Transcript
Buffy coat preparation &
examination
ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร. นพมาศ เข็มทองหลาง กลุ่มวิชาจุลทรรศน์คลินิก
คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น E mail : noppamat@kku.ac.th
Bone marrow examination
วิชา 463 212 ปฏิบัติการโลหิตวิทยาพื้นฐาน ปีการศึกษา 2563
Buffy coat preparation เป็นวิธีการเพิ่มจ านวนเม็ดเลือดขาวหรือเซลล์ทีผ่ิดปกต ิทีม่ีจ านวนน้อยจากเลือด โดยทั่วไปจะเตรียมเมื่อ มีเม็ดเลือดขาวน้อยกว่า 1,000 /ul กรณี Hairy cell leukemia ที่มีเซลล์เม็ดเลือดทุกสายต่ ากว่าปกติ (pancytopenia) กรณีเตรียม LE cell ช่วยในการตรวจหา bacteria fungus หรือ parasite ทีอ่ยู่ ใน neutrophil หรือ monocyte
ตัวอย่างเลือดที่ใส่สารกันเลือดแข็ง เมื่อน าไปปั่นจะแยกเป็น 3 ชั้น จากด้านบน คือ พลาสมา เม็ดเลือดขาวและเกล็ดเลือด (buffy coat) และเม็ดเลือดแดง ชั้น buffy coat จะดูดออกมาเพื่อเตรียมสเมียร ์ย้อมส ีและนับแยกชนิดเม็ดเลือดขาวหรือท าการทดสอบอื่นๆ ต่อไป
หลักการ
https://vcahospitals.com/know-your-pet/buffy-coat-examination-for-mast-cells
ตัวอย่างรายงานการพบเซลล์ผิดปกติจากการเตรียม buffy coat
Buffy coat film. From blood of a patient with pancytopenia showing two hairy cells, an erythroblast and a bare nucleus. Only rare cells resembling hairy cells were seen in the conventional film, whereas the buffy coat film showed many such cells.
Dacie and Lewis Practical Haematology . Barbara J. BAIN 2017
Atlas of peripheral blood, the primary of diagnostic tool. Pereira I et al 2012
(a) Circulating Tumor Cells (CTCs) detach from primary tumor as single cells and clusters, shed into the bloodstream, and migrate to colonize in distant organs, known as metastasis. It is assumed 1 ml of blood can comprise 1e10 single CTCs and roughly one CTC cluster, millions of WBCs and billions of RBCs. Copyright © 2017 Vortex Biosciences
Figure 2. Illustration of current and potential applications of CTC technologies. The peripheral blood of a cancer patient is collected and processed through various CTC isolation technologies. CTCs are captured along with contaminating leukocytes. Immunostaining for specific markers and FISH for genomic amplification and translocation can be applied to CTCs. DNA or RNA can be extracted from the CTCs and subjected to sequencing, quantitative RT-PCR (qRT-PCR), and potential expression profile analysis. Viable cells can be released and propagated in cell culture.
