Dr. Sevim GÖNEN Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi …...2015/04/16  · işaretli anti-human IgG antikoru ile boyanmadan sonra, anti-HLA IgG pozitif serumu, negatif seruma kıyasla

Dr. Sevim GÖNEN

Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi

Doku Tipleme Laboratuvarı

Panel Reaktif Antikor Düzeyleri??

Reddedilmiş böbrek nakli ve kan transfüzyonları

sonrasında veya kadınlarda gebelik döneminde gelişebilen

Panel reaktif antikor düzeyleri çeşitli yöntemlerle

belirlenebilmektedir.

DOKU ANTİJENLERİNE KARŞI ANTİKORLAR NASIL SAPTANIYOR? 40 Yıllık Gelişim…

Hücresel antikor saptama testleri:

CDC (Kompleman Bağımlı Sitotoksisite)

Akım sitometrisi (1983)

Solid faz antikor saptama testleri (SPADS):

Rekombinant HLA Sınıf I ve II molekülleriyle kaplanmış solid bir matriks/mikropartiküller ve optik okuma yöntemi kullanılmaktadır.

– ELISA

– Luminex

Transplantation 2008;86: 384–390, Human Immunology 2009; 70:610-617 ,Curr Opin Organ Transplant 2009;14:392-397

Teknolojinin İlerleyişi…

Böbrek bekleme listelerinde bekleyen hastaların

serumlarındaki antikorları tespit etmede kullanılan en eski

ve en klasik yöntem CDC…

Fakat antikor özgüllüklerini tayin etmede düşük duyarlılık

ve düşük çözünürlüğe sahip olmasından dolayı yeni

arayışlar…

Teknolojinin İlerleyişi…

1990’lı yıllarda ELISA teknolojisinin gelişmesiyle

lenfositlerin yerine HLA molekülleri kullanılmaya

başlanıyor…

CDC ve ELISA’dan daha fazla hassasiyete sahip olduğu

için Luminex teknolojisi son 10 yıldır yaygın şekilde doku

tipleme laboratuvarlarında yerini alıyor.

PRA tespitinin duyarlılığının ve özgüllüğünün arttırılması

için kullanılan hücresel ve solid faz temeline dayalı testler:

6

HLA-A1

HLA-A2

HLA-A3

HLA-B7

Kompleman bağımlı sitotoksisite Akım sitometrisi

ELISA Luminex

Hedef

lenfositler

HLA

molekülleri

Kompleman Bağımlı Sitotoksisite (CDC)

Tamamen canlı hücreye dayanır.

Lenfosit izolasyonuKompleman ilavesiBoyaMikroskobik değerlendirme

Dezavantajları

Düşük düzeydeki Sınıf I ve Sınıf II antijenlerine özgül

antikorlar belirlenememektedir.

Sadece aktivasyonu komplemana bağlı olan antikorlar

(IgG1,IgG3) saptanabilmektedir.

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)

Antijen- antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin

aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm

yöntemidir.

Kuyular yıkama solüsyonu ile rehidrate edilir.

Dilüe edilmiş hasta serumu, kontroller ve enzim işaretli anti-IgG antikoru eklenir.

Enzime uygun bir kromojen substrat ortama konulur.

Sisteme bağlanmış enzim bu substratı parçaladığında ortaya

çıkan renk, yapılacak kolorimetrik yöntemlerle ölçülerek

bağlanmış olan enzim dolayısıyla bağlanmış olan antikor

hakkında fikir verecektir.

Flow PRA Tarama Testi

İnsan serumundaki PRA’nın akış sitometrisi ile hızlı bir

şekilde saptanması için önceden kalibre edilmiş reaktifler

bulunmaktadır.

FlowPRA boncuklarının her birinin reaktivitesi, insan

alloserumları ve spesifik HLA monoklonal antikorlar

kullanılarak akış sitometrisi ile teyit edilmiştir.

Serumda anti-HLA antikoru varsa Flow-PRA boncuklarına bağlanır. Floresan

işaretli anti-human IgG antikoru ile boyanmadan sonra, anti-HLA IgG pozitif

serumu, negatif seruma kıyasla bir floresan kanal geçişi gösterir.

Flow PRA Tarama: Test serumunda bulunan HLA

antikorlarının yüzde miktarını verir.

FlowPRA I boncuklarının FSC-SSC nokta alanı

FlowPRA II boncuklarının FSC-SSC nokta alanı

Flow PRA Spesifik Testleri:Antikorların hangi HLA antijenine spesifik olduğunu belirler.

Luminex : Cihaz, iki lazer içeren mini dijital akım analiz sisteminden oluşmaktadır.

İkinci geçişte PE işaretli anti human IgG bağlı HLA

moleküllerine göre boncuklar taranır.

Sıvı lazerden geçtiğinde ilk geçişte boncuklar HLA

tipine göre sınıflandırılır.

PRA pozitifliğini saptamak için boncuğun median

fluorescent intensity (MFI) değeri: Üç negatif kontrol

boncuğunun MFI değerine bölünür ve elde edilen

değerden arka plandaki ayarlama etkeni çıkarılarak üç

farklı ayarlanmış oran elde edilir.

MFI NEDİR?

