Aislamiento y Caracterizacion de Enzimas
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7/25/2019 Aislamiento y Caracterizacion de Enzimas
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3. AISLAMIENTO YCARACTERIZACIN DE ENZIMAS
3.1 Tcnicas de purificacin de en!i"as
3.# Tcnicas ana$%&icas para cuan&ificacin de pr'&e%nas
3.3 Medicin de ac&i(idad en!i")&ica
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Organismo Tamao delgenoma (Mpb)*
Nmero decromosomas
Nmero degenes
Secuencias
codificadoras paraprotenas(%)
Virus de laepatitis !
"#$ &'
Escherichia coli # & +',, ,,
Saccharomyces
cervisiae
&' & +""" -"
Caenorhabditiselegants
- &+""" '$
.rro/ " 01$+""" 0&"
Drosophila &," &1+"" &1
2ollo &+'"" 1
3at4n 1+""" '"
Vaca 1+""" 1"
umano 1+""" '1 01$+""" &$
* Millones de pares de bases* * Tamao del genoma 5 nmero de cromosomas referidos a c6lulas 7aploides
Tama8o 5 nmero de cromosomas en diferentes organismos
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*ARA ENTENDER LA +,NCIN DE ,NA ENZIMA-AY ,E *R,+ICARLA
/ +uen&e
/ E$ ensa0'/ C'"' $ierar una $a pr'&e%na de su nic2' na&ura$/ S'$ui$idad Ta"a4' Car5a 0 Afinidad
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*,RI+ICACIN
/ In&erca"i' inic'/ In&eraccin 2idr'fica/ SEC/ +racci'na"ien&' p'r
diferencia de c'efici'en&ede difusin
CARACTERIZACIN
/ 9lectroforesis/ Secuencia peptdica
/ Mapeo Trptico
/ :ltracentrifugaci4n
analtica/ 9spectroscopa
/ ;ispersi4n de lu/
din
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LA +ORMA DE ROM*ER EL TE6IDO
Fundamento Homogeneizador Materiales
Esfuerzo de corte producido porlquidos
Potter-Elvehjem Tejidos blandos
PolytronTejidos blandos yduros
Prensa de French Bacterias
Esfuerzo de corte producido por slidos ortero con mazo !e"etales
#avitacin "aseosaBomba de nitr"eno #$lulas
%onicador &r"'nelos y c$lulas
edios qumicos y bioqumicos
edio hipotnico #$lulas de la san"re
Enzimas (lisozima)*idrlisis de la paredcelular bacteriana
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E$ ensa0'
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Centrifugacin Diferencial. Las clulas se homogenizan y se centrifugan con
cambios en la fuerza centrfuga. El material ms denso se va la fondo del tubo.
Cada una de las fracciones pueden usarse para fines especficos.http!!""".ncbi.nlm.nih.gov!boo#s!$%&''()*!figure!+(()!
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,raccionamiento -alting out y dilisis
Dilisis: Las molculas de protenas crculos ro/os0 1uedan retenidos dentro de la
bolsa de dilisis2 en la medida 1ue molculas pe1ue3as azules0 pueden difundir.
http!!""".ncbi.nlm.nih.gov!boo#s!$%&''()*!4+((5
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Cr'"a&'5raf%a de &a"ices "'$ecu$ares7per"eacin en 5e$ gel filtration8
En la cromatografa de tamices moleculares un mezcla de protenas se
aplica en la parte superior de una columna llena de esferas porosas.
http!!""".ncbi.nlm.nih.gov!boo#s!$%&''()*!4+((5
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Cr'"a&'5raf%a de in&erca"i' inic'
En la cromatografa de intercambio inico se
separan protenas de acuerdo a su carga neta.
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Cr'"a&'5raf%a de afinidad
Como e/emplo2 la Cocanavalina + amarilla0 se une a
un soporte slido 1ue contiene glucosa. La adicin deuna concentracin ms alta de glucosa desprende la
concavalina del soporte.
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E$ec&r'f'resis en 9e$ de p'$iacri$a"ida 7*A9E8
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Step Total protein(mg)
Total activity(Unidades=micromoles/min)
Specifcactivity,(U/mg)
ield (!) "urifcationlevel
-'"'5eni!a&i'n 1:;;; 1:;;;; 1; 1;; 1
Sa$& frac&i'na&i'n ;;; 3; ?# 3
I'n@ec2an5ec2r'"a&'5rap20
1#B> 11::;; ?; BB ?
