Procura de novos drogas antifúngicas que contêm compostos naturais: perspectivas, sinergismo e mecanismo de ação Prof. Susana A. Zacchino Farmacognosia Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas
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Procura de novos drogas antifúngicas que contêm compostos naturais: perspectivas,
sinergismo e mecanismo de ação
Prof. Susana A. ZacchinoFarmacognosia
Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas
Os fungos
são oportunistas
Causan doença em pacientesimunossuprimidos
transplantados que recebem quimioterapia
prematurosqueimados
idosos
produzindo infecções muito graves
Brown et al., Hidden killers: Human fungalinfections. Med Mycol. 4, 165rv13, 2012
pulmões
cérebro
pele
rins
Frequentemente os fungos
causam a morte aos pacientes
imunossuprimidos
Pfaller, Michael A., et al. PloS one 9.7 (2014): e101510.
principalmente
Candida sppCryptococcus sp
Dispomos de
antifúngicos em uso clínico
Pared celular
Membrana
Inhibición de distintas etapas de
la biosíntesis del ergosterol
se liga a ergosterolANFOTERICINA B
de 1955
Pared celular
Membrana
Unión al ergosterol
AZOLES
Inibem diversos estádios da
biossíntese de ergosterol
ALILAMINAS
a inibição parede celular
fúngica
Membrana
Inhibición de distintas etapas de
la biosíntesis del ergosterol
Unión al ergosterol
Metabolismo
intermediário
Equinocandinas: CASPOFUNGINA
5-FC
No entanto infecções fúngicas são muito difíceis de erradicar
Muitos fungos tornaram-se resistentes
C C
Uma causa é a formação de biofilmes
Fungal comunidade aderida a uma superfície,
suportado por uma matriz extracelular polimérica
que aderir a qualquer superfície ou qualquer órgão
ARTICULAÇÕES Alvéolos pulmonares
N
N
N
OH
NN
N
F
F
NH
NH2N
NH
O
HO
HO
OH
NH
NH
HN
O
N
O
O
H3C
H3C CH3
OHNH
H2N
OHO
HOCH3
OH
OH
O
O
HN
NH
NH2
F
O
5’-fluorocitosina
fluconazolcaspofungina
CH3
O
OOHOHOHO OH
COOH
CH3
HO
H3COH
O
O
OH
NH2
H3C
OH
OH
OH
N CH3
H3CCH3
CH3
terbinafina
resistem ao entrada de antifúngicos
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0.03
0.06
0.12
0.25 0.
5 1 2 4 8 16 32 64 128
256
512
Resistente
Sensível
Concentração inibitória mínima (CIM) de FCZ
biofilm
Candida albicans
A fim de combater a infecções fúngicas,os médicos usam a terapia de combinação
Johnson, M., et al., AAC 48, 693-715, 2004
+
+
+
Terapia antifúngica de
combinación
5-fluorocitosina + fluconazol
itraconazol + anfotericina B
caspofungina + fluconazol
Célula fúngica
Os modos de acção da combinação
Efeitos sobre a
múltiplos alvos
Efeitos
farmacocinéticos e
físicoquímicos
Os modos de acção da combinação
Efeitos sobre a
múltiplos alvos
Efeitos
farmacocinéticos e
físicoquímicos
Efeitos sobre a
múltiplos alvos
Os modos de acção da combinação
Efeitos sobre a
múltiplos alvos
Efeitos
farmacocinéticos e
físicoquímicos
Os modos de acção da combinação
Efeitos sobre a
múltiplos alvos
Efeitos
farmacocinéticos e
físicoquímicos
Aumentar a solubilidadee / ou absorção
Melhorar a
biodisponibilidade dos compostos activos
Piper spp.piperina
aumenta a biodisponibilidade
Patente US 7119075 B2
O uso de agentes à base de plantas para a potenciação da bioeficácia de anti infecciosos
As plantas têm provado ser uma importante fonte de compostos antifúngicos
+
Atualmente estão sendo estudados, combinações
contendo antifungicos y extratos vegetais ou seus
componentes
Combinação de fármacos antifúngicos, com extracto de
Melaeuca alternifolia
WO 2011140309 A3
Abril 5, 2012
Como o efeito das combinações
é analisada?
Pode-se falar de
- Enhancement
de la actividad de un compuesto
DRI = Dose Reduction Index(Índice de redução da dose)>
CIM do composto sozinhoCIM del composto en combinaçao
DRI=
Use of herbal agents for potentiation of bioefficacyof anti infectives Patente US 7119075 B2
DRI = 16Dose Reduction Index(Indice de Reducción de dosis)
- Sinergismo
- Antagonismo
- Indiferencia o aditivismo
Pode-se falar de
SINERGISMO
El efecto producido es MAYOR que el que se podría
haber esperado de las contribuciones individuales.
Heinrich, et al., 2004. Fundamentals of Pharmacognosy and
Phytotherapy, Churchill Livingstone, London p. 161
ANTAGONISMO
El efecto producido sea MENOR que el que se podría
haber esperado de las contribuciones individuales.