Pozitif nedir?

MFI değerleri icin konsensus yok!!!: DSA için değişik yorumlamalar : evet/hayır

MFI 2000

Negatif nedir?

Luminex PRA Tarama

LuminexPRA Tanım II

Tek Antijen (Single Antigen) Boncuk Çalışması ile Donöre Özgü Antikorların Saptanması

Tek HLA molekülleri ile kaplanmış [single antigen bead

(SAB)] solid faz çalışmaları, hastanın HLA antikor

spesifisitelerini, donörün HLA tiplemesi ile sanal olarak

karşılaştırarak donöre özgü HLA antikorlarının

saptanmasına imkan sağlar.

Özel bir test olan SAB ile saptanan donöre özgü antikor

(DSA)'ların klinik ile ilişkisinin belirlenmesi son derece

önemlidir.

HLA Antikor özgüllüğünü tanımlamak için Luminex tek antijen boncuk çalışması mükemmel bir araçtır

27

Boncuklar bireysel HLA

antijenleriyle kaplıdır…

MFI ( mean fluorescence intensity)

Önceden başarısız bir böbrek transplantasyonu geçiren hastanın

serumundan 3 farklı teknik kullanılarak (CDC-PRA,ELISA-PRA

ve L-SAB) donör HLA’sına karşı uyumsuzluk gösteren HLA B27

antijenine karşı DSA tespit edilmiştir.

CDC-PRA: B27+Extras

ELISA-PRA: A23,A24,B7,B27,B60,B61+Extras

L-SAB: A23,A24,A25,A29,A32,A33,A66,A74,B7,B13,B18,B27,B35,B37,B38,B39,B42,B44,B47,B48,B53,B54,B56,B57,B58,B59,B60,B61,B63,B67,B73,B76,B81

Sensitize Hastada Transplantasyon Öncesi

İmmunolojik Risk Değerlendirilmesi

Human Immunology 70 (2009) 563–568

PRA TAYININDE KULLANILAN YÖNTEMLER /DUYARLILIK

Method Pozitif (n)/Toplam(n) %

CDC 12 / 66 18

ELISA 32 / 66 48

FLOW 48 / 66 73

Analysis of HLA Presensitization (PRA) W.E. Herczyk 2003

3 Farklı test tekniği karşılaştırılmıştır:

CDC ,ELISA ve Akım Sitometrisi:

Solid faz testlerinin duyarlılığı, hücre temelli testlere göre

daha yüksektir.

Ancak serumdaki birçok bileşen etkileyebilir.

Bu nedenle standartizasyon dikkatli bir şekilde yapılmalı

ve tayinlerin klinik olarak eşik değerleri önemlidir.

2009’dan itibaren ABD’de kullanılmaktadır. 2003-2005

yılları arasında 12000 kadavra donörün HLA’ları

kullanılmış.

Merkezler her hastası için “kabul edilemez MM” leri

sisteme girdiğinde sistem bir PRA tahmini yapmaktadır.

Gerçek PRA ölçümleriyle korelasyonu oldukça iyi

bulunmuştur.

PRA HESAPLANMASI

Eurotransplantta, benzer bir uygulama olan “Virtual PRA”

uygulamasını başlatmıştır.

Human Immunology 70 (2009) 636–639

Received date: 16-Mar-2015

Accepted date: 20-Mar-2015

Virtual PRA replaces traditional

PRA: small change but

significantly more justice for

sensitized patients

Caner Süsal and Christian MorathDepartments of Transplantation Immunology and Nephrology, University of Heidelberg,Germany

SONUÇ 1

Avantaj: Ucuza mal edilir.

CDC

Dezavantaj: Canlı hücre gerektirir.

Duyarlılığı düşüktür.

HLA için spesifik değildir.

SONUÇ 2

Avantaj: Duyarlılığı CDC’den fazladır.

Farklı hücre tiplerini ve Ig G sınıfı/alt tiplerini ayırabilir.

Dezavantaj: Reaktif ve donanımları pahalıdır.

HLA için spesifik değildir.

AKIM SİTOMETRİSİ

SONUÇ 3

Avantaj:Yüksek duyarlılık ve özgüllük sağlar.

Canlı hücreye gerek duyulmaz.

Az serum ile çalışılabilir.

Dezavantaj: Birçok serum faktöründen etkilenebilir.

SOLİD FAZ TEKNİKLER

SONUÇ 4

Avantaj: Mevcut bütün antikorları saptar.

Epitop veya allel spesifik antikorları

tanımlayabilir.

Cw,DP ve DQ’ya karşı antikorları tayin edebilir.

Dezavantaj:Tek boncukla temsil edilen antijen, degişik

miktardaki antijen ve bozulmuş molekülleri

kaçırılabilir.

Multipl antikorların toplam düzeyini

vermeyebilir.

Tek Antijen Boncuk

(SİNGLE ANTİGEN)

ELISA, Flow-PRA veya Luminex gibi yöntemlerle

saptanmış sitotoksik olmayan antikorlar transplantasyonda

risk faktörü,

CDC ile saptanmış antikorlar kontrendikasyon olarak

görülmelidir.

Am J Transplant 2003;3:1488–500

Teşekkürler…