M'$ecu$arec$usi'nc2r'"a&'5rap20
=>.> B:;;; 11;; :; 11;
Affini&0c2r'"a&'5rap20
1.B: :#:;; 3;;;; 3: 3;;;
#a actividad enzim$tica es una medida de la cantidad de enzima activapresente y del nivel de actividad de la misma% #a actividad e&presa lacantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo, teniendo
condiciones%
' U = ' mol sustrato convertido & min *'
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electroforesis
Elecroforesis de zona
6soelectroenfo1ue 7+8E9-D-
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7+8E9-D-
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6soelectroenfo1ue
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'D
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:7LC
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" is &2e "ass 'f &2e par&ic$e is &2e par&ia$ specific ('$u"e
is &2e densi&0 'f &2e "ediu"f is &2e fric&i'na$ c'efficien& 7a "easure 'f &2es2ape 'f &2e par&ic$e8.T2e 71 @ 8 &er" is &2e u'0an& f'rce eer&ed 0$iuid "ediu"
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=entrifugaci4n por >ona# +'r"acin de un 5radien&eC'$'cacin de $a "ues&ra Cen&rifu5acin 0 C'$eccin defracci'nes.2&&pFGGHHH.nci.n$".ni2.5'(G''sGNJK##
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MALDI@TO+ Mass Spec&r'"e&r0 2&&pFGGHHH.0'u&ue.c'"GHa&c2(OKR;c&r$;fea&urere$a&ed718 T2e pr'&ein sa"p$e e"edded in an appr'pria&e "a&ri is i'ni!ed 0 &2e app$ica&i'n 'f a $aser ea".7#8 An e$ec&rica$ fie$d acce$era&es &2e i'ns f'r"ed &2r'u52 &2e f$i52& &ue &'Hard &2e de&ec&'r. 738 T2e$i52&es& i'ns arri(e firs&. 7
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2&&pFGGHHH.nci.n$".ni2.5'(G''sGNJK:=;11G
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MALDI@TO+ Mass Spec&ru" 'f Insu$in and $ac&'5$'u$inA "i&ure 'f : p"'$ eac2 'f insu$in 7I8 and @$ac&'5$'u$in 7L8 Has i'ni!ed 0 MALDI H2ic2 pr'ducespred'"ina&e$0 sin5$0 c2ar5ed "'$ecu$ar i'ns fr'" pep&ides and pr'&eins 7I - f'r insu$in and L - f'r$ac&'5$'u$in8. -'He(er "'$ecu$es Hi&2 "u$&ip$e c2ar5es as He$$ as s"a$$ uan&i&ies 'f a sin5$0 c2ar5ed di"er 'f
insu$in 7# I -8 a$s' are pr'duced. Af&er 6. T. Pa&s'n In&r'duc&i'n &' Mass Spec&r'"e&r0 3d ed. 7Lippinc'&&@Ra(en 1??B8 p. #>#.Q
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Tec7ni?ue 2rocess .pplication
#@DE 7#@di"ensi'na$ 5e$ e$ec&r'p2'resis8 S'$u$e pr'&ein separa&i'n in 5e$ 0 is'e$ec&ricf'cusin5 7IE+8 f'$$'Hed 0 separa&i'n ased 'n"'$ecu$ar Hei52& 7SDS@*A9E8
+rac&i'na&i'n 'f pr'&eins &2r'u52 2i52$0si"p$ified pr'&ein sp'&s
1@DE 71@di"ensi'na$ 5e$ e$ec&r'p2'resis8 S'$u$e pr'&ein separa&i'n in 5e$ 0 is'e$ec&ricf'cusin5 7IE+8 'r "'$ecu$ar Hei52& 7SDS@*A9E8
L'H@res'$u&i'n separa&i'n 'f pr'&eins.9enera$$0 used pri'r &' suseuen&separa&i'n s&eps
DI9E 7differen&ia$ 5e$ e$ec&r'p2'resis8 +$u'rescen& d0e $ae$ed s'$u$e pr'&eins
separa&ed 0 is'e$ec&ric p'in& f'$$'Hed 0separa&i'n ased 'n "'$ecu$ar Hei52&
uan&i&a&i(e #@D frac&i'na&i'n used f'r
accura&e re$a&i(e epressi'n differences 'fs'$u$e pr'&eins
O9E 7'ff@5e$ e$ec&r'p2'resis8 S'$u$e pr'&ein separa&i'n in a 5e$Gufferc'"ina&i'n. Is'e$ec&ric f'cusin5 Hi&2'u&a"p2'$0&es
Separa&i'n 'f in&ac& pr'&eins. ,sed &'ac2ie(e "'dera&e$0 si"p$ified pr'&ein"i&ures
Tar5e& affini&0 enric2"en& *r'&ein inds &' an i""'i$i!ed sus&ancese$ec&i(e f'r &2e pr'&ein 'f in&eres&. *r'&einindin5 is re(ersi$e
Kn'Hn pr'&ein c'"p$ees MARS'ida&i'ns 5$0c's0$a&i'ns p2'sp2'r$0a&i'nsRNAGDNA. +'r 2i52$0 specific pr'&einfrac&i'na&i'n
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Tec7ni?ue 2rocess .pplication
SCUG-*LC 7s&r'n5 ca&i'nec2an5eG-*LC8
On@$ine e$u&i'n 'f &r0p&ic di5es&sased 'n i'nic s&ren5&2 f'$$'Hed0 re(ersed p2ase -*LC
-i52$0 c'"p$e pr'&ein di5es&"i&ures
-*LCGCE On@$ine e$u&i'n ased 'n20dr'p2'ici&0 and c2ar5eG"assra&i'
L'H $e(e$ s"a$$ ('$u"e pr'&einiden&ifica&i'n 'f di5es&s
-*LCGCZE On@$ine e$u&i'n ased 'n20dr'p2'ici&0 and si!e
L'H $e(e$ s"a$$ ('$u"e pr'&ein
C$ass enric2"en& Affini&0 in&erac&i'n 'f pep&ide *referen&ia$ re"'(a$ 'f "'dified
pep&ides
ICAT 7is'&'pe c'ded affini&0 &a58 Ji'&in deri(a&i!ed c0s&eineresidues se$ec&i(e$0 is'$a&ed 0a(idin c'$u"n c2r'"a&'5rap20
Re$a&i(e uan&ifica&i'n andiden&ifica&i'n 'f pr'&eins ased 'nis'&'pic $ae$s
A,A 7as'$u&e uan&i&a&i(e
ana$0sis8
Is'&'pica$$0 $ae$ed pep&ides
uan&ified 0 &2e presence 'f as&a$e is'&'pica$$0 $ae$ed in&erna$s&andard
As'$u&e uan&ifica&i'n 'f pep&ide
c'ncen&ra&i'n
iTRA 7is'&'pe &a55in5 rea5en&sf'r as'$u&e uan&ifica&i'n8
Is'aric $ae$in5 'f pri"ar0a"ines
C'"paris'n 'f up &' f'ur sa"p$esuan&i&a&i(e$0 in MSGMS "'de
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