1

به نام آنکه مـــا را

زندگی دادوزان پس

مژده پایندگی داد

2

3

.

4

ن�س�ل� ر�و�ش�ه�ا�ی� ا�ن�و�ا�ع�ی�ا�ب�ی� ت�و�ا�ل�ی� ب�ع�د�ی�

DNA

Next Generation DNA Sequencing

Metod

5

مولکولی درس : نشانگرهایرحیمی استاد : دکتر جناب

دهنده : یوسفی ارائه بابکماه 1394دی

6

یابی را DNA( DNA sequencing)توالی درازی راهدهه در دوبعدی کروماتوگرافی زمان تاکنون 1970از

. است کرده طی ی وسیله ب�ه یاب�ی توال�ی روش دو ظهور و Sangerب�ا

و سال Maxam Gilbertهمکاران ، 1977&درو بزرگ تحوالت دچار شناسی زیس�ت ب�ا مرتب�ط علوم

. شدند بنیادینی روش گرفته، شکل روش دو میان علت Sangerاز ب�ه

و عالقه مورد روش ی�ک عنوان ب�ه انجام، در س�هولت . به اینک�ه ت�ا گردید تبدی�ل مولکول�ی مطالعات در روزمرهسال در ک�ه انس�ان ژنوم ی پروژ�ه روش، ای�ن لط�ف

س�ال 1990 در ؛ بود شده با 2003شروع میالدی . رسید پایان به موفقیت

مقدمه

7

کمپان�یApplied Biosystems خودکار دستگاه اولی�نمویینگی الکتروفورز روش اس��اس بر یاب��ی توال��ی

(Capillary Electrophoresis ) CE . کرد معرفی راAB370 س�ال سال AB3730xlو 1987در 1998در

ژنوم پروژه طرح در ک�ه بودن�د های�ی دس�تگاه اولی�ن. گرفتند قرار استفاده مورد انسان

NGS

8

پیشرفته های تکنولوژ�ی ب�ه نیاز و بشری دان�ش پیشرف�ت ب�ابه رو نیازهای گوی جواب موجود، های روش از اس�تفاده

س�ال در اینک�ه ت�ا نبود، محققی�ن روش 2004رش�د اولینرونمایی تجاری ص�ورت ب�ه باال حج�م ب�ا زمان ه�م یاب�ی توال�ی

شد. توالی روش از پ�س جدی�د تکنولوژ�ی گیری شک�ل عل�ت ب�ه

س���انگر عنوان یاب���ی با تکنولوژ���ی ای���ن ،Next Generarion Sequencing (NGS) . گردید معرفی

از بی�ش گذش�ت از پ�س کاربردهای 10اکنون اولین از س�الNGS عمیق تاثی�ر ی دهنده نشان اخی�ر علم�ی های یافت�ه ،

. باشد می ژنتیک علم بر تکنولوژی این

NGS

9

کل توال�ی توان م�ی تکنولوژ�ی ای�ن ی وس�یله ب�ه امروزهباال بسیار دق�ت ب�ا را آ�ن از محدودی قس�مت تنه�ا ی�ا ژنوممناسب بس�یار ای هزین�ه ب�ا و ممک�ن زمان کمتری�ن در و

. داد آزمایشقرار و بررسی مورد مطالعات ، تکنولوژی ای����ن از اس�تفاده ی DNAب��ا

( خوبی( ancient DNAباس�تانی های ف�ت پیش�ر. است داشته

NGS

10

شده شناخته هاي ژنوم مجدد ياب���ي توال���يResequencing ))يكي آ�ن از بخش�ی ي�ا ژنوم ك�ل

راي��ج كارب�������ردهاي براي NGSاز كه اس��ت))SNPشن����اس���ايي ، ، Insertion / deletionها

قابل س��اختاري تغييرات و ژن��ي هاي نس��خه تعداد. است استفاده

سال در ژنوم مجدد ياب�ي توال�ي پروژ�ه اولي�نبا 2005 واتس�ون دكت�ر خون نمون�ه روي بر و

