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DIPLOMARBEIT Titel der Diplomarbeit Charakterisierung von Phenylpropan- Verbindungen aus Scrophularia lucidaverfasst von Tobias Ledermüller angestrebter akademischer Grad Magister der Pharmazie (Mag.pharm.) Wien, 2015 Studienkennzahl lt. Studienblatt: A 449 Studienrichtung lt. Studienblatt: Diplomstudium Pharmazie Betreut von: ao. Univ. Prof. Mag. Dr. Liselotte Krenn
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Jan 06, 2020

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DIPLOMARBEIT

Titel der Diplomarbeit

„Charakterisierung von Phenylpropan-

Verbindungen aus Scrophularia lucida“

verfasst von

Tobias Ledermüller

angestrebter akademischer Grad

Magister der Pharmazie (Mag.pharm.)

Wien, 2015

Studienkennzahl lt. Studienblatt: A 449

Studienrichtung lt. Studienblatt: Diplomstudium Pharmazie

Betreut von: ao. Univ. Prof. Mag. Dr. Liselotte Krenn

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Danksagung

Ich möchte mich zuerst bei Frau Univ.-Prof. Dr. Verena M. Dirsch, Vorstand des

Departments für Pharmakognosie, für die Möglichkeit der Durchführung meiner

praktischen Arbeit an ihrem Department bedanken.

Ich bedanke mich auch in besonderer Weise bei Frau ao. Univ. Prof. Mag. Dr.

Liselotte Krenn für die stets lehrreiche, freundliche und geduldige Betreuung im

Rahmen der gesamten Arbeit.

Des Weiteren möchte ich mich auch bei Apothekerin Andrea Lubich, bei Dr. Martin

Zehl und dem ganzen Department für Pharmakognosie bedanken, die nicht nur für

ein angenehmes Arbeitsklima sorgten, sondern auch immer eine helfende Hand für

mich übrig hatten.

Nicht zuletzt bin ich Gott, meiner Familie, meinen Freunden und meinen

Studienkollegen äußerst dankbar. Ohne ihre Hilfe und ermutigende Unterstützung

wäre der Abschluss meines Studiums bestimmt nicht möglich gewesen.

Vielen Dank.

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Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung und Aufgabenstellung ..................................... 1

2. Material und Methoden ...................................................... 3

2.1. Untersuchungsmaterial ................................................................... 3

2.2. Angewendete Methoden .................................................................. 4

2.2.1. Dünnschichtchromatographie (DC) ................................................ 4

2.2.2. Säulenchromatographie (SC) .......................................................... 5

2.2.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ....................... 6

2.2.4. Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) ............................. 8

3. Ergebnisse ......................................................................... 8

3.1. Präparative Trennung mittels Dünnschichtchromatographie ..... 8

3.2. Säulenchromatographie 1 (SC 1) ................................................. 11

3.3. Säulenchromatographie 2 (SC 2) ................................................. 12

3.4. Vergleiche mit Referenzsubstanzen............................................. 16

3.4.1. Charakterisierung der Säure-Derivate............................................17

3.4.2. Untersuchung von Fraktion SC 2 / SF 14 .......................................18

3.4.3. Untersuchung von Fraktion SC 2 / SF 21 .......................................21

3.4.4. Untersuchung der Fraktionen SC 2 / SF 24, 25, 26 und 27 ...........23

3.5. Strukturaufklärung mittels HRMS ................................................ 25

3.6. Quantifizierung .............................................................................. 26

3.6.1. Gewinnung der Reinsubstanzen ....................................................27

3.6.1.1. Aufreinigung von Homoplantaginin............................................27

3.6.1.2. Aufreinigung von Scrovalentinosid ............................................27

3.6.1.3. Koelziosid und Hispidulin ...........................................................30

3.6.2. Stammlösungen und Verdünnungsreihen .....................................30

3.6.3. Quantifizierung von Homoplantaginin ...........................................31

3.6.4. Quantifizierung von Koelziosid ......................................................34

3.6.5. Quantifizierung von Scrovalentinosid............................................37

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3.6.6. Quantifizierung von Hispidulin....................................................... 40

4. Diskussion ....................................................................... 44

5. Zusammenfassung .......................................................... 46

6. Summary .......................................................................... 47

7. Literaturverzeichnis ......................................................... 48

8. Abbildungsverzeichnis .................................................... 50

9. Tabellenverzeichnis ......................................................... 52

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Abkürzungsverzeichnis

AAS…………………………………….……………Anisaldehyd-Schwefelsäure

CCID…………………………………Circular Chemorepellent Induced Defects

DC…………………………………….…………….Dünnschichtchromatographie

DMSO……………………...…………………………..………….Dimethylsulfoxid

ELSD……………………………….…….Evaporative Light Scattering Detector

ESI…………………………………….……………...Elektronen Spray Ionisation

EtOAc…………………………………….……………………………...Ethylacetat

HPLC…………………….………….High Performance Liquid Chromatography

HRMS…………………….………………...High Resolution Mass Spectrometry

MeOH………………………………………………………………………Methanol

NL……………………………………….……………..……………………Nachlauf

NS…………………………………………………….………………..Niederschlag

NST A/ PEG……………….………Naturstoffreagenz A/ Polyethylenglykol 400

SC…………………………………………………………Säulenchromatographie

SF………………………………………………….………………..Sammelfraktion

SPE………………………………………………..………..Solid Phase Extraction

T………………………………………………………………………….………..Teil

TOF……………………………………………………………..……..Time of Flight

ÜS…………………………………………….…………………………...Überstand

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1

1. Einleitung und Aufgabenstellung

Der Familie der Scrophulariaceae gehören mehr als 220 Gattungen an, zu welchen

unter anderem die Gattung Scrophularia zählt. Deren verschiedene Arten finden eine

breite Anwendung in der Volksmedizin bei Ekzemen, Psoriasis, Krätze, entzündlichen

Erkankungen und Tumoren [1, 2]. Eine dieser Arten ist Scrophularia lucida (L.). Sie

ist vorwiegend im mediterranen Raum, in der Türkei, Griechenland und Italien zu

finden [3].

Abbildung 1: Scrophularia lucida (L.)1

Für die Gattung Scrophularia wurden bereits antiinflammatorische, antibakterielle,

zytotoxische und einige weitere Effekte beschrieben [2, 4]. Aus diesem Grund wurden

im Zuge einer Studie fünf verschiedene Vertreter der Gattung auf ihre Anti-Tumor-

Wirkung untersucht. Hierzu wurde u.a. ein Zell-Modell für Brustkrebs-Metastasierung

herangezogen, um auf Aktivität der ausgewählten Arten zu prüfen [1].

1 Quelle: http://azalas.de/blog/?page_id=4175 (zuletzt aufgerufen am: 20.1.2015)

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2

Ein notwendiger Schritt für die Metastasierung des Tumors ist eine „Lochbildung“

(gap-formation) im betroffenen Endothel, wodurch Tumorzellen in Lymph- und/oder

Blutbahn eindringen und Metastasen in Lymphknoten oder entfernten Körperregionen

bilden [1].

Im Rahmen der Studie wurde der CCID-Assay (Circular chemorepellent induced

defects) angewendet. Hierbei wurde eine einlagige Schicht von Lymphendothelzellen

mit MCF-7 Brustkrebszell-Sphäroiden inkubiert. Nach wenigen Stunden Inkubation

wurde auf Größe und Zahl der Löcher geprüft, welche nach Behandlung mit den

Extrakten der verschiedenen Scrophularia-Arten entstanden sind [1].

Es zeigte sich, dass es unter Einwirkung eines methanolischen Extraktes von

Scrophularia lucida zu einer signifikanten Hemmung der gap-formation gekommen

war [1].

Die Ergebnisse der Studie und die Untersuchungen vorhergehender Diplomarbeiten

zur Aufklärung der Sekundärmetabolite bilden die Grundlage der vorliegenden

Diplomarbeit. Da es über Scrophularia lucida keine Informationen über die chemische

Zusammensetzung der Sekundärmetabolite einschließlich der wirksamen

Komponenten gab, war es das Ziel dieser Arbeit, die Charakterisierung des

Inhaltsstoffmusters fortzusetzen, um Scrophularia lucida innerhalb der Gattung

chemotaxonomisch besser zuordnen zu können. Die bisher unbekannten

Phenylpropan-Verbindungen vor allem aus der Ethylacetat-Fraktion (siehe 2.1., Seite

3) sollten identifiziert und vier Hauptkomponenten des methanolischen Extraktes

quantitativ bestimmt werden.

Abbildung 2: Aktivität im CCID-Assay: Reduktion der Löcher unter

Behandlung mit dem Methanol-Extrakt von Scrophularia lucida [1]

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3

2. Material und Methoden

2.1. Untersuchungsmaterial

In vorangegangen Diplomarbeiten [5, 6] standen 158 g methanolischen Extraktes von

Scrophularia lucida zur Verfügung. Das Pflanzenmaterial stammte aus der Türkei.

Der Extrakt wurde anschließend nach der Methode von Wall et al. vorgereinigt.

Danach standen eine Petrolether-, Chloroform-, Ethylacetat- und eine Butanol-

Fraktion zur Verfügung [5].

Im Zuge dieser Diplomarbeit wurden die in Tabelle 1 angeführten Fraktionen zur

weiteren Untersuchung verwendet.

Tabelle 1: Verwendete Fraktionen

Fraktion Menge (mg) Quelle Weitere Aufarbeitung

SPE 2 / 1 + 2 38,2 [7] SC 1

SPE 2 / 3 - 8 10,3 [7] SC 1

SPE 2 / 9 - 11 10,6 [7] Präparative Trennung mittels DC

SC 1 / SF 8 385,0 [5] SC 2

SC 3 / SF 12 24,5 [5] Isolierung von Homoplantaginin;

Quantifizierzung

SL 1 133,4 [6] Quantifizierung

SL 2 208,4 [6] SC 3; Quantifizierung

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4

2.2. Angewendete Methoden

2.2.1. Dünnschichtchromatographie (DC)

Die Dünnschichtchromatographie wurde zur Überprüfung der Einzel- bzw.

Sammelfraktionen angewendet.

Andererseits wurden mehrere Inhaltsstoffe mit Referenzsubstanzen auf ihre Identität

geprüft.

