UNIVERSIDADE NILTON LINS INSTITUTO NACIONAL DE …pgaquicultura.inpa.gov.br/pgaquicultura/images/Marieta Queiroz.pdf · UNIVERSIDADE NILTON LINS ... Manaus, Amazonas Junlho, 2012.

UNIVERSIDADE NILTON LINS

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA

EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DA Piper aduncum L NO CONTROLE DE

PARASITAS MONOGENÉTICOS (PLATHYHELMINTHES: MONOGENOIDEA) E

PARÂMETROS FISIOLÓGICOS DO PIRARUCU, Arapaima gigas SCHINZ 1822

MARIETA NASCIMENTO DE QUEIROZ

Manaus, Amazonas

Julho, 2012

MARIETA NASCIMENTO DE QUEIROZ

EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DA Piper aduncum L NO CONTROLE DE

PARASITAS MONOGENÉTICOS (PLATHYHELMINTHES: MONOGENOIDEA) E

PARÂMETROS FISIOLÓGICOS DO PIRARUCU, Arapaima gigas SCHINZ 1822

ORIENTADORA: ELIZABETH GUSMÃO AFFONSO

Dissertação apresentada a UniNilton

Lins/INPA como parte dos requisitos

para obtenção do título de Mestre em

Aquicultura

Manaus, Amazonas

Junlho, 2012

iii

Sinopse:

O estudo verificou o efeito do extrato aquoso de Piper aduncum L sobre os

parâmetros fisiológicos de pirarucu Arapaima gigas e avaliou sua eficácia sobre os

parasitos monogenéticos dessa espécie.

Palavras-chave:

Fitoterapia, hematologia, parasitologia, peixes.

Q42 Queiroz, Marieta Nascimento.

Efeito do extrato aquoso da Piper aduncum L no controle de parasitas

monogenéticos (Plathyhelminthes: Monogenoidea) e parâmetros fisiológicos do

pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822 / Marieta Nascimento de Queiroz. –

Manaus: UNL / INPA, 2012.

83. 30 cm.

Dissertação (Mestrado em Aquicultura) – Universidade Nilton Lins / Instituto

Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, 2012.

Orientadora: Elizabeth Gusmão Affonso

1. Fitoterapia. 2. Fisiologia. 3. Parasitologia. I. Título. II. Universidade Nilton Lins /

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.

CDU 639.3.09

iv

DEDICATÓRIA

Dedico esta conquista aos

meus pais Raimunda e Romeu

Queiroz e aos meus irmãos

v

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos mediada pelo Edital Nº 025/2010

durante o período de realização do mestrado.

A Universidade Nilton Lins e ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pela

oportunidade através do curso de Pós-graduação em Aquicultura, pela

disponibilidade da infraestrutura para a realização deste trabalho.

À pesquisadora Dra. Elizabeth Gusmão Affonso, pela orientação, dedicação e

compreensão diante às minhas dificuldades e, principalmente, pela

oportunidade e confiança durante o desenvolvimento deste trabalho.

À pesquisadora Dra. Cleusa Suzana Oliveira de Araújo, pela sugestão sobre

fitoterápicos, amizade, apoio e, principalmente, por me apresentar o mundo da

parasitologia de peixes.

Ao M.Sc. Eduardo Akifumi Ono, pelo auxílio concedido durante os experimentos e

pela disposição em compartilhar seus conhecimentos.

À Coordenação de Tecnologia e Inovação (COTI) e ao Laboratório de Fisiologia

Aplicada à Piscicultura (LAFAP), do INPA.

Aos colegas César Oishi, pelo auxílio nas análises estatísticas, Elenice Martins

Brasil, Irenice Filagrana, Renata Silva, Márcio Quara, Iracimar Batista do

Carmo, Aline Alcântara, aos irmãos Alyson e Eduardo Carvalho (B1 e B2),

Sanny Maria Sampaio Andrade, Patrícia Castro e Gabriela Viana pela

colaboração nas análises laboratoriais.

Às coordenadoras do curso em Aquicultura, Dra. Vera Maria Fonseca de Almeida e

Val e Dra. Elizabeth Gusmão Affonso, pela dedicação e empenho para o

desenvolvimento e consolidação do curso em Aquicultura, na Amazônia.

À Ione Castro, secretária do PPG-Aquicultura pela simpatia, paciência e dedicação.

À banca da aula de qualificação Dra. Andréia Belém Costa (UFAM), Dra. Cleusa

Suzana Oliveira Araújo (UNINILTONLINS) e Dr. Luis Inoue (Embrapa-Am), e

aos referis, Dr. Acilino do Carmo Canto (UNINILTON LINS), Dr. Marcos

Tavares Dias (Embrapa-AP), Dr. Gilberto Pavanelli (UEM) pelas sugestões.

À Dra. Cleusa Suzana Oliveira de Araújo por ter cedido o Laboratório Zoologia

Aplicada (UNINILTON LINS).

Aos colegas da turma PPG-AQUI 2010, pelo companheirismo, e pelos bons

momentos compartilhados, Aline Alcântara, Alyson e Eduardo Carvalho,

vi

Izamilde Carvalho, Gabriela Viana, Patrícia Castro, Valéria Sobral e Joana

Paula e PPG-AQUI 2011, Renata Maria da Silva, Mary Anne B. Silva e Sônia

Rosana Oliveira dos Santos.

À minha família, meus irmãos, meus sobrinhos que sempre estiveram ao meu lado,

me apoiando, à minha querida mãe Raimunda, pelo apoio e incentivo nesta

fase de minha vida.

vii

RESUMO

Efeito do extrato aquoso da Piper aduncum L no controle de parasitas

monogenéticos (Plathyhelminthes: Monogenoidea) e parâmetros fisiológicos

do pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822

Visando contribuir com os estudos sobre o uso de fitoterápicos na aquicultura,

principalmente em espécies nativas como o pirarucu Arapaima gigas, o presente

estudo avaliou, in vitro, a toxicidade do extrato aquoso da pimenta de macaco, Piper

aduncum L nos monogenéticos de pirarucu, e determinou concentrações como

referência para tratamentos de alevinos de pirarucus em banhos terapêuticos

(Capítulo 1). A partir dessas informações avaliou-se a eficácia do extrato no controle

dos monogenéticos das brânquias do pirarucu em banhos curtos (0,5 h) e longos (24

h), e seus efeitos sobre as variáveis sanguíneas (Capítulo 2). No teste in vitro, foi

avaliado o efeito de 40, 60, 80, 100 e 120 ml/L do extrato em monogenéticos durante

três horas de exposição. O extrato causou 100% de mortalidade dos parasitas em

100 e 120 ml/L, após duas horas, enquanto em 80 ml/L após três horas exposição.

Para 40 e 60 ml/L do extrato, a mortalidade foi de 90% após três horas de

exposição. A partir desses resultados, as respostas fisiológicas do pirarucu foram

avaliadas em banhos com 40, 60, 80 e 100 ml/L do extrato e um controle (sem

extrato), durante 24 h, sendo analisados o hematócrito (Ht), a concentração de

hemoglobina ([Hb]), o número de eritrócitos (RBC), a concentração de hemoglobina

corpuscular média (CHCM), a hemoglobina corpuscular média (HCM), o volume

corpuscular médio (VCM), a glicose e as proteínas plasmáticas totais. Foi observada

redução significativa (p<0,05) no Ht e 16,6% de mortalidade dos pirarucus na

concentração 100 ml/L. No capítulo 2, foram testadas tres concentrações do extrato

(0, 40, 60 e 80 ml/L) e um grupo controle (sem extrato), em banhos de curta (0,5 h) e

longa duração (24 h) e avaliados os parâmetros sanguíneos e a carga parasitária.

Os resultados demonstraram que não houve diferença significativa na redução da

carga parasitária dos peixes expostos em banhos por 0,5 horas e houve aumento da

hemoglobina [Hb] em 40 ml/L. No banho longo (24 h), todas as concentrações

apresentaram redução da carga parasitária, entretanto 80 ml/L causou o melhor

resultado com 80,16% de eficácia. Nos banhos curtos (0,5) e longos (24 h), houve

uma tendência na redução dos valores de Ht e RBC. Ao contrário [Hb], HCM e

CHCM e glicose plasmática demonstraram elevação. Os resultados indicaram que

concentrações inferiores a 80 ml/L do extrato, testadas neste estudo, não altera a

homeostase fisiológica do pirarucu além de apresentar eficácia contra Dawestrema

cycloancistrium e D. cycloancistrioides.

Palavras-chave: Fitoterapia, fisiologia, hematologia, parasitologia, peixes.

viii

ABSTRACT

Effect of aqueous extract of Piper aduncum L in the control of parasitic

monogeneans (Plathyhelminthes: Monogenoidea) and physiological

parameters of the pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822

Aiming to contribute to studies on the use of herbal medicines in aquaculture, mainly

native species like the arapaima (Arapaima gigas), the present study evaluated the in

vitro toxicity of aqueous extract of pepper jack (Piper aduncum L) in monogeneans

pirarucu, and determined as reference concentrations treatments of fingerlings

pirarucus in therapeutic baths (Chapter 1). From this information, the effectiveness of

the extract was evaluated in control of monogeneans on the gills of pirarucu baths

short (0.5 h) and long (24 h), and their effects on blood variables (Chapter 2). In vitro

test, the effect of 40, 60, 80, 100 and 120 ml/L of the extract was evaluated in

monogeneans for three hours exposure. The extract caused 100% mortality of the

parasites in 100 and 120 ml/L after two hours, while 80 ml/L after three hours

exposure. To 40 to 60 ml/L of the extract, the mortality was 90% after three hours of

exposure. From these results, the physiological responses of arapaima in baths were

evaluated at 40, 60, 80 and 100 ml/L of the extract and a control (without extract) for

24 h, and analyzed the hematocrit (Ht), the concentration of hemoglobin ([Hb]), the

number of erythrocytes (RBC), the mean corpuscular hemoglobin concentration

(MCHC), the mean corpuscular hemoglobin (MCH), the mean corpuscular volume

(MCV), glucose and total plasma proteins. A significant reduction (p<0.05) in Ht and

16.6% mortality of pirarucus concentration in 100 ml/L. In Chapter 2, three extract

concentrations (0, 40, 60 and 80 ml/L) were tested and a control group (without

extract) in baths short (0.5 h) and long term (24 h) and evaluated blood parameters

and parasitic load. The results showed no significant difference in reducing the

parasite load of fish exposed in baths for 0.5 hours and increased hemoglobin ([Hb])

in 40 ml/L. In long bath (24 h), all concentrations had reduced parasite burden,

however, 80 ml/L caused the best result with 80.16% efficiency. In short baths (0,5)

and long (24 h), there was a tendency in reduction in hematocrit and RBC values.

Unlike [Hb], MCH and MCHC and plasma glucose showed an increase. The results

indicated that concentrations of less than 80 ml/L of extract tested in this study, does

not alter the physiological homeostasis of pirarucu besides showing efficacy against

Dawestrema cycloancistrium and D. cycloancistrioides.

Keywords: herbal medicine, physiology, hematology, parasitology, fish.

ix

SUMÁRIO

Efeito do extrato aquoso da Piper aduncum L no controle de parasitas

monogenéticos (Plathyhelminthes: Monogenoidea) e parâmetros fisiológicos

do pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822............................................................. vii

RESUMO................................................................................................................... vii

Efeito do extrato aquoso da Piper aduncum L no controle de parasitas

monogenéticos (Plathyhelminthes: Monogenoidea) e parâmetros fisiológicos

do pirarucu Arapaima gigas Schinz 1822.............................................................. vii

ABSTRACT .............................................................................................................. viii

Effect of aqueous extract of Piper aduncum L in the control of parasitic

monogeneans (Plathyhelminthes: Monogenoidea) and physiological

parameters of the pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822 .................................. viii

SUMÁRIO .................................................................................................................. ix

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

2. REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 8

3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 20

3.1 Geral ............................................................................................................... 20

3.2 Específicos ...................................................................................................... 20

CAPITULO 1 ............................................................................................................. 21

Toxicidade do extrato aquoso da Piper aduncum L em monogenéticos e nos

parâmetros sanguíneos de pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822 ................... 21

RESUMO................................................................................................................... 21

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 23

2. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 25

2.1 Aquisição e aclimatação dos peixes ............................................................... 25

2.2 Aquisição e preparo da solução estoque de P. aduncum ............................... 25

2.3 Exposição in vitro dos monogenéticos ao extrato de P. aduncum .................. 26

2.4 Exposição dos peixes ao extrato de P. aduncum ............................................ 26

2.5 Coleta de sangue e determinação dos parâmetros sanguíneos ..................... 27

2.6 Monitoramento da qualidade da água ............................................................. 27

2.7 Análises estatísticas ........................................................................................ 27

3. RESULTADOS ...................................................................................................... 28

3.1 Toxicidade do extrato de P. aduncum sobre os monogenéticos (in vitro) ....... 28

x

3.2 Efeitos da toxicidade aguda do extrato de P. aduncum nos parâmetros

sanguíneos de A. gigas ......................................................................................... 28