Heinrich, et al., 2004. Fundamentals of Pharmacognosy and
Phytotherapy, Churchill Livingstone, London p. 161
Heinrich, et al., 2004. Fundamentals of Pharmacognosy and
Phytotherapy, Churchill Livingstone, London p. 161
INDIFERENCIA
El efecto producido es el que se podría haber esperado
de la suma de las contribuciones individuales.
Estudio de sinergismo in vitro
Metodología
HONGOS PRUEBASINERGISMO?Proporção de
cada um
dos
compostos
HONGOS PRUEBAProporção de
cada um
dos
compostos
a una concentración << CIM
MIC = 12 µg/mL
a una concentración<< CIM
MIC= 30 µg/mL
Concentraciones sub-
inhibitorias
15,0 µg/mL
7,5 µg/mL
3,7 µg/mL
1,9 µg/mL
………..
Concentraciones sub-
inhibitorias
6,0 µg/mL
3,0 µg/mL
1,5 µg/mL
0,7 µg/mL
………..
• Relación fija• Relación variable
Fungos alvo
Candida albicans
ATCC 90029
Candida albicans
ATCC 900955
3.12
Anfotericina B+ epigalocatequingalato (EGC)
Hirasawa et al., J. Antimicrob. Chemother. 2004 , 53, 225
Metodología
HONGOS PRUEBA
Existem diferentes metodologías
Interactions in vitro by fungal species
Combination antifungal agents
Candida spp. C. neoformans Aspergillus spp.
AMB + FC no interactionsynergy
synergyno interaction
no interactionsynergyantagonism
AMB + azoles no interactionantagonismsynergy
no interactionantagonismsynergy
no interactionantagonismsynergy
Azoles no interactionantagonismsynergy
synergy no interaction
no interaction
Estudos de combinaçãos de agentes antifúngicos
Cuenca-Estrella, M., J. Antimicrob. Chemother. 54, 854, 2004
Há muitos modelos para detectar sinergismo
Métodos in vitro mais utilizados
Tempo para matar
DifusiónCheckerboard
Métodos in vitro mais utilizados
Difusión
16 mg
8 mg
+
10 mg fluconazole
N
N
N
OH
NN
N
F
F
32 mg
64 mg
Métodos in vitro mais utilizados
Tempo para matar
Tempo para matar
Métodos in vitro mais utilizados
CheckerboardTabuleiro de
xadrez
ICIF ISOBOLOGRAMA
0 15,75 31,25 62,5 125 250
0
0,24
0,49
0,98
1,95
3,91
7,81
15,75
A
sozinho
B
sozinho
DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INTERACCIÓN
0 15,75 31,25 62,5 125 250
0
0,24
0,49
0,98
1,95
3,91
7,81
15,75
A
sozinho
B
sozinho
DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INTERACCIÓN
0 15,75 31,25 62,5 125 250
0
0,24
0,49
0,98
1,95
3,91
7,81
15,75
CIM da
A sozinho
CIM
deB sozinho
DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INTERACCIÓN
0 15,75 31,25 62,5 125 250
0
0,24
0,49
0,98
1,95
3,91
7,81
15,75
CIM da
A sozinho
CIM
deB sozinho
combinações inibitórios
DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INTERACCIÓN
0 15,75 31,25 62,5 125 250
0
0,24
0,49
0,98
1,95
3,91
7,81
15,75
COMBINAÇÕES
CIMA en combinación = 0,98 µg/mL
CIMA en solitario = 1,95 µg/mL= CIF A
DETERMINACIÓN DEL TIPO DE INTERACCIÓN
0 15,75 31,25 62,5 125 250
0
0,24
0,49
0,98
1,95
3,91
7,81
15,75
COMBINAÇÕES
CIMB en combinación = 15,75 µg/mL
CIMB en solitario = 1,95 µg/mL= CIFB
ICIF = CIFA + CIFB
ICIF < 0,5
ICIF 0,5 ≤ 4
ICIF > 4
Sinergismo
Antagonismo
Indice de Concentración Inhibitoria
Fraccionaria (ICIF)
Aditividade ou indiferença
Chequerboard technique.
