Biosensor Berbasis Sel Dan Protein Untuk Deteksi Bioavailibilitas

Biosensor Berbasis Sel dan Protein untuk Deteksi Bioavailibilitas Logam Berat pada Sampel Lingkungan

Maryanna I. Pratiwi

Anis Balqis N

Aruna Pradipta

Dian Cahyana Putra

Ibnu Nur Fikri

1. Pendahuluan

Pendeteksi ion logam dalam sampel dilakukan dengan metode lama seperti :

1.ICP/AES

2.ICP/MS

3.FIAAS

4.Metode Elektrokimia

5.Polarografi

6.Elektroda voltametrik

Sampel yang diambil dari lingkungan perlu dilakukan:

1.Dilarutkan dalam suhu tinggi

2.Tekanan

3.Kondisi asam

Untuk membebaskan ion logam dalam larutan sebagai prasyarat

semua metode yang telah di sebutkan

Meskipun jumlah total sampel logam yang tedeteksi setelah

beberapa ekstraksi menggunakan metode diatas tidak selalu

terkait dengan toksisitas sampel.Sebab ketersediaan biologis ion

logam tidak di perhitungkan.Oleh karena itu dilakukan

pengukuran pendekatan secara biologis

Perlu Dilakukan pendekatan:

1.Pendekatan pertama dengan menggunakan bakteri tanah yang

secara genetik telah di modifikasi sehingga dapat memberikan

sinyal jika terjadi kontak dengan ion logam dalam sampel

sehingga dapat di ukur kadarnya.

2.Pendekatan kedua

Interaksi antara ion logam dan protein pengikat logam spesifik

dengan merekam kapasitansinya

2. Cara Kerja

Experimental

Pembuatan promotor cassettes yang diinduksi logam berat

Immobilisasi dari biosensor tembaga

Pengukuran bioluminescence

Overekspresi dan purifikasi dari protein logam berat

Imobilisasi protein dan pengukuran kapasitansi

2.1 Pembuatan promotor cassettes yang diinduksi logam berat

Dua klon yang mengandung promotor copSRA dikonstruksi di plasmid pUC18/SfiI

Cassete SfiI yang mengandung elemen yang responsif terhadap merkuri dibentuk

Cassete SfiI yang mengandung elemen yang responsif terhadap chromate dibentuk

2.2 Immobilisasi dari biosensor tembaga

Imobilisasi strain AE1239 pada sodium alginat:

50mL kultur bakteri dipanen menggunakan sentrifugasi pada 6000 rpm

Pellet tersuspensi pada 20mL 0.9% NaCl dan ditambahkan 20mL 4% sodium alginat

Dimasukkan ke dalam 200mL 0.2 M CaCl2 agar membentuk alginat “beads”

Imobilisasi keseluruhan biosensor tembaga:

Pellet disuspensi pada 9mL 0.9% NaCl

2.22 gr Agarosa dilarutkan didalam 100mL 0.9 NaCl dengan pemanasan, lalu didinginkan pada suhu 30 derajat Celsius dan ditambahkan 5mL suspensi bakteri

2.3 Pengukuran bioluminescence

25 mL kultur bakteri LB disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10.000 rpm dan di resuspensasi pada cryoprotectant dingin

150 mikroliter suspensi sel didispensasi pada tabung vial dan didinginkan pada air es sebelum dimasukan freezer dengan suhu -40 derajat celsius

Didapat sel viabel setelah rekonstitusi pada medium rekonstitusi (MR)

Larutan “metal salt” 20mL ditambahkan kedalam suspensi sel bakteri 180mL dan bioluminescence dihitung dalam waktu lima jam pada 23 derajat celsius menggunakan Lucy1 Microtitre plate luminometer

2.4 overekspresi dan purifikasi

Protein MerR dicangkok di E. coli dan dioverekspresikan.

Setelah induksi selama 3 hari, dilakukan sonikasi, kemudian MerR dipurifikasi dengan LC

GST-SmtA ditanam di E. coli dengan vektor dan di-overekspresikan

GST-SmtA dipurifikasi dengan Glutathine Sepharose 4B.

2.5 immobilisasi protein dan pengukuran kapasitansi

GST dan MerR dicampur buffer fosfat, lalu ditempelkan ke plate emas dengan EDC mediated coupling

Biosensor disusun dengan 3 elektroda yang dihubungkan dengan potensiostat yang responsif.

Elektroda : foil platina, kabel platina, dan Ag/AgCl.

Buffer dimasukkan dalam sel dengan pompa peristaltik, sampel dimasukkan lewat sampel loop.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1 Pengembangan tools genetika baru

Sejumlah tools genetic baru serta pengetahuan dasar untuk produksi

strain yang responsive terhadap logam telah dikembangkan

Pengetahuan dasar yang penting adalah bahwa mekanisme aktivasi

regulator/ promoter sensor berdasarkan aktivasi daerah

operator/promoter yang diinduksi logam

Pada biosensor, sinyal akan diterima Ppotein membran luar sel LamB

LamB merupakan peptida heterolog metal-binding metalothionein

pada permukaan luar membran sel gram negative.

