Top Banner
ZWIĄZKI BIOLOGICZNIE CZYNNE POCHODZENIA NATURALNEGO DR INŻ.TOMASZ LASKOWSKI KATEDRA TECHNOLOGII LEKÓW I BIOCHEMII WYDZIAŁ CHEMICZNY POLITECHNIKI GDAŃSKIEJ WYKŁAD DLA SPECJALIZACJI: BIOTECHNOLOGIA LEKÓW
66

Wprowadzenie & metody badawcze

Jan 11, 2017

Download

Documents

vutu
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Wprowadzenie & metody badawcze

ZWIĄZKI BIOLOGICZNIE CZYNNE POCHODZENIA NATURALNEGO

DR INŻ. TOMASZ LASKOWSKI

KATEDRA TECHNOLOGII LEKÓW I BIOCHEMII

WYDZIAŁ CHEMICZNY POLITECHNIKI GDAŃSKIEJ

WYKŁAD DLA SPECJALIZACJI: BIOTECHNOLOGIA LEKÓW

Page 2: Wprowadzenie & metody badawcze

Warunki zaliczenia: Egzamin/kolokwium wykładowe na koniec semestru

Pozytywna ocena z zadania domowego

Konsultacje: Czwartek, 1100-1200

Chemia B, pokój nr 1

Dane kontaktowe: [email protected]

Page 3: Wprowadzenie & metody badawcze

CZĘŚĆ I: PLAN WYKŁADÓW WPROWADZENIE

Page 4: Wprowadzenie & metody badawcze

PLAN WYKŁADÓW

Kawa (co tydzień)

Klasyfikacja związków naturalnych oraz metod badawczych

Omówienie poszczególnych grup związków pod względem:

rangi i występowania biogenezy pełnionych funkcji zastosowania

Przykłady związków naturalnych:

historia biogeneza chemia izolacja badania spektroskopowe

Związki naturalne badane w KTLiB Wydziału Chemicznego PG:

makrolidy polienowe dsDNA, telomerowe DNA, RNA

Page 5: Wprowadzenie & metody badawcze

WPROWADZENIE Czym są związki naturalne?

W najszerszym ujęciu: to wszystkie organiczne oraz nieorganiczne związki chemiczne, które mają jakikolwiek związek z organizmami żywymi (tj. są przez nie wytwarzane bądź pobierane z otoczenia i przetwarzane).

W ujęciu chemii organicznej: to wszystkie metabolity pierwotne (ang. primary metabolites), metabolity wtórne (ang. secondary metabolites) oraz biomakromolekuły występujące w żywych organizmach.

W ujęciu chemii medycznej oraz farmakognozji: to wszystkie metabolity wtórne występujące w żywych organizmach.

Każdy związek występujący w organizmie żywym ma swoją rangę, szlak biogenezy (bądź pobierania z otoczenia), pełni określone funkcje w organizmie i posiada potencjalne zastosowanie.

Page 6: Wprowadzenie & metody badawcze

WPROWADZENIE

RANGA/WYSTĘPOWANIE

biomakromolekuły DNA/RNA

białka/enzymy rybozymy inne (?)

metabolity pierwotne

metabolity wtórne

BIOGENEZA/STRUKTURA

mono-/di-/polisacharydy

aminokwasy/peptydy/białka

lipidy kwasy tłuszczowe

glicerolipidy glicerofosfolipidy

sfingolipidy steroidy

inne

nukleotydy/RNA/DNA

terpeny i terpenoidy monoterpeny (monoterpenoidy)

diterpeny (diterpenoidy) triterpeny (triterpenoidy)

inne

pochodne poliketydów

alkaloidy

flawonoidy

polifenole

…oraz kombinacje, np. saponiny

…i wiele, wiele innych

PEŁNIONE FUNKCJE

energetyczne

strukturalne

przekaźnikowe

sygnałowe (np. feromony)

regulatorowe (np. hormony, stymulanty)

katalityczne (np. kofaktory enzymów)

gromadzenie informacji genetycznej (kwasy nukleinowe)

zapachowe i smakowe

funkcje obronne (np. jady, toksyny, fitoncydy)

zdobywanie przewagi w środowisku (np. antybiotyki)

barwniki

…oraz wiele, wiele innych

…i sporo nadal nieokreślonych

ZASTOSOWANIE

żywieniowe

przemysłowe przemysł tekstylny

przemysł papierniczy barwniki

i tysiąc innych

farmaceutyczne leki pochodzenia roślinnego

antybiotyki suplementy diety i milion innych

…i wiele (ale nie miliard) innych

Związki naturalne można podzielić ze względu na:

Page 7: Wprowadzenie & metody badawcze

WPROWADZENIE UPROSZCZONY SCHEMAT METABOLIZMU LUDZKIEGO TAKŻE TEGO… MIŁEJ NAUKI NA EGZAMIN.

Page 8: Wprowadzenie & metody badawcze

WPROWADZENIE

Page 9: Wprowadzenie & metody badawcze

WPROWADZENIE Uproszczony schemat metabolizmu roślinnego:

metabolity pierwotne

metabolity wtórne

Page 10: Wprowadzenie & metody badawcze

CZĘŚĆ II: METODY BADAWCZE

Page 11: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY BADAWCZE

IZOLACJA

ekstrakcja

modyfikacje chemiczne

metody chromatograficzne

elektroforeza

krystalizacja

IDENTYFIKACJA ORAZ BADANIA STRUKTURALNE

METODY SPEKTROSKOPOWE METODY CHEMICZNE

MS własności fizykochemiczne

NMR, EPR korelacja chemiczna

IR badania kinetyki reakcji

LD metody sekwencjonowania białek i kwasów nukleinowych

UV/VIS, ORD, CD metody enzymatyczne

rentgenografia strukturalna …oraz inne, mniej istotne

Idealny schemat badań związków naturalnych:

Najważniejsze metody izolacji, identyfikacji oraz badań strukturalnych związków naturalnych – zarówno te klasyczne, jak i bardziej nowoczesne:

OBSERWACJA ZJAWISKA IZOLACJA

IDENTYFIKACJA/OKREŚLENIE STRUKTURY

BIOGENEZA EKOLOGIA CHEMICZNA

Page 12: Wprowadzenie & metody badawcze

OBSERWACJA ZJAWISKA Studia nad danym związkiem naturalnym rozpoczynają się od obserwacji zjawiska towarzyszącego spożyciu/zastosowaniu danej substancji.