3.3 Qualidade da água dos aquários .................................................................... 31

4. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 32

5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 37

6. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 37

CAPITULO 2 ............................................................................................................. 49

Efeito do extrato aquoso da Piper aduncum L, no controle de monogenéticos

em pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822 ............................................................ 49

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 51

2. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 52

2.1 Aquisição e aclimatação dos peixes ............................................................... 52

2.2 Aquisição e preparação da solução estoque de P. aduncum ......................... 53

2.3 Banhos com a P. aduncum ............................................................................. 53

2.4 Coleta de sangue e determinação dos parâmetros hematológicos ................. 53

2.5 Análises parasitológicas e eficácia do tratamento ........................................... 54

2.6 Monitoramento da qualidade da água ............................................................. 54

2.7 Análises estatísticas ........................................................................................ 55

3. RESULTADOS ...................................................................................................... 55

4. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 59

5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 62

6. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 63

CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 72

1

1. INTRODUÇÃO

O potencial do Brasil como produtor aquícola mundial vem se confirmando

com as últimas estatísticas (2010), cuja produção foi de 479.399 toneladas (MPA,

2012). Dessas, 63,4% são tilápia (Oreochromis niloticus Linnaeus 1758) e carpas

comum (Cyprinus carpio Linnaeus 1758); capim (Ctenopharyngodon idella Cuvier e

Valenciennes 1844); prateada (Hypophthalmichthys molitrix Cuvier & Valenciennes

1844); cabeça grande (Aristichthys nobilis Richardson 1845) enquanto as espécies

nativas, tambaqui (Colossoma macopomum Cuvier 1818), pacu (Piaractus

mesopotamicus Holmberg1887) e o híbrico tambacu (P. mesopotamicus x C.

macropomum), representaram 24,6% da produção nacional. O crescimento na

produção de espécies nativas se deve aos investimentos em pesquisa e tecnologias,

e a previsão para os próximos anos é que, além dessas, outras espécies da

ictiofauna brasileira passarão a contribuir com o desempenho nacional da

aquicultura (Kubitza et al. 2007; MPA 2012). Além dos investimentos no setor, os

estados da região Centro-Oeste e Norte do país contribuirão, significativamente,

com a produção de espécies nativas, onde ocorre a proibição no cultivo de espécies

exóticas.

Dentre as espécies nativas com alto potencial para a piscicultura brasileira

destaca-se o pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822, um Osteoglossiforme da família

Arapaimatidae Ferraris 2003, endêmico da região amazônica. Essa espécie está

entre os maiores representantes da ictiofauna que habita as águas doces do mundo,

apresenta hábito alimentar carnívoro, respiração aérea obrigatória e chama a

atenção pelo seu enorme potencial de crescimento (Fontenele, 1948; Val e

Honczarick 1995; Imbiriba 2001; Cavero et al. 2003; Pereira-Filho et al. 2003).

Tem sido, por muito tempo, importante fonte de alimento para os habitantes

da Amazônia. Apresenta elevado valor econômico e tem sido explorado desde o

século XVIII (Menezes 1951). Porém, a intensa exploração do pirarucu provocou um

acentuado declínio nos seus estoques ao ponto de ser, atualmente, considerada

quase extinta em algumas regiões e sobre-explorada em outras. Em resposta à

sobre-pesca dos estoques naturais, as autoridades governamentais proibiram a

pesca do pirarucu no Amazonas, estando esta restrita apenas aos planos de manejo

comunitário de lagos apoiados pelos órgãos ambientais estaduais e federais.

Há registros sobre o potencial e as experiências do cultivo desta espécie

desde a década de 40, onde são ressaltadas as suas características biológicas e

2

zootécnicas, além do elevado valor mercantil e como alimento na região amazônica

(Bard e Imbiriba 1986; Fontenele 1948; Ono et al. 2004; Ono 2005; 2011; SEBRAE

2010; Roubach et al. 2003; Venturieri e Bernardino 1999). Segundo Ono et al. (2004)

e Ono (2011); o pirarucu apresenta, do ponto de vista da piscicultura intensiva, uma

série de características positivas, como: rápido crescimento e tolerância ao

adensamento em ambientes tropicais; respiração aérea obrigatória, aproveitando o

ar diretamente da atmosfera, ficando independente do oxigênio dissolvido na água;

fácil adaptação ao alimento balanceado; carne branca, magra, de alta qualidade e

livre de espinhas intramusculares; elevado rendimento de filé (> 45%), superando o

rendimento dos peixes atualmente cultivados no país; elevado valor de mercado,

sobretudo no mercado internacional.

Embora nos últimos anos os estudos sobre a criação do pirarucu tenham sido

intensificados, a falta de domínio sobre a reprodução, a produção de alevinos, as

técnicas de cultivo, a nutrição e as condições gerais de saúde, ainda dificulta sua

criação e precisa ser superada (Ono et al. 2004; Ono 2005, 2011; Roubach et al.

2003).

Ono (2011) descreve que a baixa sobrevivência (10 a 20%) do pirarucu

ocorre, principalmente, na fase de alevinagem, devido às altas infestações de

parasitos. Segundo o autor, doenças em peixes de cultivo são causadas,

principalmente, pelas práticas de manejo incorretas, além de aspectos envolvendo

altas densidades de estocagem e má alimentação, que tem como principal

consequência a degradação da qualidade da água. Com isso, é desfeito o equilíbrio

da relação hospedeiro/parasito/ambiente e, consequentemente, surgem infestações

massivas, responsáveis pelas elevadas mortalidades (Ranzani-Paiva et al. 2000;

Moraes e Martins 2004; Pavanelli et al. 2008). Dentre os principais patógenos

responsáveis pelas injúrias em peixes cultivados destacam-se os monogenéticos.

Estudos sobre parasitos de pirarucu em sistemas de cultivo ainda são insipientes,

entretanto, diagnóstico realizado na Amazônia Central tem comprovado que os

monogenéticos são causadores de doenças em pirarucu por Araújo et al. (2009a,b)

e Gomes et al. (2012a).

Os monogenéticos, uma das classes dos Plateyhelminthes, são, na sua

grande maioria, ectoparasitos que se encontram nas brânquias, narinas e superfície

do corpo de peixes marinhos e de água doce (Buchmann e Bresciani 2006; Thatcher

2006; Pavanelli et al. 2008; Eiras et al. 2010; Noga 2010). Esses parasitos

3

apresentam um elevado grau de especificidade parasitária em relação ao

hospedeiro, embora algumas espécies sejam capazes de parasitar um grande

número de hospedeiros (Thatcher 2006; Pavanelli et al. 2008).

Todos os monogenéticos são hermafroditas, não necessitam de hospedeiros

intermediários e são na sua grande maioria ovíparos. Os Gyrodactylidae são

vivíparos e não passam pela fase de oncomiracídio (Thatcher 2006; Eiras et al.

2010, Noga 2010). As famílias Dactylogyridae e Gyrodactylidae são as mais

importantes, devido ao número de espécies, a vasta distribuição geográfica, e ao

impacto econômico que podem causar, não só em peixes de cultivo, mas também

em populações naturais (Thatcher 2006).

No Brasil há registro de mais 300 espécies de monogenéticos, sobretudo da

família Dactylogyridae (Thatcher 2006). Para o pirarucu são descritas quatro

espécies específicos de monogenéticos: Dawestrema cycloancistrioides Kritsky,

Boeger e Thatcher (1985); Dawestrema cycloancistrium Price e Nowlin (1967) e

Dawestrema punctatum Kritsky Boeger e Thatcher (1985) e Dawestrema sp. (Eiras

et al. 2010).

Com a expansão da aquicultura no Brasil, começam a surgir os problemas

sanitários, onde, atualmente, já são percebidos tanto em pisciculturas de grande

porte, como também nas pisciculturas familiares. Estudos do diagnóstico

epidemiológico, relativo à prevalência de parasitos de ocorrência comum em

pisciculturas têm sido realizado por diversos autores, entre outros, Tavares-Dias et

al. (2001a) registrou a ocorrência de monogenéticos, crustáceos, mixosporídeos,

Piscinoodinium pillulare e Trichodina sp. num levantamento parasitário em peixes de

"pesque-pagues" em Franca, São Paulo, Brasil; Braccini et al. (2008) a ocorrência de

monogenéticos e Trichodina sp. em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) cultivadas

em tanques-rede nos rios do Corvo e Guairacá, PR; Lizama et al. (2007) uma alta

incidência parasitária por monogenéticos e crustáceos, em peixes de três

pisciculturas no Estado de São Paulo.

Martins et al. (2000, 2002a) num diagnóstico em estabelecimentos de criação

e manutenção de peixes no estado de São Paulo, por um período de 5 e 2 anos,

respectivamente, os monogenéticos foram os parasitos mais abundantes, seguidos

dos protozoários Ichthyophthyrius multifilis e Piscinoodinium pillulare, crustáceo

Lernaea cyprinacea, tricodinídeos e mixosporídeo Henneguya piaractus. No

Nordeste brasileiro, bactérias Streptococcus dysgalactiae nos anos 90, causaram

4

mortalidade em cultivos de peixes marinhos, principalmente do gênero Seriola e da

tilápia do Nilo, O. niloticus (Figueiredo 2009a) nos anos 90; e Wissella sp.,

responsável pela septicemia hemorrágica em truta arco-íris em Oncorhynchus

mykiss (Figueiredo 2009b).

Na Amazônia, com o crescimento da aquicultura, estudos epidemiológicos e

de monitoramento para diagnósticos das infecções parasitárias têm sido realizados

(Malta et al. 2001; Varella et al. 2003; Andrade et al. 2006; Tavares-Dias et al. 2006;

Araújo et al. 2009a; França et al. 2011). Recentemente, Gomes et al. (2012a, b)

realizaram um levantamento sobre diagnóstico de enfermidades de peixes de cultivo

nas pisciculturas do estado do Amazonas e verificaram que, independente do

sistema de criação e do tamanho do empreendimento, as espécies cultivadas

apresentaram uma alta incidência parasitária, principalmente por monogenéticos.

Segundo Campos (2011), as pisciculturas brasileiras são carentes em

diagnosticar problemas sanitários em seus cultivos, pois, com raras exceções, não

existem laboratórios que possam emitir um diagnóstico rápido e recomendações

eficientes para o controle de enfermidades, principalmente em regiões mais

distantes.

Os estudos que avaliam a eficácia e os efeitos secundários de drogas

utilizadas no combate às enfermidades parasitárias, principalmente para espécies

nativas, ainda são escassos (Pavanelli et al. 2008), sendo estes descritos por Onaka

et al. (2003); Lopes (2005); Chagas et al. (2006), Affonso et al. (2009); Maciel

(2009); Silva et al. (2009a); Schalch et al. (2009); França et al. (2011); Tavares-Dias

et al. (2011). Com isso, surge a preocupação com o uso indiscriminado de produtos

químicos veterinários no controle de enfermidades, pois estes podem ser tóxicos ao

organismo, acumular resíduos químicos nos tecidos dos peixes, além da

contaminação dos ambientes aquáticos (Holmstrom et al. 2003; FAO 2010;

Figueiredo 2011).

De acordo a Agência Reguladora de Alimentos e Produtos Farmacêuticos dos

Estados Unidos da América, o uso de compostos sintéticos na aquicultura depende

de testes prévios para a definição de dosagens, evitando-se, assim, aplicações de

quimioterápicos que alterem outros elos da cadeia alimentar no ambiente aquático

(FDA 2007). No Brasil, não há uma legislação específica para o uso desses

compostos na aquicultura, com apenas um registro de produto para esta finalilidade,

o antibiótico Aquaflor* 50% Premix. É importante destacar que os produtos de uso

5

veterinário devem ter, obrigatoriamente, registro específico no Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), e o seu uso deve ser feito

respeitando a Portaria Ministerial n.º 48, de 12 de maio de 1997.

Para minimizar o uso de compostos químicos na aquicultura, surgem os

produtos alternativos, como, por exemplo, pró e pré-bióticos (Fabregat 2006),

imunoestimulantes (Chitmanat 2002; Portz 2006; Menezes et al. 2006; Affonso et al.

2007; Aride et al. 2010) e plantas com propriedades medicinais.

Há milhões de anos as plantas são utilizadas pelos homens pela importância

que estas possuem a saúde humana e para os animais. Um dos primeiros relatos

para o uso de plantas medicinais data de 2.600 a.C., para as civilizações

mesopotâmicas. Na medicina egípcia, 700 drogas foram documentadas no “Ebers

Papyrus” em 1.500 a.C. civilizações antigas que habitavam a China, Índia e Norte da

África, utilizavam plantas no tratamento de diversas doenças. A Grécia Antiga

contribuiu de forma significativa para o desenvolvimento do uso das plantas. A partir

das classificações feitas por Theophrastus (300 a.C.) naturalista conhecido como pai

da Botânica. Dioscorides, físico grego (100 d.C.), foi um dos mais importantes

representantes na ciência das drogas vegetais. Também Galeno (130-200 d.C.)

praticou e ensinou farmácia e medicina com base no uso de plantas, com cerca de

30 publicações sobre as plantas (Newman et al. 2000). Antigas civilizações do

mundo Oriental, como as culturas chinesa e hindu, são tradicionais no uso de ervas.