Alcaligenes euthropus dipakai sebagai chassis karena

kemampuannya sintas di lingkungan keras

Feasibilitas pendekatan biosensor logam yang dibahas antara lain

promoter yang responsif terhadap Cu2+ ; Hg2+ ; Cr6+/3+ ; Pb2+

• Biosensor logam Cu

menggunakan operon resisten

Cu pMOL30

• Dipakai pula gen copSR yang

mengkode dua komponen

regulator system

• Berbeda dengan operon

resisten Cu pada E. coli, gen

regulator copSR ditranskripsi

pada arah berlawanan dengan

copABCD

Daerah regulator mer (merR dan

moter mer , PmerTPAD dari

transposon Tn501 dipakai untuk

biosensor merkuri

Daerah promoter copSRA

digunakan sebagai promoter

biosensor Cu

Ketika dikloning dalam A.

euthrophus untuk

mengekspresikan LamB atau

sistem reporter GFP, konsentrasi

1 µM Cu2+ atau 0,01 µM HgCl2

dapat mudah dideteksi

Vektor ekspresi promoterless Vibrio fischeri

luxCDABE seperti pMOL877 digunakan untuk

biosensor Cr.

Promoter chrA pada vector ini lebih mudah

diinduksi oleh ion Cr6+ daripada Cr3+

Namun Ni, Zn, Co, Al, Cd, Mn, AsO4, MoO4, WoO4,

SeO3 dan SeO4 tidak menginduksi bioluminesen

dan tidak bersifat toksik hingga 100 µM

vektor pMOL877 dan promoter chrA

menunjukkan dapat digunakan sebagai biosensor

Hg dan Cr

Operon resisten timbal plasmid

pMOL30 mengandung 2 gen

Ketika dikloning pbrR terlihat

sangat spesifik terinduksi oleh ion

timbal

1. pbrRA untuk meregulasi dan

karesistensi timbal

2. pbrR sebagi regulator

operon resisten merkuri

3.2 Imobilisasi sensor bakteri

Selanjutnya dilakukan imobilisasi biosensor yang diinduksi logam pada matriks padat yang berbeda

• Sensor Cu AEI1239 diimobilisasi di gel alginate dan gel agarose dengan penambahan konsentrasi ion Cu2+ di medium LB

Kedua matriks imobilisasi memiliki karakteristik sama namun sinyal relatif lebih tinggi pada agarose karena overgrown kultur bakteri

Secara umum imobilisasi pada gel alginate lebih stabil daripada pada gel agarosa

Kapasitas afinitas sensor terhadap ion logam spesifik

Self Assembled Monolayer(SAM) – pembentukan molekul yang digunakan untuk mengkonstruksi sensor yang sangat sensitif dan spesifik terhadap ion logam.

Konstruksi over ekspresi broader-spectrum MerR dari transposon Tn501 Bacillus yang dapat merespon adanya ion merkuri serta organomerkuri.

Produksi protein fusi synechococcal GST-SmtA metallothione

Karakteristik terjadinya pengikatan Zink (Zn) pada fusi protein dilihat berdasarkan atomic adsorption spectroscopy

Fusi protein juga dapat mengikat ion Cd, Cu, dan Hg pada pH sedang.

pembuatan sebuah sensor afinitas didasarkan pada pengukuran kapasitas,keberadaan lapisan immobilisasi

Penelitian yang dilakukan ini difokuskan pada penentuan optimalisasi immobilisasi

Ada 3, antara lain :

-EDC-coupling

-PEGDGE-entrapment

-GA-crossin

Sejauh ini, EDC-coupling menunjukan sensitivitas yang paling tinggi.

Grafik 3.3.5

Grafik 3.3.7

4. Kesimpulan

Penelitian ini menghasilkan petunjuk feasibilitas teknologi untuk mendeteksi ion

logam berat berdasarkan whole cell biosensor dan protein based biosensors

Telah dilakukan beberapa identifikasi dan penyusunan daerah promoter yang diinduksi

logam untuk mengaktivasi gen reporter lux atau GFP atau ekspresi epitope membran

luar yang dideteksi dengan imunochemistry

Telah dihasilkan gambaran kemungkinan penerapan teknologi whole cell biosensor

dengan imobilisasi. Adapun spesifitas biosensor yang tinggi terlihat pada ion Pb dan

Cr

Demo afinitas sensor berdasarkan protein juga dilakukan untuk memonitor ion logam

berat pada trace level.

Sensor kapasitansi spesifik ion memiliki sensitifitas exceptional, serta sistem yang

kurang baik karena berbagai jenis pengenalan elemen dapat diimobilisasi langsung

seluruhnya pada self assembling monolayer dan melapisi permukaan elektroda

pengukuran logam mulia

Dibandingkan sensor elektrokimia, protein based sensor lebih sensitif

Whole cell sensor hanya mampu bereaksi pada fraksi ion logam yang bioavailable,

sementara protein based sensor lebih aplikatif karena sensitif untuk ion logam.

PustakaCorbisiera, Philippe ., Daniel van der Leliea., Brigitte Borremansa., Ann Provoosta.,Victor de Lorenzob., Nigel L. Brownc., Jonathan R. Lloydc., Jonathan L. Hobmanc., Elisabeth CsoÈregid., Gillis Johanssond., Bo Mattiasson.1999. Whole cell- and protein-based biosensors for the detection of bioavailable heavy metals in environmental samples. Analytica Chimica Acta 387: 235-244