Na przykład:

wyciąg z kory wierzby łagodzi gorączkę! miażdżenie, a następnie spożycie czosnku przynosi ulgę w przeziębieniu! sproszkowana kora chinowca zmieszana z syropem goździkowym stanowi lekarstwo na

malarię! napar z liści herbaty ma właściwości pobudzające (a napar z owoców kawy pobudza jeszcze

bardziej)! palenie liści tytoniu uzależnia! napar z mięty poprawia trawienie!

Wraz z rozwojem nowoczesnej chemii zauważono, że za aktywnością biologiczną ww. substancji stoją niskocząsteczkowe związki organiczne – związki naturalne: kwas salicylowy, allicyna, chinina, teina i kofeina, nikotyna, mentol, etc.

Obserwacja zjawiska prowadzi do podjęcia wysiłku izolacji związku chemicznego odpowiedzialnego za aktywność biologiczną.

Page 13: Wprowadzenie & metody badawcze

IZOLACJA Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

EKSTRAKCJA

I. Wymywanie substancji zawartej w fazie stałej/materiale biologicznym przy pomocy odpowiedniego rozpuszczalnika.

II. Podział substancji między dwie, niemieszające się fazy ciekłe. III. Ekstrakcja substancji zawartych w materiale biologicznym przy pomocy cieczy w stanie nadkrytycznym

(ang. SF – Supercritical Fluid).

Ad. I: Izolacja kwasu ursolowego z liści szałwii n-heptanem przy pomocy aparatu Soxhleta.

Kwas ursolowy – triterpenoid, pochodna ursanu. Metabolit wtórny m.in. mącznicy lekarskiej (Arctostaphylos uva ursi) i szałwii lekarskiej (Salvia officinalis). Liczne własności farmakologiczne, m.in. przeciwbólowe, przeciwwirusowe, przeciwbakteryjne i przeciwpierwotniakowe.

Page 14: Wprowadzenie & metody badawcze

IZOLACJA Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

EKSTRAKCJA

I. Wymywanie substancji zawartej w fazie stałej/materiale biologicznym przy pomocy odpowiedniego rozpuszczalnika.

II. Podział substancji między dwie, niemieszające się fazy ciekłe. III. Ekstrakcja substancji zawartych w materiale biologicznym przy pomocy cieczy w stanie nadkrytycznym

(ang. SF – Supercritical Fluid).

Ad. I & II: Izolacja eugenolu z goździków przy pomocy eteru naftowego, stężonego roztoru NaHCO3 i wodnego roztworu NaOH.

Eugenol – terpenoid, pochodna gwajakolu. Metabolit wtórny m.in. goździków (Syzygium aromaticum) i cynamonu (Cinnamomum verum). Liczne zastosowania w przemyśle perfumeryjnym (m.in. składnik zapachów orientalnych) oraz dentystycznym (własności antyseptyczne, składnik cementu dentystycznego). Może również służyć jak atraktant owadów.

Eter naftowy – mieszanina izomerów pentanu, heksanu i heptanu o różnych proporcjach; zwana niekiedy lekką benzyną.

Strategia postępowania: 1. Ekstrakcja eterem naftowym (aparat Soxhleta). 2. Ekstrakcja mocnych kwasów stężonym roztworem NaHCO3. 3. Ekstrakcja eugenolu roztworem NaOH.

Page 15: Wprowadzenie & metody badawcze

IZOLACJA Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

EKSTRAKCJA

I. Wymywanie substancji zawartej w fazie stałej/materiale biologicznym przy pomocy odpowiedniego rozpuszczalnika.

II. Podział substancji między dwie, niemieszające się fazy ciekłe. III. Ekstrakcja substancji zawartych w materiale biologicznym przy pomocy cieczy w stanie nadkrytycznym

(ang. SF – Supercritical Fluid).

Ad. III: Wydobywanie tiosulfinatów (m.in. allicyny) z czosnku metodą ekstrakcji CO2 w stanie nadkrytycznym.

Allicyna – tiosulfinat, fitoncyd, pochodna alliiny. Związek powstający w trakcie miażdżenia czosnku (Allium sativum) i cebuli (Allium cepa). Morderca niezliczonych szczepów bakterii, w tym pałeczek cholery, salmonelli, gronkowca złocistego, Helicobacter pylori i pałeczek jadu kiełbasianego.

Stan nadkrytyczny – stan, w którym substancja posiada własności zarówno cieczy, jak i gazu. Dla CO2: TC = 304 K; pC = 7,38 MPa.

Page 16: Wprowadzenie & metody badawcze

IZOLACJA Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

MODYFIKACJE CHEMICZNE

Modyfikacje chemiczne mogą być prowadzone:

na etapie izolacji w celu zmiany (polepszenia) właściwości fizykochemicznych izolowanego związku, aby ułatwić (czasem: umożliwić) proces jego oczyszczania;

na etapie biosyntezy w celu wprowadzenia grupy funkcyjnej, umożliwiającej zastosowanie specjalnej metody oczyszczania (np. chromatografii metalopowinowactwa);

na etapie badań strukturalnych w celu umożliwienia studiów stereochemicznych.

Modyfikacje chemiczne powinny być:

wydajne; proste; odwracalne.

Page 17: Wprowadzenie & metody badawcze

IZOLACJA Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

MODYFIKACJE CHEMICZNE

Na przykład:

Leworyna A1 – składnik kompleksu leworyny, antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, produkowany przez promieniowce Actinomyces levoris. Silne działanie przeciwgrzybicze. Toksyczny dla człowieka.

Strategia modyfikacji: 1. Acetylacja kilkunastoprocentowego kompleksu leworyny bezwodnikiem kwasu octowego (acetylacji ulega wyłącznie grupa aminowa reszty mykozaminy). 2. Tworzenie estru metylowego dzięki reakcji z diazometanem. Cel: obniżenie polarności, większa podatność na ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi.

Page 18: Wprowadzenie & metody badawcze

IZOLACJA Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

MODYFIKACJE CHEMICZNE

Na przykład:

Mentol – terpenoid, metabolit wtórny m.in. mięty pieprzowej (Mentha piperita). Niezliczone zastosowania w przemyśle spożywczym, higienie jamy ustnej i wielu innych. Bardzo aktywny biologicznie - wykazuje zdolność m.in. do aktywacji receptorów odpowiedzialnych za uczucie chłodu.