تكنولوژي از .454استفاده است گرفته انجام

NGS

11

كه ان�د شده ابداع جديدي هاي ش رو ه�ا، هزين�ه كاه�ش برايتوالي تعيي�ن را ه�ا نمون�ه از بزرگ�ي طول ت�ر، كوتاه زمان در

. قطعات ياب�ي توال�ي كل�ي طور ب�ه كنند استفاده DNA م�ي ب�اروش با ياب�ي توال�ي برخالف ياب�ي، توال�ي جدي�د هاي تكني�ك ازمسئله اي�ن ندارد، س�ازي همس�انه مراح�ل ب�ه نيازي س�نگر

. است داده كاهش شدت به را يابي توالي هزينه و زمان چندين تولي�د ياب�ي، توال�ي نوع اي�ن ديگ�ر توج�ه قاب�ل مزي�ت

و نظر مورد هدف ب�ه بس�ته متوس�ط طول ب�ه توال�ي ميليونچند ي�ا س�اعت چن�د ط�ي در تنه�ا ، اس�تفاده مورد س�يستم نوعدر يابي توال�ي مبی�ن ک�ه باش�د م�ي باال ص�حت و دق�ت ب�ا روز

باشد . می مقياسوسيع

عمل NGSروش

12

تكنولوژي اي�ن ت�ا ش�د س�بب ، آ�ن س�ازی وتجاری ه�ا ويژگ�ي اي�نها آزمايشگاه اغل�ب و شده س�انگر ياب�ي توال�ي روش جايگزي�نآن از بزرگ ژنوم�ي ياب�ي توال�ي مراك�ز از مس�تقل طور ب�ه بتوانن�د

. كنند برداري بهره �تكنيك ارزشمن�د مزاياي كنار در ك�ه اس�ت ذك�ر ب�ه ، NGSالزم

در چالش بزرگتري�ن ، ياب�ي توال�ي ز ا حاص�ل عظي�م هاي داده آنالي�زنرم پيشرفته، كامپيوترهاي نيازمن�د ك�ه باش�د م�ي زمين�ه اي�نتخصص و دان�ش همچني�ن و ه�ا داده آنالي�ز براي خاص افزارهاي

. است كافي افزارهای نرم فوق، موارد رفع ب�ه نیاز احس�اس ب�ا و حاضر حال در

تفسیر و تحلیل و تجزیه .NGSتخصصی است شده طراحی

NGS

13

ی زمینه در بزرگ پیشرف�ت ای�ن ب�ا رابط�ه در امروزهمتفاوت تجاری روش چندی�ن دست NGSژنتی�ک، جه�ت

هاي شركت توس�ط بیشت�ر، ژنتیک�ی اطالعات ب�ه یاب�یشرح به ذیل در که گیرد می قرار استفاده مورد مختلف

: پردازیم می آنها

روشهای NGSانواع

14

س�ال در تجاری بطور ک�ه مورد شد، 2004اولی�ن معرف�ی.Roche/454FLX Pyrosequencerدستگاه بود

حرارتی توال��ي تعيي��ن روش از دس��تگاه ای��ن(Pyrosequencing )توسط ک�ه کرد، م�ی اس�تفاده

روش Life Sciencesشرك�ت اين و پيشنهاد امریک�اشركت توسط ها . Rocheبعد شد سوییسخريداري

    مخترع نایرن پال با همراه رونق�ی اس�ت ذک�ر قاب�ل   توالی‌یاب�ی  برای س�کونسینگ پیرو . DNAروش است

  شرک��ت ارش��د معاون و ایلومینارونق��ی بوده. دارد متعددی مقاالت و اختراعات

Roche / 454روش

15

قطعات روش اي�ن محيط DNAدر ي�ك در آ�ب قطرات داخ�ل درامولس�يون ) . PCRروغن�ي قطر( اي�ن از كدام ه�ر در شود م�ي تكثي�ر

الگوي يك آب شود DNAات مي متصل آغازگر يك به كه دارد قرار . شود مي ايجاد فشرده كلون�ي ي�ك آ�ن تكثي�ر اث�ر بر نهاي�ت در وپيكوليتر حد در حجم با چاهك زيادي تعداد حاوي خوان توالي دستگاهمخصوص آنزي�م و دان�ه ي�ك حاوي ه�ا چاه�ك اي�ن از كدام ه�ر ك�ه اس�ت