Es wurde verschiedene DC-Systeme verwendet:

Stationäre Phase:

a) Kieselgel-Fertigplatte 60 F254 (Merck®)

b) Polyamid-Fertigplatte 6 F254 (Sigma-Aldrich®)

c) Kieselgel-Fertigplatte mit Konzentrierungszone (Merck®)

Mobile Phase:

1. Ethylacetat + Ameisensäureconc.+ Essigsäureconc. + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

2. Toluol + Petrolether + Butanon + MeOH (15 + 4,5 + 9 + 12)

3. Chloroform + MeOH + Essigsäureconc. (2 + 1 + 2)

4. Ethylacetat + MeOH + Ameisensäureconc. + Wasser (70 + 8 + 4 + 4)

Detektion:

Naturstoffreagenz A/ Polyethylenglykol 400 (NST A/PEG):

Zur Detektion wurde bei den Analysen mit den mobilen Phasen 1 - 3 die entwickelte

DC-Platte zunächst mit 1% methanolischer Naturstoffreagenz A-Lösung (NST A) und

nach kurzem Zwischentrocknen mit 5% ethanolischer Polyethylenglykol-400-Lösung

(PEG) besprüht. Nach etwa 10 – 15 Minuten konnte unter UV-Licht bei 366 nm

ausgewertet werden [8].

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5

Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagens (AAS):

Bei Verwendung der mobilen Phase 5 zur Detektion der Inhaltsstoffe aus der

Chloroform-Fraktion, wurde mit einer frisch bereiteten Mischung aus 0,5 ml

Anisaldehyd, 10 ml Eisessig, 85 ml Methanol und 5 ml Schwefelsäureconc besprüht.

Anschließend wurde die DC-Platte für wenige Minuten im Trockenschrank bei 100°C

erhitzt. Danach konnte bei Tageslicht ausgewertet werden [8].

2.2.2. Säulenchromatographie (SC)

Es wurden zwei verschiedene Systeme verwendet, um das komplexe

Inhaltsstoffmuster der verwendeten Fraktionen (s. Tabelle 1, S. 3) besser auftrennen

zu können.

Stationäre Phase:

A) Polyamid (Roth®)

Die Trennung erfolgt hier vor allem auf Grund unterschiedlicher Affinität, aber auch

auf Grund der Größe von Molekülen eines Stoffgemisches und eignet sich gut, um

Phenole und Carbonsäuren zu trennen [9].

B) Sephadex® LH-20 (Sigma -Aldrich®)

Sephadex besteht aus hydroxypropylierten Dextranen. Als stationäre Phase eignet

es sich ebenfalls zur Trennung von phenolischen Verbindungen [10].

Mobile Phase:

Zur Trennung der Stoffgemische wurden bei Verwendung von Polyamid als stationäre

Phase Gemische von Ethanol und Wasser und bei Verwendung von Sephadex

Methanol/Wasser-Gemische in unterschiedlichen Konzentrationen als mobile Phase

eingesetzt.

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6

Die weiteren Parameter sind bei der jeweiligen SC angegeben.

Es wurde jede zehnte Fraktion in einem geeigneten DC-

System überprüft. Bei Übereinstimmung der Inhaltsstoffe

der analysierten Fraktionen wurden diese zu Sammel-

fraktionen vereinigt.

2.2.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Die HPLC wurde zur Identitätsprüfung von Komponenten des Untersuchungs-

materials eingesetzt. Die in Dünnschichtchromatogrammen aufgezeigten Über-

einstimmungen von Inhaltsstoffen mit Referenzsubstanzen sollten durch Vergleich in

der HPLC bestätigt werden.

Die HPLC wurde auch zur Quantifizierung von vier ausgewählten Hauptinhaltsstoffen

des methanolischen Extraktes von Scrophularia lucida herangezogen.

Vor jeder Analyse wurde die Analysen-Lösung zentrifugiert.

Abbildung 3: Säulenchromatographie

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Tabelle 2: HPLC-Parameter

Zur Kontrolle der Reinheit der Standards, welche für die Quantifizierung verwendet

wurden, kam ein Evaporative Light Scattering Detector (ELSD-LT, Shimadzu®) zum

Einsatz. Der Vorteil dieser Detektionsmethode besteht darin, dass damit auch nicht

chromophore Verbindungen detektiert werden können.

Mobile Phase [5]:

A: Destilliertes Wasser, mit Ameisensäure auf pH 3 eingestellt

B: Acetonitril / Destilliertes Wasser pH 3 (80 + 20)

Gradient [5]:

2 Konzentration für Identitätsprüfung

Gerät (Shimadzu®) Einstellungen

Pumpe LC - 20AD Injektionsvolumen 10µl

Detektor SPD - M20A

(Dioden-Array-

Detektor)

Temperatur 25°C

Säulenofen CTO – 20AC Konzentration der

Analysenlösungen2

0,5 mg/ml

Autosampler SIL – 20AC HT Flussrate 1 ml/min

Säule Luna 5µ C18 100A

250x 4,6 mm,

Phenomenex, USA

Detektion 200 nm -

400 nm

Konzentration Zeit

5% 20% B 15 min

20% B isokratisch 10 min

20% 50% B 40 min

50% 95% B 15 min

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2.2.4. Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS)3

Die HRMS wurde verwendet, um jene Substanzen, deren Struktur durch HPLC-

Vergleich nicht aufgeklärt werden konnte, über das Molekulargewicht und das

Fragmentierungsverhalten zu identifizieren.

Die Versuche wurden am maXis HD ESI-Qq-TOF Massenspektrometer (Bruker

Daltonics®) durchgeführt. Die Probenlösungen wurden mit einer Flussrate von 3

µL/min direkt in die ESI-Quelle infundiert.

Die ESI-Quelle wurde mit folgenden Parametern betrieben: Kapillarspannung: 2,0 –

4,0 kV, Verneblungsgas: 0,4 bar (N2), Trockengasfluss: 4,0 L/min, Trockengas-

temperatur: 200°C. Die Massenspektren wurden in einem Bereich von 50 m/z bis

1550 m/z aufgenommen. Die Summenformeln konnten mit Hilfe des Programms

Bruker Compass Data Analysis 4.2 ermittelt werden, basierend auf einer

Massengenauigkeit von Δm/z ≤ 2 ppm und einem Isotopenmustervergleich.

3. Ergebnisse

3.1. Präparative Trennung mittels

Dünnschichtchromatographie

Im ersten Schritt sollten die zwei gelb fluoreszierenden Banden bei Rf= 0,73 und Rf=

0,79 (s. Abb. 4, S. 9) in der Fraktion SPE 2/ 9-11 [7] einzeln dargestellt werden.

Dazu erfolgte ein Vorversuch zur Ermittlung einer geeigneten mobilen Phase für die

Auftrennung mittels DC (s. Abb. 4, S. 9).

3 Für die Durchführung der MS-Messungen bedanke ich mich bei Herrn Dr. Martin Zehl,

Institut für Pharmakognosie, Universität Wien.

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Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: NST A/ PEG

Die zwei gelb fluoreszierenden Banden konnten in der DC ausreichend getrennt

dargestellt werden (s. Abb. 4), deshalb wurde die dafür benützte mobile Phase für die

anschließende Trennung verwendet.

Für die präparative Trennung (s. Abb. 5) wurde eine Kieselgel-Platte mit

Konzentrierungszone verwendet und die Fraktion SPE 2/ 9-11 (10,6 mg) [7]

aufgetragen. Nach der Entwicklung der DC wurden beide Banden getrennt

voneinander von der Platte abgekratzt.

Stationäre Phase: Kieselgel-Platte mit Konzentrierungszone; 20 cm x 20 cm

Mobile Phase:

EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: Tageslicht

Bahn Fraktion

1 SPE 2/ 3-8 [7]

2 SPE 2/ 9-11 [7]

Bande 2

Bande 1

1 2

Abbildung 4 : DC der Fraktionen SPE 2/ 3-8 [7] und SPE 2/ 9-11 [7]

Abbildung 5: Präparative DC-Trennung

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Die Substanzen, die den gelben Banden 1 bzw. 2 entsprachen (s. Abb. 5, S. 9),

wurden mit einer Mischung aus Methanol/Chloroform (7:1) vom Kieselgel gelöst,

mittels Dünnschichtchromatographie überprüft und mit Kämpferol-3-O-rutinosid

verglichen.

Abbildung 6: DC-Prüfung der isolierten Banden 1 und 2

Stationäre Phase: Polyamid-Fertigplatte 6 F254 (Sigma-Aldrich®)

Mobile Phase: Toluol + Petrolether + Butanon + MeOH (15 + 4,5 + 9 + 12)

Detektion: NST A/ PEG

Abbildung 6 zeigt, dass die weniger polare, gelb fluoreszierende Substanz in der

Bande 1 angereichert war. Der Vergleich mit der Referenz zeigte auch deutlich, dass

es sich bei der angereicherten Substanz nicht um Kämpferol-3-O-rutinosid handelt.

Es wurden 3,7 mg der Substanz erhalten.

In Bande 2 wurden zwei dunkel gefärbte Komponenten detektiert, bei denen es sich

um Derivate von Homoplantaginin handeln könnte. Es wurden 5,2 mg des Gemisches

erhalten.

Bahn Fraktion

1 SPE 2/ 1 + 2 [7]

2 Kämpferol-3-O-rutinosid

3 Bande 1

4 Bande 2

1 2 3 4

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11

3.2. Säulenchromatographie 1 (SC 1)

Um eine ausreichende Menge für die Strukturaufklärung von der Substanz in Bande

1 (s. Abb. 6, S. 10) zu gewinnen, wurden die Fraktionen SPE 2/ 1+2 [7] und SPE 2/

3-8 [7] (s. Tabelle 1, S. 3) vereinigt und mittels SC 1 unter folgenden Bedingungen

aufgetrennt.

Füllhöhe: 65 cm

Säulendurchmesser: 1,2 cm

Stationäre Phase: Polyamid (Roth®)

Mobile Phase: Ethanol/Wasser-Gemische

Aufgetragene Menge: 48,4 mg

Flussrate: 3 ml/ 30 min

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: NST A/ PEG

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 SPE 2/ 1-8

Abbildung 7: DC der Sammelfraktionen der SC 1

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Tabelle 3: Sammelfraktionen der SC 1

In der DC der Sammelfraktionen von SC 1 (s. Abb. 7, S. 11) ist zu sehen, dass es zu

einer Auftrennung gekommen ist, die gewünschte Reindarstellung von einzelnen

Komponenten wurde allerdings nicht erreicht. Da die isolierten Mengen zu gering für

eine Reindarstellung von Komponenten waren, wurden einzelne Sammelfraktionen

der SC 1 für den Vergleich mit Referenzsubstanzen (s. 3.4., S. 16) herangezogen.

3.3. Säulenchromatographie 2 (SC 2)

Für die Säulenchromatographie 2 wurde die Fraktion SC 1/ SF 8 [5] (s. Abb. 8)

ausgewählt, da eine ausreichende Menge verfügbar war und die Möglichkeit zur

Reindarstellung und anschließenden Identifizierung mehrerer Substanzen des

komplexen Inhaltsstoffmusters gegeben war.

