mutação na
posição Trp102Arg que altera a sensibilidade as quinolonas, principalmente
ciprofloxacino. Até o momento a enzima mais prevalente na S. maltophilia é
a enzima aac(4’)-ib. Não existem trabalhos que avaliem a presença da
enzima aac(6’)-ib-cr na S. maltophilia. Entretanto, no GenBank existe uma
sequencia descrita dessa enzima na S. maltophilia depositada com número
HQ438047.1.Curiosamente, nas quatro amostras avaliadas observamos a
mutação na posição 102, porém não conseguimos correlacionar a presença
dessa mutação com a CIM para ciprofloxacino ou levofloxacino. No presente
estudo, tentamos conferir se a presença dessa enzima era plasmidial o não,
porém, na transferência plasmidial não observamos a presença de
plasmídios, levando a creer que essa enzima na S. maltophilia tem
localização cromossômica.
O estudo de clonalidade das cepas resistentes a SMX/TMP e ao
levofloxacino mostrou uma importante variabilidade genética, mesmos cepas
do mesmo hospital com resistência as mesmas drogas exibiram perfis
clonais diferentes. Este achado é compatível com estudos prévios descritos
na literatura que relatam um padrão policlonal nas infecções por
Discussão
104
S. maltophilia exceto em pacientes com fibrose cística (Gulmaz et al. 2010;
Valdezate et al., 2004). Valdezate et al., 2004, na Espanha estudaram 112
casos de colonização/infecção por S. maltophilia e observaram que 99 cepas
não foram relacionas. Almeida et al., 2006, no Rio de Janeiro, avaliaram a
clonalidade de 21 cepas de S. maltophilia, observando unicamente 5 pares
de cepas com perfil clonal possivelmente relacionado. Travassos et al.,2006
avaliaram 39 cepas e mostraram um perfil clonal diferente em 34 cepas.
Focos de colonização e infecção por S. maltophilia no ambiente hospitalar
são diversos, dificultando assim a determinação da transmissão cruzada na
colonização/infecção por esse agente. Esses resultados mostram a grande
variedade de perfis genéticos que a S. maltophilia exibe reforçando assim a
idéia da ampla distribuição da espécie no ambiente.
As limitações do presente estudo foram a não avaliação de todos os
mecanismos possíveis de resistência as quinolonas, principalmente em
relação às bombas de efluxo. Outra limitação foi a não avaliação de
mecanismos cromossômicos de resistência a TMP/SMX.
7 CONCLUSÕES
Conclusões
106
- S. maltophilia exibe um padrão de multirresistencia intrínseca a várias
classes de antimicrobianos.
- Minociclina e Tigeciclina foram as drogas que apresentaram a melhor
sensibilidade e podem ser opções na terapia de infecções por
S. maltophilia.
- S. maltophilia parece ser um importante reservatório de genes de
transmissão plasmidial.
- Isolados resistentes ao levofloxocino e a SMX/TMP são policlonais.
- Os genes sul1, sul2 em integrons ou em regiões móveis do cromossomo
da S. maltophilia parecem ser importantes mecanismos de resistência a
SMX/TMP.
- A mutação na girase A aparentemente não é um mecanismo importante
na resistência as quinolonas na S. maltophilia.-
8 REFERÊNCIAS
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