لوسيفراز . ) آنزي�م از ، س�يستم اي�ن اس�ت توال�ي Luciferaseتعيي�نEnzyme )به ك�ه نوكلئوتي�د ه�ر تشخي�ص براي كن�د م�ي نور تولي�د ك�ه

.DNAرشته كند مي استفاده شود مي افزوده شده تشكيل تازه تکنولوژ�ی پیشرف�ت های Rocheب�ا مولکول توان بطول DNAمی

.1000تا کرد یابی توالی را باز جفت

Roch / 454روش

16

نمونه سازي آماده تكثير )DNA ((Aمراحل ،B ) با توالي تعيين و454( Cتكنولوژي )

17Roche GS-Junior

18Roche GS-FLX

19

The Roche-454 GS-FLX Pyrosequencer

20

كمپان�يSolexa س�ال در Genomeدستگاه ٢٠٠٦ك�هAnalyzer س�ال در كرد ارائ�ه بازار ب�ه توسط ٢٠٠٧را

با Illuminaكمپان�ي بع�د ب�ه زمان آ�ن از و ش�د خريداري.Illumina / Solexaنام شود مي شناخته

س�ال اواي�ل س�يستم Illumina 2010در ،Hiseq به راتعيین براي الذک�ر فوق اس�تراتژي از ك�ه كرد ارائ�ه بازار . با مقايس�ه در آ�ن خروج�ي ام�ا كند م�ي اس�تفاده توال�ي

. است بيشتر بسيار قبلي نسخه

Illumina / Solexaروش

21

پايان هاي رنگ خاص�يت از اس�تفاده ب�ا توال�ي تعيي�ن روش اي�نپذير برگش�ت ول�ي ( Reversible Dye-Terminators)دهنده

مولكول . شده شكسته قطعات ابتدا اس�ت شده DNAطراح�يمي تكثي�ر س�پس و وص�ل اس�اليد ب�ه متص�ل آغازگرهاي ب�ه

. Bridge Amplificationشود) چهار( سپس دهد م�ي تشكي�لپذي�ر ) برگش�ت ول�ي دهنده پايان هاي رن�گ ب�ه متص�ل باز -RTنوع

bases )محل ك�ه ص�ورتي در باز ه�ر و شود م�ي واكن�ش ب�همي متص�ل ناحي�ه آ�ن ب�ه باش�د، داشت�ه وجود اتص�ال براي مناس�بيواكنش محي�ط از و شده شس�ته آزاد هاي نوكلئوتي�د س�پس و شود

به مرحله هر در نوكلئوتيد يك تنها و شود، مي اضافه DNAحذف . با شده نشاندار هاي نوكلئوتي�د از دوربين�ي لحظه اي�ن در شود ميرشد . كننده متوق�ف پايان در نماي�د م�ي برداري تص�وير فلورس�نت

DNA ' س�ر و 3از شود مي جدا شيمياي�ي هاي واكن�ش توس�طشود . مي آغاز بعدي چرخه

Illumina / Solexaروش

22

.

Illumina/Solexa Genome AnalyzerTM

23

Illumina S-L 1600

24

Illumina MiSeq

25

Illumina HiSeq

26illumina_nextseq500

27

كمپان�يSOLiD س�ال از ٢٠٠٦در يابي توال�ي تكنولوژ�ي( اتص�ال بازار( Sequencing- by-ligationطري�ق به را

شركت ) توس�ط ني�ز س�ال همي�ن در و كرد Appliedمعرف�يBiosystems - ABI. شد( خريداري

شماره های تکنی�ک همانن�د نی�ز روش کتابخانه 2و 1ای�ن از ،بهره یابی توال�ی جه�ت آداپتور ی وس�یله ب�ه گرفت�ه شک�ل های

. گیرد می ت�ا دس�تگاه اجراي ه�ر در ابتدا مي Gb٣در قرائ�ت توال�ي

در ام�ا عنوان ٢٠٠٩گردي�د، تحت مت�د اي�ن از جديدي نس�خه ،Plus 3 ™SOLiD اجرا هر در اس�ت قادر ك�ه ش�د معرف�ي