Strategia modyfikacji: 1. Utworzenie trichloroacetoimidanu 2,3,4,6-tetrabenzylomannozy. 2. Reakcja ww. związku z mentolem w obecności katalitycznych ilości NaH (reakcja Schmidta) w celu utworzenia 2,3,4,6-tetrabenzylomannozydu mentylu. Cel: wprowadzenie sondy chiralnej, możliwość określenia konfiguracji absolutnej aglikonu metodami spektroskopii NMR.

CH3

CH3H3C

O

O

H

BnO

H

BnO

OBn

HH

OBn

Page 19: Wprowadzenie & metody badawcze

IZOLACJA Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

METODY CHROMATOGRAFICZNE

Metody chromatograficzne służą przede wszystkim do rozdziału mieszanin niemożliwych do rozdzielenia innymi metodami (np. ekstrakcja) i są stosowane na końcowym etapie oczyszczania izolowanego związku.

Podstawowe techniki:

chromatografia cienkowarstwowa (TLC); chromatografia cieczowa (kolumnowa); wysoko-sprawna/ultra-sprawna chromatografia cieczowa (HPLC/UPLC).

Przykład:

Piperyna – alkaloid, metabolit wtórny pieprzu czarnego (Piper nigrum). Wykazuje działanie przeciwbakteryjne. Ostry w smaku. Silny stymulant metabolizmu.

Strategia izolacji: 1. Ekstrakcja chloroformem (aparat Soxhleta) – ekstrakt zawiera

wszystkie lipofilowe związki zawarte w pieprzu. 2. Saponifikacja trójglicerydów 10% KOH (50% EtOH w H2O). 3. Krystalizacja surowych kryształów piperyny (niska temp.), oddzielenie

kryształów i rekrystalizacja w układzie Cyklohex:Tol 4:1, v/v.

Page 20: Wprowadzenie & metody badawcze

IZOLACJA Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

METODY CHROMATOGRAFICZNE

Metody chromatograficzne służą przede wszystkim do rozdziału mieszanin niemożliwych do rozdzielenia innymi metodami (np. ekstrakcja) i są stosowane na końcowym etapie oczyszczania izolowanego związku.

Podstawowe techniki:

chromatografia cienkowarstwowa (TLC); chromatografia cieczowa (kolumnowa); wysoko-sprawna/ultra-sprawna chromatografia cieczowa (HPLC/UPLC).

Przykład:

Analiza TLC kryształów (Tol:AcOEt 1:1, v/v) wskazuje, że produkt wcale nie jest czysty! Stwierdza się obecność drugiego stereoizomeru o wyższej polarności (Rf = 0,26; dla piperyny: Rf = 0,53).

Co zrobić? 1. Dobrać układ na kolumnę (obniżyć Rf pożądanego składnika). 2. Chromatografia kolumnowa, dobrany eluent: Tol:AcOEt 2:1, v/v. 3. Efekt: czysta piperyna w postaci bezbarwnych kryształów,

Tt: 127-129 °C.

Page 21: Wprowadzenie & metody badawcze

IZOLACJA Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

ELEKTROFOREZA

Metody elektroforetyczne stosowane są przede wszystkim do analiz oraz rozdziału białek i kwasów nukleinowych, tj. dużych cząsteczek obdarzonych ładunkiem elektrycznym i znacznie różniących się masą.

Podstawowe techniki:

elektroforeza żelowa (DNA, RNA, białka); elektroforeza kapilarna (DNA, peptydy, mniejsze cząsteczki).

Ruchliwość elektroforetyczna – parametr związku poddawanego elektroforezie, zależny od: całkowitego ładunku cząsteczki; masy cząsteczki; kształtu cząsteczki; gęstości żelu; przyłożonego napięcia.

Page 22: Wprowadzenie & metody badawcze

IZOLACJA Celem izolacji danego związku naturalnego jest otrzymanie go w ilości nadającej się do identyfikacji lub badań strukturalnych w możliwie najczystszej postaci.

KRYSTALIZACJA

Krystalizacja stanowi z reguły końcowy etap oczyszczania, poprzedzony licznymi zabiegami ekstrakcji, rozdziału oraz destylacji.

Podstawowe techniki:

ochładzanie roztworu; reakcja chemiczna; zmiana pH roztworu; odparowanie rozpuszczalnika.

Przykłady:

eugenol, po oczyszczeniu i przedestylowaniu, krystalizuje po umieszczeniu w zamrażalniku (Tt = 264 K);

strychnina krystalizuje z roztworu wodnego po dodaniu H2SO4 i węgla aktywnego w postaci siarczanu strychniny (Tt = 277 K); krystalizacja zachodzi w większym stopniu po częściowym odparowaniu rozpuszczalnika pod próżnią;

siarczan strychniny, rozpuszczony w gorącej wodzie z dodatkiem Na2CO3, krystalizuje w postaci czystej strychniny w temperaturze pokojowej.

Page 23: Wprowadzenie & metody badawcze

IDENTYFIKACJA Jeżeli oczyszczony związek naturalny jest znany, zostaje poddany identyfikacji.

Podstawowe techniki identyfikacji związków polegają zazwyczaj na porównaniu właściwości fizykochemicznych do wartości referencyjnych, takich jak:

skręcalność optyczna; temperatura topnienia/wrzenia; gęstość (w przypadku cieczy); masa cząsteczkowa (spektrometria mas); czas retencji z kolumny (HPLC) lub współczynnik retencji (TLC).

Obecnie, bardzo często do identyfikacji związków stosuje się „szybkie” techniki spektroskopowe:

widma 1D NMR (1H, 13C, 31P); widma w bliskiej podczerwieni (tzw. „fingerprint”); widma UV; widma CD.

Page 24: Wprowadzenie & metody badawcze

Jeżeli oczyszczony związek naturalny nie jest znany, kolejny etap badań polega na ustaleniu jego struktury (konstytucji) oraz stereostruktury (stereochemii, struktury wyższych rzędów w przypadku białek, etc.)

WSTĘP: KLASYFIKACJA METOD

Metody badań strukturalnych można z grubsza podzielić na dwa główne rodzaje.

Metody chemiczne:

badania kinetyki reakcji; korelacja chemiczna; sekwencjonowanie białek i kwasów nukleinowych.

