TEKNIK APLIKASI KONSORSIUM BAKTERI ENDOFITIK …

TEKNIK APLIKASI KONSORSIUM BAKTERI ENDOFITIK PENAMBAT N2ASAL TUMBUHAN EKOSISTEM AIR HITAM KALIMANTAN TENGAHDALAM MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN PENAMBATAN N2

TANAMAN PADI GOGO

........ :.:.:.:-::::::.,

Mieke R. Setiawati\ Tualar Slmarmata', Yuyun Sumarni\Dedeh H.Arief\ dan Dwi Andreas Santosa\ Hari R. Harlyadf

'Lab Biologi dan Bioteknologi Tanah Fakultas Pertanian UNPAD,'Lab.Mikrobiologi dan Bioteknologi Lingkungan PPLH IPB.

'Lab. Mikrobiologi Lingkungan PP Kimia LlPIE-mail: [email protected]

INTISARI

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkanteknik aplikasi konsorsium bakteri endofitik asaltumbuhan Ekosistem Air Hitam Kalimantan Tengahyang dapat meningkatkan pertumbuhan danpenambatan N2 tanaman padi gogo. Percobaandilakukan di Laboratorium Biologi dan BioteknologiTanah Fakultas Pertanian Universitas Padjadjaran.

Dari seleksi iahap awal didapatkan 12konsorsium bakteri endofitik asal tumbuhan EkosistemAir Hitam Kalimantan Tengah yang dapatmeningkatkan pertumbuhan tanaman padi gogo. Duadari 12 konsorsium bakteri endofitik tersebut dapaimenambat N2 secara konsisten dan meningkatkanpertumbuhan dan penambatan N2 pada tanaman padigogo. Konsorsium tersebut adalah konsorsium H yangdiisolasi dari daun tumbuhan Waru (Dilleniapulchella) dan konsorsium I yang diisolasi daritumbuhan Gemor (Alceodaphde sp.).

Rancangan penelitian yang digunakan padapercobaan ini adalan Rancangan Acak Lengkapfaktorial3 faktor dengan tiga ulangan. Faktor pertamaadalah jenis konsorsium bakteri endofitik penambat N2yang terdiri dari dua taraf yaitu : il = konsorsium Hdan i2 = konsorsium I. Faktor kedua adalah caraaplikasi bakteri endofitik penambat N2 yang terdiri atasdua tarat yaitu : al = benih direndam dengan suspensibakieri selama 24 jam dan a2= tanaman padi umur 1MST disemprot dengan suspensi bakteri. Faktor ketigaadalah kepadatan inokulan bakteri endofitik penambatN2 yang terdiri atas empat taraf, yaitu : Po = tanpa

26

''i'1

inokulan, PI = kepadatan inokulan 107 CFU ml', P2=kepadatan inokulan 109 CFU ml", P3 = kepadataninokulan 1011 CFU mi', CFU adalah singkatan dariColony-Forming Unit yang mencerminkan satuanmikroba yang membentuk sebuah koloni.

Hasil percobaan menunjukkan aplikasikonsorsium kedua bakteri endofitik penambat N2dengan cara merendam benih padi gogo di dalamsuspensi bakteri dengan kepadatan 1011 CFU mtl

selama 24 jam dapat meningkatkan pertumbuhan danpenambatan N2 tanaman padi gogo. Berat keringtanaman dan aktivitas nitrogenase tanaman padi gogoyang diinokulasi konsorsium H dan I berturut turutsebesar 0,084 dan 0,097 g serta 254,0 dan 225,0 nmol tI· -1Jam.

