Le metodologie di studio del cervello: SYSTEMS BIOLOGY
Alessia Stell13.04.10
IV secolo A.C
IPPOCRATE ipotizza che il cervello sia sede dell’intelli-genza
IV secolo A.C
ARISTOTELE considera il cervello come un meccanismo di “raffreddamento” del sangue.
MEDIOEVO
Si studiano disturbi neurologici e psichiatrici(tra cui il mal d’amore)
1674
Anton van Leeuwenhoek costruisce il primo microscopio
La nascita delle neuroscienze
“La reazione nera”
neuroni come entità singole che sono in contatto e si succedono l'una all'altra
Studio del cervello: UN APPROCCIO RIDUZIONISTICO
Studio del cervello: UN APPROCCIO OLISTICO
“lo studio delle interazioni e degli interscambi che
avvengono a diversi livelli dell’informazione biologica”
Il confronto dei due approcciAPPROCCIO RIDUZIONISTICO
Focalizzato su pochi geni e sui loro prodotti proteici
Si ottiene solo una comprensione parziale dei complessi meccanismi eziopatologici
APPROCCIO SYSTEMS BIOLOGYI sistemi biologici vengono affrontati non più come insieme di entità separabili, ma come
network di molecole interagenti, che si influenzano a vicenda
Permette di comprendere la complessità di un sistema in termini di cambiamenti quantitativi
e temporali.
Da dove deriva la complessità del nostro organismo?
25.000 geni codificanti
Il tutto è maggiore della somma delle sue singole parti
Systems Biology cerca di studiare le PROPRIETA’ EMERGENTI
Queste proprietà sono caratteristiche inattese dell’insieme, che non possono essere dedotte se osserviamo solo i componenti e non l’interazione complessa
Da Systems Biology a Systems Neuroscience
302 neuroni5000 connessioni
Possono essere usati tool computazionali per definire le connessioni Possono essere mappate le interconnessioni nervose specifiche di determinati pathways e circuiti
comportamentali Possono essere quindi tracciate relazioni causali dirette tra l’attività neuronale e il comportamento
C.Elegans
Da Systems Biology a Systems Neuroscience
100 miliardi neuroni5 x 10^14 connessioni
Devono essere utilizzati approcci diversi che consentano di comprendere la complessità
Metodi di studio di Systems Biology
Genomica Sequencing
Epigenomica ChIP-chip, ChIP-seQ…
Trascrittomica Microarray e Sequencing
Proteomica Mass Spectrometry e Protein Microarrays
Sequencing
Porta alla determinazione della struttura primaria di un polimero• Metodo Sanger• Automatizzazione del metodo di Sanger• Next-Generation Sequencing
Sequencing – Metodo Sanger
1975
dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs), lacking a 3'-OH group required for the formation of a phosphodiester bond
between two nucleotides
chain-terminator method
Sequencing - Automatizzazione del metodo di Sanger
2000
1975
Sequencing – SHOTGUN Sequencing
Human Genome Project
Sequencing – Next Generation
Sanger: 0.1 Mbp/dayNGS: 5 Gbp/day (5000 Mbp/day)
Incremento di 50.000 volte
Throughput: Costi:
Sanger: 500$/MbNGS: 1-2$/Mb
Riduzione 500 volte
Sequencing – Next Generation
Roche 454
Illumina Solexa
Abi SoLID
Sequencing – Solexa Technology
Epigenomica
Modificazioni della architettura del DNA, non dovuta a modificazioni della struttura primaria (sequenza)
• ChIp-chip / ChIP-Seq• DamID
EpigenomicaModificazioni degli Istoni (N-term)
Acetilazione Metilazione
UbiquitilazioneFosforilazioneSumoilazione
Modificazioni del DNA
Metilazione
Epigenomica – ChIP-chip/ChIP-Seq
Il principio della Chromatin immunoprecipitation è quello
di ISOLARE le porzioni di cromatina che interagiscono con proteine specifiche (in
questo caso ISTONI) dal complesso miscuglio di DNA, attraverso l’uso di ANTICORPI
specifici
Epigenomica – ChIP-chip/ChIP-Seq
ChIP-Seq
Identificando le sequenze, si può capire DOVE si localizzano i gli istoni, quanto è compatta la cromatina, e se queste condizioni cambiano nel tempo o in condizioni diverse
Epigenetica - DamID (DNA adenine methyltransferase identification)
DNA-binding protein as a fusion protein with DNA adenine methyltransferase
localizes the methyltransferase in the region of the binding site Adenosine methylation
Trascrittomica
Modificazioni dell’espressione del DNA, quindi dei livelli di RNA messaggero
• Real Time PCR• Expression Microarrays
Proteomica
Modificazioni del livello delle proteine all’interno di una cellula, e della loro funzione
• Mass Spectrometry• Protein Microarrays
Proteomica – Mass SpectrometryDeterminazione della struttura elementare di un campione o di una molecola (peptidi).Il principio della massa si basa sul diverso rapporto massa/carica dei componenti che
vengono ionizzati e accelerati in un campo elettrico
Ionizzazione: MALDI (matrix-assisted laser
desorption/ionization)
Campo Elettrico Detector
Proteomica – Protein Microarrays
Per determinare la presenza e quantificare la proteina di interesse
in un campione
Esempi di studi Systems Biology
• Epigenetica & Trascrittomica• Genomica & Trascrittomica• Proteomica
Biology today relies heavily on genomic data for hypothesis
building.Replacement from “descriptive science” to “discovery science”
Epigenetica & Trascrittomica
altered epigenetic profiles in human neoplasia
Uso di anticorpi specifici per Citosine metilate
ChIP-chip
Cancer Biol 2009
Genomica & Trascrittomica
Science 2008
Scopo: identificare alterazioni geniche in pazienti con GBM, e la loro associazione con la patologia
Genomica: sequencing Trascrittomica:Microarrays Fisiologia:survival
Isocitrate Dehydrogenase 1_- non associato precedentemente con GBM- altamente mutato in GBM (mutazioni puntiformi G>A)- associato a miglior survival
Proteomica
Proteomica è il metodo di elezione per lo studio delle proteine delle vescicole post-sinaptiche, poiché i profili di espressione non sono in grado di fornire dati
accurati
Identificazione dei complessi con la proteina PSD-95(post-synaptic protein) identificarte 118 proteine
Identificazione dei pathways in cui tali proteine sono coinvolte (schizofrenia)
Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY
Data Sharing Network
Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica
Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY
Data Sharing Network
Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica
Data sharing“omics” reaserach richiede non solo una
strumentazione high-throughput e un team multidisciplinare di biologi, informatici, statistici, ma
richiede anche, e in modo fondamentale, un cambio di prospettiva.