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: NST A/ PEG

Sammelfraktion Einzelfraktion Menge (mg) Mobile Phase

SC1 / SF 1 2 – 28 1,0 30% Ethanol SC1 / SF 2 29 – 50 0,5

SC1 / SF 3 51 – 60 0,1

SC1 / SF 4 61 – 80 0,1

SC1 / SF 5 81 – 129 0,9 40% Ethanol SC1 / SF 6 130 – 137 1,4

SC1 / SF 7 138 – 140 1,6

SC1 / SF 8 141 – 150 8,5

SC1 / SF 9 151 – 160 5,3 50% Ethanol SC1 / SF 10 161 – 170 3,9

SC1 / SF 11 171 – 190 10,3

SC1 / SF 12 191 – 290 7,6

SC 1/ SF 8

Abbildung 8: DC der Fraktion SC 1/ SF 8 [5]

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SC 2 wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Füllhöhe: 75 cm

Säulendurchmesser: 2,5 cm

Stationäre Phase: Sephadex® LH-20 (Sigma -Aldrich®)

Mobile Phase: Methanol/Wasser-Gemische

Aufgetragene Menge: 385 mg

Flussrate: 5 ml/ Stunde

Es wurde jede zehnte Fraktion mittels Dünnschichtchromatographie überprüft. Bei

Übereinstimmung des Inhaltsstoffmusters wurden die Fraktionen vereinigt. Auf diese

Weise wurden 908 Einzelfrakionen gesammelt, die zu 32 Sammelfraktionen vereinigt

wurden. In Sammelfraktion 21 kam es zur Bildung eines farblosen Niederschlags.

Daraufhin wurde der Überstand abdekantiert und der Niederschlag als Fraktion 21

NS bezeichnet.

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Abbildung 9: DC der Sammelfraktionen von SC 2

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: NST A/ PEG

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

15 16 17 18 19 20 21 21NS 22 23 24 25 26 27 28 29 30 NL Vgl.

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Tabelle 4: Sammelfraktionen der SC 2

Sammelfraktion Einzelfraktion Ausbeute (mg) Mobile Phase

1 1 – 110 7,8

Methanol 30%

2 111 – 130 0,7

3 131 – 140 0,2

4 141 – 150 0,1

5 151 – 160 0,1

6 161 – 200 2,0

7 201 – 280 6,6

8 281 – 310 1,9

9 311 – 330 2,6

10 331 – 350 0,5

11 351 – 400 4,9

12 401 – 410 3,9

13 411 – 420 12,7

14 421 – 440 67,0

15 441 – 450 ÜS 4,7

16 441 -450 NS+ 451 – 460 ÜS

13,6

17 451 – 460 NS 4,7

18 461 – 470 11,0

19 471 – 500 32,0

20 501 – 580 87,6

21 581 – 640 63,2

21 NS 7,6

22 641 – 690 16,1 Methanol 40%

23 691 – 720 5,9

24 721 – 750 8,0

25 751 – 770 4,6

26 771 – 800 4,5

27 801 – 820 2,6

28 821 – 840 1,9 Methanol 50% 29 841 – 880 2,5

30 881 – 908 1,7

NL Nachlauf 0,1 Methanol 60%

Auch bei der zweiten Säulenchromatographie kam es nicht zur gewünschten

Reindarstellung von Einzelsubstanzen. Die Sammelfraktionen 2 bis 6 waren in sehr

geringer Menge vorhanden (s. Tabelle 4) und wurden deshalb nicht weiter untersucht.

In den Fraktionen 1 bis 11 zeigten sich nach dem Besprühen mit NST A/PEG unter

UV366 zahlreiche blau fluoreszierende Banden (s. Abb. 9, S. 14), bei welchen es sich

vermutlich um Phenolcarbonsäure-Derivate handelte. In SF 8 ist eine blau

fluoreszierende Hauptkomponente bei Rf= 0,80 erkennbar, welche mittels DC-

Vergleich (s. 3.4.1., S. 17) und HRMS (s. 3.5., S. 25) analysiert wurde.

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16

In den Fraktionen 12 bis 14 wurden zwei Flavonoid-Komponenten bei Rf=0,37 und

bei Rf=0,47 detektiert, bei welchen es sich aufgrund der Fluoreszenzfarben

vermutlich um Kämpferol- und Quercetinmono- oder Diglykoside handelte.

Von Sammelfraktion 15 bis 22 war eine dunkel gefärbte Bande bei Rf=0,61 sichtbar,

welche für das Vorliegen des Flavonoids Homoplantaginin in den Fraktionen sprach

[5].

Von Fraktion 18 bis 27 waren in der oberen Hälfte der DC (s. Abb. 9, S. 14) mehrere

gelb fluoreszierende Banden detektierbar, deren Fluoreszenz für Flavonoide

charakteristisch ist.

Die Identifizierung der Komponenten erfolgte durch Vergleiche der DC- und HPLC-

Charakteristika mit bekannten Referenzsubstanzen [11].

3.4. Vergleiche mit Referenzsubstanzen

Zunächst wurden Versuche zur Identifizierung der Inhaltsstoffe mittels DC

durchgeführt. Bei Übereinstimmungen in Rf-Wert und Fluoreszenzfarbe der Banden

von Referenz und Komponente einer Fraktion, wurde mit einem zweiten,

unterschiedlichen chromatographischen Verfahren, in diesem Fall mittels HPLC (s.

2.2.3., S. 6), die Übereinstimmung bestätigt und die Identität der entsprechenden

Substanz bewiesen.

Stationäre Phase: Kieselgel

60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: NST A/ PEG

Legende s. Tabelle 5, S. 17

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Abbildung 10: DC-Vergleiche mit Referenz-Substanzen

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17

Tabelle 5: DC-Vergleiche mit Referenz-Substanzen

Die DC (Abb. 10, S. 16) zeigte beim Vergleich der Fraktionen mit den

Referenzsubstanzen Übereinstimmungen. Die gelb fluoreszierende Bande von SC 2/

SF 13 bei Rf=0,37 stimmt mit jener von Rutin auf Bahn 1 überein und die hellblau

fluoreszierende der Fraktion SC 1/ SF 8 bei Rf= 0,70 mit jener des

Phenylcarbonsäure-Derivates Verbascosid. Die gelb fluoreszierende Bande von SC

1/ SF 8 bei Rf= 0,57 war mit zwei Referenzsubstanzen, Hyperosid und Nepitrin,

vergleichbar.

Basierend auf diesen Ergebnissen wurden weitere Sammelfraktionen mit

verschiedenen Referenzsubstanzen verglichen.

3.4.1. Charakterisierung der Säure-Derivate

Aufgrund der DC (s. Abb. 10 S. 16) wurde vermutet, dass in der Fraktion SC 1/ SF 8

Verbascosid enthalten ist. Da auch in den Fraktionen SC 1/ SF 1 und SC 2/ SF 8 blau

fluoreszierende Hauptkomponenten detektiert wurden, sollten diese Säure-Derivate

ebenfalls identifiziert werden.

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: NST A/ PEG

Bahn Fraktion/ Substanz

1 SC 1 / SF 1

2 Verbascosid

3 SC 2 / SF 8

Bahn Referenz / Fraktion Bahn Referenz / Fraktion

1 Rutin 7 Astragalin

2 Eriodictyol 8 SC 1 / SF 1

3 SC 2 / SF 13 9 Verbascosid

4 Nepitrin 10 SC 1 / SF 8

5 Luteolin-7-O-glucosid 11 Hyperosid

6 SC 2 / SF 13

1 2 3

Abbildung 11: DC-Vergleich mit Verbascosid

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18

Der Vergleich mit Verbascosid (s. Abb. 11, S. 17) zeigte, dass es sich bei den intensiv

blau fluoreszierenden Banden von Fraktion SC 1/ SF 1 bei Rf= 0,33 und Fraktion SC

2/ SF 8 bei Rf= 0,80 nicht um dieses Phenolcarbonsäure-Derivat handelte. Ein HPLC-

Vergleich von SC 2/ SF8 mit Verbascosid zeigte ebenfalls keine Überstimmung der

Retentionszeiten und bestätigte dieses Resultat.

Die Hauptkomponente der Fraktion SC 2/ SF 8 wurde daher mittels HRMS untersucht

(siehe 3.5., S. 25).

3.4.2. Untersuchung von Fraktion SC 2 / SF 14

Bei allen dünnschichtchromatographischen Untersuchungen der Sammelfraktionen

13 und 14 der SC 2 zeigte sich einen Tag nach Durchführung der DC eine Rot-

Verfärbung der Bande bei Rf= 0,69. Dieses Verhalten ist charakteristisch für das

Flavanon Eriodictyol [11]. Da es sich hierbei, wie bereits gezeigt (s. Abb. 10, S. 16),

nicht um das Aglykon handeln konnte, wurde die Sammelfraktion 14 mit Eriodictyol-

7-O-glucosid verglichen.

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: NST A/ PEG

In der Sammelfraktion 14 war die rote Bande bei Rf= 0,69 nur sehr schwach zu sehen.

Somit konnte das Vorkommen von Eriodictyol-7-O-glucosid nicht eindeutig

nachgewiesen werden.

Bahn Fraktion/Substanz

1 SC 2/ SF 14

2 Eriodictyol-7-O-glucosid

1 2

Abbildung 12: DC-Vergleich mit Eriodictyol-7-O-glucosid

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19

Die Sammelfraktion 14 der SC 2 wurde außerdem mit den Referenzsubstanzen Rutin

und Kämpferol-3-O-rutinosid verglichen.

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: NST A/ PEG

Wie in Abbildung 13 zu sehen ist, stimmten die Banden von Referenz und

Komponenten der Sammelfraktion überein. Die gelb fluoreszierende Bande bei

Rf=0,37 von Rutin (Bahn 1) und die türkis fluoreszierende Bande bei Rf=0,47 von

Kämpferol-3-O-rutinosid (Bahn 3) zeigen denselben Rf-Wert und dieselbe

Fluoreszenzfarbe wie die zwei Hauptkomponenten in Sammelfraktion 14.

Diese dünnschichtchromatographischen Übereinstimmungen wurden mittels HPLC

überprüft, um das Vorliegen von Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid in der

Sammelfraktion 14 zu bestätigen.

Bahn Fraktion/ Substanz

1 Rutin

2 SC 2/ SF 14

3 Kämpferol-3-O-rutinosid

1 2 3

Abbildung 13: DC-Vergleich mit Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid

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20

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

Das Chromatogramm der Referenz Rutin (s. Anhang 1 und 2, S. 53) zeigte eine

Übereinstimmung des Substanzpeaks bei Retentionszeit und UV-Spektrum mit dem

Peak der Sammelfraktion 14 bei 33,31 min.