O conhecimento dos povos tradicionais a cerca das plantas no tratamento de

enfermidades, representa a base da fitoterapia moderna e oferece pressupostos

para pesquisas e produção de novos medicamentos pelas indústrias farmacêuticas.

No Brasil há uma vasta tradição no uso popular de plantas medicinais. Uma

justificativa para o aumento do uso de plantas medicinais é a disponibilidade de

matéria prima vegetal na extração de compostos farmacologicamente ativos ou

como precursores de medicamentos a base de plantas. As variações químicas

estruturais são por vezes inviáveis de serem reproduzidas sinteticamente no

laboratório, pela complexidade estrutural, alto custo, e ainda por apresentarem

características e efeitos diferentes quando comparado ao extrato vegetal após a

industrialização.

As pesquisas envolvendo extratos ou substâncias puras de plantas para o

controle e a prevenção de doenças de organismos aquáticos vêm demonstrando sua

eficácia em várias partes do mundo. Ekanem et al. (2004) avaliaram o efeito do

6

extrato metanólico de sementes de Piper guineense sobre parasitas monogenéticos

de Carassius auratus auratus. Liu et al. (2010) descreveram a eficácia do extrato de

sementes da Semen pharbitidis contra Dactylogyrus intermedius em Carassius

auratus. Wu et al. (2010) verificaram potencial anti-helmíntico em Radix Bupleuri

chinensis contra Dactylogyrus intermedius de Carassius auratus. Li et al. (2011)

estudaram o efeito de Chelidonium majus L de peixes ciprinídeos contra

Dactylogyrus intermedius, responsáveis por grandes prejuízos e na reprodução de

peixes ornamentais.

Figueiredo (2011) destacou a importância de alguns fitoterápicos aplicados na

aquicultura no país, tais como: goji (Lycium sp.) testado na tilápia do Nilo

(Oreochromis niloticus) com propriedade imunoestimulante e bactericida; alho

(Allium sativum), para a truta arco-íris (O. mykiss) e para a tilápia do Nilo, excelente

imunoestimulante, confere resistência a parasitos e estimula o apetite; alecrim

(Rosmarinus officinalis), para a tilápia do Nilo, tem efeito imunoestimulante e

bacterioestático. Martins et al. (2002b), reduziram em 95% a infestação por

monogenéticos Anacanthorus penilabiatus em pacus (P. mesopotamicus) com o uso

do alho (A. sativum) na ração. Cruz (2005) obteve 89% de efetividade no controle de

Anacanthorus penilabiatus em pacu (P. mesopotamicus) utilizando extrato aquoso

de folhas de nim (Azadirachta indica). Silva et al. (2009b) avaliaram a eficácia do

extrato aquoso de folhas secas de Terminalia catappa em juvenis de tambaqui

parasitados por monogenéticos e pelos protozoários Ichthyophthirius multifiliis e

Piscinoodinium pillulare.

Apesar destes estudos, o uso de fitoterápicos para profilaxia e tratamento de

doenças na piscicultura brasileira ainda é incipiente, principalmente por ser

considerado o país detentor da maior biodiversidade de plantas do planeta.

Uma planta da região amazônica que vem sendo estudada por suas

propriedades medicinais é a Piper aduncum da família Piperaceae, conhecida como

pimenta de macaco. Essa planta possui alto teor (2,5 a 4%) de óleo essencial, com

elevada concentração de éter fenílico dilapiol, cerca de 97% (Bernard et al. 1995;

Maia et al. 1998). Na literatura é descrito que o óleo essencial da P. aduncum

apresenta propriedades inseticida, fungicida, bactericida, acaricida, larvicida,

moluscicida e parasiticida (Nair e Burke 1990; Maia et al. 1998; Estrela et al. 2006;

Bastos e Albuquerque (2004); Fazolin et al. 2005; 2007; Lobato et al. 2007; Flores et

al. 2009) e tem sido utilizada tanto na terapia humana (Bastos 1997; Morandim et al.

7

2002; Gaia et al. 2004) quanto na medicina veterinária (Silva et al. 2009c). Em

peixes, espécie do mesmo gênero, a P. guineense possui alta eficácia no controle

de parasitas monogenéticos de goldfish (Carassius auratus auratus) (Ekanem et al.

2004). Entretanto, apesar de sua ampla utilização como fitoterápico, a eficácia da

Piper aduncum no controle de patógenos em peixes ainda não foram estudadas.

Os estudos envolvendo novos fármacos para o tratamento de patógenos em

peixes, devem, além da avaliação de sua eficácia, passar por testes de toxicidade,

tanto do organismo alvo como não-alvo, os quais podem ser realizados em

condições laboratoriais (USEPA 2002; Grisolia 2005) Em geral, durante esses

testes, são avaliadas nos organismos alterações comportamentais, fisiológicas,

bioquímicas, histológica e genotóxicos (Ferreira 2004). Além disso, são

indispensáveis para regulamentar o desenvolvimento, fabricação ou liberação de

substâncias (Rand 2008).

Mudanças ambientais ou qualquer modificação que proporcione desconforto,

aos organismos podem causar estresse. Estes são induzidos a emitir respostas à

nova condição, que serão refletidas conforme a intensidade e a duração do agente

estressor (Barton 1997; Morgan e Iwama 1997; Urbinati e Carneiro 2004). As

respostas ao estresse são divididas em primárias, secundárias e terciárias

(Wedemeyer 1996; Urbinati e Carneiro 2004). As respostas primárias são mediadas

pelo sistema neuroendócrino e culminam com a liberação instantânea para a

circulação dos hormônios do estresse, catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e,

posteriormente, os corticosteroides (principalmente o cortisol). As respostas

secundárias compreendem os efeitos metabólicos, hematológicos,

osmorregulatórios e cardiorrespiratórios mediados por esses hormônios (Tavares-

Dias et al. 2001b; Urbinati e Carneiro 2004). As respostas terciárias afetam o animal

como um todo, provocando modificações nos padrões comportamentais,

prejudicando o crescimento, o sucesso reprodutivo e diminui a resistência a doenças

(Urbinati e Carneiro 2004).

A importância dos parâmetros fisiológicos na avaliação de substâncias

naturais em organismos aquáticos tem sido demonstrada nos trabalhos de Farah et

al. (2006), testando o extrato de folhas de nim em Channa punctatus; Winkaler et al.

(2007), no extrato aquoso de folhas de neem para Prochilodus lineatus e Kavitha et

al. (2011), no extrato de sementes de Moringa oleifera em Cyprinus carpio.

8

Em vista do exposto, e pela relevância do pirarucu para a piscicultura

brasileira, pretende-se, com este trabalho, contribuir com os estudos sobre

fitoterápicos, utilizando, principalmente, plantas da biodiversidade amazônica, que

apresentem eficácia no tratamento de doenças de peixes nativos. Assim, neste

estudo, foram avaliadas a toxicidade e a eficácia da P. aduncum em pirarucus sob

condições laboratoriais.

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3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar o efeito do extrato aquoso de pimenta de macaco, Piper aduncum, no

controle de parasitos monogenéticos em juvenis de pirarucu, Arapaima gigas.

3.2 Específicos

Capítulo 1:

1) Avaliar, in vitro, a toxicidade de diferentes concentrações do extrato aquoso

da P. aduncum em monogenéticos de pirarucu e;

2) Determinar a toxicidade das concentrações do extrato aquoso da P.

aduncum em juvenis de pirarucu.

Capítulo 2:

3) Avaliar a eficácia do extrato aquoso da P. aduncum no controle de

monogenéticos parasitas das brânquias do pirarucu em banhos curtos (0,5 h) e

longos (24 h), sob condições laboratoriais e;

4) Avaliar o efeito da P. aduncum sobre as variáveis sanguíneas do pirarucu.

21

CAPITULO 1

Toxicidade do extrato aquoso da Piper aduncum L em monogenéticos e nos

parâmetros sanguíneos de pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822

RESUMO

Este estudo avaliou os efeitos tóxicos do extrato aquoso de folhas de P. aduncum L

sobre os monogenéticos (in vitro) e as respostas fisiológicas dos pirarucus expostos

a diferentes concentrações deste fitoterápico. No teste in vitro, foi avaliado o efeito

das concentrações de 40, 60, 80, 100 e 120 ml/L do extrato em monogenéticos de

brânquias de pirarucus durante três horas de exposição. Os resultados desses

testes demonstraram 100% de mortalidade dos parasitas em 100 e 120 ml/L do

extrato, após duas horas de exposição, enquanto em 80 ml/L após três horas. Para

40 e 60 ml/L do extrato, a mortalidade foi de 90% após três horas de exposição. A

partir desses resultados, as respostas fisiológicas de pirarucu foram avaliadas em

banhos com 40, 60, 80 e 100 ml/L do extrato da P. aduncum e um controle (sem

extrato), durante 24 h, sendo analisados o hematócrito (Ht), a concentração de

hemoglobina ([Hb]), o número de eritrócitos (RBC), a concentração de hemoglobina

corpuscular média (CHCM), a hemoglobina corpuscular média (HCM), o volume

corpuscular médio (VCM), a glicose e as proteínas plasmáticas totais. Foi observada

redução significativa (p<0,05) no Ht. Os neutrófilos foram diferentes nas três maiores

concentrações (60, 80 e 100 ml/L) e os eosinófilos em 40 ml/L, em relação ao

controle. A mortalidade foi de 16,6% dos pirarucus na concentração 100 ml/L. Os

resultados sugerem que concentrações abaixo de 80 ml/L do extrato de P. aduncum

podem ser utilizadas sem causar danos a homeostase fisiológica dessa espécie.

Palavras-chave: fitoterápico, parasita, peixe, toxicidade.

22

CHAPTER 1

Toxicity of aqueous extract of Piper aduncum L in monogeneans and blood

parameters of pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822

ABSTRACT

This study evaluated the toxic effects of aqueous extract of leaves of P. aduncum L

on monogeneans (in vitro) and the physiological responses of pirarucus exposed to

different concentrations of this herbal. In in vitro tests, we evaluated the effect of

concentrations of 40, 60, 80, 100 and 120 ml/L of the extract in the gills of

monogeneans pirarucus during three hours of exposure. The results of these tests

showed 100% mortality of the parasites in 100 and 120 ml/L of the extract after two

hours exposure, while 80 ml/L after three hours. To 40 to 60 ml/L of the extract, the

mortality was 90% after three hours of exposure. From these results, the

physiological responses of arapaima in baths were evaluated at 40, 60, 80 and 100

ml/L of the extract of P. aduncum and a control (without extract) for 24 h, and

analyzed the hematocrit (Ht), the hemoglobin concentration ([Hb]), the number of

erythrocytes (RBC), the mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), the

mean corpuscular hemoglobin average (MCH), the mean corpuscular volume (MCV),

glucose and total plasma proteins. A significant reduction (p<0.05) in Ht. Neutrophils

were different at the three highest concentrations (60, 80 and 100 ml/L) and in

eosinophils in 40 ml/L, compared to the control. Mortality was 16.6% pirarucus

concentration of 100 ml/L. The results suggest that concentrations below 80 ml/L of

the extract of P. aduncum can be used without adversely affecting the physiological

homeostasis of this kind.

Keywords: herbal medicine, parasite fish toxicity.

23

1. INTRODUÇÃO

O pirarucu (Arapaima gigas), a espécie mais emblemática da ictiofauna

amazônica e apesar de excelentes características para criação intensiva, ainda

apresenta uma produção em cativeiro pouco expressiva (10,4 t em 2010) se

comparada às outras espécies nativas, (Ministério da Pesca e Aquicultura-MPA,

2012). Isso se deve aos vários obstáculos relacionados à sua produção em larga

escala, sendo a baixa oferta de alevinos a mais significativa, devido à falta de

domínio sobre as técnicas de reprodução induzida (Ono 2011). Além disso, estudos

realizados pelo SEBRAE (Serviço Brasileiro de Apoio às Micro e Pequenas

Empresas), de 2007 a 2010, e Ono (2011) identificaram diversas dificuldades na

cadeia produtiva do pirarucu na região Norte, como mão de obra qualificada, manejo

alimentar incorreto, cuidado com os juvenis e com a qualidade de água, além de alta

incidência parasitária, sobretudo de monogenéticos, que são responsáveis pelos

baixos índices de sobrevivência (10 a 20%) de juvenis com tamanho inferior a 15 cm

(Ono 2011).

A maioria dos estudos relacionados aos parasitos de pirarucu foi realizada em

ambiente natural (Malta 1982; Kritsky et al. 1985; Thatcher 2006; Gomes et al. 2006;

Feijó et al. 2008; Santos et al. 2008; Menezes et al. 2011). Os primeiros

levantamentos parasitários em pirarucus, em ambiente de cultivo, são descritos por

Silva et al. (2008), Araújo et al. (2009a; 2009b) e Andrade et al. (2011), na Amazônia

Central. Para prevenir possíveis infestações dos peixes por patógenos em

ambientes de cultivo, as Boas Práticas de Manejo (BPM) é a forma mais

recomendada. Entretanto, em situações de enfermidades parasitárias, o tratamento,

na maioria das vezes, é feito com o uso de produtos químicos (ex. formol,

permanganato de potássio, verde de malaquita, triclorfon, sulfato de cobre

praziquantel, albendazol e mebendazol), tanto em forma de banhos quanto

adicionados à ração (Pavanelli et al. 2008; Noga 2010). Para o pirarucu, os estudos

relacionados ao tratamento de parasitos ainda são escassos, sendo descrito na

literatura o potencial anti-helmíntico do cloreto de sódio (NaCl), formalina e

mebendazol, aplicados em forma de banhos longos contra monogenético

Dawestrema sp. (Cavero et al. 2002; Andrade et al. 2009).