Anggota konsorsium H bakteri endofitikpenambat N2 adalah Klebsiella pneumoniae,Pseudomonas stutzeri, Brevundimonas vesicularis, danBurkholderia cepacia sedangkan anggota konsorsium Iadalah Klebsiella pneumoniae, Pseudomonasfluorescens, Burkholderia cepacia, dan Acinetobacterbaumanii

Kata Kunci : Bakteri endofitik, Nitrogen, TumbuhanEkosistemAir Hitam, Padi Gogo_

ABSTRACT

This study was intended to derive an applicationtechnique of bacterial consortium obtained fromplantation black water ecosystem of CentraKalimantan, and therefore to increase the nitrogen

JKTJ, VOL. 12, No.1, Juni 2010

fixation and growth of the upland rice. The experimentswere conducted in the Biology and BiotechnologyLaboratory, Faculty of Agriculture, PadjadjaranUniversity, Jatinangor-West Java.

The preliminary selection of inoculum sourcefrom the plantation ecosystem at black water ecosystemof Central Kalimantan produced 12 consortia of theendophytic bacterium that increase the growth ofupland rice.Among of the 12 consortia, 2 consortia (didcontribute nitrogen fixation consistently and soincrease the growth of upland rice. The two consortiawere a bacterial consortium (H) isolatedfrom the leavesof Waru plant (Dillenia pulchella) and a bacterialconsortium (I) isolatedfrom Gemor plant (Alceodaphdesp.).

Threefactorial of Complete-Random Design andtriplo experiment was selected for the experimentaldesign of this study. First factor was consortium ofendophytic nitrogen fixation bacterial with two stages (~ = consortium Hand i2 = consortium I). The secondfoetor was the technique of endophytic nitrogen fixationbacteria application with two stages (aI = rice seedsoaked in the bacterial suspension for 24hours and a2= 1MST old rice plant sprayed the bacterial suspension).The third factor was turbidity (population) ofendophytic nitrogen fixation bacterial inoculum with 4stages (Po=no inoculum control, PI= 107 CFU.mtI, P2=1(/ CFU.mtI, P3= 1011CFU.mtI). The CFU is a Colony-Forming Unit indicating microbes in aform of colony,initially, grewfrom single cell.

The results of this experiment showed that theapplication technique of endophytic nitrogen fixationbacteria by soaking the upland rice seed in bacterialsuspension containing 1011CFU.mrI for 24 hours wasable to increase the growth and nitrogen fixation of theupland rice plant. Dry weight of the plant inoculatedwith consortia Hand I was respectively 0.084 and 0.097g while the nitrogenase activity of the upland rice plantinoculated with consortiaHand I was 254.0 and 225.0nmol g"1 DWhou,-I, respectively. With Microbact 24 E(12E/12A + 12B) and API-20 NE methods, member ofendophytic nitrogen fixation bacteriafrom consortiumH was indentified as Klebsiella pneumoniae,Pseudomonas stutzeri, Brevundimonas vesicularis, and

JKTI, VOL. 12, No.1, Juni 2010

Burkholderia cepacia while from consortium I wasKlebsiella pneumoniae, Pseudomonas fluorescens,Burkholderia cepacia,and Acinetobacter baumanii.

Kata Kunci : Endophytic bacteria.Nitrogen, Plantationblackwaterecosystem,Uplandriceplant.

PENDAHULUAN

Tumbuhan yang terdapat pada EkosistemAir Hitam Kabupaten Barito Selatan, KalimantanTengah umumnya merupakan tanaman pioniryang mampu hidup dalam kondisi ekstrim.Tanaman endemik yang khas pada lokasi tersebuttentunya berkemampuan lebih dari tanaman lainyang tumbuh pada kondisi normal. Dari tanamantersebut besar kemungkinan diperoleh mikrobaunik yang berpotensi untuk dikembangkansebagai pupuk hayati seperti bakteri penambat N,pemacu pertumbuhan tanaman, atau mikrobayang berkemampuan berkompetisi denganpenyakit tanaman. Oleh karena itu, pemanfaatanbakteri endofitik penambat N2 hasil eksplorasidari Ekosistem Air Hitam Kalimantan Tengahmerupakan salah satu altematif yang dapatdiaplikasikan sebagai pensubtitusi pupuknitrogen anorganik.