Metody spektroskopowe:

spektrometria mas, MS (bombardowanie atomami, jonami, elektronami, fotonami, etc.) magnetyczny rezonans jądrowy, NMR (fale radiowe); elektronowy rezonans paramagnetyczny, EPR (mikrofale); spektroskopia w podczerwieni, IR; dichroizm liniowy, LD (podczerwień, ultrafiolet); spektroskopia UV/VIS; dyspersja skręcalności optycznej, ORD (podczerwień, światło widzialne, ultrafiolet); dichroizm kołowy, CD (ultrafiolet); rentgenografia strukturalna (promienie X).

BADANIA STRUKTURALNE

Page 25: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY CHEMICZNE: BADANIA KINETYKI REAKCJI

Pewne reakcje chemiczne, np. estryfikacji, mogą zachodzić z różną szybkością w zależności od stereochemii badanego związku.

Przykład z historii:

Struktura mentolu jest znana od roku 1891 (Semmler i wsp.). Olejek z mięty japońskiej (Mentha arvensis) zawiera mieszaninę dwóch diastereoizomerów, znanych dzisiaj jako (-)-mentol i (+)-neomentol. Jak się okazało, różnią się one konfiguracją na węglu 1, zawierającym grupę –OH.

BADANIA STRUKTURALNE

Mentol Mieszanina (-)-mentolu i (+)-neomentolu

CH3

H3C CH3

OH*

*

*

iPrCH3HO

iPrCH3

OH

W jaki sposób określić orientację (aksjalną vs. ekwatorialną) grupy hydroksylowej w każdym z tych diastereoizomerów?

Page 26: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY CHEMICZNE: BADANIA KINETYKI REAKCJI

Pewne reakcje chemiczne, np. estryfikacji, mogą zachodzić z różną szybkością w zależności od stereochemii badanego związku.

Przykład z historii:

Grupy hydroksylowe w pozycji aksjalnej oraz ekwatorialnej ulegają reakcji estryfikacji z różną szybkością. Pozycje ekwatorialne są zazwyczaj estryfikowane szybciej, niż analogiczne pozycje aksjalne.

BADANIA STRUKTURALNE

(-)-mentol: szybko!

Wnioski: (-)-mentol ulega estryfikacji szybko → grupa –OH w pozycji ekwatorialnej! (+)-Neomentol ulega reakcji wolno lub wcale → grupa –OH w pozycji aksjalnej!

(+)-neomentol: wolno! (-)-mentol: szybko! (+)-neomentol: brak reakcji!

iPrCH3HO

iPrCH3

OH

iPrCH3EtO2C

iPrCH3

OH

Cl OEt

O

iPrCH3HO

iPrCH3

OH

iPrCH3AcO

iPrCH3

OAc

Cl

O

Page 27: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA

Metody korelacji chemicznej zakładają dwa, główne podejścia:

1. degradacja badanego związku naturalnego lub utworzenie jego pochodnej w celu otrzymania związku(-ów) o identycznych własnościach fizykochemicznych w porównaniu do już poznanych struktur – analiza organiczna;

2. założenie konstytucji badanego związku naturalnego, a następnie synteza założonej struktury ab initio z dobrze poznanych substratów – synteza totalna.

Jaskrawy przykład analizy organicznej (Haarmann-Tiemann, 1874):

BADANIA STRUKTURALNE

WANILINA domniemana struktura

HCl / H2O

OH

OH

O OHO O-

O-

O-

NaOH, KOH

463 - 518 K

O H

OH

OCH3

KWAS PROTOKATECHOWY substancja o znanej strukturze

Page 28: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA

Synteza totalna:

I. założenie konstytucji i stereostruktury badanego związku naturalnego na podstawie prowadzonych badań, np.: skład elementarny, stopień nienasycenia; temperatura wrzenia i topnienia; czynność optyczna; wyniki prostych doświadczeń (np. odbarwianie wody bromowej, kwasowość/zasadowość, świecenie

pod lampą UV, etc.); degradacja chemiczna (np. ozonoliza) i/lub tworzenie pochodnych.

II. synteza założonej struktury z łatwo dostępnych i dobrze poznanych substratów; w przypadku związków optycznie czynnych synteza musi być stereospecyficzna lub otrzymana

mieszanina racemiczna musi zostać rozdzielona; III. porównanie właściwości fizykochemicznych otrzymanego związku z wyizolowanym

związkiem naturalnym.

Pełna zgodność własności fizykochemicznych syntetycznej wersji związku i wersji naturalnej stanowi dowód poprawności założonej struktury.

BADANIA STRUKTURALNE

Page 29: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA

Synteza totalna – przykład (Haarmann-Tiemann, 1874):

BADANIA STRUKTURALNE

WANILINA tą reakcją Harmann i Tiemann potwierdzili

strukturę waniliny

KONIFERYNA glukozyd alkoholu koniferynowego, substrat ligniny, izolowany z roślin

iglastych; znana struktura

H+

OH

OCH3

O HO H

O

OCH3

K2Cr2O7

OCH3

HO

O

H

HO

H

HO

H

HOHH

O

OH

Glu

Page 30: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA

Synteza totalna – przykład (Reimer, 1876):

BADANIA STRUKTURALNE

OH

OCH3

O H

CHCl3

OH

OCH3

KOH

GWAJAKOL WANILINA

OH

CHCl3

KOH

OH

H

O

Fenol Aldehyd salicylowy

Reakcja Reimera-Tiemanna

Aldehyd salicylowy – metabolit wtórny m.in. gryki zwyczajnej (Fagopyrum esculentum) oraz, uwaga, bobra europejskiego. Stanowi jeden ze składników kastoreum, wysoko cenionej wydzieliny bobra z gruczołów wstydliwych, stosowanej w przemyśle perfumeryjnym oraz żywnościowym. Kastoreum miało być również jednym ze składników mitycznego panaceum.

Page 31: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA

Synteza totalna – przykład (Reimer-Erlenmeyer, 1876):

BADANIA STRUKTURALNE

OH

OCH3

CH3

OH

OCH3

O H

H3C H

O

+

O3

Mieszanina aldehydu octowego i WANILINY w stosunku 1:1

IZOEUGENOL izomer eugenolu

OH

OCH3

EUGENOL znany i lubiany

KOH

Ciekawostka! W 2007 roku przyznano Anty-Nobla za otrzymanie waniliny z krowiego łajna.

Page 32: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY CHEMICZNE: KORELACJA CHEMICZNA

Synteza totalna – inne przykłady:

BADANIA STRUKTURALNE

Strychnina Izolacja: Palletier & Caventon, 1818; Struktura: Robinson; 1946; Synteza: Woodward; 1954.