สิง่สง่ตรวจ ( specimen ) ใช้เลือดปริมาตร 3 มิลลิลิตร ทีม่ีสารกันเลือดแข็งชนิด EDTA
วิธีการเตรียม buffy coat
การเตรียม smear
Push wedge technique
Squash technique
Coverslip method
การเตรียม buffy coat
Wintrobe tube
Microhematocrite tube
Wintrobe tube Microhematocrit tube
10 9
8 7 6 5
4 3 2 1
10 9 8 7
6 5 4 3
2 1
Plasma Buffy coat Red blood cell
Plasma Buffy coat Red blood cell
Wintrobe tube ใช้ pasteur pipette ดูดเลือดใส่ Wintrobe tube ป่ัน 2,000-2,500 rpm (1500 g) นาน 5-10 นาที ใช้ pasteur pipette ดูดพลาสมาออกทิง้ ดูดส่วน buffy coat ทีเ่ป็นรอยตอ่ระหวา่งพลาสมากบัเม็ดเลอืดแดง หยด buffy coat ลงบน slide หรือ cover slip
ดูดเลือดเข้า pasteur pipette ระวังอย่าให้มีฟอง แหย่ปลาย pasteur pipette ลงไป ที่ก้น Wintrobe tube แล้วบีบลูกยางแดงเบาๆ เลือดจะไหลลงมา พร้อมกับค่อยๆดึง pasteur pipetteขึ้นช้าๆ
น าไปปั่น หลังการปั่น
ใช้ pasteur pipette ดูดพลาสมาออกทิง้ ดูดส่วน buffy coat
Microhematocrit tube ดูดเลือดใส่ microhematocrit tube อุดด้วยดนิน้ามนัทีป่ลายด้านหนึ่ง ป่ันด้วย microhematocrit centrifuge 12,500 rpm for 4-5 นาที ใช้ใบเลื่อยตัดรอยตอ่ของ plasma กับ red blood cell แตะ buffy coat ลงบน slide หรือ cover slip
Wedge technique Squash technique Coverslip method
https://clinicalgate.com/examination-of-the-peripheral-blood-film-and-correlation-with-the-complete-blood-count/
การเตรียมสเมียร์
การย้อมสเมียร์
ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร. นพมาศ เข็มทองหลาง กลุ่มวิชาจุลทรรศน์คลินิก
คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น E mail : noppamat@kku.ac.th
Bone marrow examination
สรุปวิธีการเตรียมไขกระดูก
Aspiration Biopsy
Smear Squash Clot section Touch preparation Biopsy section
การตรวจและการรายงานการตรวจไขกระดูก 1. Cellularity assessment
2. Megakaryocyte assessment
3. Myeloid : Erythroid ratio (M : E ratio)
4. Bone marrow differential count 5. Other finding
Morphology examination of the bone marrow
Adequacy bone marrow
Morphology examination of the bone marrow
Low power examination (10x) ตรวจหา marrow particle ตรวจหา megakaryocytes (ปกติพบ 1 cell/LPF) ตรวจหา clumps of abnormal cell ชึ่งอาจเกิดจาก metastatic tumor cell หรือกลุ่มเซลล์ผิดปกติอื่น
Bone marrow (Objective lensx10)
Marrow particle
Morphology examination of the bone marrow
Low power examination (10x) ประเมิน cellularity The ratio of marrow space occupied by hematopoietic
cells to the total available marrow space
การรายงาน Normocellular marrow หรือ bone marrow normal cellularity
Hypocellular marrow หรือ bone marrow hypocelluarity
Hypercellular marrow หรือ bone marrow hypercellularity
Cellularity ranges for various age groups
Age Cellularity
Newborn to 3 month 80-100
Childhood 60-80
20-40 years 60-70
40-70 years 40-50
>70 years 30-40
Porwit A et al. Blood and bone marrow pathology Edinburgh : Livingstone,2011
The bone marrow differential count from aspirated from 12 healthy men
Wintrobe’s Clinical Hematology 14th Edition 2018
Hypocellular Normocellular Hypercellular
Bone marrow (Objective lensx10)
ใช่ไขกระดูก? รายงาน cellularity
Bone marrow (Objective lensx10)
ใช่ไขกระดูก? รายงาน cellularity
Bone marrow (Objective lensx10)
ใช่ไขกระดูก? รายงาน cellularity
Bone marrow (Objective lensx10)
ใช่ไขกระดูก? รายงาน cellularity
Megakaryocyte
Bone marrow (Objective lensx10)
รายงาน cellularity Bone marrow (Objective lensx10)
ใช่ไขกระดูก? รายงาน cellularity
Bone marrow (Objective lensx10)
Plasma cell
Bone marrow (Objective lensx100)
Fat cell
Bone marrow (Objective lensx100)
Fat cell
Bone marrow (Objective lensx100)
Megakaryocyte
Bone marrow (Objective lensx100)
Basophil Erythroid precursor
(NRC)
Bone marrow (Objective lensx100)
Promyelocyte
(Granulocyte) Erythroid precursor
(NRC)
Bone marrow (Objective lensx100)
Erythroid precursor
(NRC)
Bone marrow (Objective lensx100)
Plasma cell
Neutrophilic myelocyte
(Granulocyte)
Erythroid precursor
(NRC)
Bone marrow (Objective lensx100)
Erythroid precursor
(NRC)
Erythroid precursor
(NRC)
Bone marrow (Objective lensx100)
Megakaryocyte
Bone marrow (Objective lensx100)
Mast cell
Bone marrow (Objective lensx100)
Macrophage
Bone marrow (Objective lensx100)
Single cells or small groups
Ovoid or elongated, single small
eccentric nucleus with small quantities
of condensed chromatin
and one to three nucleoli
Abundant lightly basophilic cytoplasm
with indistinct
margins.
