12 Producción de Proteínas Recombinantes
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Importancia biológica
Componentes estructurales de los seres vivos y son sintetizadas como parte del metabolismo normal de las células: • Enzimas: biocatalizadores incrementan la
velocidad de la RXN metabólicas. • Integran estructuras celulares: citoesqueleto,
pared celular, ribosomas. • Funciones celulares: organización del DNA,
replicación, transcripción, movilidad, señalización, respuestas inmune, adhesión celular, ciclo celular.
Metabolitos precursores para síntesis, E y crecimiento
Metabolismo Síntesis de enzimas
Traslocación de enzimas
Difusión de enzimas
Hidrólisis del polímero
Gradiente de moléculas pequeñas
Transportadores específicos
Hidrólisis de almidón: amilasas
Amilosa
Amilopectina
Unidad de glucosa
Maltosa
(14)
(14)
(16)
O
H
OH
HO
O
H
OH
CH2OH
O
H
OH
H
OH
H
O
H
OH
CH2OH
OH
H
O
H
OH
CH2OH(14)
Maltosa Glucosa
Maltosa
Industria de enzimas
• Para 1970s, la mayoría de las enzimas utilizadas eran de origen vegetal o animal: baja disponibilidad, altos costos.
• Usos de sistemas microbianos (1980s):
– 1) Escherichia coli, amidasa para la producción de ácido aminopimélico (6-APA), 40,000 tons/año;
– 2) Streptomyces, xilosa isomerasa para producción de D-fructosa ade D-glucosa, 100,000 tons/año:
– 3) Pseudomonas chlorapis nitrilo hidrolasa para producir acrilamida de acrilonitrilo, 30,000 tons/año.
Tecnología de DNA recombinante
(Inicio de 1970s: Berg, Cohen and Boyer in California):
La modificación deliberada del genoma de un microorganismo a través del cambio de la secuencia de nucleótidos que lo conforman se denomina como ingeniería genética y se logra a través de la aplicación de una serie de métodos conocidos como tecnología del ADN recombinante.
• Producción de enzimas de origen vegetal y animal en sistemas microbianos por sistemas fermentación.
• Producción de enzimas de organismos patógenos, difíciles de crecer o manipular genéticamente en sistemas conocidos.
• Incremento en la producción de enzimas por el uso de varias copias de genes , promotores fuertes, secuencias señal eficientes, etc.
• Ingeniería de proteínas: mejora de la estabilidad, actividad y/o especificidad.
Secreción de proteínas
• Papel de Signal Recognition Particle (SRP), presentes en todas las
células.
• En Bacteria, presencia de un solo tipo de SRP y una molécula ARN
pequeña (small RNA) 4.5S RNA.
• Durante el transporte la secuencia señal es hidrolizada
(modificación post-traduccional)
• Sistema de traslocasas (Sec), p.e. SecYEG, ampliamente
distribuida en procariontes: asisten en los eventos de transporte y
Twin arginine traslocase (Tat).
Algunos sistemas de secreción de proteínas en bacterias Gram-negativas
Sistema Nombre Dependencia Sec Descripción
Tipo I Exportador ABC Independiente Consiste de 3 proteínas, una de las cuales es
ATP dependiente.
Opera en proteínas que no tiene señal de
reconocimiento
Tipo II Sistema de dos pasos Dependiente Mueve la proteína al periplasma por el sistema
Sec en un paso. Entonces 14 proteínas
accesorias la mueven a través de la membrana
en un segundo paso.
Tipo III Sistema dependiente
de contacto
Independiente Involucra 20 o más proteínas incluyendo
ATPasa, que forman un sistema continuo entre
el citoplasma y la superficie.
Activado por contacto por una célula
hospedera, libera una toxina (proteína) en el
hospedero directamente.
Tipo IV Sistema de
transferencia conjugal
Desconocido Utiliza el mismo sistema de transferencia de
DNA de algunas bacterias a células
eucariontes.
Tipo V Autotransporte Dependiente Están involucrados dos pasos como el tipo II,
pero no requiere de proteínas transportadoras
para transferir a través de la membrana
Chaperonas en E. coli
DnaK (Familia Hsp 70): previene la formación de CI reduciendo la agregación y promueve proteólisis de proteínas mal plegadas. Sistema de bichaperonas DnaK y ClpB (Familia Hsp100) favorece la solubilización de o desagregación de proteínas GroEL (Familia Hsp60) Controla la transición entre proteínas solubles e insolubles y participa en la desagregación de CI. Proteínas de heat shock lbpA, lbpB protegen a proteínas desnaturalizadas térmicamente de una agrgación irreversible y se han encontrado asociados a CI La expresión soluble de proteínas recombinantes se estimula por la co-sobree xpresión de GroEL–GroES y DnaK–DnaJ–GrpE junto con trigger factor (chaperonas citoplasma de 40 kDa).
Fig. 1. SDS–PAGE analysis (12%, Coomassie blue-stained) of CorA overexpressed in E. coli at (A) 37 °C, (B) 20 °C, and (C) 15 °C. Control lane at 37 °C: uninduced whole cell lysate. The expressed CorA protein migrated as a 40 kDa polypeptide. Inclusion bodies were solubilized in 6 M urea before the sample was loaded onto the gel.
Estrategias para mejorar la excreción de proteínas recombinantes en E. coli
1. Ingeniería de sistemas de excreción nativos en E. coli patógenas.
2. Uso de proteínas acarreadoras con mecanismos de translocación no conocidos
3. Desarrollo de mutantes en superficie celular 4. Co-expresión de proteínas promotoras de lisis (Kil)
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