Pemanfaatan bakteri endofitik penambat N2dari hasil eksplorasi ekosistem yang kaya akankeanekaragaman sumber hayatinya merupakansalah satu alternatif dalam menutupiketimpangan akibat penggunaan pupuk nitrogenanorganik. Nitrogen yang dihasilkan selain dariproses asimilasi biologis dapat memberi dampakpencemaran nitrat pada air tanah dan dari sisanitrogen yang tidak termanfaatkan akan diubahmenjadi gas N20 yang berpotensi dalam efekrumah kaca. Stoltzfus et al; (1997)menyatakanbahwa endosymbiotic penambat N2 yangberasosiasi dengan tanaman, dapat memberikannitrogen yang ditambatnya secara biologislangsungpada tanaman.

27

Sturz dan Nowak (2000) menyatakanbahwa dalam mengeksplorasi mikroba endofitikperIu suatu strategi yang dimulai dari isolasi danpurifikasi mikroba endofitik yang bersifatmenguntungkan dari mikroba penyebabpenyakit, menguji kemampuannya dalammeningkatkan pertumbuhan tanaman,memperbanyak, dan mengaplikasikan padatanaman sedini mungkin agar mendominasipopulasi mikroba pada jaringan tanaman yangdiinokulasi.

Teknik aplikasi isolat bakteri endofitikpenambat N2 pada tanaman padi gogo dapatdilakukan dengan berbagai cara seperti halnyapemberian pupuk biologis, aplikasinya dapatdengan perendaman pada benih ataupenyemprotan pada tanaman yang muda. Dosisaplikasi yang tepat perIu dicari mengingatbanyaknya bakteri endofitik penambat N2 yangdiaplikasikan mempengaruhi kemampuanadaptasi di tempat yang barn.

Inokulasi bakteri endofitik pada jaringantanaman yang tepat dapat membantukeberhasilan kolonisasi bakteri tersebut. Quadt-Hallmann and Kloepper (1996) telah mencobamenginokulasi bakteri endofitik Pseudomonasjluorescens pada jaringan biji, batang, dan dauntanaman kapas. Cara aplikasinya adalahmerendam biji kapas dengan suspensi inokulanselama 30 menit, sedangkan pada daun tanamankapas berumur 2 minggu bakteri endofitikdisebarkan dengan pipet secara merata dan padabatang kapas bagian bawah disuntikkan bakteriendofitik sebanyak 20 mL. Bakteri endofitik P.jluorescens yang diinokulasi pada biji dan daundapat diisolasi kembali setelah tanamandiinkubasikan selama dua minggu, tetapi tidakhalnya dengan yang diinokulasikan pada batang.

Aplikasi bakteri endofitik penambat N2pad a benih atau tanaman inang harusmemperhatikan kepadatan inokulum bakteritersebut. Kepadatan bakteri endofitik yang tepatketika diinokulasikan pada tanamanmeningkatkan daya adaptasi pada lingkunganyang barn. Hal itu dijadikan dasar pertimbanganjika bakteri endofitik penambat N2 akandiaplikasikan di lapangan, sedangkan bakteri

28

filosfer lainnya telah lebih dahulu menempatijaringan permukaan tanaman. Kepadatan bakteriendofitik yang diberikan pada biji dan dauntanaman kapas sebesar 1,0 x 107 cfuj mL telahberhasil mengkolonisasi organ tersebut danberhasil diisolasi kembali dengan kepadatan 1,1 x103 sampai 8,7 x 105cfu g.ljaringan akar dan lebihkurang 1,6x 104CFU.g'lbobot basah daun (Quadt-Hallmann danKloepper1996).

BAHAN DAN METODA

Ekstraksi bakteri endofitik dari jaringantumbuhan dari ekosistem Air Hitam kalimantanTengah dilakukan dengan metode Stoltzfus(1997) yang dimodifikasi. Bakteri endofitik yangdiperoleh dari jaringan sampel tanaman berupakonsorsium bakteri endofitik dari ekstraktanaman dalam larntan bufer fosfat.