Cholesterol Izolacja: Windaus, 1909; Struktura: Wielanc; 1932; Synteza: Robinson, Woodward (doniesienie równoległe); 1952.

Page 33: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY CHEMICZNE: SEKWENCJONOWANIE BIAŁEK I KWASÓW NUKLEINOWYCH

Chemiczne metody sekwencjonowania białek i kwasów nukleinowych polegają na degradacji lub syntezie badanej biomakromolekuły.

Dla białek:

degradacja Edmana – reakcja izotiocyjanianu fenylu (Ph-N=C=S) z N-terminalnym aminokwasem i analiza chromatograficzna produktów rozpadu, wydajność << 100%.

Do ustalania sekwencji aminokwasowej białek i peptydów jest obecnie stosowana przede wszystkim spektrometria mas (nie można odróżnić: leucyny od izoleucyny oraz lizyny od glutaminy).

Dla kwasów nukleinowych:

sekwencjonowanie Sangera – reakcja syntezy (PCR) DNA/RNA z dodatkiem ddNTP (2’,3’-dideoksynukleotydotrifosforanów); dodatek ten powoduje syntezę nici o wszystkich, możliwych długościach i zakończonych jednym z czterech możliwych ddNTP; analiza – rozdział elektroforetyczny produktów reakcji;

metoda Maxama-Gilberta – reakcja degradacji DNA znakowanego izotopem 32P na końcu 5’ przy użyciu czterech, różnych odczynników, modyfikujących zasady azotowe (G, G+A, C, C+T); obecnie rzadko stosowana;

inne.

BADANIA STRUKTURALNE

Page 34: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROMETRIA MAS (MS)

Spektrometria mas jest zaliczana do metod spektroskopowych, ponieważ jako wynik zastosowania tej metody badawczej otrzymuje się widma (ang. spectra).

Podstawowe różnice pomiędzy różnymi odmianami spektrometrii mas pojawiają się na etapie 3 , tj. jonizacji (bombardowanie elektronami, atomami, jonami, fotonami, etc.).

BADANIA STRUKTURALNE

Page 35: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROMETRIA MAS (MS)

Niektóre metody jonizacji (np. FAB, EI, LD) powodują fragmentację powstałych jonów molekularnych.

Widma masowe powstałe w wyniku fragmentacji cząsteczek stanowią doskonałe narzędzie do badań strukturalnych.

BADANIA STRUKTURALNE

Page 36: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY (NMR)

Spektroskopia NMR opiera się na zjawisku absorpcji promieniowania elektromagnetycznego o częstotliwości radiowej przez jądra atomowe obdarzone momentami magnetycznymi.

I. Badaną próbkę umieszcza się w silnym, zewnętrznym polu magnetycznym, w którym różnicują się energie spinów jądrowych.

II. Dla jąder o spinowej liczbie kwantowej I = ½ (np. 1H, 13C, 15N, 31P, etc.), ilość dozwolonych orientacji w silnym, zewnętrznym polu magnetycznym wynosi 2, zgodnie ze wzorem N = 2I + 1.

III. Wzbudzenie jądra atomowego następuje w wyniku absorpcji kwantu energii E = hν, gdzie ν – kilkadziesiąt lub kilkaset MHz.

BADANIA STRUKTURALNE

Page 37: Wprowadzenie & metody badawcze

B0 Transmiter hυL

v [Hz]

BADANIA STRUKTURALNE METODY SPEKTROSKOPOWE: MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY (NMR)

Mechanizm powstawania sygnału rezonansowego:

Page 38: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY (NMR)

Częstotliwość rezonansowa danego jądra zależy od:

typu badanego jądra (czyli rodzaju pierwiastka chemicznego); mocy aparatu (tj. natężenia pola magnetycznego porządkującego spiny badanych jąder); jego otoczenia chemicznego, czyli indukcji lokalnego pola magnetycznego, zależnej od ilości oraz typu

atomów sąsiadujących.

Niewielkie różnice w częstotliwościach rezonansowych jąder tego samego pierwiastka sprawiają, że generują one sygnały rezonansowe w różnych miejscach osi częstotliwości, co umożliwia zastosowanie spektroskopii NMR do celów praktycznych.

BADANIA STRUKTURALNE

A

A B

B

C

C D

D

E E

Page 39: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY (NMR)

Najważniejsze dwuwymiarowe eksperymenty NMR:

GCOSY; DQF-COSY; TOCSY; HSQC; HMBC; HETCOR; NOESY; ROESY.

BADANIA STRUKTURALNE

STRYCHNINA GCOSY

Page 40: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: ELEKTRONOWY REZONANS PARAMAGNETYCZNY (EPR)

Spektroskopia EPR opiera się na tych samych fundamentach teoretycznych, co spektroskopia NMR – z tą różnicą, że wzbudzaniu ulegają spiny elektronów, a nie jąder atomowych.

I. Próbka umieszczana jest w silnym, zewnętrznym polu magnetycznym, którego wymagane natężenie jest dużo niższe, niż dla zjawiska magnetycznego rezonansu jądrowego.

II. Spiny elektronowe wzbudzane są kwantami promieniowania elektromagnetycznego o około 1000-krotnie wyższej energii, niż w przypadku spinów jądrowych, co oznacza, że częstotliwości rezonansowe elektronów odpowiadają promieniowaniu mikrofalowemu, a nie radiowemu.

Zasadniczym ograniczeniem techniki EPR jest fakt, że obserwowalnemu wzbudzeniu mogą ulegać wyłącznie elektrony niesparowane. Oznacza to, że związki badane przy pomocy spektroskopii rezonansu elektronowego muszą być: wolnymi rodnikami; kompleksami z paramagnetycznymi jonami metali.

BADANIA STRUKTURALNE

Page 41: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI (IR)

Spektroskopia IR opiera się na fakcie, iż częstotliwości promieniowania elektromagnetycznego z zakresu podczerwieni odpowiadają częstotliwościom drgań własnych wiązań atomowych (zjawisko rezonansu).

W co najmniej kilkuatomowych cząsteczkach może wystąpić kilka rodzajów drgań:

rozciągające symetryczne i asymetryczne; nożycowe; wahadłowe; deformacyjne poza płaszczyznę; skręcające.

Częstotliwość rezonansowa (liczba falowa) określonego typu drgań danego wiązania chemicznego zależy od typu atomów tworzących wiązanie oraz ich otoczenia chemicznego.

Zakres widma IR poniżej 1000 cm-1 jest unikalny dla danego związku chemicznego i może służyć do jego szybkiej identyfikacji (tzw. fingerprint).