O uso de compostos químicos em criações de organismos aquático tem

crescido nos últimos anos em todo mundo, com o objetivo de aumentar a produção e

evitar as doenças. Entretanto, esses compostos possuem alto poder residual e

24

podem contaminar os peixes, o homem e o ambiente (Holmstrom et al. 2003; FAO,

2010; Figueiredo 2011). Em função disso, existem várias restrições quanto ao uso

desses compostos, não somente na aquicultura, como em outros setores de

produção animal. No Brasil, o uso de qualquer fármaco de uso veterinário deve ter,

obrigatoriamente, registro específico no Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento (MAPA). Uma alternativa que tem se mostrado viável na

aquicultura de alguns países é o uso de fitoterápicos que, ao contrário dos produtos

químicos, são biodegradáveis, apresentam baixa toxicidade, são de fácil acesso e

seguros para o homem e para o ambiente (Maximiano et al. 2005). Apesar disso,

existe a preocupação quanto ao uso de fitoterápicos destinados ao tratamento de

doenças parasitárias em peixes, devido ao potencial tóxico que estas substâncias

podem causar ao organismo do animal (Figueiredo 2011). Dessa forma, são

necessárias pesquisas que possam contribuir com o desenvolvimento de novos

produtos para fins preventivos e de tratamento de doenças em organismos

aquáticos.

A região amazônica é a maior fonte da biodiversidade vegetal do planeta, o

que a tornar um grande potencial para os estudos sobre fitoterápicos de interesse na

aquicultura, além do vasto conhecimento das populações tradicionais sobre o uso de

plantas medicinais (Di Stasi e Hiruma-Lima 2002). Uma planta que ocorre

naturalmente na Amazônia e que tem se mostrado bastante promissora para

diversas finalidades é a Piper aduncum L, da família Piperácea, cujo gênero possui

mais de 140 espécies (Maia et al. 1998). Seu óleo essencial tem mostrado eficácia

no controle de microrganismos de importância econômica para agricultura, por

apresentar propriedades inseticida, fungicida, bactericida, acaricida, larvicida,

moluscicida e parasiticida (Bastos 2004; Estrela et al. 2006; Fazolin et al. 2007; Silva

et al. 2007) e pelo seu uso na terapia humana (Magalhães 2010) e na medicina

veterinária (Silva et al. 2009a). Além disso, possui importância econômica e

tecnológica devido à presença de importantes precursores capazes de sintetizar

outras substâncias como alcalóides, fenilpropanoides, lignanas, neolignanas,

terpenos, pironas, amidas, amidas insaturadas como miristicina e dillapiol, derivados

de ácido benzóicos, cromenos e avonóides (Burke e Nair 1986; Orjala 1993; Parmar

et al. 1997).

Uma vez que as substâncias desta planta já foram caracterizadas, e sua

eficácia farmacológica na medicina veterinária tem sido comprovada em alguns

25

estudos, a Piper aduncum parece bastante promissora para uso na aquicultura. O

teste de toxicidade é um dos primeiros passos para o estudo da eficácia terapêutica

de fármacos contra diferentes organismos patogênicos e seus efeitos adversos nos

hospedeiros (Xie et al. 2008; Das et al. 2009; Suvetha et al. 2010; Kumar et al.

2011). Além da taxa de sobrevivência, os parâmetros sanguíneos tem sido

importante ferramenta na identificação de condições estressantes para os peixes

frente à exposição de produtos potencialmente tóxicos (Affonso et al. 2002; 2009;

Fajer-Ávila et al. 2003; Maciel 2009; Tavares-Dias et al. 2011).

Assim, este estudo teve como objetivo avaliar in vitro os efeitos tóxicos do

extrato aquoso de P. aduncum nos parasitos monogenéticos e a influência de

diferentes concentrações e tempos de exposição deste fitoterápico nas respostas

fisiológicas de pirarucu.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Aquisição e aclimatação dos peixes

Os juvenis de pirarucu (24,9 ± 4,4 g) foram adquiridos de uma piscicultura

comercial localizada em Santarém, PA e transportados, via aérea, para a Estação

Experimental de Aquicultura da Coordenação de Tecnologia e Inovação (COTI) do

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) em Manaus, AM. Durante 20

dias, os peixes foram aclimatados em tanques de polietileno com capacidade para

500 L, com fluxo contínuo de água de poço artesiano e aeração constante. Os

parâmetros físicos e químicos da água foram avaliados durante todo o experimento,

conforme item 2.6. Os peixes foram alimentados com ração comercial com 45%

proteína bruta ad libitum, quatro vezes ao dia.

2.2 Aquisição e preparo da solução estoque de P. aduncum

Folhas de P. aduncum foram coletadas nas dependências do horto da

Universidade Nilton Lins, Manaus, AM, entre 8 e 10 h, no período de dezembro de

2010 a março de 2011. As folhas foram selecionadas, lavadas e secas em estufa a

45 ± 0,5 ºC por 72 h. Após a secagem, o material foi triturado em um moinho

(Tecnal, Tipo Willy-TE 650), e mantido sob baixa temperatura (aproximadamente 10

ºC) (Prista et al. 1981), e ao abrigo da luz até a preparação dos extratos.

26

Para preparar o extrato aquoso, foram utilizados 10 g das folhas trituradas em

um litro de água destilada (10:1000 m/v) (Silva et al. 2009b). Após homogeneização

da suspensão com o auxilio de um bastão de vidro, esta foi mantida em repouso por

uma hora. Utilizou-se o um filtro de nylon para a separação das partículas vegetais.

2.3 Exposição in vitro dos monogenéticos ao extrato de P. aduncum

Para avaliar a toxicidade do extrato aquoso de P. aduncum, foram realizados

testes in vitro. Para isso, foram utilizadas cinco concentrações do extrato aquoso

(40, 60, 80, 100 e 120 ml/L) e um controle (0=sem adição do extrato). Estruturas

branquiais de três pirarucus, naturalmente parasitados, foram retiradas e seus arcos

individualizados em placas de Petri (Eiras et al. 2006). Em cada arco 20

monogenéticos foram selecionados visualmente e observados a cada 15 minutos

num estereomicroscópio da Zeiss® (Fajer-Ávila et al. 2003). Todas as concentrações

foram realizadas em duplicatas, num tempo total de exposição de três horas.

2.4 Exposição dos peixes ao extrato de P. aduncum

Após o período de aclimatação, cinco grupos com 18 peixes (24,9 ± 4,4 g)

foram distribuídos em 15 aquários de vidro com capacidade para 60 L. De acordo

com os resultados obtidos nos experimentos in vitro, descrito no ítem 2.3, foram

utilizadas as concentrações de 40, 60, 80 e 100 ml/L do extrato aquoso da P.

aduncum, acompanhado por um grupo controle (sem adição do extrato), por 24

horas, conforme determinado para testes de toxicidade aguda. Durante este período,

não houve troca de água, a oxigenação foi realizada por aeradores, e mantido o

fotoperíodo de 12 h. Todas as concentrações foram testadas em triplicata e o

bioensaio foi realizado segundo recomendações da USEPA (2002) e ABNT (2004).

Ao final das 24 horas de exposição, foram retirados três peixes de cada

aquário para coleta de sangue e posterior análise dos parâmetros fisiológicos, como

descrito no item 2.5. Durante o período experimental, foram observados e

registrados a sobrevivência e o comportamento dos peixes (perda de equilíbrio,

natação errática, frequência respiratória e alteração de coloração da pele), e

monitorada a qualidade da água dos aquários.

27

2.5 Coleta de sangue e determinação dos parâmetros sanguíneos

Amostras de sangue foram coletadas, por punção da veia caudal, utilizando

seringas de 3 mL rinsadas com EDTA a (10%) e armazenadas sob refrigeração a 4

°C. O sangue total foi destinado às seguintes determinações: hematócrito (Ht), pelo

método de microhematócrito, contagem de eritrócitos (RBC) usando câmara de

Neubauer® em solução de Natt e Herrick (1952); concentração de hemoglobina

([Hb]) pelo método da cianometahemoglobina. Os índices hematimétricos, volume

corpuscular médio (VCM), concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM)

e hemoglobina corpuscular média (HCM) foram calculados a partir dos valores de Ht,

RBC e [Hb], segundo Wintrobe (1934).

O plasma sanguíneo, obtido por centrifugação do sangue total, foi destinado à

análise da glicose plasmática (mg/dL) pelo método enzimático-colorimétrico de

glicose oxidase e as proteínas plasmáticas totais (PPT – g/dL) pelo método de

biureto. Essas análises foram realizadas em espectrofotômetro UV/Visível (BIOPLUS

2000).

A determinação de trombócitos totais (μL/L), leucócitos totais (μL/L) e

leucometria específica (número de cada tipo de leucocitário em μL/L) foi realizada

em extensões sanguíneas coradas com uma combinação May Grunwald-Giemsa

Wright (Tavares-Dias e Moraes 2003) e as contagens totais seguiram

recomendações de Ishikawa et al. (2008).

2.6 Monitoramento da qualidade da água

Foram determinadas, durante o experimento, as seguintes variáveis físicas e

químicas da água: oxigênio dissolvido (OD), temperatura e condutividade elétrica,

com o auxílio de um oxímetro digital da YSI, modelo 85/10, pH com pHmetro digital

da YSI, modelo 60/10. A concentração de amônia total (NH3 + NH4+), segundo

Verdouw et al. (1978), nitrito (NO2-), gás carbônico (CO2) segundo Boyd e Tucker

(1992), sendo modificado, utilizando seringas de 10 ml, para evitar o contato das

amostras de água com o ar.

2.7 Análises estatísticas

Os parâmetros sanguíneos dos pirarucus e o monitoramento da água dos

aquários, após 24 h de exposição foram comparados mediante análise de variância

(ANOVA) de dois fatores (tempo de exposição e concentrações), seguido pelo teste

28

de Tukey, quando as diferenças foram significativas a 5% de probabilidade (Zar

1999).

3. RESULTADOS

3.1 Toxicidade do extrato de P. aduncum sobre os monogenéticos (in vitro)

Na tabela 1 está representada a mortalidade dos monogenéticos nas

diferentes concentrações de extrato de P. aduncum e tempo de exposição. As

concentrações de 100 e 120 ml/L de extrato, após 2 horas de exposição, causaram

100% de mortalidade dos monogenéticos. Após 3 horas, 100% dos monogenéticos

morreram em 80 ml/L, enquanto em 40 e 60 ml/L do extrato causou a morte de

apenas 90% dos parasitas. No grupo controle, 25% dos monogenéticos morreram

ao final do período de exposição (Tabela 1).

Tabela 1. Mortalidade in vitro de monogenéticos de brânquias de A. gigas em diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum após 2 h e 3 h de exposição.

Mortalidade dos monogenéticos (%)

Concentrações (ml/L)

2 horas 3 horas

0 (controle) 0 25

40 75 90

60 75 90

80 75 100

100 100 100

120 100 100

3.2 Efeitos da toxicidade aguda do extrato de P. aduncum nos parâmetros

sanguíneos de A. gigas

As alterações comportamentais foram observadas após uma hora de

exposição, nas concentrações de 40, 60 e 80 ml/L, os animais apresentaram

letargia, tanto em relação ao grupo controle quanto aos submetidos a 100 ml/L de

extrato, e não houve mortalidade. Já os animais submetidos a 100 ml/L do extrato

apresentaram hiperatividade, concentração nas proximidades da área de aeração,

aumento na frequência respiratória, seguida de exaustão e dificuldade de emersão

29

que permaneceram por, aproximadamente, três horas, com morte de três animais

(16,6%), tabela 2.

Tabela 01. Porcentagem de mortalidade e sobrevivência de A. gigas em diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum após 12 h e 24 h de exposição.

Tempo de

exposição 12 h 24 h

Concentrações

(ml/L)

Mortalidade

(%)

Sobrevivência

(%)

Mortalidade

(%)

Sobrevivência

(%)

0 0 100 0 100

40 0 100 0 100

60 0 100 0 100

80 0 100 0 100

100 16,6 83,4 16,6 83,4

Após 24 h de exposição em diferentes concentrações do extrato de P.

aduncum, os pirarucus não demonstraram alteração nos valores dos parâmetros

sanguíneos, exceto para o hematócrito, cujos valores médios foram

significativamente diferentes (p<0,05) em 40, 60, 80 ml/L comparados ao grupo

controle. Nessas concentrações, os valores de eritrócito e concentração de

hemoglobina demonstraram uma tendência na redução dos valores (Tabela 3).