از .Gb ٦٠بيش كند قرائت توالي

ABI / SOLiDروش

28

،توال�ی تعيي�ن از پي�ش روش اي�ن هاي DNAدر دانه توس�طروغني هاي حباب در آغازگ��ر از Aqueousپوشيده

droplets within an oil phase )) شود مي تكثي�ر(Emulsion PCR .)يك حاوي ه�ا حباب اي�ن از كدام ه�ر

هاي ل مولك�و از سطح DNAنس�خه بر ك�ه اس�ت مشاب�ه. دارد قرار اي شيشه اساليد

صورتي در و شود م�ي باز اي رشت�ه دو هاي اليگونوكلئوتي�دمي متص�ل آ�ن ب�ه كن�د پيدا اتص�ال براي مشاب�ه هاي جايگاه ك�ه . و كيفيت توال�ي، تعيي�ن نتيج�ه ك�ه اس�ت ذك�ر ب�ه الزم شودايلومينا روش ب�ا مقايس�ه قاب�ل روش، اي�ن در قطع�ات طول

است. آنزیم از اس�تفاده روش� ای�ن بارز و ligaseخص�وصیت لیگاز

میزان به را روش دق�ت ک�ه اس�ت دار نشان های پروب. است داده افزایش� زیادی بسیار

ABI / SOLiDروش

29

توالي تعيين تكنولوژي DNAروش از استفاده / ABIباSOLiD

30

5500 SOLiD™ System

31

بلکه آنه�ا، ناکارآمدی دلی�ل ب�ه ن�ه روشه�ا ای�ن کمت�ر کاربرددر مربوطه های کمپان�ی کمت�ر فعالی�ت برای بیشت�ر شای�د . این از تعدادی باشد مربوط�ه دان�ش و دس�تگاهها فروش

: است شده اورده زیر در روشها

کمتر کاربرد با روشهایی

32

شركت Pacific Bioscience روش كننده ابداع کانادا( توالي ( Single Molecular Real Timeتعيين��ِ

SMRT .همانند ط�بيعي فرآين�د اس�اِس بر روش اي�ن اس�تدرستي DNAس�ازي و كارآي�ي از ك�ه شده طراح�ي

. فناوری اس�ت برخوردار سنتز SMRTباالي�ي مشاهدهDNA. سازد مي پذير امكان وقوع زمان همان در را

SMRTروش

33

نسل براي پيشنهادي هاي روش اولي�ن از ديگ�ر يك�يروش به توال�ي تعيي�ن ه�ا، توال�ي تعيي�ن بود Polonyجدي�د

سال در هاروارد دانشگاه در توالي 2005ك�ه تعيين براي . چند از تركي�بي روش ي�ك اي�ن ش�د ابداع ژنوم كام�ل

. شرك�ت توس�ط وري فن��ا اي�ن بود ( ABIروش آمريكا ). شد خريداري

Polonyروش

34

توالي تعيي�ن Massively Parallel SignatureروشSequencing - MPSS سال در بار اولي�ن 1992براي

انفصال . و اتص�ال مبناي بر روش اي�ن اس�اس ش�د پيشنهاداست . نوكلئوتيد افزايشچهار با همزمان پذيرشگرها

نشد اراي�ه بازار ب�ه روش اي�ن مكانيس�م، پيچيدگ�ي خاط�ر ب�هبه روش اي�ن كننده پيشنهاد آزمايشگاه همان در تنه�ا و

س�ال . در پرداخ�ت ده�ي توسط 2004س�رويس روش اي�ن. Selectraشركت آن كردن، بهينه از پس که شد خريده

توالي تعيين براي مناسب كاربردي روش يك صورت به راداد . ارايه سنتز با همزمان

MPSSروش

35

ب�ه ياب�ي توال�ي س�يستم جديدتري�ن حاض�ر حال توالي در ـسوم نـسلمعروف " Next-Next-Generation Sequencing“ يابي است.