Pada seleksi awal 29 konsorsium bakteriendofitik asal vegetasi Kalimantan Tengah diujikemampuannya dalam mengkolonisasi danmeningkatkan bobot kering serta aktivitasnitrogenase tanaman padi gogo. Konsorsiumbakteri endofitik yang diisolasi dalam bentukekstrak tumbuhan diinokulasikan pada tanamanpadi gogo umur tiga hari dan ditumbuhkan padamedium semi solid Fahraeus di dalam tabungreaksi (Stoltzfus et al; 1997). Dua konsorsiumterpilih diisolasi dan diinokulasikan kembali padatanaman padi gogo umur tiga hari yang ditanampada media semisolid Fahraeus dalam tabungreaksi dengan dua macam cara aplikasi dandipelihara selama 21hari pada growth chamber.

Pengujian teknik aplikasi dan kepadatandua konsorsium endofitik terpilih terhadappeningkatan bobot kering dan penambatan N2tanaman padi gogo dilakukan dengan rancanganacak lengkap pola faktorial (2x 2 x 4) dengan tigaulangan. Tiga faktor yang diteliti adalah:(1) faktor pertama, jenis konsorsium bakteri

endofitik penambat N2 yang terdiri atas duataraf, yaitu :(a) konsorsium ke-1 bakteri endofitik

penambat N, (4),(b) konsorsium ke-2 bakteri endofitik

penambat Njl.).

JKTI, VOL. 12, No.1, Juni 2010

(2) faktor kedua, cara aplikasi bakteri endofitikpenambat N2yang terdiri atas dua taraf, yaitu :(a) benih direndam dengan suspensi bakteri

selama Zdjamja.),(b) tanaman padi umur 1 MST (Minggu

Setelah Tanam) disemprot dengansuspensi bakteri (aJ.

(3) faktor ketiga, kepadatan dalam satuanColony-Forming Unit per mL (CFU.mL-I)inokulan bakteri endofitik penambat N2yangterdiri atas empat taraf, yaitu :(a) tanpainokulanjp.),(b) kepadataninokulan 107CFUmL-I(PI)'(c) kepadatan inokulan Itf Cf'U mL-I(pJ,(d) kepadataninokulan 1011CFU mL-I(P3)'

Analisis data dilakukan dengan uji F danuntuk membedakan antara rata-rata perlakuanpada setiap respons, digunakan uji Beda NyataTerkecil (BNT)pada tarafnyata 0.05.

Anggota kedua konsorsium yangdigunakan dalam percobaan diidentifikasidengan menggunakan Kit Microbact 24 E(12Ej12A + 12B) untuk bakteri golonganEnterobacter, sedangkan Kit API-20 NE

digunakan untuk mengidentifikasi golongan nonEnterobacter sehingga anggota dari konsorsiumbakteri endofitik penambat N2 tersebut dapatdiketahui.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada tahap seleksi konsorsium bakteriendofitik dilakukan uji konsistensi darikonsorsium bakteri endofitik yang dapatmeningkatkan bobot kering dan aktivitasnitrogenase (ARA, Acetylene Reduction Assay)tanaman padi gogo. Dari seleksi tahap awaldidapatkan 12 konsorsium bakteri endofitik asaltumbuhan Ekosistem Air Hitam KalimantanTengah yang dapat meningkatkan pertumbuhantanaman padi gogo. Dua dari 12 konsorsiumbakteri endofitik tersebut dapat menambat N2secara konsisten dan meningkatkan pertumbuhandan penambatan N2 pada tanaman padi gogo.Konsorsium tersebut adalah konsorsium H yangdiisolasi dari daun tumbuhan Warn (Dilleniapulchella) dan konsorsium I yang diisolasi daridaun tumbuhan Gemor (Alceodaphde sp.).