30

Tabela 3. Parâmetros sanguíneos de pirarucus, A. gigas, expostos a diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum por 24 horas. Hb= hemoglobina, RBC= número de eritrócitos, HCM= hemoglobina corpuscular média, CHCM= concentração de hemoglobina corpuscular, VCM = volume corpuscular médio. Média ± desvio padrão.

Extrato de P. aduncum (ml/L)

Parâmetros 0 40 60 80 100

Hematócrito (%) 40,60±2,5a 31,60±4,4b 33,00±8,2b 33,80±4,2b 36,63±2,2ab

Hb (g/dL) 11,60±1,3 9,70±1,9 9,90±2,3 10,10±1,3 11,00±0,9

RBC(x106 cél/μL) 2,26±0,37 1,88±0,49 1,84±0,49 1,69±0,27 1,79±0,38

HCM (pg) 52,80±12,0 52,89±9,1 54,60±7,7 61,40±14,0 64,00±12,5

CHCM (%) 28,60±3,4 30,70±4,3 30,20±1,9 30,60±7,4 30,20±2,2

VCM (fL) 183,5±26,8 172,5±23,1 181,8±29,6 208,3±39,9 199,1±30,5

Glicose (mg/dL) 90,7±34,4 96,0±16,8 86,9±12,7 88,7±18,4 96,2±30,7

Proteína (g/dL) 1,86±0,31 1,63±0,18 1,59±0,27 1,72±0,26 1,91±0,26

Letras diferentes na mesma linha indicam médias significativamente diferentes dentro do mesmo tempo de exposição (p< 0,05).

Em relação à análise dos leucócitos e trombócitos, houve diferença

significativa apenas (p<0,05) no número de neutrófilos nas três maiores

concentrações (60, 80 e 100 ml/L) e nos eosinófilos em 40 ml/L, comparados com o

grupo controle (tabela 4).

Tabela 4. Trombometria total, leucometria total e leucometria específica absoluta (número de células/μL) de A. gigas submetidos a diferentes tratamentos com P. aduncum após 24 h de exposição (teste de tolerância) CGE = célula granulocítica especial. Médias ± desvio padrão.

Concentrações (ml/L)

Parâmetros Controle (0) 40 60 80 100

Trombócitos 96,67±19,01 81,78±7,00 93,42±20,41 80,46±7,67 100,93±16,51

Leucócitos 129,30±2,32 106,31±1,87 90,55±1,88 74,72±1,93 90,15±1,83

Linfócitos 46,82±5,27 36,55±2,36 34,65±16,44 33,23±11,2 34,57±12,22

Monócitos 57,75±20,47 48,56±6,77 47,53±5,05 36,80±9,14 51,11±6,19

Neutrófilos 22,34±5,62a 16,71±4,60a 6,029±3,98b 2,06±1,26b 3,37±2,37b

Eosinófilos 0,74±0,34a 4,17±0,96b 0,40±0,19a 1,03±0,84a 0,19±0,19a

CGE 1,63±0,51 0,312±0,47 1,94±1,02 1,59±0,51 0,89±0,88

Letras diferentes significam diferenças significativas (p<0,05) entre os tratamentos e o grupo controle

31

3.3 Qualidade da água dos aquários

As variáveis físicas e químicas da água dos aquários, com exceção da

condutividade elétrica, não apresentaram diferenças estatísticas significativas

(p>0,05) entre as diferentes concentrações do extrato de P. aduncum durante 24 h

de exposição (Tabela 4).

Tabela 5. Parâmetros físico-químicos da água dos aquários após 24 h de exposição de pirarucus, A. gigas a diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum OD= oxigênio dissolvido; pH= potencial hidrogeniônico, CO2= gás carbônico Média ± desvio padrão.

Concentração de P. aduncum (ml/L)

Parâmetros 0 40 60 80 100

OD (mg/L) 7,64±0,03 7,38±0,03 7,30±0,09 6,98±0,28 7,36±0,24

Temperatura (°C) 25,63±0,05 25,80±0,00 25,80±0,10 25,87±0,06 25,90±0,17

pH 7,64±0,02 7,56±0,04 7,54±0,01 7,42±0,03 7,45±0,05

CO2 (mg/L) 10,83±1,44 10,10±0,00 10.50±0,00 10,20±0,01 10,83±1,44

Amônia (mg/L) 2,01±0,02 1,92±0,00 1,83±0,01 1,82±0,03 1,79±0,00

Nitrito (mg/L) 0,104±0,009 0,117±0,013 0,100±0,02 0,102±0,29 0,153±0,07

Significância (p< 0,05)

A condutividade elétrica da água apresentou aumento proporcional às

concentrações do extrato, cuja variação entre o controle (0= sem adição do extrato)

e 100 ml/L, após uma hora de exposição dos peixes, foi 28,1 ± 1,09 a 84,3 ± 5,0

µS.cm-¹ e em 24 horas foi 62,0 ± 2,00 a 107,3 ± 4,36 µS.cm-¹ (Figura 1).

Foi observada após uma hora do início dos experimentos, a formação de

bolhas na água dos aquários, sendo mais intensa naqueles com maiores

concentrações do extrato de P. aduncum.

32

a

b

0

20

40

60

80

100

120

Controle 100

Condutivi

dad

e µ

S-¹

Concentrações de P. aduncum ml/L

24 h

Figura 1. Variação da condutividade elétrica da água dos aquários entre o controle e a maior

concentração do extrato durante 24 h de exposição de A. gigas. Letras diferentes significam médias

estatisticamente diferentes (p<0,05).

4. DISCUSSÃO

Uma característica na escolha de determinada planta para fins terapêuticos,

além de sua eficácia farmacológica comprovada, é ser uma espécie de baixa

toxicidade aos peixes (Maciel et al. 2002; Fonsêca 2005).

Os testes de toxicidade têm sido uma técnica utilizada para avaliar produtos

com o objetivo de estabelecer limites toleráveis pelos organismos vivos (Rand 2008).

Por meio desses testes, é possível determinar o tempo e a concentração em que o

produto testado é potencialmente prejudicial, sendo, portanto, diretamente

relacionados. Por exemplo, em altas concentrações e em curto tempo de exposição,

o produto pode ser prejudicial, e, ao contrário, baixas concentrações em tempos

longos podem produzir efeitos crônicos sub-letais ou mesmo letais durante longos

períodos (Rand 2008).

Testes in vitro são comuns em ensaios farmacológicos de substâncias

químicas, os quais contribuem com os testes de toxicidade in vivo. Ekanem et al.

(2004) avaliaram1,5 e 2,0 mg/L do extrato de sementes de P. guineense in vitro,

verificaram que estas podem causar 80 e 100% de mortalidade dos parasitas de

brânquias em Carassius auratus auratus; Sitjà-Bobadilla et al. (2006), avaliaram o

efeito da água destilada, formalina, limoseptic®, peróxido de hidrogênio (100 ppm -

30 min), cloro (60 ppm - 1 H), e praziquantel (PZQ) (50 ppm - 30 min) in vitro e in

33

vivo no tratamento contra ovos, larvas e adultos de Sparicotyle chrysophrii, um

parasita de Sparus aurata L, as larvas foram mais sensíveis aos testes in vitro que

os adultos; Smith et al. (2012), testaram concentrações (1.5 μg/mL e 200 μg/mL) in

vitro de praziquantel sobre Cardicola forsteri helmintos de Thunnus maccoyii, com

respostas em menos de cinco minutos.

No presente estudo, os testes in vitro com extrato aquoso de folhas, de P.

aduncum demonstraram que esta possui atividade anti-helmíntica contra os

monogenéticos, identificados aqui como Dawestrema cycloancistrium e D.

cycloancistrioides, em brânquias de pirarucu, e que são dose e tempo-dependentes.

Uma vez que vários compostos estão presentes numa planta, e de acordo

com a caracterização química já descrita na literatura para P. aduncum, além de

outros estudos sobre o efeito antiparasitário realizados (Belzile et al. 2000; Flores et

al. 2009), é possível que a mortalidade dos parasitos tenha ocorrido pela ação dos

compostos secundários como o fenilpropanóide dilapiol ou ainda pela ação conjunta

dessa lignina e outros compostos como o sarizan e safrol, por apresentarem em

suas estruturas o grupo metilenodioxidofenil (Mukerjee et al. 1979; e Bernard et al.

1995), considerados importantes inibidores de monooxigenases dependentes de

citrocromo P450 (Omura e Sato 1964). Enzimas microssomais (citocromo P450) são

responsáveis pelas reações de biotransformação, ou desintoxicação de

xenobióticos, quando inibidas aumentam o efeito tóxico dos compostos ativos.

Dessa forma, acredita-se que no presente estudo a inibição parasitária tenha

ocorrido por esses mesmos princípios.

Os testes in vitro são importantes indicadores e da eficácia de fármacos

contra determinado patógeno. Entretanto, estes não são suficientes para definir a

eficácia do produto em peixes (Figueiredo 2011). O fato de determinada substância

apresentar efeito parasiticida, bactericida e outros, não comprova que esta será

absorvida pelo organismo do animal, atóxica para o peixe chegará ao órgão

infectado e auxiliará na eliminação do patógeno (Figueiredo 2011). Isso porque,

existem algumas barreiras naturais, como por exemplo, a produção de muco pelos

peixes, e fatores abióticos.

Testes de toxicidade e efeitos tóxicos devem ser realizados quando se estuda

a eficácia de uma nova planta. Neste caso, o animal deve estar em perfeitas

condições de saúde para que seja avaliado se a planta causa ou não efeitos

deletérios (Figueiredo 2011).

34

Hematologia, bioquímica e histologia são áreas da fisiologia amplamente

utilizadas como importantes ferramentas para auxiliar na avaliação e diagnóstico do

estado de saúde de organismos aquáticos em bioensaios realizados com

substâncias naturais (Osman et al. 2010; Hirazawa et al. 2011). Isto porque, sob

condições de estresse, os animais podem alterar estes parâmetros como uma

resposta para manter a homeostase fisiológica. Esta adaptação é tolerada por certo

tempo e, se persistir, pode levar a exaustão e até a morte do animal (Wendeelar-

Bonga1997; Barton 2002).

Como resposta ao estresse, as alterações nos parâmetros hematológicos

podem indicar a ocorrência de hemoconcentração ou hemodiluição (Houston et al.

1996). A hemoconcentração pode ser uma estrtégia para aumentar a capacidade de

transporte de oxigênio do sangue sob situações de elevada demanda de energia

(Carvalho e Fernandes 2006; Trenzado et al. 2008). Entretanto, agentes estressores

que podem comprometer a absorção do ferro, a malformação ou hemólise dos

eritrócitos, a inibição da síntese de hemoglobina, a competição pelo sítio de ligação

do oxigênio podem causar uma hemodiluição ou anemia nos peixes, dessa forma,

reduzindo a capacidade de transporte de oxigênio do sangue (Heath 1995; Tavares-

Dias e Moraes 2004, Das et al. 2009).

No presente estudo, os efeitos de diferentes concentrações do extrato de P.

aduncum em juvenis de pirarucus induziram alterações nos valores de hematócrito

em relação ao controle. Tais alterações pode ser uma consequência na diminuição

do número e não no tamanho dos eritrócitos, como verificados pelos valores de RBC

e VCM (Tabela 3). Por outro lado, a diminuição na concentração de Hb nas

concentrações mais baixas da P. aduncum (40 e 60 ml/L) é, embora não acentuada,

uma resposta à hemólise dos eritrócitos. Entretanto, em altas concentrações do

fitoterápico, parece ocorrer à síntese da Hb, como pode ser sugerido pelos valores

de HCM e CHCM. Apesar das alterações citadas, estas não devem ter sido a causa

da mortalidade de 16,6% dos peixes em 100 ml/L do extrato de P. aduncum.

Alterações nos parâmetros hematológicos causadas pelo efeito de extratos

vegetais tem sido descritas pos diversos autores, Kavitha et al. (2011) estudaram o

efeito tóxico do extrato de Moringa olerifera, em Cyprinus carpio, cujos valores de

RBC, Hb e Ht diminuiram, provavelmente, devido a hemólise dos eritrócitos causada

pelo extrato da planta. Entretanto, Osman et al. (2010), avaliaram o efeito do extrato

de folhas Cydonia oblonga Miller na diminuição do efeito da radiação ultravioleta em

35

Clarias gariepinus, o extrato foi capaz de impedir a destruição da hemoglobina dos

peixes exposto a UVB, devido a ação de polifenóis contido na planta que podem

interagir com a bicamada da membrana dos eritrocitos, diminuindo a fluidez e a

difusão de radicais livres (Chaudhuri et al. 2007), enquanto os peixes expostos a

UVB somente, sofreram redução de RBC, Hct e Hb. Ao contrário, o extrato de

Nigella sativa sobre a resposta imune Oncorhynchus mykiss causou aumento Hct

(Dorucu et al. 2009).