دوم نسل هاي تكني�ك ب�ا مقايس�ه در تكنولوژ�ي اي�ن ممتاز هاي ويژگ�يياب�ي تكثير( ( NGSتوال�ي ب�ه نياز عدم ،DNA واكن�ش باشد PCRب�ا م�ي

. است شده يابي توالي براي الزم زمان كاهش و افزايشدقت باعث كه س�يستم اي�ن توس�ط شده قرائ�ت هاي توال�ي متوس�ط طول ١٣٠٠همچني�ن

bp هاي دستگاه تمام توس�ط شده خوانده هاي توال�ي طول از ك�ه اس�ت. است بيشتر دوم نسل

یابی توالی بعدی بعدی NNGSنسل

36

كمپاني توس��ط بار Helicos Bioscienceاولي��نتجاری نام با و The Helicos Heliscopeمعرف�ي

مي منفرد مولكول ي�ك ياب�ي توال�ي ب�ه قادر و ش�د عر�ض�هباشد.

استفاده س�نتز حی�ن یاب�ی توال�ی اص�ول از نی�ز روش ای�ننیازی یابی توال�ی انجام از پی�ش ک�ه تفاوت ای�ن ب�ا کند می

. ندارد وجود الگو های رشته تکثیر و کتابخانه ایجاد به خوانش هر در تواند مي دستگاه .55این بخواند را باز

Helicos Heliscopeروش

37

Helicos Heliscope

38

كمپان�يIon Torrent س�ال اواخ�ر موسوم ٢٠١٠در دس�تگاهيرا Machine Ion Personal Genome (Ion PGM)به

توالي س�وم نس�ل هاي دس�تگاه از ديگري نوع ك�ه كرد بازار روان�هاست . يابي

ساير در ك�ه ي نور روش خالف بر توال�ي تعيي�ن روش اي�نهيدروژن هاي يون شناس�ايي از شود، م�ي اس�تفاده ه�ا س�يستم

شدن پليمريزه هنگام در استفاده DNAك�ه شود، م�ي آزادو تغيير pHنموده ترتي�ب اي�ن ب�ه كن�د، م�ي تغيي�ر واكن�ش محي�ط

pH. خير يا است شده اضافه جديد نوكلئوتيد كه دهد مي نشان

Ion PGMروش

39

Ion Torrent

40

Refrence

منابع

41

# Advanced sequencing technologies and their wider impact in microbiologyNeil HallThe Journal of Experimental Biology 209, 1518-1525

# Applications of next-generation sequencing technologies in functional genomics Olena Morozova, Marco A. MarraGenomics - Volume 92, Issue 5, November 2008, Pages 255–264

42

# A tale of three next generation sequencing Michael A Quail , Miriam Smith, Paul Coupland, Thomas D Otto, Simon R Harris, Thomas R Connor, Anna Bertoni, Harold P Swerdlow and Yong GuBMC Genomics 2012, 13:341

# Buyer’s Guide :Next-Generation Sequencing SystemsThis buyer’s resource is presented to you by Illumina Inc.

# Next-generation DNA sequencing - Jay

Shendure & Hanlee Ji, naturebiotechnology / volume 26. naumber 10. OCTOBER 2008

43

# Sequencing Methods ReviewA review of publications featuring Illumina® TechnologyPub No. 073-2014-001 Current as of 29 May 2014

# The advantages of SMRT sequencingRichard J Roberts, Mauricio OCarneiro and Michael C Schatz - Genome Biology 2013, 14:405 

44

# 6th Next Generation Sequencing Conference12th and 13th August 2014Dunedin Art GalleryThe Octagon, Dunedin, New Zealand

# www.illumina.com/

# www.ngsleaders.org/

# www.thermofisher.com/

45

در‌پایان‌بر‌خود‌واجب‌می‌دانم‌تا‌از‌استاد‌محترم‌جناب‌دکتر‌

رحیمی‌بابت‌آموخته‌هایم‌از‌ایشان‌،‌تشکر‌و‌قدردانی‌نمایم.

همچنین‌بر‌خود‌واجب‌می‌دانم‌از‌صبر‌و‌حوصله‌‌همکالسی‌

های‌گرانقدر‌نیز‌تشکری‌خاص‌داشته‌باشم.

م����ان����ا‌باشید‌و‌ماندگار

تقدیر‌و‌تشکر