Cuenca-Estrella M J. Antimicrob. Chemother. 2004;54:854-869
ISOBOLOGRAMA
ISOBOLOGRAMA
CIF A
CIF
B
Combinaciones
Un antifúngico + un extratode planta
Dos extratos de plantas
Estudos de combinações contendo produtos naturais
Um antifúngico + um composto natural pura
Combinaciones
Un antifúngico + un extratode planta
Dos extratos de plantas
Procura de novas combinações contendo produtos naturais
Um antifúngico + um composto natural pura
Estudos de combinações contendo produtos naturais
terpenos + fenoles
otros compuestos
Os compostos que mostraram uma maior capacidade de aumentar a actividade do antifúngico
70 %
Terpenos
Monoterpenes diterpenes
triterpenos
Fenóis
cumarina
Métodos in vitro
Estudios de mecanismo de acción
5 %
Estudios in vivo5 %
CheckerboardIsobologramaTempo para matarDRI
No hay prácticamente estudios en
humanos
Combinaciones
Un antifúngico + un extratode planta
Dos extratos de plantas
Procura de novas combinações contendo produtos naturais
Um antifúngico + um composto natural pura
Pelargoniumgraveolens (aceite esencial)
Origanum vulgare (aceite esencial)
Melaleuca alternifolia(aceite esencial)
As plantas que têm demonstrado sinergismo com Anfotericina B contra Candida albicans
Sinergismo de extratos vegetales e antifungico
A. Rosato et al. / Phytomedicine 15 (2008) 635–638
A. Rosato et al. / Phytomedicine 15 (2008) 635–638
Estudos em nosso laboratório
44 EXTRATOS
do géneroBaccharis
em combinação comTERBINAFINA
contraTrichophyton rubrum
Estudo tridimensional de
sinergismo
Extracto sozinho
Terbinafinasozinha
Efeito sobre o
crescimento
do fungo
Curva de dose-
resposta de
extracto
Curva de dose-
resposta da
terbinafina
A superfície é obtido para um comportamento de aditividade de efeitos
sinergismo
Baccharis articulata
Baccharis crispa
Baccharis trimera
Rodríguez et al. Phytomedicine 2013
Combinaciones
Un antifúngico + un extratode planta
Dos extratos de plantas
Procura de novas combinações contendo produtos naturais
Um antifúngico + um composto natural pura
Análise de curvas de dose-
resposta e o uso de Método
Efeito médio
Chou, T-Ch., Pharmacol, Rev 58, 621–681, 2006
Combinação de
Zuccagnia punctata Cav. (Fabaceae)
Larrea nitida Cav. (Zigophyllaceae)
utilizados em conjunto ou alternadamente na medicinatradicional
Objetivos
- Determinar se existe sinergismo
- Qual é la composição mais sinérgica
Zuccagnia punctata Larrea nitida
Febrero Mayo Septiembre Noviembre
Dipping en DCM
60 s, ta
Dipping en DCM
60 s, ta
ZpE
Febrero
Febrero Mayo Septiembre Noviembre
ZpE
MayoZpE
Septiembre
ZpE
NoviembreLnE
Febrero
LnE
MayoLnE
Septiembre
LnE
Noviembre
Collection em 4 meses diferentes
Zuccagnia punctata Larrea nitida
Febrero Mayo Septiembre Noviembre
Dipping en DCM
60 s, ta
Dipping en DCM
60 s, ta
ZpE
Febrero
Febrero Mayo Septiembre Noviembre
ZpE
MayoZpE
Septiembre
ZpE
NoviembreLnE
Febrero
LnE
MayoLnE
Septiembre
LnE
Noviembre
Collection em 4 meses diferentes
Zuccagnia punctata Larrea nitida
Febrero Mayo Septiembre Noviembre
Dipping en DCM
60 s, ta
Dipping en DCM
60 s, ta
ZpE
Febrero
Febrero Mayo Septiembre Noviembre
ZpE
MayoZpE
Septiembre
ZpE
NoviembreLnE
Febrero
LnE
MayoLnE
Septiembre
LnE
Noviembre
Extrato 1 Extrato 2
Collection em 4 meses diferentes
1
Extrato 1
CompuSynComputer SoftwareChou, J and Chou, T.-C. Dose-effect analysis with microcomputers
Package ‘Mixlow’Author John Boik Software for assessing drug synergism/ antagonism
1
extracto 1
CIM50
1
2
Extrato 2
1
2
Extrato 2
CIM50
1
2C
Combinação 1+ 2
CIM50 + CIM50
CIM50 de la
combinaçao
CIM50 de la
combinaçao
[1] em combinação[1] sozinho
CIF1 =
CIM50 de la
mistura
[2] em combinação[2] sozinho
CIF2 =
Índice de combinação (Cl) para cada CIM
CI = CIF1 CIF2+
CI < 1 sinergismoCI = 1 indiferenciaCI > 1 antagonismo
CICIM50
CI
CIM80
CIM50
CI
CIM80
CIM50
CI < 1 sinergismo
1.0
Fevereiro
Maio
Setembro
Novembro
Contra C. albicans
Maio
C. glabrata
Fevereiro
Conteúdo de vários marcadores nas misturas sinérgicas
Mezcla ZpE-LnE May Mezcla ZpE-LnE Feb
L. nitida Z. punctata
Apesar da complexidade do estudo de compostos e extractos em combinação
Toxicidade
Resistencia
Recurrencia
Combinações N
N
N
OH
NN
N
F
F
Nuevas drogas antifúngicas
O re-exame da plantas en
combinaçao
Maximiliano SortinoMarcos DeritaLaura SvetazEstefanía ButassiAgustina PostigoMarcela RaimondiMaría Victoria Rodríguez
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