Alterações nos leucócitos e trombócitos sanguíneos podem ser utilizadas

como ferramenta para avaliar o estado de saúde dos peixes frente a fatores

ambientais, visto que estas alterações ocorrem em resposta aos danos causados

por agentes agressores (Tavares-Dias et al. 2011). Os resultados encontrados neste

estudo mostraram redução no número de neutrófilos nos peixes nas maiores

concentrações do extrato e aumento dos eosinófilos na menor concentração testada.

Os neutrófilos são a primeira linha de defesa contra patógenos e são as primeiras

células a chegarem nos locais de inflamação (Campbell 2004). Em Oreochromis

mossambicus ocorre monocitopenia e a neutropenia devidas à elevada migração e à

atividade fagocítica nas brânquias, fígado e rins, que foram danificados pelo cobre

(Nussey et al. 1995). Essa pode ter sido, a causa da neutropenia neste estudo,

devido aos grandes danos nos tecidos branquiais causados por monogenéticos. Em

mamíferos a produção de eosinófilos está relacionada à doenças alérgicas e

parasitárias. Em peixes as funções dos eosinófilos ainda não é bem definida,

entretanto em Piractus mesopotamicus (Ranzani-Paiva et al. 1998) Colossoma

macropomum (Ranzani-Paiva et al. 1998) a presença dessas células foi relacionada

a doenças.

A hiperglicemia é outro importante indicador de estresse em peixes em

condicões de campo, pois ajuda a suprir o aumento da demanda energética do

organismo (Jeney et al. 1997; Mazeaud et al. 1977; Benfey e Biron 2000). Esse

parâmetro tem contribuído para avaliar os efeitos adversos de diversos fármacos em

peixes (Borges et al. 2007; Winkaler et al. 2007; Hori et al. 2008; Maciel 2009;

Kavitha et al. 2011). Neste trabalho, os efeitos da P. aduncum não foram suficientes

para aumentar a demanda por glicose o que contribui com a suposição que as

concentrações usadas nos bioensaios são de baixa toxicidade. Esses dados são

corroborados com os valores de proteínas totais obtidos nas diferentes

concentrações testadas.

36

Além da eficácia no tratamento contra patógenos, a P. aduncum tem sido

citada na literatura pelo seu poder calmante, devido a presença de alcaloides que

atuam no sistema nervoso central (Parmar et al. 1997; Lorenzi e Matos 2002). A

análise comportamental confirma que essa planta diminuiu os movimentos dos

peixes, os quais se tornaram mais lentos durante as 24 h de experimento nas

diferentes concentrações testadas. Em geral, os calmantes, além de outros efeitos,

baixam o tônus muscular e altera a coordenação de movimentos. Em 100 ml/L do

extrato aquoso da P. aduncum, esses podem ter sido os sintomas que levaram a

mortalidade de tres indivíduos nas primeiras três horas de experimentos. Segundo

Honczark e Inoue (2009), banhos anestésicos em peixes pulmonados levam ao risco

de afogamento do animal, pois sua absorção, ainda que pouca possa ser suficiente

para impedir que este chegue até a superfície para respirar. Novas pesquisas sobre

as respostas metabólicas do pirarucu podem contribuir para o entendimento sobre o

possível efeito anestésico da P. aduncum.

A qualidade da água dos aquários experimentais, no presente trabalho,

esteve dentro dos limites considerados adequados para peixes da Amazônia

(Kubitza 2003; Ono 2011). Entretanto, durante todo o experimento foram observadas

alterações na condutividade elétrica da água influenciadas, principalmente, pelas

diferentes concentrações de extrato de P. aduncum. Estudos realizados com extrato

de folhas de neem, (Azadirachta indica) em Proclodus lineatus, também

apresentaram aumento significativo na condutividade elétrica da água, com variação

de 162.0 a 1226 µS.cm-¹ (Winkaler et al. 2007).

Os valores de condutividade elétrica da água estão relacionados à presença

de íons dissolvidos na água, entre outros, cálcio, magnésio, potássio, sódio,

carbonato, sulfato, cloreto e o íon amônio, quando encontrado em elevadas

concentrações (Esteves 1998). Nas plantas, parte desses minerais, considerados

macronutrientes (nitrogênio, fósforo, potássio, magnésio, sódio), adquiridos pelo

processo de nutrição mineral, são encontrados em diferentes concentrações

(Epstein e Bloom 2004). Assim, supõe-se que, o aumento dos valores da

condutividade relacionados ao extrato observados neste trabalho, tenha ocorrido

pelo aumento na concentração desses íons na água. No controle, supõe-se que o

aumento observado, embora menor, tenha ocorrido perda de íons das brânquias

para a água, em função da hiperatividade apresentada pelos peixes no início dos

experimentos.

37

Quanto à formação de bolhas na superfície da água dos aquários, estas

podem ser atribuídas a compostos derivados do metabolismo secundários da P.

aduncum, denominado saponinas. Estas substâncias estão relacionadas com o

sistema de defesa das plantas (Wina et al. 2005). Quando presentes em meio

aquoso apresentam ação detergentes com a formação de espumas na superfície da

água.

5. CONCLUSÃO

As concentrações acima de 80 ml/L do extrato de P. aduncum, testadas neste

estudo, possuem alta toxicidade capaz de matar parasitos monogenéticos

(Dawestrema cycloancistrium e D. cycloancistrioides) de pirarucu in vitro. Entetanto,

concentrações abaixo de 80 ml/L não comprometeram a homeostase fisiológica

desta espécie em 24 h de exposição.

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CAPITULO 2

Efeito do extrato aquoso da Piper aduncum L, no controle de monogenéticos

em pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822

RESUMO

O uso de produtos químicos no controle de parasitas na aquicultura pode causar

resistência imunológica nos peixes, tornando-os mais patogênicos, além de

prejudicar a saúde do homem e do ambiente. Uma alternativa é o uso de produtos

naturais, que comparados aos quimioterápicos, são biodegradáveis e de baixa

toxicidade. Este trabalho teve como objetivo avaliara a eficácia do fitoterápico Piper

aduncum L, uma planta de ampla distribuição nos trópicos, sobre os monogenéticos

de pirarucu. Para isso, foram testadas três concentrações do extrato aquoso de P.

aduncum 40, 60 e 80 ml/L e o controle (sem o fitoterápico), em banhos curtos (0,5 h)

e longos (24 h). Além da carga parasitária, foram avaliados os parâmetros

indicadores de estresse: hematócrito, número de eritrócitos, concentração de

hemoglobina, índices hematimétricos, glicose e proteína total plasmática dos peixes

dos diferentes tratamentos. Os resultados demonstraram que não houve diferença

significativa na redução da carga parasitária dos peixes expostos em banhos por 0,5

horas e houve aumento da hemoglobina [Hb] no tratamento 40 ml/L. No banho longo

(24 h), todas as concentrações apresentaram redução da carga parasitária,

entretanto o tratamento com 80 ml/L proporcionou o melhor resultado com 80,16%

de eficácia. As diferentes concentrações de extrato aquoso de P. aduncum em

banhos curtos (0,5) e longos (24 h) apresentou uma tendência na redução dos

valores de Ht e RBC. Ao contrário, [Hb], HCM e CHCM e glicose plasmática

demonstraram uma tendência na elevação de seus valores em 0,5 h, e em 24 h de

exposição. Os resultados indicaram que as maiores concentrações de P. aduncum

testadas causaram maiores alterações nos índices hematológicos, embora as

eficácias obtidas tenham sido altas.

Palavras-chave: Fitoterápico, cultivo, parasitas, peixe.

50

CHAPTER 2

Effect of aqueous extract of Piper aduncum L in controlling monogeneans in

pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822

ABSTRACT

The use of chemicals to control pests in aquaculture can cause immunological

resistance in fish, making them more pathogenic, and harming human health and the

environment. An alternative is the use of natural products that, compared to

chemotherapy, are biodegradable and with low toxicity. This study aimed to assess

the efficacy of herbal Piper aduncum L, a plant widely distributed in the tropics, on

monogeneans pirarucu. For this, three concentrations of aqueous extract of P.

aduncum were tested: 40, 60 and 80 ml/L and the control (without the

phytotherapeutic) in short (0.5 h) and long (24 h) baths. Besides the parasitic load,

the stress indicators were evaluated: hematocrit, number of erythrocytes, hemoglobin

concentration, erythrocyte indices, glucose and total plasma protein fish of different

treatments. The results showed no significant difference in reducing the parasite load

of fish exposed in baths for 0.5 hours and increased hemoglobin [Hb] in the treatment

40 ml/L. In long bath (24 h), all concentrations had reduced parasite burden, however

treatment with 80 ml/L provided the best result with 80.16% efficiency. The different

concentrations of aqueous extract of P. aduncum in short baths (0,5) and long (24 h)

showed a trend in the reduction of hematocrit and RBC values. Rather, [Hb], MCH

and MCHC and plasma glucose showed a trend in the increase of their values at 0.5

h, and 24 h of exposure. The results indicated that the highest concentrations of P.

aduncum tested caused major changes in hematological indices, although the

efficiencies obtained were high.

Keywords: Herbal, farming, pests, fish.

51

1. INTRODUÇÃO

A criação do pirarucu, apesar do grande potencial para a aquicultura

brasileira, têm sido pouco expressiva, cuja produção em 2010 foi cerca de 10,4 t

(Ministério da Pesca e Aquicultura-MPA 2012). A primeira grande barreira para a

produção comercial dessa espécie é a falta de domínio de técnicas de reprodução

induzida, onde a oferta de alevinos depende da desova natural, que pode alcançar

de 3.000 a 5.000 espécimes (Ono 2011). Apesar desse número, apenas 10 a 20%

sobrevivem, principalmente devido as práticas inadequadas, que vão desde o

momento da retirada dos alevinos dos pais, às condições inadequadas de qualidade

da água, treinamento alimentar, má nutrição, alta infestação de parasitos,

principalmente por monogenéticos (Araújo et al. 2009a; Ono 2011). Desde os

primeiros dias de vida, o pirarucu é susceptível a ação dos monogenéticos,

aumentando a carga parasitária com o crescimento do animal (Araújo et al. 2009a).

Os monogenéticos (Filo Platyhelminthes, Classe Monogenoidea), geralmente são

ectoparasitos que habitam as brânquias, pele e nadadeiras do hospedeiro. São

considerados os mais importantes parasitos para a piscicultura, por apresentarem

alta especificidade parasitária, ciclo monóxeno e fácil transmissão (Pavanelli et al.

2008). A intensidade das lesões provocadas por estes parasitos depende do número

de parasitos, da estrutura afetada, da idade e dos fatores genéticos do hospedeiro

(Thatcher 2006; Pavanelli et al. 2008; Woo 2006; Noga 2010). Nas brânquias, esses

parasitas podem causar hipersecreção de muco, hiperplasia celular e fusão de

filamentos das lamelas e no tegumento, as lesões podem ser pouco acentuadas.

Entretanto, os ferimentos causados pelas estruturas de fixação (haptor) facilitam a

entrada de patógenos secundários, como fungos e bactérias (Pavanelli et al. 2008).

Existem vários fármacos descritos na literatura para tratamento de

monogenéticos, dentre eles: albendazol; levamisol; praziquantel (Onaka et al. 2003;

Maciel 2009; Schalch et al. 2009); formalina (Fajer-Ávila et al. 2003) peróxido de

hidrogênio (Mansell et al. 2005); cloreto de sódio e formalina (Silva et al. 2009a);

sulfato de cobre (CuSO4) (Tavares-Dias et al. 2011). Atualmente, o uso desses e de

outros quimioterápicos utilizados no controle de monogenéticos tem sido realizado

de forma incorreta e empírica, visto que não existe uma legislação regulamentadora

no Brasil para registro desses produtos na aquicultura, causando vários prejuízos,

como aumento da resistência dos parasitos aos fármacos, resíduos nos tecidos dos

peixes, contaminação do ambiente aquático e do homem (Campos 2005; Maximiano

52

et al. 2005; FAO 2010). Com isso, surge a necessidade de pesquisas que possam

desenvolver métodos alternativos para o tratamento de enfermidades de peixes na

piscicultura, como o uso de fitoterápicos, que, comparados aos quimioterápicos,

possuem baixo custo, diminui a contaminação ambiental e é seguro ao homem

(Chagas 2004).

Na literatura são descritos os efeitos do uso de alguns fitoterápicos no

controle de doenças de peixes na piscicultura brasileira (Martins et al. 2002;

Winkaler et al. 2005; Cruz 2005; Silva et al. 2009b; Fujimoto et al. 2012). Entretanto,

são necessários mais estudos utilizando, principalmente, plantas da biodiversidade

amazônica, que, apesar da sua potencialidade, ainda é pouco explorada. Alguns

estudos tem avaliado a eficácia da Piperaceae Piper aduncum L, conhecida como

pimenta de macaco, uma planta nativa da região amazônica que possui princípio

ativo contra patógenos de importância econômica na agricultura (Bastos 2004;

Estrela et al. 2006; Fazolin et al. 2007; Silva et al. 2007), na medicina humana

(Magalhães 2010) e na medicina veterinária (Silva 2008). Apresenta alto teor de óleo

essencial (2,5 a 4%), sendo seu componente majoritário o dilapiol (75 a 95 %).