Die Komponente aus SC 2/ SF 14, die nach 38,35 min eluiert wurde, konnte mit Hilfe

der Referenz als Kämpferol-3-O-rutinosid (s. Anhang 3 und 4, S. 54) identifiziert

werden, da die Retentionszeit und UV-Spektrum übereinstimmten.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

33

.31

0/1

78

62

03

/13

20

06

38

.34

6/8

55

08

28

/79

35

93

42

.48

2/1

28

55

29

0/1

21

29

64

46

.88

1/3

38

57

2/3

17

88

47

.12

3/1

52

08

3/1

53

41

200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

mAU 33.31

237

282

449

205

256

354

Abbildung 14: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 14

Abbildung 15: UV-Spektrum von Rutin in SF 14, bei 33,31 min

Kämpferol-3-O-

rutinosid

Rutin

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21

Durch die Vergleiche in zwei unterschiedlichen chromatographischen Systemen

konnte das Vorkommen der Flavonoldiglykoside Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid

in der Sammelfraktion 14 bestätigt werden. Beide Komponenten waren in

Scrophularia ilwensis nachgewiesen worden [12].

3.4.3. Untersuchung von Fraktion SC 2 / SF 21

Die Sammelfraktion 21 der SC 2 wurde bezüglich der intensiv gelb fluoreszierenden

Bande bei Rf=0,56 näher untersucht. Aus einer vorhergehenden Diplomarbeit [5]

lagen Hinweise vor, dass Nepitrin im methanolischen Extrakt von Scrophularia lucida

enthalten sein könnte. Daher sollten diese Hinweise bestätigt werden.

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: NST A/ PEG

Bahn Fraktion/Substanz

1 SC 2 / SF 21

2 Nepitrin

1 2

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 nm

-100

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

1050

1100

mAU 38.35

28

1

26

5

34

7

Abbildung 16: UV-Spektrum von Kämpferol-3-O-rutinosid in SF 14, bei 38,35 min

Abbildung 17: DC-Vergleich von SC 2/ SF21 mit Nepitrin

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22

Auf Grund der Überstimmung im DC-Vergleich (s. Abb. 17, S. 21), wurde die HPLC

als zweites chromatographisches System zum Identitätsnachweis herangezogen.

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

Abbildung 19: UV-Spektrum von Nepitrin in SF 21, bei 37,18 min

Die Vergleiche mittels DC und HPLC bestätigten die Identität von Nepitrin in der

Sammelfraktion 21 von SC 2, da bei der HPLC-Analyse der Referenz (s. Anhang 5

und 6, S. 54-55) Nepitrin nach 37,11 min eluiert wurde und sich ein völlig

überstimmendes UV-Spektrum mit dem Inhaltsstoff in SF 21 zeigte. Nepitrin ist ein

selten vorkommendes Flavonol, welches schon in Scrophularia ningpoensis

identifiziert werden konnte [13].

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

1050

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

37

.18

4/4

92

92

48

42

.23

4/1

01

40

25

5

45

.58

3/6

38

30

0

48

.14

2/9

57

62

64

9.1

28

/18

03

96

4

52

.57

6/4

13

10

49

Abbildung 18: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 21

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 nm

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000mAU

37.18

26

1

24

2

29

8

20

6

34

5

27

1

25

6

Nepitrin

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23

3.4.4. Untersuchung der Fraktionen SC 2 / SF 24, 25, 26 und 27

Die drei gelb fluoreszierenden Flavonoide der Sammelfraktionen 24 bis 27 der

Säulenchromatographie 2 mit Rf-Werten von 0,67 bis 0,79, wurden mittels

Dünnschichtchromatographie mit ausgewählten Referenzsubstanzen verglichen.

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + konz. Essigsäure + konz. Ameisensäure + Wasser (100 + 11 + 11 + 10)

Detektion: NST A/ PEG

Bahn Fraktion/ Referenz

1 SC 2/ SF 26

2 Luteolin-7-O-glucosid

3 SC 2/ SF 27

4 Nepetin

5 SC 2/ SF 24

Der Vergleich der Sammelfraktionen mit Nepetin (s. Abb. 20), dem Aglykon des

Flavonoids Nepitrin (s. 3.4.3., S. 21), zeigte keine Übereinstimmung, da die Referenz

eindeutig apolarer war als die zu identifizierenden Substanzen.

Der Vergleich mit Luteolin-7-O-glucosid (s. Abb. 20) deutete darauf hin, dass die

intensiv gelb fluoreszierende Bande bei Rf=0,67 in den untersuchten

Sammelfraktionen mit dieser Substanz übereinstimmte.

Daher wurden die Fraktionen 24 bis 27 auch mittels HPLC mit Luteolin-7-O-glucosid

verglichen.

1 2 3 4 5

Abbildung 20: DC-Vergleich von SC 2/ SF 24, 26 und 27

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24

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

Abbildung 22: UV-Spektrum von Luteolin-7-O-glucosid in SF 27, bei 34,97 min

Anhand der Retentionszeit und des UV-Spektrums der Referenz (s. Anhang 7 und 8,

S. 55) konnte eine Übereinstimmung mit dem Substanzpeak der Fraktion zweifelsfrei

gezeigt werden. Luteolin-7-O-glucosid konnte auch in Fraktion 25 und 26 (s. Anhang

9, 10, 11 und 12, S. 56 und 57) nachgewiesen werden.

Das Flavonol Luteolin-7-O-glucosid war bisher unbekannt in der Gattung Scrophularia

und konnte somit in Scrophularia lucida zum ersten Mal nachgewiesen werden.

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 nm

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

2750

3000

mAU 34.97

20

4

23

6

29

6

21

1

34

7

25

4

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

1050

1100

1150

1200

1250mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

15

.60

5/8

94

09

9

18

.12

9/2

03

89

30

34

.96

8/1

52

57

07

2

37

.18

6/8

64

26

0

40

.94

0/1

64

01

18 4

1.7

17

/94

69

32

42

.25

3/1

18

86

24

48

.45

8/1

07

05

15

54

.18

6/8

34

03

0

Abbildung 21: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 27

Luteolin-7-O-

glucosid

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25

3.5. Strukturaufklärung mittels HRMS

Um über das Molekulargewicht und das Fragmentierungsverhalten auf die Strukturen

schließen zu können, wurden die Komponenten, die mittels Referenz-Vergleich nicht

identifiziert werden konnten, mittels hochauflösender Massenspektrometrie

untersucht.

Aus Fraktion SC 2 / SF 8 wurde der Substanzpeak bei einer Retentionszeit von 28,11

min mittels HPLC präparativ gewonnen (s. Abb. 23).

HPLC-Methode

(s. 2.2.3., S. 7)

Die dadurch gewonnene Substanz-Lösung wurde anschließend mittels HRMS im

Negativ-Ionenmodus analysiert.

Das Massenspektrum (s. Anhang 13, S. 58) zeigte, dass es sich um eine Verbindung

mit einem Molekulargewicht von 168 Da und der Summenformel C8H8O4 handelte.

Diese Resultate legten nahe, dass es sich um Vanillin– oder Isovanillinsäure handeln

könnte. Beide Benzoesäure-Derivate waren bereits in der Gattung Scrophularia

nachgewiesen worden [14, 15].

Daher wurde ein HPLC-Vergleich der Fraktion SC 2/ SF 8 mit Vanillinsäure (4-

Hydroxy-3-methoxybenzoesäure) durchgeführt.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

21

.59

1/1

42

18

14

28

.10

9/2

37

43

71

Abbildung 23: HPLC-Chromatogramm von SC 2 / SF 8

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26

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

Da die Vergleichssubstanz bereits nach 19,55 min eluiert wurde, konnte das

Vorliegen von Vanillinsäure ausgeschlossen werden. Die Überstimmung der UV-

Spektren von Vanillinsäure und der Komponente mit Rt= 28,11 min in der

Sammelfraktion 8 (s. Anhang 14 und 15, S. 59) spricht für das Vorliegen eines

strukturverwandten Isomers des untersuchten Benzoesäure-Derivates wie

Isovanillinsäure (3-Hydroxy-4-methoxybenzoesäure).

Ein Strukturbeweis war allerdings nicht möglich, da entsprechende

Referenzsubstanzen im Rahmen dieser Diplomarbeit nicht verfügbar waren.

3.6. Quantifizierung

Zum Abschluss der Charakterisierung des Inhaltsstoffmusters des methanolischen

Extraktes von Scrophularia lucida wurden vier Komponenten des Extraktes quantitativ

bestimmt. Einerseits wurden die drei Hauptinhaltsstoffe Homoplantaginin, Koelziosid,

und Scrovalentinosid quantifiziert. Andererseits wurde Hispidulin quantitativ

bestimmt, welches in aktivitätsgeleiteten Untersuchungen von Fraktionen des

methanolischen Extrakts eine hohe Aktivität gezeigt hatte [16].

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

1050

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

19

.87

7/8

86

33

99

85

.29

4/1

02

08

1

Abbildung 24: HPLC-Chromatogramm von Vanillinsäure

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27

3.6.1. Gewinnung der Reinsubstanzen

Die Quantifizierung erfolgte mittels externer Standardisierung in HPLC-Analysen. Für

die Bestimmungen war es notwendig, die Substanzen zur Herstellung einer

Stammlösung in möglichst reiner Form zu gewinnen.

3.6.1.1. Aufreinigung von Homoplantaginin

Das Flavonoid Homoplantaginin war in einer vorangegangen Diplomarbeit [5] aus der

Ethylacetat-Fraktion des methanolischen Extraktes gewonnen worden. Allerdings

stand es nicht in ausreichender Reinheit und Menge zur Verfügung. Aus diesem

Grund wurde die Fraktion SC 3 / SF 12 (s. 2.1., S. 3), in der Homoplantaginin die

Hauptkomponente darstellte, aufgereinigt. Dazu wurde die Fraktion (24,5 mg) in

wenigen ml Chloroform gelöst und anschließend mit 1-2 ml Methanol versetzt. Daraus

kristallisierte unter Kühlung ein hellgelber Niederschlag von Homoplantaginin, der

abzentrifugiert wurde.

Die Reinheit des gewonnenen Homoplantaginins wurde mittels ELSD (s. 2.2.3., S. 7)

und unter UV-Detektion überprüft.

3.6.1.2. Aufreinigung von Scrovalentinosid

Das Iridoidglykosid Scrovalentinosid (=SL 2) war in der Chloroform-Fraktion des

methanolischen Extraktes von Scrophularia lucida nachgewiesen worden [6]. Bei

einer HPLC-Untersuchung der zur Verfügung stehenden Substanz zeigte sich, dass

die Reinheit für eine Quantifizierung nicht ausreichend war (s. Abb. 25, S. 28).

Deswegen sollten mittels Säulenchromatographie Begleitsubstanzen abgetrennt

werden.