Osteoblasts
Resemble plasma cells
They are larger and their Golgi zone is not
immediately adjacent to the nucleus.
The nucleus of an osteoblast does not show
the heavily-stained coarse clumps of
condensed chromatin that are
characteristic of plasma cells.
Blood and Bone Marrow Pathology 2nd Edition 2011
Plasma cells
Osteoclasts
Giant multinucleate cells with abundant
pale-staining cytoplasm containing
many fine azurophilic granules
Nuclei within a single cell are small, round
or oval, are uniform in size, single
prominent nucleolus.
Must be distinguished from
megakaryocytes
Unlike multinucleated osteoclasts, normal
megakaryocytes have a single large
lobulated nucleus.
Megakaryocyte
Blood and Bone Marrow Pathology 2nd Edition 2011
Myeloid : erythroid ratio (M : E)
Bone marrow nucleated differential cell count (NDC)
Morphologically recognizable cells blast cells, promyelocytes, myelocytes, metamyelocytes, band forms, neutrophil, eosinophils,basophils, promonocytes and monocytes, lymphocytes,
plasma cells erythroblasts
It does not include megakaryocytes, macrophages, mast cells, osteoblasts, osteoclasts,
stromal cells, smudged cells or non-hemopoietic cells such as metastatic tumor cells.
Morphology examination of the bone marrow
Neonate : M : E ratio is 1 : 3–4
Adults: 2–5 : 1.
Cell type Report (%) 95% Range
Myeloblast 60 0.2-1.5
Promyelocyte 5 2.1-4.1
Myelocyte (neutrophilic)
5 8.2-15.7
Metamyelocyte 5 9.6-24.6
Neutrophil 15 6-12
Myelocyte (eosinophil)
10 0.2-1.3
Eosinophil 0-1.3
Basophil 0-0.2
Lymphocyte 11.1-23.2
Monocyte 0-0.8
Plasma cell 0.4-3.9
Erythroblast 10 18.4-33.8
Megakaryocyte 0-0.4
M:E ratio = 90/10 = 9/1 (ปกติ 1.5-3.3 : 1)
ตัวอย่างการรายงาน
Bone marrow iron staining
Prussian blue reaction (Perl’s reaction)
Theml H et al. Color atlas of hematology [electronic resource] : practical microscopic and clinical diagnosi. Stuttgart ; New York : Georg Thieme Verlag, c2004.s
Bone marrow storage iron located in macrophages. A, Iron stores 1+ (1000×). B, Iron stores 2+ (1000×). C, Iron stores 3+ (1000×). D, Iron stores 4+ (1000×). E, Iron stores 5+ (500×).
HENRY’S CLINICAL DIAGNOSIS AND MANAGEMENTBY LABORATORY METHODS, 2017
Ring sideroblast. Siderotic granules form a perinuclear ring spanning
more than half of the nuclear diameter (Prussian blue stain, 1000×).
HENRY’S CLINICAL DIAGNOSIS AND MANAGEMENTBY LABORATORY METHODS, 2017
Reticulin stain of marrow myelofibrosis.
Silver stain of a myelofibrotic marrow showing an increase in reticulin fibers (black-staining threads).
Theml H et al. Color atlas of hematology [electronic resource] : practical microscopic and clinical diagnosi. Stuttgart ; New York : Georg Thieme Verlag, c2004.s
Silver impregnation
Silver impregnation
Theml H et al. Color atlas of hematology [electronic resource] : practical microscopic and clinical diagnosi. Stuttgart ; New York : Georg Thieme Verlag, c2004.s
Objective lens x10 เห็น marrow particle? เห็น fat cell? เห็น megakaryocyte? เห็น hematopoietic cell? ประเมิน cellularity Hypocellular Normocellular Hypercellular
Objective lens x100 ศึกษา blood cell ในบริเวณที่สเมียร์ไม่หนาเกินไป
ในชั่วโมงปฏิบัติการ
top related