Baseada nas informações já existentes sobre a potencialidade farmacológica

desta planta e ainda para contribuir com os avanços sobre os estudos de novos

produtos fitoterápicos, este trabalho avaliou a eficácia da P. aduncum no controle de

monogenéticos de juvenis de pirarucu, naturalmente parasitados, e seus efeitos nas

respostas fisiológicas dos peixes.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Aquisição e aclimatação dos peixes

Foram utilizados 144 juvenis de pirarucu com 24,9 ± 4,4 g, provenientes de

uma piscicultura comercial localizada no município de Santarém, PA. Após o

transporte, os peixes foram aclimatados por 20 dias em tanques de polietileno com

capacidade para 500 L de água, abastecido com água de poço artesiano, com fluxo

contínuo e aeração constante. Os peixes foram alimentados com ração comercial

extrusada (45% proteína bruta) ad libitum, quatro vezes ao dia.

Durante este período, amostras de muco foram retiradas dos peixes, para

verificar a presença de parasitos. Para isso, utilizou-se a técnica de raspado com o

auxílio de lâminas e lamínulas no sentido ântero-posterior da superfície externa e

53

das estruturas branquiais (Eiras et al. 2006), onde foi constatada a presença de

parasitos monogenéticos em 100% dos peixes examinados.

2.2 Aquisição e preparação da solução estoque de P. aduncum

Folhas de P. aduncum foram coletadas nas dependências do horto da

Universidade Nilton Lins, Manaus, AM, entre 8 e 10 h, no período de dezembro de

2010 a março de 2011. As folhas foram selecionadas, lavadas e secas em estufa a

45 ± 0,5 ºC por 72 h. Após a secagem, o material foi triturado em um moinho

(Tecnal, Tipo Willy-TE 650), e mantido sob baixas temperaturas (aproximadamente

10 ºC) (Prista et al. 1981), e ao abrigo da luz.

Para elaborar o extrato aquoso foram utilizadas 10 g de folhas trituradas em um litro

de água destilada (10:1000 m/v) (Silva et al. 2009b). Em seguida, realizou-se a

homogeneização da suspensão com o auxilio de um bastão de vidro, seguida de

repouso por uma hora. Após isso, foram filtradas com um filtro de nylon para a

separação das partículas vegetais.

2.3 Banhos com a P. aduncum

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, o qual consistiu de

quatro tratamentos: 0 (controle), 40, 60 e 80 ml/L de extrato aquoso da P. aduncum ,

com seis peixes em cada unidade experimental, totalizando 12 aquários com

capacidade de 60 litros. Durante os banhos curtos (0,5 h) e longos (24 h), não houve

troca de água e a oxigenação foi mantida por aeradores. As concentrações testadas

foram estimadas pelos resultados obtidos nos testes de toxicidade in vivo, onde foi

avaliada a tolerância do pirarucu ao extrato aquoso, e in vitro, com o uso de

parasitos monogenéticos (capítulo I). Todas as concentrações foram testadas em

triplicata e o bioensaio realizado segundo recomendações da USEPA (2002) e

ABNT (2004).

2.4 Coleta de sangue e determinação dos parâmetros hematológicos

Amostras de sangue foram coletadas, por punção da veia caudal, utilizando

seringas de 3 mL rinsadas com EDTA a (10%) e armazenadas sob refrigeração a 4

°C. O sangue total foi destinado à determinação do hematócrito (Ht /%), pelo método

de microhematócrito; contagem de eritrócitos (RBC-eritrócitos/µL) usando uma

câmara de Neubauer® em solução de Natt e Herrick (1952) e concentração de

54

hemoglobina ([Hb]-g/dl) pelo método colorimétrico da cianometahemoglobina. Os

índices hematimétricos-volume corpuscular médio (VCM-fL), concentração de

hemoglobina corpuscular média (CHCM-%) e hemoglobina corpuscular média

(HCM-pg) foram calculados a partir dos valores de Ht, RBC e [Hb], segundo

Wintrobe (1934).

O plasma sanguíneo, obtido por centrifugação do sangue total, foi destinado à

análise da glicose plasmática (mg/dL) pelo método enzimático-colorimétrico de

glicose oxidase e as proteínas plasmáticas totais (PPT–g/dL) pelo método de

biureto. Essas análises foram realizadas em espectrofotômetro UV/Visível (BIOPLUS

2000).

2.5 Análises parasitológicas e eficácia do tratamento

Após a coleta de sangue, cada peixe foi morto por concussão cerebral de

acordo com recomendações da AVMA (2007), para retirada das brânquias, e, em

seguida, acondicionadas em frascos contendo formalina 5% para fixação das

amostras para análises posteriores (Eiras et al. 2006). A contagem do número total

de parasitos monogenéticos por peixe foi realizada em placa de Petri com auxílio de

um estereomicroscópio (Zeis®).

Para identificação das espécies, foram selecionados 100 espécimes de

monogenéticos, e identificados seguindo as instruções de Kritsky (1985) e Thatcher

(2006), tendo como principais estruturas de identificação o haptor e o complexo

copulatório, a partir da técnica desenvolvida por Lim, (2003 apud Eiras et al. 2006).

Os índices parasitários foram calculados de acordo com Bush et al. (1997). A

estimativa da porcentagem de eficácia dos tratamentos foi calculada segundo

Martins et al. (2001) e Onaka et al. (2003), utilizando a expressão matemática:

Eficácia = (média do n° de parasitos do grupo controle – média do n° de parasitos do

grupo tratado) x 100 / média do n° de parasitos do grupo controle.

2.6 Monitoramento da qualidade da água

Foram determinadas, durante o experimento, as seguintes variáveis físicas e

químicas da água: oxigênio dissolvido (OD), temperatura (ºC) condutividade elétrica

(µS) e pH, utilizando sondas multiparamétricas da YSI. As concentrações de amônia

total (NH3 + NH4+) (mg/L) e nitrito (NO2

-) (mg/L) pelos métodos colorimétricos de

Verdouw et al. (1978) e Boyd e Tucker (1992) respectivamente. Alcalinidade total,

55

dureza total (CaCO3/L) (mg) foram analisadas por titulação descrita por Boyd e

Tucker (1992) e o gás carbônico (mg/L) segundo Boyd e Tucker (1992) modificado,

utilizando seringas de 10 ml, para evitar o contato das amostras de água com o ar.

2.7 Análises estatísticas

Os resultados de carga parasitária dos peixes, variáveis físicas e químicas da

água e parâmetros sanguíneos foram analisados pela análise de variância (ANOVA)

com medidas repetidas no tempo, seguido pelo teste de Tukey, quando as

diferenças foram significativas a 5% de probabilidade (Zar 1999).

3. RESULTADOS

Os resultados obtidos das variáveis físicas e químicas da água dos aquários,

com exceção da condutividade elétrica, não apresentaram diferenças significativas

(p>0,05) em relação ao grupo controle (sem adição do extrato) (Tabelas 1 e 2).

Entretanto, foi observado aumento significativo (p<0,05) da condutividade elétrica da

água com a adição do extrato na água, após 0,5 h e 24 h de exposição. Nos banhos

curtos (0,5 h) a variação entre o controle (sem adição do extrato) e a maior

concentração do extrato (80 ml/L), foi 35,2 ± 0,55 e 85,7 ± 3,97 µS.cm-1

respectivamente (Figura 1). Em 24 h (banhos longos) a variação foi: 36,02 ± 7,90 e

68,50 ± 12,11 µS.cm-1, entre o controle e 80 ml/L, respectivamente (Figura 1).

a

b

a

b

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Controle 80

Condutiv

idade µ

S-¹

Concentrações de P. aduncum ml/L

24 h

0,5 h

Figura 1. Variação da condutividade elétrica da água dos aquários entre o controle e a maior

concentração do extrato durante 0,5 e 24 h de exposição de A. gigas. Letras diferentes significam

médias estatisticamente diferentes (p<0,05).

56

Tabela 1. Variáveis físicas e químicas da água dos aquários, após 0,5 h de exposição de A. gigas a diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum. OD= oxigênio dissolvido; pH= potencial hidrogeniônico; CO2= gás carbônico; AT=alcalinidade total; DT= dureza total; AT= amônia total. Média ± desvio padrão.

Concentrações de P. aduncum (ml/L)

Variáveis Controle 40 60 80

OD (mg/L) 7,14±0,07 7,09±0,04 7,15±0,13 7,12±0,12

Temperatura (°C) 25,43±0,4 25,77±0,2 25,43±0,5 25,67±0,5

pH 6,16±0,19 6,36±0,16 6,19±0,29 6,25±0,28

CO2 (mg/L) 10,16±0,28 10,8±1,4 11,67±1,4 10,83±1,4

AT (mg CaCO3/L) 1,03±0,12 1,15±0,11 1,35±0,16 1,32±0,23

DT(mg CaCO3/L) 0,73±0,28 0,74±0,06 0,7±0,09 0,79±0,05

AT (mg/L) 2,01±0,65 1,53±0,11 1,79±0,31 1,68±0,42

Nitrito (mg/L) 0,020±0,01 0,19±0,30 0,18±0,10 0,018±0,03

Letras diferentes na mesma linha indicam médias significativamente diferentes (p< 0,05).

Em relação às variáveis sanguíneas, no banho curto (0,5 h), somente a

concentração de hemoglobina em 40 ml/L do extrato de P. aduncum foi

significativamente maior (p<0,05) em relação ao controle (Tabela 3).

Tabela 2. Variáveis físico-químicas da água dos aquários, após 24 h (banho longo) de exposição de A. gigas a diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum. OD= oxigênio dissolvido; pH= potencial hidrogeniônico; AT=alcalinidade total; DT= dureza total; AT= amônia total. Média ± desvio padrão.

Concentrações de P. aduncum (ml/L)

Parâmetros Controle 40 60 80

OD (mg/L) 6,64±0,09 6,61±0,16 6,54±0,00 6,47±0,04

Temperatura (°C) 26,76±0,06 27,11±0,06 27,01±0,12 26,95±0,1

pH 7,01±0,07 6,72±0,055 6,60±0,03 6,54±0,02

CO2 (mg/L) 15,83±1,44 15,00±0,25 16,66±1,44 17,50±1,25

AT (mgCaCO3/L) 1,00±0,03 1,07±0,06 1,25±0,00 1,28±0,075

DT (mg CaCO3/L) 0,70±0,00 0,77±0,00 0,86±0,03 0,99±0,01

AT (mg/L) 1,42±0,36 0,91±0,47 0,86±1,0 0,99±0,19

Nitrito (mg/L) 0,0155±0,15 0,108±0,14 0,069±0,06 0,05±0,01

Significância (p< 0,05)

57

Tabela 3. Parâmetros sanguíneos de A. gigas expostos a diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum por 0,5 horas. RBC= eritrócitos, [Hb]= hemoglobina, HCM= Hemoglobina corpuscular média, CHCM= concentração de hemoglobina corpuscular média, VCM= volume corpuscular médio, PT= proteína total. Média ± desvio padrão.

Concentração de extrato de P. aduncum (ml/L)

Parâmetros 0 (controle) 40 60 80

Ht (%) 35,33±5,05 35,83±2,82 33,94±6,16 33,61±5,41

RBC(x106 cl/μL) 2,13±0,21 1,90±0,39 1,85±0,46 1,95±0,53

[Hb] (g/dL) 10,8172±1,94a 11,39± 1,59b 11,01±1,82ab 10,47±1,10

HCM 50,89±8,7 60,72±5,82 61,19±9,04 57,37±14

CHCM (%) 30,56±2,49 31,79±3,74 31,71±1,18 30,77±3,08

VCM (fL) 166,52±24,09 193,94±32,29 193,24±30,79 187,71±58,67

Glicose(mg/dL) 56,43±27,06 61,09±20,71 59,53±12,01 63,96±11,47

PT (g/dL) 1,57±0,27 1,53±0,23 1,48±0,25 1,52±0,30

Letras diferentes na mesma linha indicam médias significativamente diferentes (p< 0,05).

Nos banhos longos (24 h), nenhum dos parâmetros sanguíneos analisados

apresentou diferença significativa (Tabela 4). Entretanto, pode-se observar uma

tendência na redução nos valores de hematócrito e RBC nos peixes expostos aos

banhos com extrato de P. aduncum.

Tabela 4. Parâmetros sanguíneos de A. gigas expostos a diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum por 24 horas. RBC= eritrócitos, [Hb]= hemoglobina, HCM= Hemoglobina corpuscular média, CHCM= concentração de hemoglobina corpuscular média, VCM= volume corpuscular médio, PT= proteína total, CT= colesterol total. Média ± desvio padrão.