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28

HPLC-Methode (s.2.2.3., S. 7)

Säulenchromatographie 3:

Die Säulenchromatographie wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Füllhöhe: 60 cm

Säulendurchmesser: 1,2 cm

Stationäre Phase: Sephadex® LH-20 (Sigma -Aldrich®)

Mobile Phase: Methanol 40%

Aufgetragene Menge: 104,2 mg SL 2 [6]

Flussrate: 5 ml/ Stunde

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + MeOH + konz. Ameisensäure + Wasser (70 + 8 + 4 + 4)

Detektion: AAS-Reagens

Bahn Fraktion

1 SC 3 / 14

2 SC 3 / 24

3 SC 3 / 34

4 SC 3 / 44

Vergleich SL 2 [6]

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

2.9

16

/84

40

61

4.1

39

/10

61

26

55

.28

1/3

88

99

6

69

.24

4/2

03

53

56

9.9

32

/69

83

51

1 2 3 4 Vgl.

Abbildung 25: HPLC-Chromatogramm von Scrovalentinosid (69,93 min) vor der SC 3

Abbildung 26: DC-Überprüfung der Fraktionen von SC 3

Scrovalentinosid

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29

Es wurde jede zehnte Fraktion mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. In

Abbildung 26 (s. S. 28) ist zu sehen, dass Scrovalentinosid bei Rf=0,54 in Fraktion 24

fast rein vorlag. Um die erwünschte Komponente möglichst quantitativ zu gewinnen,

wurden auch die Fraktionen 18, 20, 22 und 28 mittels DC überprüft (s. Abb. 27 und

28).

Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254 Fertigplatte (Merck®)

Mobile Phase: EtOAc + MeOH + konz. Ameisensäure + Wasser (70 + 8 + 4 + 4)

Detektion: AAS-Reagens

Da auch die Fraktionen 20 und 22 Scrovalentinosid in reiner Form enthielten, wurden

die Fraktionen 20 bis 26 vereinigt. Die Ausbeute betrug 44,4 mg.

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

18 28 20 22

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

2.9

67/1

57361

3.0

43/3

68319

69.2

01/1

08921

69.8

83/1

235463

Abbildung 29: HPLC-Chromatogramm von Scrovalentinosid nach der SC 3

Abbildung 28: DC-Überprüfung der Fraktionen 18 und 28 von SC 3

Abbildung 27: DC-Überprüfung der Fraktionen 20 und 22 von SC 3

Scrovalentinosid

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30

Das HPLC-Chromatogramm (s. Abb. 29, S. 29) bestätigte die erfolgreiche

Aufreinigung von Scrovalentinosid durch die SC 3, das nun für die Erstellung der

Eichgeraden verwendet werden konnte.

3.6.1.3. Koelziosid und Hispidulin

Das zweite Iridoidglykosid Koelziosid (=SL 1), welches neben Scrovalentinosid aus

der Chloroform-Fraktion isoliert worden war [6], stand in ausreichender Reinheit zur

Verfügung.

Das Flavonoid-Aglykon Hispidulin, welches ebenfalls in der Chloroform-Fraktion des

methanolischen Extraktes nachgewiesen worden war [16], stand in reiner Form als

Standard zur Verfügung (Sigma-Aldrich®).

3.6.2. Stammlösungen und Verdünnungsreihen

Um die passenden Konzentrationen der Verdünnungslösungen zur Erstellung der

Eichgeraden zu ermitteln, wurde zunächst von jeder Substanz eine Lösung von je 1

mg/ml in DMSO angefertigt. In Abhängigkeit der Fläche des Substanzpeaks in den

Chromatogrammen von Methanol-Extrakt, Ethylacetat- und Chloroform-Fraktion,

wurde jede Stammlösung entsprechend verdünnt. Die Quantifizierung der

Substanzen erfolgte beim jeweiligen UV-Maximum.

Die Reinheit der verwendeten Standards wurde über die Verdünnungslösung mit der

höchsten und der zweitniedrigsten Konzentration jeder Verdünnungsreihe berechnet.

Tabelle 6: Reinheit der Standards

4 Reinheit deklariert vom Hersteller (Sigma-Aldrich®)

Standard Reinheit

Homoplantaginin 93,6%

Koelziosid 84,4%

Scrovalentinosid 88,0%

Hispidulin 98,0%4

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31

3.6.3. Quantifizierung von Homoplantaginin

Die quantitative Bestimmung des Flavonoids Homoplantaginin erfolgte im MeOH-

Extrakt, der Ethylacetat- und der Chloroform-Fraktion.

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%334nm,4nm (1.00)

41

.46

7/1

06

49

21

42

.26

7/3

86

57

00

45

.71

7/3

34

51

8

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%334nm,4nm (1.00)

37

.18

7/3

83

23

6

41

.44

5/2

82

57

64

1.8

71

/38

74

2.2

44

/29

61

57

7

48

.11

5/1

40

32

24

9.0

93

/18

62

25

51

.01

6/2

26

15

9

52

.53

7/1

29

07

35

Abbildung 30: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 334 nm

Abbildung 31: HPLC-Chromatogramm der Ethylacetat-Fraktion bei 334 nm

Homoplantaginin

Homoplantaginin

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32

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

Die Auswertung erfolgte bei einer Wellenlänge von 334 nm.

Für Stammlösung wurden 0,97 mg Homoplantaginin (s. 3.6.1.1., S. 27) in 1 ml DMSO

gelöst. Unter Berücksichtigung der Reinheit von 93,5% (s. Tabelle 6, S. 30), enthielt

die Stammlösung 0,9066 mg/ml Homoplantaginin. Für die Erstellung der Eichgerade

wurden sechs Verdünnungen analysiert.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425

450

475

500

525

550

575

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%334nm,4nm (1.00)

42

.25

8/2

70

98

2

49

.09

9/3

70

67

3 50

.22

2/3

21

28

35

1.0

10

/27

59

85

51

.30

7/4

16

40

85

2.5

07

/15

66

49

85

3.1

55

/31

70

97

55

.08

2/1

73

72

52

59

.96

6/3

07

27

16

0.4

31

/14

78

63

4

62

.49

9/4

61

60

9

64

.20

2/5

80

59

36

5.1

76

/25

49

10

68

.63

7/6

25

54

16

8.8

29

/60

81

81

69

.59

2/5

43

54

78

70

.99

8/2

72

82

57

1.8

65

/46

44

72

72

.91

3/3

03

93

27

3.2

17

/52

82

12

74

.08

9/4

36

88

07

4.5

14

/40

02

70

74

.98

7/9

05

35

3 75

.22

8/2

69

51

1

76

.82

8/8

21

24

5

200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425

450

475

mAU 42.36

29

9

24

8

33

3

27

3

Abbildung 33: UV-Spektrum von Homoplantaginin bei 42,36 min

Abbildung 32: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 334 nm

Homoplantaginin

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33

Tabelle 7: Herstellung der Eichlösungen von Homoplantaginin in DMSO

Verdünnungs-

lösung

Verdünnungsschritte Konzentration

(mg/ml)

Peakfläche

(n=2)

H1 1 T Stammlsg. + 2 T DMSO 0,3022 9 379 157

H2 2 T H1 + 1 T DMSO 0,2015 6 278 013

H3 1 T H1 + 1 T DMSO 0,1511 4 687 986

H4 1 T H3 + 1 T DMSO 0,0755 2 357 932

H5 1 T H3 + 3 T DMSO 0,0189 586 581

H6 1 T H4 + 9 T DMSO 0,0076 234 475

Abbildung 34: Eichgerade Homoplantaginin

Tabelle 8: Peakflächen von Homoplantaginin in den Untersuchungslösungen

y = 3E+07x - 357,1R² = 1

100000

1000000

1900000

2800000

3700000

4600000

5500000

6400000

7300000

8200000

9100000

10000000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

Peakfläche

Konzentration (mg/ml)

Homoplantaginin (n=2)

Untersuchungslösung Konzentration

(mg/ml)

Peakfläche Homoplantaginin (n=2)

MeOH-Extrakt 4,26 3 826 192

Ethylacetat-Fraktion 0,41 2 990 176

Chloroform-Fraktion 4,30 275 263

Geradengleichung: y = 3*107x - 357,1

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34

Aus den jeweiligen Peakflächen aus Tabelle 8 (s. S. 33) konnte mit Hilfe der

Geradengleichung die Konzentration und damit auch der Anteil des

Homoplantaginins in den entsprechenden Untersuchungslösungen errechnet werden

(s. Tabelle 9).

Tabelle 9: Ergebnisse der Quantifizierung von Homoplantaginin

Mit einem Anteil von 2,99% war Homoplantaginin ein Hauptinhaltsstoff des

methanolischen Extraktes von Scropularia lucida, der durch Verteilung stark in der

Ethylacetat- und in nur geringen Mengen in der Chloroform-Fraktion angereichert

wurde.

3.6.4. Quantifizierung von Koelziosid

Das Iridoidglykosid Koelziosid wurde sowohl im MeOH-Extrakt als auch in der

Chloroform-Fraktion quantifiziert.

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

Konzentration (mg/ml) Anteil (%)

Methanol-Extrakt 0,1276 2,99

Ethylacetat-Fraktion 0,0997 24,08

Chloroform-Fraktion 0,0092 0,21

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%276nm,4nm (1.00)

28

.76

7/1

13

29

5

34

.95

3/1

20

46

9 37

.22

1/5

05

27

53

8.0

22

/12

44

73

40

.17

2/1

19

83

64

1.4

68

/81

01

86

42

.26

7/3

23

79

50

45

.58

7/1

11

21

0

48

.14

2/1

40

97

94

8.6

13

/11

99

05

49

.12

0/3

31

73

75

0.0

57

/19

89

20 5

1.0

43

/58

34

02

52

.56

8/1

70

39

54

53

.28

5/1

28

45

1

55

.14

9/3

53

86

0

60

.52

3/1

15

32

9

69

.70

2/4

93

03

1

76

.49

4/2

32

70 76

.74

7/2

74

68

4

Abbildung 35: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 276 nm

Koelziosid

Page 43: Titel der Diplomarbeit Charakterisierung von …othes.univie.ac.at/37371/1/2015-05-14_0848273.pdfDIPLOMARBEIT Titel der Diplomarbeit „Charakterisierung von Phenylpropan-Verbindungen

35

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S.7)

Die quantitative Bestimmung von Koelziosid erfolgte bei einer Wellenlänge von 276 nm.

Für die Herstellung der Stammlösung wurden 1,01 mg Substanz (s. 3.6.1.3., S. 30)

in 1 ml DMSO gelöst, wovon aufgrund der Reinheit von 84,4% (s. Tabelle 6, S. 30)

0,8554 mg Koelziosid enthalten war. Es wurden fünf Verdünnungslösungen

angefertigt.