BADANIA STRUKTURALNE

Page 42: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI (IR)

Spektroskopia IR; fingerprint – przykład:

BADANIA STRUKTURALNE

IZOEUGENOL

EUGENOL

Page 43: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI (IR)

Spektroskopia IR – przykład:

BADANIA STRUKTURALNE

Page 44: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: DICHROIZM LINIOWY (LD)

Technika dichroizmu liniowego polega na pomiarze różnicy absorpcji przez molekułę spolaryzowanego liniowo promieniowania elektromagnetycznego (UV, VIS, IR) w kierunku równoległym (A║) oraz prostopadłym (A┴) do orientacji (osi) badanej cząsteczki.

Warunek – makroskopowa orientacja cząsteczek w próbce:

kryształ;

… a jeżeli nie dysponujemy kryształem, orientację należy wymusić, np. poprzez:

rozciąganie folii polimerowej; naprężenia ścinające w przepływie laminarnym; zewnętrze pole elektryczne/magnetyczne, etc.

Należy jednak pamiętać, że wymuszona orientacja cząsteczek nigdy nie jest całkowita, a jej stopień zależy od kształtu badanych molekuł – najłatwiej orientacji ulegają cząsteczki długie i stosunkowo sztywne.

Ogólne równanie dichroizmu liniowego: LD = A║ - A┴

BADANIA STRUKTURALNE

Page 45: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: DICHROIZM LINIOWY (LD)

Dichroizm liniowy – przykład:

BADANIA STRUKTURALNE

Dla DNA: LD = A║ - A┴ < 0 Zastosowania: rozróżnienie form DNA w roztworze (A, B, Z); śledzenia zmian strukturalnych w roztworze; śledzenie zjawiska kompleksowania z ligandami. A║ ≈ 0

A ┴ > 0

Page 46: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA ABSORPCJI ELEKTRONOWEJ – UV/VIS, DYSPERSJA SKRĘCALNOŚCI OPTYCZNEJ (ORD), DICHROIZM KOŁOWY (CD)

Jedne z pierwszych metod spektroskopowych, stosowanych w badaniach strukturalnych związków organicznych.

UV/VIS

Technika służy przede wszystkim stwierdzeniu obecności chromoforów w strukturze, zwłaszcza sprzężonych; np. fragmentów aromatycznych, dienów i polienów, ketonów α,ß-nienasyconych, etc.

Widmo UV/VIS prezentuje stopień absorpcji izotropowego promieniowania elektromagnetycznego w funkcji długości fali.

Metoda niewrażliwa na czynność optyczną, tj. widma enancjomerów tego samego związku są identyczne.

Położenie maksimum/ów absorpcji dla danego chromoforu zależy od jego otoczenia chemicznego.

BADANIA STRUKTURALNE

Chromofor Przykład związku λmax (nm)

C=C 1-heksen 180

-C≡C- 1-butyn 172

fenyl toluen 261, 206.5

C=O acetaldehyd

aceton kamfora

298, 182 275, 290

295

-COOH kwas octowy 204

Page 47: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA ABSORPCJI ELEKTRONOWEJ – UV/VIS, DYSPERSJA SKRĘCALNOŚCI OPTYCZNEJ (ORD), DICHROIZM KOŁOWY (CD)

Jedne z pierwszych metod spektroskopowych, stosowanych w badaniach strukturalnych związków organicznych.

UV/VIS

Technika służy przede wszystkim stwierdzeniu obecności chromoforów w strukturze, zwłaszcza sprzężonych; np. fragmentów aromatycznych, dienów i polienów, ketonów α,ß-nienasyconych, etc.

Widmo UV/VIS prezentuje stopień absorpcji izotropowego promieniowania elektromagnetycznego w funkcji długości fali.

Metoda niewrażliwa na czynność optyczną, tj. widma enancjomerów tego samego związku są identyczne.

Położenie maksimum/ów absorpcji dla danego chromoforu zależy od jego otoczenia chemicznego.

BADANIA STRUKTURALNE

Leworyna A1; λmax (nm): 360, 378, 401

Page 48: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA ABSORPCJI ELEKTRONOWEJ – UV/VIS, DYSPERSJA SKRĘCALNOŚCI OPTYCZNEJ (ORD), DICHROIZM KOŁOWY (CD)

Jedne z pierwszych metod spektroskopowych, stosowanych w badaniach strukturalnych związków organicznych.

ORD (OPTICAL ROTATORY DISPERSION)

Technika służy do badań stereostrukturalnych związków optycznie czynnych. Podstawą metody jest różnica we współczynnikach załamania światła spolaryzowanego kołowo w

lewą i prawą stronę przechodzącego przez układ asymetryczny. Widmo ORD prezentuje skręcalność molową danego związku w funkcji długości fali.

BADANIA STRUKTURALNE

Page 49: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA ABSORPCJI ELEKTRONOWEJ – UV/VIS, DYSPERSJA SKRĘCALNOŚCI OPTYCZNEJ (ORD), DICHROIZM KOŁOWY (CD)

Jedne z pierwszych metod spektroskopowych, stosowanych w badaniach strukturalnych związków organicznych.

CD (CIRCULAR DICHROISM)

Technika służy do badań stereostrukturalnych związków optycznie czynnych. Podstawą metody jest różnica w absorpcji światła spolaryzowanego kołowo w lewą i prawą

stronę przez zaburzony chiralnie chromofor (efekt Cottona; Δε = εL - εR). Widmo CD prezentuje zazwyczaj różnicę molowego współczynnika absorpcji światła

spolaryzowanego kołowo w lewo oraz w prawo danego związku w funkcji długości fali.

BADANIA STRUKTURALNE

Page 50: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: SPEKTROSKOPIA ABSORPCJI ELEKTRONOWEJ – UV/VIS, DYSPERSJA SKRĘCALNOŚCI OPTYCZNEJ (ORD), DICHROIZM KOŁOWY (CD)

BADANIA STRUKTURALNE

Page 51: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: RENTGENOGRAFIA STRUKTURALNA

Rentgenografia strukturalna bada zjawisko rozpraszania (ugięcia) promieni Röntgena przez kryształy i służy do ustalania koordynatów atomów należących do badanej struktury w trójwymiarowej przestrzeni.