Concentração de extrato de P. aduncum (ml/L)

Parâmetros 0 (controle) 40 60 80

Hematócrito (%) 37,70±7,75 31,95±4,91 29,30±8,13 30,72±9,50

RBC (x106cél/µL) 1,73±0,45 1,45±0,37 1,35±0,65 1,39±0,41

[Hb] (g/dL) 9,30±2,57 8,39±1,35 8,84±2,55 9,88±2,46

HCM 54,15±9,20 64,33±10,65 55,99±16,56 67,75±13,75

CHCM (%) 26,22±3,01 26,074±3,07 33,22±9,5 33,15±6,59

VCM (fL) 208,41±39,59 249,56±48,36 170,59±38,39 210,32±53,10

Glicose (mg/dL) 49,71±18,62 58,21±22,20 56,67±20,76 64,38±7,82

PT (g/dL) 1,53±0,26 1,41±0,11 1,47±0,19 1,56±0,32

Significância (p< 0,05)

58

O resultado da atividade anti-helmíntica do extrato aquoso de pimenta de

macaco em banhos curtos (0,5 h) e longos (24 h) para pirarucus infectados por

monogenéticos está representado na tabela 6. Neste estudo, foram identificadas

duas espécies de monogenéticos para pirarucu, Dawestrema cycloancistrium (58%)

e Dawestrema cycloancistrioides (42%). No banho curto (0,5 h), não houve diferença

significativa (p>0,05) entre os tratamentos e a maior concentração do extrato

aquoso, 80 ml/L, apresentou uma baixa eficácia (12,98%) na redução da carga

parasitária em relação ao grupo controle. Não foram observadas mortalidades e nem

sinais de intoxicação nos exemplares expostos aos diferentes tratamentos.

Tabela 6. Porcentagem de eficácia do extrato aquoso de P. aduncum em banhos curtos (0,5 h) e longos (24 h) contra monogenóides de Arapaima gigas.

Tratamento Eficácia (%)

0,5 h

Eficácia (%)

24 h

Controle _ _

40 ml/L 9,12 49,47

60 ml/L 24,4 58,4

80 ml/L 12,98 80,16

No banho longo (24 h), o melhor resultado ocorreu em 80 ml/L, com redução

significativa (p<0,05) da carga parasitária em relação ao grupo controle, tendo

80,16% de eficácia. Foi observada uma diminuição significativa (p<0,05) na carga

parasitária dos peixes expostos a diferentes concentrações do extrato aquoso de P.

aduncum em relação ao controle (Figura 1). Os valores médios da intensidade de

parasitos nos tratamentos controle (sem adição do extrato) e 40, 60 e 80 ml/L do

extrato de P. aduncum foram: 346,87 ± 62,7, 148,5 ± 55,7, 174,8 ± 47,1e 68,87 ±

31,16 respectivamente (Figura 1).

59

0 40 60 80

Extrato de P. aduncam (mg/L)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Abundância

Figura 2. Abundância de monogenéticos em Arapaima gigas após banhos longos (24 h) com diferentes concentrações do extrato aquoso de Piper aduncum (p<0,05). 0= controle (sem o extrato aquoso). Letras diferentes significam diferenças significativas entre as médias (p<0,05).

4. DISCUSSÃO

Em experimentos de bioensaios, o acompanhamento da qualidade da água,

principalmente em testes de toxicidade, tem sido uma prática comum, devido a

influência das variáveis físicas e químicas da água sobre a biodisponibilidade e

absorção do produto testado (Affonso et al. 2009; Tavares-Dias et al. 2011). A

qualidade da água dos aquários experimentais, no presente trabalho, esteve dentro

dos limites considerados adequados para peixes da Amazônia (Kubitza 2003; Ono

2011). Apesar disto, o aumento da condutividade elétrica da água, observado nos

banhos curtos (0,5 h) e longos (24 h), vem corroborar com os resultados obtidos no

capítulo I, onde pirarucus foram exposto por 24 h a diferentes concentrações do

extrato de P. aduncum (0, 40, 60, 80 e 100 ml/L), cujos valores estiveram entre 28,1

± 1,09 a 107,3 ± 4,36 µS.cm-¹ do controle (sem extrato) ate 100 ml/L de extrato.

Winkaler et al. (2007) registraram aumento da condutividade elétrica da água (162,0

a 1226 μS.cm−1), nos experimentos com extrato de folhas de neem, (Azadirachta

indica) para Prochilodus lineatus durante 24 h de exposição. Cruz (2005) observou

variação na condutividade (0,165 a 0,450 μS.cm−1) em testes com o paration metílico

e azadiractina contida no extrato aquoso de folhas secas de nim (A. indica) no

controle de Anacanthorus penilabiatus em Piaractus mesopotamicus. Uma

a

b

b

c

Concentrações de P. aduncum ml/L

Abu

ndâ

ncia

60

explicação provável para o aumento da condutividade elétrica na água pode ser

devido a liberação de macronutrientes (nitrogênio, fósforo, potássio, magnésio,

sódio) diluídos nos extrato das plantas avaliadas.

Um dos pré-requisitos para a classificação de produtos destinados a

aquicultura é avaliar o efeito tóxico que determinadas substâncias provocam nos

peixes (Xie et al. 2008; Das et al. 2009; Suvetha et al. 2010; Kumar et al. 2011).

Uma excelente ferramenta que tem corroborado com estes estudos é o

acompanhamento dos parâmetros sanguíneos utilizados na detecção de alterações

fisiopatológicas em diferentes condições de estresse em peixes (Ranzani-Paiva et

al. 2005; Tavares-Dias e Moraes 2007; Barcellos et al. 2009; Clauss et al. 2008;

Sepici-Dinçel et al. 2009; Osman et al. 2010; Sharma et al. 2010). Assim, o

monitoramento dos parâmetros sanguíneos sob práticas terapêuticas, tem sido uma

ferramenta essencial para detectar alterações fisiológicas importantes para a

homeostase dos peixes (Maciel 2009; Tavares-Dias et al. 2011; Harikrishnan et al.

2011).

No presente trabalho, o pirarucu exposto a diferentes concentrações de

extrato aquoso de P. aduncum em banhos curtos (0,5) e longos (24 h), apresentou

uma tendência na redução dos valores de Ht e RBC. Ao contrário, [Hb], HCM e

CHCM demonstraram uma tendência na elevação de seus valores em 0,5 h,

enquanto os dois últimos parâmetros foram elevados em 24 h de exposição.

Comparativamente, estes valores obtidos em 24 h de exposição ao fitoterápico

corroboram os resultados observados no capítulo 1, onde os peixes foram

submetidos às diferentes concentrações (40, 60, 80 e 100 ml/L) de extrato de P.

aduncum. Resultados similares foram descritos por Kavitha et al. (2011), em

exposição de Cyprinus carpio à Moringa oleífera nas concentrações 80,100,120,140,

160 mg/L, após 96 h de exposição, com redução significativa da Hb, Hct, RBC, e dos

valores MCHC. Resultados diferentes foram encontrados por Winkaler et al. (2007),

em Prochilodus lineatus expostos a diferentes concentrações (0, 2.5, 5.0, 7.5 g L-1)

de extrato de folhas de A. indica após 24 h de exposição, sem alterações do Hct,

porém com aumento da glicose plasmática.

Embora as alterações hematológicas observadas nos pirarucus sob efeito de

diferentes concentrações de P. aduncum sejam pequenas, as variações nos valores

dos parâmetros hemoglobínicos, HCM e CHCM, podem ser uma forma de

compensar a diminuição no número de eritrócitos no sangue dos peixes sob efeito

61

do fitoterápico. Esta é uma resposta adaptativa dos peixes sob condições de

estresse, para maximizar a capacidade de transporte de oxigênio no sangue

(Carvalho e Fernandes 2006; Affonso et al. 2009). Essa capacidade adaptativa dos

peixes tem sido descrita por diversos autores. Assim, Del Rio-Zaragoza et al. (2011)

compararam os parâmetros de sanguíneos de Lutjanus guttatus, entre peixes

saudáveis e peixes infectados por monogenéticos dactylogyridae, e mostrou que

Hct, contagem de glóbulos brancos, o percentual de trombócitos e eosinófilos foram

significativamente maiores (P<0,05) nos peixes infectados. Em Labeo rohita

submetidos aos quimioterápicos cypermethrin e carbofuran, houve baixos níveis na

contagem de eritrócitos (RBC) concentração de hemoglobina e no percentual de

hematócrito. Em contraste, houve aumento significativo do VCM e HCM em resposta

aos químicos (Adhikari et al. 2004).

A hiperglicemia é outro importante indicador de estresse em peixes, pois

ajuda a suprir o aumento da demanda energética do organismo (Benfey e Biron

2000; Jeney et al. 1997; Mazeaud et al. 1977). Esse parâmetro tem contribuído para

avaliar os efeitos adversos de produtos químicos e naturais em peixes (Borges et al.

2007; Winkaler et al. 2007; Hori et al. 2008; Maciel 2009; Kumar et al. 2011; Kavitha

et al. 2011). Neste trabalho, os efeitos da P. aduncum não foram suficientes para

aumentar a demanda por glicose o que contribui com a suposição que as

concentrações usadas nos bioensaios são de baixa toxicidade. Esses dados são

corroborados com os valores de proteínas totais obtidos nas diferentes

concentrações testadas.

O comportamento dos pirarucus durante a exposição aos diferentes

tratamentos com o fitoterápico não demonstraram sinais de intoxicação e nem

mortalidade de peixes. Esses resultados corroboram com aqueles obtidos no

capítulo 1, cuja dose-resposta de P. aduncum para essa espécie encontra-se em 80

ml/L.

Os resultados de eficácia do extrato aquoso de P. aduncum em banhos curtos

(0,5 h) e longos (24 h) contra monogenéticos de pirarucus demonstraram uma

redução da carga parasitária em todas as concentrações e tempos de exposição

testada. Entretanto, somente em 80 ml/L do extrato de P. aduncum e após 24 h de

exposição, foi verificada o melhor resultado 80,16% de eficácia do fitoterápico contra

os monogenéticos em brânquias de pirarucu. Estes resultados corroboram com os

testes in vitro apresentados no capítulo 1 deste trabalho, pois a concentração de 80

62

ml/L do fitoterápico foi capaz de matar 100% do monogenéticos em três horas de

experimentos.

De acordo com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

(MAPA), Portaria n° 48, de 12/05/1997, através de sua Secretaria da Defesa

Agropecuária, o registro de produtos antiparasitários para mamíferos domésticos só

é possível se sua eficácia não for inferior a 90%. Entretanto, até o momento, não há

na legislação parâmetros para uso em peixes e outros organismos aquático. Em

todo caso, os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que 80 ml/L do

extrato de P. aduncum testado para monogenéticos, identificados como D.

cycloancistrium e D. cycloancistrioides, de pirarucu, em 24 h de exposição, foi

80,16% e, portanto, próximos ao recomendado por esta portaria do MAPA.

Dessa forma, o efeito do extrato de P. aduncum sobre os parasitas de

pirarucu mostrou-se promissor, não apenas por se tratar de um produto natural, mas

também pelas baixas concentrações utilizadas e eficácia encontrada. Entretanto,

estudo da eficácia com outros vegetais sobre parasitas de peixes tem mostrado que

este parâmetro está relacionado com a espécie, tempo de exposição e método

utilizado. O controle de trichodinosis e gyrodactylose em Oreochromis niloticus (48

horas de idade), mostrou que banhos com tres ppt. de óleo de alho durante 1 h,

assim como 300 mg/L-1 de dentes de alho recém esmagados em banhos por tempo

indeterminado impediu completamente a infecção causada pelos dois parasitas

comparados ao grupo de controle (Abd El-Galil e Aboelhadid 2011); Em Astyanax cf.

zonatus, alimentados ad libitum com sementes de abobora causou eficácia (95,26%

e 92,48%) no controle de nematoides do intestino e do estomago. Os alimentados

ad libitum com sementes de mamão promoveu 72% de eficácia no controle de

monogenéticos (Fujimoto et al. 2012); Exposição durante 48 h aos compostos

bruceine A e bruceine D isolados de Brucea javanica, mostraram eficácia notável

contra D. intermedius com percentuais de eliminação de 97% e 91,2% em 1,0 mg/L-

1.

5. CONCLUSÃO

Os resultados sugerem que a P. aduncum apresenta eficácia no controle de

parasitos monogenéticos, especificamente para D. Cycloancistrium e D.

Cycloancistrioides, de pirarucu, após 24 horas de exposição com concentrações

63

máximas de 80 ml/L. Além disso, possui baixa toxicidade nesta fase de

desenvolvimento dos peixes (25 g) sem comprometer sua homeostase fisiológica.

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

1) O ponto de partida para o estudo de uma planta com fins terapêuticos é a

existência dos conhecimentos medicinais pelas comunidades tradicionais;

2) Testes de toxicidade in vitro e in vivo são essenciais para avaliar a eficácia

de uma planta nos tratamentos de enfermidades;

3) Conhecer a biologia do peixe é um passo importante na fitoterapia, pois

suas especificidades podem ser influenciadas por substâncias presentes na planta;

4) Apesar da eficácia da P. aduncum no tratamento de monogenéticos de

pirarucu, recomenda-se a realização de novas pesquisas com esta espécie, que

possam contribuir para o entendimento sobre o efeito anestésico deste fitoterápico,

através do uso de frações isoladas da planta, assim como identificar a substância

responsável pela mortalidade dos parasitos;

73

5) Por fim, é importante a continuidade das pesquisas com esta planta a fim

de desenvolver um produto que atenda os requisitos legais (controle de qualidade,

segurança e eficácia) e de baixo custo para o setor aquícola brasileiro.