200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm-50

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425

450

475

500

525

mAU 76.83

211

232

434

277

219

204

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-5.0

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5

45.0

47.5

50.0

52.5

55.0

57.5

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%276nm4nm (1.00)

52

.52

0/1

03

74

5

55

.09

9/2

68

12

6

69

.65

1/3

96

76

0

75

.03

0/1

47

03

2

76

.46

7/3

18

42

76

.57

6/5

43

76

.72

3/3

94

77

27

7.3

48

/13

94

5

Abbildung 36: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 276 nm

Abbildung 37: UV-Spektrum von Koelziosid bei 76,83 min

Koelziosid

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36

Tabelle 10: Herstellung der Eichlösungen von Koelziosid in DMSO

Verdünnungs-

lösung

Verdünnungsschritte Konzentration

(mg/ml)

Peakfläche

(n=2)

K1 1 T Stammlsg. + 9 T DMSO 0,0855 796 309

K2 3 T K1 + 1 T DMSO 0,0642 607 508

K3 1 T K1 + 1 T DMSO 0,0428 401 302

K4 1 T K2 + 1 T DMSO 0,0321 300 569

K5 1 T K3 + 1 T DMSO 0,0214 201 394

Abbildung 38: Eichgerade Koelziosid

Tabelle 11: Peakflächen von Koelziosid in den Untersuchungslösungen

y = 9E+06x + 4701,3R² = 1

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

0,015 0,025 0,035 0,045 0,055 0,065 0,075 0,085

Peakfläche

Konzentration (mg/ml)

Koelziosid (n=2)

Untersuchungslösung Konzentration

(mg/ml)

Peakfläche Koelziosid (n=2)

MeOH-Extrakt 4,26 276 905

Chloroform-Fraktion 0,48 406 258

Geradengleichung: y = 9*106x + 4701,3

Page 45: Titel der Diplomarbeit Charakterisierung von …othes.univie.ac.at/37371/1/2015-05-14_0848273.pdfDIPLOMARBEIT Titel der Diplomarbeit „Charakterisierung von Phenylpropan-Verbindungen

37

Die Konzentration und der Anteil des Koelziosids in MeOH-Extrakt und Chloroform-

Fraktion wurden durch Einsetzen der Peakflächen der Komponente (s. Tabelle 11, S.

36) in die Geradengleichung ermittelt.

Tabelle 12: Ergebnisse der Quantifizierung von Koelziosid

Im Vergleich zum Homoplantaginin war Koelziosid in deutlich geringerer

Konzentration im Methanol-Extrakt enthalten und wurde durch Verteilung fast

quantitativ in die Chloroform-Fraktion übergeführt.

3.6.5. Quantifizierung von Scrovalentinosid

Das zweite Iridoidglykosid Scrovalentinosid aus Scrophularia lucida wurde ebenfalls

im MeOH-Extrakt und der Chloroform-Fraktion quantitativ bestimmt.

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

Konzentration (mg/ml) Anteil (%)

MeOH-Extrakt 0,0302 0,71

Chloroform-Fraktion 0,0446 9,34

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%313nm,4nm (1.00)

18

.80

4/1

12

23

8

28

.71

6/1

68

07

8

34

.95

2/1

81

58

53

6.0

90

/17

00

65

37

.22

1/3

90

81

43

8.0

27

/15

91

83

40

.16

7/1

17

90

54

1.4

67

/78

02

02

42

.26

8/3

21

59

27

43

.12

8/1

15

44

0

45

.58

5/2

21

98

6

48

.13

9/1

11

44

74

8.6

17

/24

15

72

49

.11

9/3

22

09

55

0.0

57

/26

48

69

51

.04

4/1

19

96

06

51

.34

1/1

06

19

55

2.5

68

/16

69

08

15

3.2

92

/15

85

63

55

.14

8/5

80

54

6

60

.52

2/1

24

95

9

68

.75

9/2

11

96

36

9.7

02

/12

07

60

17

0.0

36

/70

93

7

74

.14

8/1

10

86

0

75

.90

9/9

34

24

76

.89

2/9

31

73

95

.89

3/1

52

47

7

Abbildung 39: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 313 nm

Scrovalentinosid

Page 46: Titel der Diplomarbeit Charakterisierung von …othes.univie.ac.at/37371/1/2015-05-14_0848273.pdfDIPLOMARBEIT Titel der Diplomarbeit „Charakterisierung von Phenylpropan-Verbindungen

38

HPLC-Methode (s. 2.2.3., S. 7)

Für die Quantifizierung von Scrovalentinosid wurde eine Wellenlänge von 313 nm,

entsprechend dem UV-Maximum der Komponente, gewählt.

Die Lösungen, die zur Erstellung der Eichgerade gedient hatten, wurden durch

Verdünnen der Stammlösung (1,01 mg Substanz in 1 ml DMSO) hergestellt. Unter

Berücksichtigung der Reinheit von 88,0% (s. Tabelle 6, S. 30) waren 0,8891 mg

Scrovalentinosid in der Lösung enthalten. Es wurden fünf unterschiedliche

Verdünnungen des externen Standards vermessen.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%313nm4nm (1.00)

55

.09

7/4

61

23

3

69

.65

1/9

96

21

56

9.9

96

/13

31

2

75

.02

0/1

62

79

2

76

.86

5/1

95

65

1

95

.93

5/1

89

73

7

200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

mAU 69.98

218

249

423

312

229

439

Abbildung 40: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 313 nm

Abbildung 41: UV-Spektrum von Scrovalentinosid bei 69,98 min

Scrovalentinosid

Page 47: Titel der Diplomarbeit Charakterisierung von …othes.univie.ac.at/37371/1/2015-05-14_0848273.pdfDIPLOMARBEIT Titel der Diplomarbeit „Charakterisierung von Phenylpropan-Verbindungen

39

Tabelle 13: Herstellung der Eichlösungen von Scrovalentinosid in DMSO

Verdünnungs-

lösung

Verdünnungsschritte Konzentration

(mg/ml)

Peakfläche

(n=2)

S1 1 T Stammlsg. + 9 T DMSO 0,0889 1 607 510

S2 4 T S1 + 1 T DMSO 0,0711 1 286 785

S3 2 T S1 + 1 T DMSO 0,0593 1 067 917

S4 2 T S2 + 1 T DMSO 0,0474 853 748

S5 7 T S3 + 3 T DMSO 0,0415 742 853

Abbildung 42: Eichgerade von Scrovalentinosid

Tabelle 14: Peakflächen von Scrovalentinosid in den Untersuchungslösungen

y = 2E+07x - 17492R² = 1

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

0,035 0,045 0,055 0,065 0,075 0,085 0,095

Peakfläche

Konzentration (mg/ml)

Scrovalentinosid (n=2)

Untersuchungslösung Konzentration

(mg/ml)

Peakfläche Scrovalentinosid

(n=2)

MeOH-Extrakt 4,26 1 181 748

Chloroform-Fraktion 0,48 1 025 435

Geradengleichung: y = 2*107x - 17492

Page 48: Titel der Diplomarbeit Charakterisierung von …othes.univie.ac.at/37371/1/2015-05-14_0848273.pdfDIPLOMARBEIT Titel der Diplomarbeit „Charakterisierung von Phenylpropan-Verbindungen

40

Unter Verwendung der Geradengleichung und der Peakfläche des Substanzpeaks

von Scrovalentinosid im MeOH-Extrakt und in der Chloroform-Fraktion (s. Tabelle 14,

S. 39) konnte die Konzentration der Komponente in den Untersuchungslösungen

ermittelt werden.

Tabelle 15: Ergebnisse der Quantifizierung von Scrovalentinosid

Die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung des Iridoidglykosids zeigten ebenfalls

eine starke Anreicherung von Scrovalentinosid in der Chloroform-Fraktion. Verglich

man die Ergebnisse mit jenen von Koelziosid (s. Tabelle 12, S. 37), so war

festzustellen, dass Scrovalentinosid die Hauptkomponente in der Chloroform-

Fraktion darstellte.

3.6.6. Quantifizierung von Hispidulin

Die Quantifizierung von Hispidulin erfolgte ausschließlich in der Chloroform-Fraktion,

da es sich hierbei nicht um eine Hauptkomponente des methanolischen Extraktes von

Scrophularia lucida handelte. Es wurde quantitativ bestimmt, da eine

aktivitätsgeleitete Untersuchung die hohe Aktivität von Hispidulin gezeigt hatte [16].

Bei Hispidulin handelt es sich um das Aglykon von Homoplantaginin.

Konzentration (mg/ml) Anteil (%)

MeOH-Extrakt 0,0560 1,41

Chloroform-Fraktion 0,0521 10,91

Page 49: Titel der Diplomarbeit Charakterisierung von …othes.univie.ac.at/37371/1/2015-05-14_0848273.pdfDIPLOMARBEIT Titel der Diplomarbeit „Charakterisierung von Phenylpropan-Verbindungen

41

HPLC-Methode

(s. 2.2.3., S. 7)

Hispidulin wurde bei einer Wellenlänge 334 nm, dem UV-Maximum der Komponente

entsprechend, quantifiziert.

Zur Erstellung der fünf Verdünnungslösungen wurde eine Stammlösung mit 0,95 mg

Hispidulin in 1 ml DMSO angefertigt. Die Stammlösung beinhaltete, entsprechend der

Reinheit von 98,0% (s. Tabelle 6, S. 30), 0,931 mg Substanz.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425

450

475

500

525

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%334nm4nm (1.00)

42

.25

8/2

70

98

2

49

.09

9/3

28

11

0 50

.22

2/2

69

01

55

1.0

10

/23

79

47

51

.30

7/3

72

39

95

2.5

07

/14

85

77

25

3.1

55

/24

07

94

55

.08

2/1

64

46

83

60

.43

1/1

48

37

58

62

.49

9/2

17

73

0

64

.20

2/4

06

04

06

5.1

76

/76

54

9

68

.63

7/5

13

99

26

8.8

29

/53

67

68

69

.59

2/5

30

40

42

70

.99

8/1

84

45

67

1.8

65

/37

20

73

72

.91

3/2

52

05

37

3.2

17

/45

69

50

74

.08

9/3

70

06

07

4.5

14

/35

03

31

74

.98

7/8

48

04

8 75

.22

8/2

28

94

2

76

.82

8/7

39

20

1

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 nm

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325mAU 60.54

20

5

30

1

24

7

21

6

33

4

27

3

Abbildung 43: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 334 nm

Abbildung 44: UV-Spektrum von Hispidulin bei 60,54 min

Hispidulin

Page 50: Titel der Diplomarbeit Charakterisierung von …othes.univie.ac.at/37371/1/2015-05-14_0848273.pdfDIPLOMARBEIT Titel der Diplomarbeit „Charakterisierung von Phenylpropan-Verbindungen

42

Tabelle 16: Herstellung der Eichlösungen von Hispidulin in DMSO

Abbildung 45: Eichgerade von Hispidulin

Tabelle 17: Peakfläche von Hispidulin in der Untersuchungslösung

y = 4E+07x - 44648R² = 0,9999

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1

Peakfläche

Konzentration (mg/ml)

Hispidulin

Verdünnungs-

lösung

Verdünnungsschritte Konzentration

(mg/ml)

Peakfläche

(n=2)

Hisp1 1 T Stammlsg. + 9 T DMSO 0,0931 3 921 578

Hisp2 1 T Hisp1 + 1 T DMSO 0,0466 1 919 522

Hisp3 2 T Hisp2 + 1 T DMSO 0,0310 1 283 460

Hisp4 2 T Hisp3 + 1 T DMSO 0,0207 832 503

Hisp5 3 T Hisp4 + 1 T DMSO 0,0155 623 062

Untersuchungslösung Konzentration

(mg/ml)

Peakfläche Hispidulin (n=2)

Chloroform-Fraktion 4,3 1 405 565

Geradengleichung: y= 4*107x - 44648

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Um die Konzentration und den Anteil des Hispidulins in der Chloroform-Fraktion zu

bestimmen, wurde die Fläche des Substanzpeaks in der Untersuchungslösung (s.