Kryształ można potraktować jako nieskończony układ powtarzających się, identycznych kopii badanej molekuły, w którym – ze względu na symetrię kryształu oraz jednakową orientację cząsteczek w przestrzeni – występują powtarzające się regularnie płaszczyzny o dużej gęstości elektronowej, na których dochodzi do silnego ugięcia promieniowania X.

BADANIA STRUKTURALNE

Page 52: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: RENTGENOGRAFIA STRUKTURALNA

Przy niektórych kątach padania promieniowanie rozproszone na kolejnych płaszczyznach sumuje się, dając tzw. refleksy. Podczas pomiaru rejestruje się intensywności oraz kierunki refleksów w przestrzeni, przy czym obydwie te wielkości zależą od:

symetrii i wielkości komórki elementarnej monokryształu; rozmieszczenia atomów w komórce elementarnej.

BADANIA STRUKTURALNE

Page 53: Wprowadzenie & metody badawcze

METODY SPEKTROSKOPOWE: RENTGENOGRAFIA STRUKTURALNA

W efekcie możliwe jest odtworzenie trójwymiarowej mapy gęstości elektronowej, wskazującej pozycje ciężkich atomów (atomy wodoru nie są obserwowane). Przy użyciu technik obliczeniowych, do uzyskanej mapy dopasowywana jest struktura badanej molekuły.

Rentgenografia strukturalna jest jedną z dwóch najważniejszych technik (obok NMR), która pozwala na ustalanie stereostruktur istotnych biologicznie cząsteczek.

BADANIA STRUKTURALNE

Page 54: Wprowadzenie & metody badawcze

BIOGENEZA Badanie biogenezy oznacza studia nad ścieżką biosyntezy danego związku przez organizm go produkujący.

Szlak metaboliczny składa się z szeregu reakcji katalizowanych przez enzymy. Są to te same reakcje, które jesteśmy w stanie zaobserwować w laboratorium chemicznym:

utlenianie; redukcja; alkilowanie; hydroliza; addycja; eliminacja; inne.

Zasadnicza różnica polega na tym, że enzymy przyspieszają te reakcje od miliarda do biliona razy oraz wykazują dużą specyficzność w stosunku do substratu.

W reakcjach tych enzymom towarzyszą kofaktory i koenzymy. Specyficzność działania takiego układu polega na przestrzennym usytuowaniu substratu, kofaktora i koenzymu przy centrym aktywnym enzymu.

Page 55: Wprowadzenie & metody badawcze

BIOGENEZA Badanie biogenezy oznacza studia nad ścieżką biosyntezy danego związku przez organizm go produkujący.

Badania biogenezy – przykład:

Poliketydy to związki naturalne produkowane przede wszystkim przez bakterie, grzyby i porosty. Są prekursorami wielu metabolitów wtórnych i pochodzą od tzw. jednostki octanowej (reszty kwasu octowego, transportowanej przez koenzym A, tj. AcCoA). Biogeneza tych związków nie była znana do roku 1953, kiedy Birch wysunął hipotezę octanową. Później okazało się jednak, że do rozbudowy łańcucha poliketydowego potrzebne są również jednostki malonianowe.

W biosyntezie poliketydów można wyróżnić cztery etapy:

1) Rozbudowa łańcucha poliketydowego. 2) Ewentualne modyfikacje łańcucha – utlenianie, redukcja i alkilowanie.

H3C

SCoA

O

H2C

SCoA

O

CO2-

+ CH3CCH2CSCoA

O O

+ CO2

Page 56: Wprowadzenie & metody badawcze

BIOGENEZA Badanie biogenezy oznacza studia nad ścieżką biosyntezy danego związku przez organizm go produkujący.

Badania biogenezy – przykład:

Poliketydy to związki naturalne produkowane przede wszystkim przez bakterie, grzyby i porosty. Są prekursorami wielu metabolitów wtórnych i pochodzą od tzw. jednostki octanowej (reszty kwasu octowego, transportowanej przez koenzym A, tj. AcCoA). Biogeneza tych związków nie była znana do roku 1953, kiedy Birch wysunął hipotezę octanową. Później okazało się jednak, że do rozbudowy łańcucha poliketydowego potrzebne są również jednostki malonianowe.

W biosyntezie poliketydów można wyróżnić cztery etapy:

1) Rozbudowa łańcucha poliketydowego. 2) Ewentualne modyfikacje łańcucha – utlenianie, redukcja i alkilowanie. 3) Stabilizacja łańcucha poprzez cyklizację wewnątrzcząsteczkową. 4) Wtórne modyfikacje grup funkcyjnych.

O

CH3

O O

COSE-

H+

O O

COSE

H3C OH

- H2O

O O

COSE

CH3

+ CoASH

enolizacja

HO OH

COSCoA

CH3

HO OH

COOH

CH3

hydroliza

KWAS ORSELINOWY

Page 57: Wprowadzenie & metody badawcze

BIOGENEZA Badanie biogenezy oznacza studia nad ścieżką biosyntezy danego związku przez organizm go produkujący.

Badania biogenezy – przykład:

Skąd wiadomo, że tak to wygląda w rzeczywistości, a hipoteza octanowa nie jest jedynie hipotezą?

Widmo 13C NMR kwasu orselinowego:

Page 58: Wprowadzenie & metody badawcze

BIOGENEZA Badanie biogenezy oznacza studia nad ścieżką biosyntezy danego związku przez organizm go produkujący.

Badania biogenezy – przykład:

Szczep Penicillium, jeden z producentów kwasu orselinowego, został wyhodowany na pożywce wzbogaconej 1-13C octanem sodu.

Jeżeli proponowana ścieżka biosyntezy jest poprawna, izotopy węgla 13C powinny wbudować się w kwas orselinowy w pozycjach 2, 4, 6 oraz 8.

H3C

SCoA

O

H2C

SCoA

O

CO2-

+ CH3CCH2CSCoA

O O

+ CO2

O

CH3

O O

COSE-

H+

O O

COSE

H3C OH

- H2O

O O

COSE

CH3

+ CoASH

enolizacja

HO OH

COSCoA

CH3

HO OH

COOH

CH3

hydroliza

H3C

SCoA

O

H2C

SCoA

O

CO2-

+ -O2C BCCP **

* * * *

H2C

SCoA

O

CO2-

*+2

*

* *

*

* *

*

* *

*

**

* *

**

** * *

Page 59: Wprowadzenie & metody badawcze

BIOGENEZA Badania biogenezy – przykład:

*

*

*

*

Page 60: Wprowadzenie & metody badawcze

BIOGENEZA Badanie biogenezy oznacza studia nad ścieżką biosyntezy danego związku przez organizm go produkujący.