Tabell. Aktivitas nitrogenase tanaman padi gogo akibat inokulasi konsorsium bakteri endofitik denganberbagai kepadatan

Jenis AplikasiKepadatan bakteri endofitik (P)

konsorsium(I) (A) 0 107 109 lOll

(Po) (PI) (P2) (P3)_______________________(nmol g-IBK jam") ___________________________

Direndam(a.) 41,00 a 226,50 a 231,50 a 254,00 b

H (il) A B B C

Disemprot 47,00 a 234,00 ab 242,00 b 255,50 b(a.) A B B C

Direndam 44,00 a 231,50 a 273,50 c 225,00 a(a.) A B C B

I (i2)Disemprot 43,50 a 241,00 b 248,50 b 255,00 a

(a2) A C C B

Keterangan: Angka yang ditandai dengan huruf keci! yang sarna (vertikal) dan huruf kapital yang sarna (horizontal) tidak berbeda nyata rnenurut Vji BNTpada taraf 5 %.

KTI, VOL. 12, No.1, Juni 2010 29

Konsorsium bakteri endofitik yangdisemprotkan pada permukaan daun dan yangdiinokulasikan dengan eara perendaman benihakan mengkolonisasi tanaman tersebut denganeara yang berbeda. Aplikasi konsorsium bakteriendofitik harus sedekat mungkin dengan tanamanyang diinokulasi karena menurut Rolfe danWeinman (2001) bakteri yang diinokulasikan disuatu tempat temyata hanya dapat bergerak padajarak yang tidak lebih dari 2 em dari lokasiinokulasi. Adaptasi dan ketahanan bakteriendofitik yang diinokulasikan pada tanamanbergantung pada kondisi tanaman itu sendiri.Morris (2001) menyatakan bahwa mikrobaberkemampuan untuk hidup dan menyebar biladiaplikasikan pada permukaan daun yangbergantung pada ketersediaan nutrisi daun. Jika

dalam mengkolonisasi permukaan daunkondisinya tidak menguntungkan, koloni bakteriterse but akan mengatur strategi dan akanmembentuk agregat atau mikrokoloni.

Aplikasi bakteri denganeara merendamkanbenih padi gogo di dalam suspensi konsorsiumbakteri endofitik menyebabkan konsorsiumbakteri dapat masuk kedalam jaringan benih padidan akan tumbuh di dalam jaringan benih. Faheyet al; (1991) menyatakan bahwa aplikasi bakteriendofitik pada benih jagung sebelum tanamdengan eara merendamnya dalam suspensibakteri endofitik menyebabkan bakteri tersebutdapat mengkolonisasi dan bertahan sertaberkembang di dalam benih. Kolonisasi itu akandilanjutkan pada saat tanaman tumbuh.

Tabe12. Bobot Kering tanaman tanaman padi gogo akibat inokulasi konsorsium bakteri endofitik denganberbagai kepadatan

Jenis Kepadatan bakteri endofitik (P )

Konsorsium Aplikasi

(I) (A) 0 06 109 1011

(Po) (Pl) (P2 ) (P3 )

-------------------------------- g ------------------------------------Direndam

( a, ) 0,067 a 0,077 a 0,089 a 0,084 aA B C C

H (il)

Disemprot 0,078 a 0,082 a 0,088 a 0,080 a(a, ) A B C B

Direndam 0,075 a 0,089 b 0,096 b O,097b( a1) A B C C

I ( i2)

Disemprot 0,072 a 0,094 b 0,090 b 0,078 a(a, ) A B C B

Keterangan: Angka yang ditandai dengan huruf keci! yang sarna (vertikal) dan huruf kapita! yang sarna (horizontal) tidakberbeda nyata rnenurut Uji BNT pada taraf 5 %.

30 JKTI, VOL. 12, No.1, Juni 2010

Aktivitas nitrogenase (Tabel 1) dan bobotleering tanaman padi gogo (Tabel 2) meningkatakibat inokulasi konsorsium bakteri endofitik Hdan I dengan kepadatan diatas 107 CFU me1.Konsorsium H meningkatkan secara nyataaktivitas nitrogenase dan bobot kering tanamanpadi gogo pada kepadatan 1011CFU mL-1denganaplikasi direndam atau disemprot. Padakonsorsium I aplikasi direndam lebih baik daripada disemprot dengan kepadatan 109 CFU mL-1.Peningkatan bobot kering tanaman sejalan denganpeningkatan aktivitas nitrogenase tanaman padi,hanya saja pengaruh kepadatan 1011CFU mL-1