Tabelle 17, S. 42) in die Geradengleichung eingesetzt.

Tabelle 18: Ergebnisse der Quantifizierung von Hispidulin

Konzentration (mg/ml) Anteil (%)

Chloroform-Fraktion 0,0363 0,84

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4. Diskussion

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen weiteren Beitrag zur Charakterisierung des

Inhaltsstoffmusters eines methanolischen Extraktes von Scrophularia lucida zu

leisten, um die genannte Art innerhalb der Gattung Scrophularia chemotaxonomisch

besser zuordnen zu können.

Hierzu erfolgte eine Identifizierung von Komponenten der Ethylacetat-Fraktion, die in

vorangegangenen Diplomarbeiten bereits aufgetrennt und analysiert worden war

[5,7]. Fraktionen aus diesen Arbeiten wurden im Zuge dieser Arbeit mittels

Säulenchromatographie (SC 1 und SC 2) fraktioniert.

Insbesondere phenolische Substanzen des komplexen Inhaltsstoffmusters sollten für

eine anschließende Strukturaufklärung in möglichst reiner Form dargestellt werden.

Eine Reindarstellung von Inhaltsstoffen mittels SC konnte nicht erreicht werden. Es

war allerdings durch Vergleiche mit bekannten Flavonoiden [11] mittels

Dünnschichtchromatographie und High Performance Liquid Chromatography

möglich, die Identität einiger Komponenten zu bestimmen. Durch Übereinstimmung

von Rf-Werten und Fluoreszenz-Farben der Substanzbanden nach der Detektion mit

NST A/ PEG in der DC und der Retentionszeiten und UV-Spektren in der HPLC

wurden in der Sammelfraktion 14 der SC 2 Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid

nachgewiesen. In SC 2 / SF 21 konnte die Identität von Nepitrin bestätigt werden und

in den Sammelfraktionen 25, 26 und 27 konnte die Komponente mit Rf=0,67 Luteolin-

7-O-glucosid zugeordnet werden.

Die Flavonoide Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid waren bereits aus Scrophularia

ilwensis [12] und Nepitrin aus Scrophularia ningpoensis [13] bekannt. Luteolin-7-O-

glucosid wurde zum ersten Mal in der Gattung Scrophularia nachgewiesen.

Die Analysen der Hauptkomponente aus Sammelfraktion 8 der SC 2 mittels HRMS

und HPLC wiesen auf ein Derivat der Vanillinsäure hin. Die Identität konnte allerdings

auf Grund fehlender Referenz-Substanzen bzw. zu geringer Ausbeute der

Sammelfraktion nicht eindeutig bestimmt werden.

Außerdem wurden zur Charakterisierung des Inhaltsstoffmusters des methanolischen

Extraktes von Scrophularia lucida vier Komponenten im Methanol-Extrakt, der

Ethylacetat- und der Chloroform-Fraktion quantitativ bestimmt.

Die Quantifizierung erfolgte mittels HPLC und externer Eichung. Dazu mussten

Homoplantaginin durch Kristallisation und Scrovalentinosid durch SC aufgereinigt

werden. Für die Erstellung einer Eichgerade wurden fünf bzw. sechs Konzentrationen

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des Standards vermessen. Durch die daraus ermittelte Geradengleichung konnte die

Menge und die Konzentration der jeweiligen Substanz in den Analysenlösungen

bestimmt werden.

Homoplantaginin konnte als Hauptinhaltsstoff von Scrophularia lucida, der sich

vorwiegend in der Ethylacetat-Fraktion und in geringem Ausmaß auch in der

Chloroform-Fraktion anreichert, bestimmt werden. Die Iridoidglykoside Koelziosid und

Scrovalentinosid sind im MeOH-Extrakt in geringerer Konzetration enthalten, werden

allerdings als Hauptkomponenten in der Chloroform-Fraktion angereichert. Hispidulin

zählt nicht zu den Hauptinhaltsstoffen von Scrophularia lucida, wurde aber auf Grund

seiner hohen Aktivität im CCID-Assay quantifiziert. Es war in der Chloroform-Fraktion

angereichert.

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5. Zusammenfassung

Scrophularia lucida wird, wie auch andere Arten der Gattung Scrophularia, seit langer

Zeit in der traditionellen Medizin zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen

wie Ekzemen und Psoriasis angewendet. Aktivitätsgeleitete Untersuchungen zeigten

einen inhibierenden Effekt des methanolischen Extraktes auf einen wichtigen Schritt

im Zuge der Metastasierung von Brustkrebs.

Da bisher keine Daten zum Inhaltsstoffmuster von Scrophularia lucida vorlagen,

wurde in vorangegangenen Diplomarbeiten mit dessen Charakterisierung begonnen,

welche in der vorliegenden Arbeit fortgesetzt werden sollte.

Es wurden Fraktionen der Ethylacetat-Fraktion mittels Säulenchromatographie

aufgetrennt. Eine Reindarstellung von Einzelkomponenten konnte nicht erreicht

werden. Durch Vergleiche mit bekannten Flavonoiden in zwei unterschiedlichen

chromatographischen Systemen (DC, HPLC) konnte das Vorliegen der Flavonoide

Rutin, Kämpferol-3-O-rutinosid und Nepitrin nachgewiesen werden, welche bereits in

der Gattung Scrophularia bekannt waren. Luteolin-7-O-glucosid wurde zum ersten

Mal in der Gattung identifiziert.

Des Weiteren wurden vier Inhaltsstoffe des methanolischen Extraktes mittels HPLC

unter Verwendung von externen Standards quantitativ bestimmt. Das Flavonoid

Homoplantaginin wurde als Hauptinhaltsstoff des methanolischen Extraktes (2,99%)

und der Ethylacetat-Fraktion (24,08%) nachgewiesen. Die Iridoidglykoside Koelziosid

(9,34%) und Scrovalentinosid (10,41%) konnten als Hauptkomponenten der

Chloroform-Fraktion bestimmt werden. Das Flavonoid Hispidulin lag zu 0,84% in der

Chloroform-Fraktion vor.

Somit konnten die Daten zum Flavonoidmuster erweitert und zum ersten Mal die

quantitativen Anteile einiger Sekundärmetaboliten in Scrophularia lucida ermittelt

werden.

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6. Summary

Scrophularia lucida, as well as other species of the genus Scrophularia has been used

since a long time in traditional medicine to treat inflammatory diseases like eczema

and psoriasis. Investigations showed an inhibiting effect of the methanolic extract on

an important step in the course of the metastasis of breast cancer.

Due to the fact that so far no data on the secondary metabolites of Scrophularia lucida

were available, the characterization was started in previous diploma theses, which

were to be continued in the present work.

Fractions of the ethylacetate fraction were initially separated by column

chromatography. As an isolation of single components was not possible, several

components were identified by comparison with authentic flavonoids in two different

chromatographic systems (TLC, HPLC). This way the flavonoids rutin, kaempferol-3-

O-rutinoside and nepitrin were confirmed in this species. Rutin and kaempferol-3-O-

rutinoside were already known in the genus Scrophularia. Luteolin-7-O-glucoside was

identified for the first time in the genus.

Furthermore, four secondary metabolites in the methanolic extract were quantified by

HPLC under external standardisation. The flavonoid homoplantaginin was

characterized as the main ingredient of the methanolic extract (2.99%) and the

ethylacetate fraction (24.08%). The iridoid-glycosides koelziosid (9.34%) and

scrovalentinoside (10.41%) were determined as the main components of the

chloroform fraction. The flavonoid hispidulin was quantified in the chloroform fraction

(0.84%).

Thus, the data on the flavonoid pattern were extended and the characterization of the

quantitative composition of some secondary metabolites of Scrophularia lucida are

described for the first time.

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7. Literaturverzeichnis

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[3] http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl?33420, zuletzt

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activity in rats and mice of phenolic acids isolated from Scrophularia

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[16] Spitznagel A., Diplomarbeit, Universität Wien, in Vorbereitung

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50

8. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Scrophularia lucida (L.) ...................................................................... 1

Abbildung 2: Aktivität im CCID-Assay: Reduktion der Löcher unter Behandlung mit

dem Methanol-Extrakt von Scrophularia lucida [1] .................................................... 2

Abbildung 3: Säulenchromatographie ..................................................................... 6

Abbildung 4 : DC der Fraktionen SPE 2/ 3-8 [7] und SPE 2/ 9-11 [7] ...................... 9

Abbildung 5: Präparative DC-Trennung .................................................................. 9

Abbildung 6: DC-Prüfung der isolierten Banden 1 und 2 ....................................... 10

Abbildung 7: DC der Sammelfraktionen der SC 1 ................................................. 11

Abbildung 8: DC der Fraktion SC 1/ SF 8 [5] ........................................................ 12

Abbildung 9: DC der Sammelfraktionen von SC 2 ................................................ 14

Abbildung 10: DC-Vergleiche mit Referenz-Substanzen ....................................... 16

Abbildung 11: DC-Vergleich mit Verbascosid ....................................................... 17

Abbildung 12: DC-Vergleich mit Eriodictyol-7-O-glucosid ..................................... 18

Abbildung 13: DC-Vergleich mit Rutin und Kämpferol-3-O-rutinosid ..................... 19

Abbildung 14: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 14 ...................................... 20

Abbildung 15: UV-Spektrum von Rutin in SF 14, bei 33,31 min ............................ 20

Abbildung 16: UV-Spektrum von Kämpferol-3-O-rutinosid in SF 14, bei 38,35 min

............................................................................................................................... 21

Abbildung 17: DC-Vergleich von SC 2/ SF21 mit Nepitrin ..................................... 21

Abbildung 18: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 21 ...................................... 22

Abbildung 19: UV-Spektrum von Nepitrin in SF 21, bei 37,18 min ........................ 22

Abbildung 20: DC-Vergleich von SC 2/ SF 24, 26 und 27 ..................................... 23