Badania biogenezy – przykład:

Szczep Penicillium, jeden z producentów kwasu orselinowego, został wyhodowany na pożywce wzbogaconej 1-13C octanem sodu.

Obserwacje z widma 13C NMR:

Cztery, dominujące sygnały od wbudowanych izotopów 13C. Znakowany był wyłącznie węgiel karbonylowy w octanie sodu.

Przesunięcia chemiczne sygnałów rezonansowych odpowiadają przesunięciom chemicznym sygnałów węgli 2, 4, 6 oraz 8 w widmie nieznakowanego kwasu orselinowego.

Wnioski:

1. Kwas orselinowy składa się z czterech jednostek octanowych. 2. Wciąż jednak nie wiadomo, czy w biosyntezie może wziąć udział jednostka malonianowa,

która została pobrana z otoczenia.

Page 61: Wprowadzenie & metody badawcze

BIOGENEZA Badanie biogenezy oznacza studia nad ścieżką biosyntezy danego związku przez organizm go produkujący.

Badania biogenezy – przykład:

Szczep Penicillium, jeden z producentów kwasu orselinowego, został wyhodowany na pożywce wzbogaconej 2-13C malonianem sodu.

Jeżeli proponowana ścieżka biosyntezy jest poprawna, izotopy węgla 13C powinny wbudować się w kwas orselinowy w pozycjach 1, 3 oraz 5.

H3C

SCoA

O

H2C

SCoA

O

CO2-

+ CH3CCH2CSCoA

O O

+ CO2

O

CH3

O O

COSE-

H+

O O

COSE

H3C OH

- H2O

O O

COSE

CH3

+ CoASH

enolizacja

HO OH

COSCoA

CH3

HO OH

COOH

CH3

hydroliza

**

H2C

SCoA

O

CO2-

*+2

**

*

**

*

**

*

**

*

**

*

Page 62: Wprowadzenie & metody badawcze

BIOGENEZA Badania biogenezy – przykład:

*

*

*

Page 63: Wprowadzenie & metody badawcze

BIOGENEZA Badanie biogenezy oznacza studia nad ścieżką biosyntezy danego związku przez organizm go produkujący.

Badania biogenezy – przykład:

Szczep Penicillium, jeden z producentów kwasu orselinowego, został wyhodowany na pożywce wzbogaconej 1-13C octanem sodu.

Obserwacje z widma 13C NMR:

Trzy, dominujące sygnały od wbudowanych izotopów 13C. Znakowany był wyłącznie węgiel metylenowy w malonianie sodu.

Przesunięcia chemiczne sygnałów rezonansowych odpowiadają przesunięciom chemicznym sygnałów węgli 1, 3 oraz 5 w widmie nieznakowanego kwasu orselinowego.

Wnioski:

1. Kwas orselinowy składa się z jednej jednostki octanowej oraz trzech jednostek malonianowych.

2. Szczep Penicillum syntezuje kwas orselinowy z takich substratów, jakie akurat ma pod nibynóżką.

Page 64: Wprowadzenie & metody badawcze

DUUUŻO WIEDZY

EKOLOGIA CHEMICZNA Ekologia chemiczna to stosunkowo młoda dziedzina nauki z pogranicza biologii i chemii, która bada chemiczne oddziaływania między organizmami żywymi oraz między organizmami i ich środowiskiem.

Ekologia chemiczna dotyczy przede wszystkim metabolitów wtórnych.

W idealnym schemacie badania związków naturalnych:

… na etapie badań ekologii chemicznej wracamy tak naprawdę do etapu obserwacji zjawiska, ale wyposażeni w mnóstwo wiedzy, której nie posiadaliśmy na początku.

Wiedza ta pozwala na wytłumaczenie ekologicznego sensu obserwowanego zjawiska; inaczej mówiąc: poznajemy celowość produkcji danego metabolitu wtórnego.

OBSERWACJA ZJAWISKA IZOLACJA

IDENTYFIKACJA/OKREŚLENIE STRUKTURY

BIOGENEZA EKOLOGIA CHEMICZNA

Page 65: Wprowadzenie & metody badawcze

EKOLOGIA CHEMICZNA Ekologia chemiczna to stosunkowo młoda dziedzina nauki z pogranicza biologii i chemii, która bada chemiczne oddziaływania między organizmami żywymi oraz między organizmami i ich środowiskiem.

Ekologia chemiczna – przykłady:

Po wyizolowaniu, poznaniu struktury i przestudiowaniu biogenezy allicyny, związku odpowiedzialnego za bakteriobójcze właściwości czosnku, okazało się, że związek ten powstaje podczas miażdżenia ząbków czosnku (więcej informacji podczas kolejnych wykładów).

Wniosek: allicyna pełni funkcję obronną, uruchamianą w przypadku fizycznego uszkodzenia rośliny.

Po przebadaniu kofeiny okazało się, że związek ten działa paraliżująco, a niekiedy zabójczo na owady żerujące na roślinach liściastych. Bardzo wysokie stężenie kofeiny zaobserwowano w rozwijających się liściach młodych roślin, a niekiedy nawet w glebie otaczającej kiełkującą roślinę.

Wniosek: kofeina jest naturalnym pestycydem, który osiąga najwyższe stężenia w elementach rośliny pozbawionych ochrony mechanicznej, a także na wczesnym etapie rozwoju, kiedy roślina stanowi łatwy łup dla owadów.

Page 66: Wprowadzenie & metody badawcze

EKOLOGIA CHEMICZNA Ekologia chemiczna to stosunkowo młoda dziedzina nauki z pogranicza biologii i chemii, która bada chemiczne oddziaływania między organizmami żywymi oraz między organizmami i ich środowiskiem.

Ekologia chemiczna – przykłady:

Badania biogenezy i mechanizmu działania tetrahydrokannabinolu, substancji psychoaktywnej zawartej w liściach konopii, doprowadziła do odkrycia endokannabinoidów, nowego typu cząsteczek sygnałowych i neuroprzekaźników. Zauważono ponadto, że THC świetnie absorbuje promieniowanie UV (więcej informacji podczas kolejnych wykładów).

Wniosek: THC pełni prawdopodobnie funkcję obronną przed roślinożercami, polegającą na „ogłuszeniu” spożywającego (!), a także – znowuż prawdopodobnie – funkcję ochronną przed nadmiarem promieniowania UV.