tidak berbeda dengankepadatan 109CFUmL-1.Kepadatan konsorsium bakteri endofitik H

dan I sebesar 1011CFU mL-1 dengan aplikasidirendam merupakan kepadatan dan cara aplikasiyang dipilih untuk disarankan dalampenerapannya. Kepadatan tertinggi dipilihberdasarkan percobaan pendahuluan (yang tidakdisajikan dalam makalah ini) bahwa tidak seluruhbakteri yang digunakan untuk merendam benihakan masuk kedalam benih padi (Setiawati et al;2003). Menurut Fahey et aL, (1991) perendamanbenih dengan kepadatan bakteri yang tinggimenyebabkan perbedaan tekanan akibat suspensibakteri dalam bufer fosfat sehingga bakteriterdorong masuk dalam benih melalui pedisel.Pada saat benih dikeluarkan dari suspensi, bakteritetap berada dalam embrio.

Dari hasil identifikasi denganmenggunakan kit Microbact 24 E (12E/12A + 12B)untuk bakteri golongan Enterobacter, dan kit API-20 NE untuk golongan non Enterobacter, anggotakonsorsium H bakteri endofitik penambat N2adalah Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas stutzeri,Brevundimonas vesicularis, dan Burkholderia cepaciasedangkan anggota konsorsium I adalah Klebsiellapneumoniae, Pseudomonas fluorescens, Burkholderiacepacia,danAcinetobacter baumanii.

KESIMPULAN

(1) Aplikasi dengan cara merendam benih padigogo pada inokulan cair dengan kepadatan1011 CFU mL-1 selama 24 jam dapat

JKTI, VOL. 12, No.1, Juni 2010

meningkatkan pertumbuhan danpenambatan Njpada tanaman padi gogo.

(2) Anggota konsorsium H bakteri endofitikpenambat N2 adalah Klebsiella pneumoniae,Pseudomonas stutzeri, Brevundimonasvesicularis, dan Burkholderia cepaciasedangkananggota konsorsium I adalah Klebsiellapneumoniae, Pseudomonas fluorescens,Burkholderia cepacia, dan Acinetobacterbaumanii.

DAFfARPUSTAKA

1. Fahey, J.W., M.B. Dimock, and S.F. Tomasino.1991. Genetically engineered endophytes asbiocontrol agents : a case study from industry. InMicrobial Ecology of Leaves. Springer-Verlag,New York. )

2. Morris, C. 2001. The impact of biofilms on' ~ecology and control of epiphytic bacteria.Interdisciplinary plant biology Seminar Speaker,January 29, 2001. Plant Pathology Station,INRA, France.

3. Quadt-Hallmann, A. and J.W. Kloepper. 1996.Imunological detection localization of cottonendophytic Enterobacter asburiae JM 22 in differentplant species.Can. J.Microbiol. 42 :1144-1154.

4. Rolfe, B.G. and J.J. Weinman, 2001. Ricecultivars and endophytic bacteria towards thedevelopments of more effective nitrogen fixingassociations. RIRDC Publication. Available at :http://www.rirdc.gov.au. (diakses tanggal 8-7-2002).

5. Stoltzfus, J.R, RSo., P.P. Malarvithi, J.K. Ladhaand F.J. de Bruijn. 1997. Isolation of endophyticbacteriafrom rice and assesment of their potentialfor supplying rice with biologically fixed nitrogen.Plant and soil. 194 :25-36

6. Setiawati, M.R, D.W. Santosa, T. Simarmata, Y.Sumarni, and D.H. Arief. 2003. Peranan bakteriendofitik pemfiksasi Ndalam meningkatkan fiksasiN2 dan serapan N tanaman padi gogo. Pros.Kongres nm 2003, Padang.

7. Struz, A.V. and J. Nowak. 2000. Endophyticcommunities of rhizobacteria and strategis requiredto create yield enhancing associations with crops.Applied Soil Ecology 15 :183-190.

31