Abbildung 21: HPLC-Chromatogramm von SC 2/ SF 27 ...................................... 24

Abbildung 22: UV-Spektrum von Luteolin-7-O-glucosid in SF 27, bei 34,97 min ... 24

Abbildung 23: HPLC-Chromatogramm von SC 2 / SF 8 ....................................... 25

Abbildung 24: HPLC-Chromatogramm von Vanillinsäure ..................................... 26

Abbildung 25: HPLC-Chromatogramm von Scrovalentinosid (69,93 min) vor der SC

3 ............................................................................................................................. 28

Abbildung 26: DC-Überprüfung der Fraktionen von SC 3 ..................................... 28

Abbildung 27: DC-Überprüfung der Fraktionen 20 und 22 von SC 3 ..................... 29

Abbildung 28: DC-Überprüfung der Fraktionen 18 und 28 von SC 3 ..................... 29

Abbildung 29: HPLC-Chromatogramm von Scrovalentinosid nach der SC 3 ........ 29

Abbildung 30: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 334 nm ................ 31

Abbildung 31: HPLC-Chromatogramm der Ethylacetat-Fraktion bei 334 nm ........ 31

Abbildung 32: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 334 nm ......... 32

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Abbildung 33: UV-Spektrum von Homoplantaginin bei 42,36 min .........................32

Abbildung 34: Eichgerade Homoplantaginin .........................................................33

Abbildung 35: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 276 nm ................34

Abbildung 36: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 276 nm .........35

Abbildung 37: UV-Spektrum von Koelziosid bei 76,83 min ....................................35

Abbildung 38: Eichgerade Koelziosid ....................................................................36

Abbildung 39: HPLC-Chromatogramm vom MeOH-Extrakt bei 313 nm ................37

Abbildung 40: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 313 nm .........38

Abbildung 41: UV-Spektrum von Scrovalentinosid bei 69,98 min ..........................38

Abbildung 42: Eichgerade von Scrovalentinosid ...................................................39

Abbildung 43: HPLC-Chromatogramm der Chloroform-Fraktion bei 334 nm .........41

Abbildung 44: UV-Spektrum von Hispidulin bei 60,54 min ....................................41

Abbildung 45: Eichgerade von Hispidulin ..............................................................42

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9. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Verwendete Fraktionen ........................................................................... 3

Tabelle 2: HPLC-Parameter..................................................................................... 7

Tabelle 3: Sammelfraktionen der SC 1 .................................................................. 12

Tabelle 4: Sammelfraktionen der SC 2 .................................................................. 15

Tabelle 5: DC-Vergleiche mit Referenz-Substanzen .............................................. 17

Tabelle 6: Reinheit der Standards ......................................................................... 30

Tabelle 7: Herstellung der Eichlösungen von Homoplantaginin in DMSO .............. 33

Tabelle 8: Peakflächen von Homoplantaginin in den Untersuchungslösungen ...... 33

Tabelle 9: Ergebnisse der Quantifizierung von Homoplantaginin ........................... 34

Tabelle 10: Herstellung der Eichlösungen von Koelziosid in DMSO ....................... 36

Tabelle 11: Peakflächen von Koelziosid in den Untersuchungslösungen ............... 36

Tabelle 12: Ergebnisse der Quantifizierung von Koelziosid ................................... 37

Tabelle 13: Herstellung der Eichlösungen von Scrovalentinosid in DMSO ............. 39

Tabelle 14: Peakflächen von Scrovalentinosid in den Untersuchungslösungen ..... 39

Tabelle 15: Ergebnisse der Quantifizierung von Scrovalentinosid .......................... 40

Tabelle 16: Herstellung der Eichlösungen von Hispidulin in DMSO ....................... 42

Tabelle 17: Peakfläche von Hispidulin in der Untersuchungslösung ...................... 42

Tabelle 18: Ergebnisse der Quantifizierung von Hispidulin .................................... 43

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53

Anhang

Anhang 1: HPLC-Chromatogramm der Referenz Rutin

HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)

Anhang 2: UV-Spektrum von Rutin bei 34,11 min

200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425

mAU 34.11

23

7

28

2

43

9

20

3

25

6

35

4

44

8

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

2.9

15

/12

37

83 3

.65

2/2

38

74

64

.18

3/1

53

99

2

34

.10

9/2

84

11

46

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54

Anhang 3: HPLC-Chromatogramm der Referenz Kämpferol-3-O-rutinosid

HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)

Anhang 4: UV-Spektrum von Kämpferol-3-O-rutinosid bei 38,33 min

Anhang 5: HPLC-Chromatogramm der Referenz Nepitrin

HPLC-Methode

(2.2.3., S. 7)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%345nm,4nm (1.00)

34

.98

4/3

30

01

37

.11

1/7

44

76

5

42

.19

5/1

28

17

84

2.9

20

/17

68

8

45

.07

5/6

08

8

52

.92

9/3

29

8

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 nm

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5mAU 38.33

28

1

43

2

26

5

34

7

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

35

.55

2/1

14

22

70

/89

71

3

38

.32

8/3

34

27

5/3

02

86

Kämpferol-3-

O-rutinosid

Nepitrin

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55

Anhang 6: UV-Spektrum von Nepitrin bei 37,11 min

Anhang 7: HPLC-Chromatogramm der Referenz Luteolin-7-O-Glucosid

HPLC-Methode

(2.2.3., S. 7)

Anhang 8: UV-Spektrum von Luteolin-7-Glucosid bei 35,05 min

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 nm

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

mAU 35.05

23

5

29

6

20

5

34

8

25

4

200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

mAU 37.11

24

2

29

8

21

4

34

5

27

1

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425

450

475

500

525

550

575

600

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

35

.16

6/6

99

47

16

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56

Anhang 9: HPLC-Chromatogramm von SC 2 / SF 25

HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)

Anhang 10: UV-Spektrum von SC 2 / SF 25 bei 34,89 min

Anhang 11: HPLC-Chromatogramm von SC 2 / SF 26

HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

2750

3000

3250

3500

3750

4000

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

26

.55

5/1

83

06

11

34

.88

9/2

50

64

22

3

36

.96

1/6

25

39

99

8

39

.68

1/1

13

03

00

40

.01

1/1

07

83

38

64

0.9

31

/37

52

96

74

2.2

28

/49

40

22

1

43

.59

9/1

71

38

18 4

4.5

98

/32

69

04

1

46

.16

9/1

11

68

72

46

.66

1/2

12

54

004

7.5

50

/76

22

46

1 48

.08

5/5

76

46

68

48

.43

4/7

08

93

75

49

.62

6/1

06

50

23

50

.78

3/1

53

86

28

52

.28

4/5

73

74

42 5

2.9

96

/96

81

95

54

.34

5/1

16

81

65

56

.84

4/1

74

48

69

58

.19

8/9

03

14

4

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 nm

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

2750

3000

3250

mAU 34.89

20

4

23

6

29

6

21

7

34

6

25

3

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0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%254nm,4nm (1.00)

28

.02

1/1

62

61

76

36

.35

9/1

70

13

56

7

41

.38

8/1

19

24

68

43

.09

0/1

96

20

37

49

.97

5/1

65

93

76

0

54

.03

1/6

63

45

32

77

.72

1/1

44

59

92

Luteolin-7-O-

glucosid

Luteolin-7-O-

glucosid

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57

Anhang 12: UV-Spektrum von SC 2 / SF 26 bei 36,36 min

200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 nm

-250

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

2750

3000

mAU 36.36

20

5

23

6

29

5

21

3

34

7

25

3

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58

Anhang 13: HRMS-Spektren im Negativ-Ionenmodus der Komponente bei 28,11 min aus SC 2/ SF 8

Meas. m/z # Ion Formula m/z err [ppm] Score

108.0217 1 C6H4O2 108.0217 -0.4 100.00

124.0166 1 C6H4O3 124.0166 0.3 100.00

152.0114 1 C7H4O4 152.0115 0.9 100.00

167.0351 1 C8H7O4 167.0350 -0.9 100.00

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59

Anhang 14: UV-Spektrum von SC 2/ SF 8 bei 28,11 min

Anhang 15: UV-Spektrum von Vanillinsäure bei 19,88 min

Anhang 16: HPLC-Chromatogramm der Homoplantaginin-Verdünnungslösung H3

HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 nm

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

mAU 28.11

21

4

28

0

23

7

20

7

21

9

26

0

29

5

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 nm

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

1900

2000

2100

mAU 19.88

28

1

23

6

26

1

29

2

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

275

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325

350

375

400

425

450

475

500

525

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%334nm,4nm (1.00)

37

.12

0/3

03

51

7

42

.18

1/4

68

09

73

52

.48

7/2

71

79

95

.82

9/1

07

00

1

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60

Anhang 17: HPLC-Chromatogramm der Koelziosid-Verdünnungslösung K3

HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)

Anhang 18: HPLC-Chromatogramm der Scrovalentinosid-Verdünnungslösung S3

HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)

Anhang 19: HPLC-Chromatogramm der Hispidulin-Verdünnungslösung Hisp3

HPLC-Methode (2.2.3., S. 7)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%276nm4nm (1.00)

6.8

72

/13

17

4

68

.84

2/3

52

16

9.6

08

/12

94

3

76

.11

4/1

11

24

76

.45

7/1

05

21

76

.70

7/4

00

45

87

7.3

38

/55

17

80

.76

2/4

49

2

82

.16

8/4

60

9

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0

5

10

15

20

25

30

35

40

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55

60

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70

75

80

85

90

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100

105

110

115

120mAU

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%334nm,4nm (1.00)

60

.16

9/6

53

54

60

.53

8/1

28

81

83

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 min

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

mAU

0.0

5.0

10.0

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30.0

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40.0

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50.0

55.0

60.0

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70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95.0

%313nm,4nm (1.00)

55

.03

4/4

47

00

59

.98

5/4

01

3

68

.86

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69

.61

7/1

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.65

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3

75

.02

0/9

07

7

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61

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62

Curriculum vitae

Ausbildung

Praktika

Juli 2006 Ströck – Brot GmbH, 1010 Wien

August 2007 Julius Meinl am Graben, 1010

Wien

September 2009 – Oktober 2010 TST GmbH Personaldienstleister

September 2011 – April 2015 Allerheiligen Apotheke, 1200 Wien

Name: Tobias Ledermüller

Geburtsdatum: 17.08.1990

Geburtsort: Wien

Staatsangehörigkeit: Österreich

Eltern: Dr. Herbert Ledermüller

Brigitte Ledermüller (geb. Mader)

1996 - 2000 Volksschule, 1210 Wien

2000 - 2008 BRG Bertha v. Suttner, 1210 Wien

04.06.2008 Reifeprüfung

März 2009 Beginn des Pharmazie-Studiums

an der Universität Wien