In questa nuova prospettiva assume un ruolo fondamentale il DATA SHARING
• Brain Atlases• Human proteome Project
Allen Brain Atlas
• Mouse Brain• Developing mouse brain• Mouse spianl cord• Human Cortex
http://www.brain-map.org/
In situ Hybridization
Per combinare GENOMICA e NEUROANATOMIA, creando una mappa di
espressione genica nel cervello
GENSAT
GENE EXPRESSION NERVOUS SYSTEM ATLAS
Database pubblico di espressione genica ne SNC di topo allo stato embrionale e nel topo adulto
Basato su bacterial artificial chromosome (BAC)-transgenic reporter mice
Human Brain proteome project
HUPO BPP is an open international project under the patronage of the Human Proteome Organisation (HUPO) that aims:
· to analyze the brain proteome of human as well as mouse models in healthy, neurodiseased and aged status with focus on Alzheimer'sand Parkinson's Disease· to perform quantitative proteomics as well as complemantary gene expression profiling on disease-related brain areas and bodily fluids· to advance knowledge of neurodiseases and aging in order to push new diagnostic approaches and medications· to exchange knowledge and data with other HUPO projects and national / international initiatives in the neuroproteomic field· to make neuroproteomic research and its results available in the scientific community and society
Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY
Data Sharing Network
Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica
Network
SYSTEMS BIOLOGY integra dati che derivano da analisi genetiche, gene
expression, esperimenti di proteomica e neurobiologici
NETWORKSsistemi di unità interconnesse in grado di
interagire e influenzarsi a vicenda
Quando i network sono studiati nel loro insieme, emergono proprietà che non
possono essere derivate dall’analisi individuale dei componenti
WGCNAFrom LISTS of genes… …To networks
WEIGHTED GENE CO-EXPRESSION NETWORK ANALYSIS (WGCNA)
Il profilo di espressione può essere organizzato in networks secondo correlazioni
di espressione
WGCNA: esempio
Nature Neuroscience 2008
Cortical Areas
Caudate Nucleus
Network: esempio di studio di geni coinvolti in Atassia
PROTEOMICA +
BIOINFORMATICA
Identificazione di proteine che
interagiscono con proteine atassia-
specifiche
Identificazione di nuovi partner attraverso lo
studio di database di interazioni
altre 7000 proteine
Identificazione di nuovi pathway
coinvolti in atassia e altre patologie
degenerative
Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY
Data Sharing Network
Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica
Integrating genotypic and phenotypic data
Expression Quantitative Trait Locus (eQTL) analysis
Genotypic Data:SNPs in un campione di pazienti
Phenotypic Data:Espressione Genica
Determinare quali regioni del genoma sono più INDICATIVE di uno stato fisiologico o patologico
Nuovi approcci in SYSTEMS BIOLOGY
Data Sharing Network
Integrazione di dati genotipici e fenotipici Simulazioni e informatica
Simulazioni e Bioinformatica“We’re literally drowning in data. We have lots
of scientists who spend their life working out important details, but we have virtually no idea
how all these details connect together.
Blue Brain is about showing people the whole.”(Henry Markram, director of BBP)
Simulazioni e BioinformaticaBLUE BRAIN PROJECT
- Iniziato nel 2005- Più di 2000 microchips connessi
- 22.800 miliardi di operazioni al secondo
Raggiunto primo traguardo: Simulazione del firing in una colonna neocorticale
(10.000 neuroni/30 milioni di connessioni)
Conclusioni
• Systems Biology è “lo studio delle interazioni e degli interscambi che avvengono a diversi livelli dell’informazione biologica”
• E’ possibile grazie all’avvento di nuove tecniche di throughput e informatiche
Conclusioni
Le scienze “omiche” non andranno a sostituire le scienze riduzionistiche. Gli approcci “omici” offrono
una nuova base su cui le scienze riduzionistiche possono essere fondate, dal momento in cui
permettono di testare molte ipotesi in parallelo e offrono un contesto di ampio respiro per
l’interpretazione dei dati.
