Participez à la recherche sur l’athérosclérose

Génie génétique Participez à la recherche sur l’athérosclérose

PROTOCOLE

Atelier d’expérimentationMacròfag

Génie génétique - 2 -

Génie génétique À la recherche d’une cible pour le traitement de l’athérosclérose

Introduction

La recherche biomédicale comprend l’étude des processus physiques et chimiques se produisant au sein des êtres vivants, ainsi que des processus déclenchant les maladies. L’un des principaux objectifs de ce domaine de recherche est d’identifier des cibles thérapeutiques, c’est-à-dire des parties de l’organisme vers lesquelles diriger de nouveaux traitements stimulant des réponses et permettant de lutter contre les maladies.

Ce protocole entre dans le cadre d’une ligne de recherche biomédicale centrée sur l’étude d’une éventuelle cible thérapeutique susceptible d’être reconnue par un médicament contre l’athérosclérose.

Comment se produit l’athérosclérose ?

L’athérosclérose est une maladie vasculaire due à l’accumulation de graisses sur les parois des

vaisseaux sanguins, pouvant provoquer des manifestations très diverses et de sévérité variable en

fonction de la localisation des vaisseaux affectés et du stade d’évolution de la maladie. Dans notre

société actuelle, la consommation d’aliments très riches en graisses saturées a augmenté

considérablement les risques de souffrir de maladies cardiovasculaires. Cet excès de graisse dans

notre organisme peut se déposer et s’accumuler au niveau de certains points des parois des artères

sous forme de plaques, appelées « plaques d’athérome », pouvant obstruer la lumière des vaisseaux

et bloquer la circulation sanguine.

-----� Artère normale

-----� Athérosclérose modérée

-----� Athérosclérose sévère

Génie génétique - 3 -

Le cholestérol et les macrophages

L’une des substances lipidiques constituant les plaques d’athérome est le cholestérol. Pour empêcher

le cholestérol de se déposer sur les parois, notre organisme possède un système de « nettoyage »,

les macrophages. Ces cellules circulent dans le sang et ont la capacité de capturer les molécules de

mauvais cholestérol, connues sous le nom de LDL (Low Density Lipoprotein, ou lipoprotéines de

basse densité).

Les macrophages les reconnaissent grâce à un

récepteur situé sur leur membrane. Ce système

de nettoyage est efficace si l’excès de cholestérol

n’est pas très important.

Si les quantités de cholestérol sont très abondantes,

les macrophages continuent à capturer les LDL.

Cependant, après avoir ingéré de grandes quantités

de LDL, les macrophages se transforment en cellules

appelées « spumeuses ». Celles-ci produisent des

substances provoquant l’inflammation et la

prolifération de cellules de la paroi artérielle

(endothéliales), ce qui entraîne la formation de la

plaque d’athérome pouvant bloquer la circulation

sanguine.

Actuellement, nombre de groupes de recherche

partout dans le monde, notamment le Groupe de

recherche de récepteurs nucléaires de l’université de

Barcelone, visent à mieux comprendre la participation

des macrophages à la régulation des taux sanguins de

cholestérol et au développement de l’athérosclérose.

Plus précisément, les scientifiques étudient le rôle

d’une protéine que possèdent les macrophages, appelée « Mylip ». C’est une protéine dont la

principale fonction est de dégrader le récepteur situé sur la membrane des macrophages qui leur

permet de reconnaître les LDL. Les scientifiques ont constaté qu’une production trop abondante de

LDL

LDL oxydé

Oxydation du LDL

Prolifération de cellules endothéliales

Activation du système immunitaire

Oxydation du LDL

LDL

Cellule spumeuse

Génie génétique - 4 -

cette protéine réduit l’ingestion du cholestérol par les macrophages. Cependant, son rôle dans le

cadre de l’athérosclérose n’est pas encore clairement défini.

Compte tenu du fait qu’il a été observé que la

protéine Mylip est liée à la régulation du mauvais

cholestérol, les scientifiques pensent que ce

processus de régulation pourrait constituer une

nouvelle cible pour le traitement de

l’athérosclérose.

Comment pouvons-nous étudier la protéine Mylip impliquée dans la régulation du cholestérol ?

Pour pouvoir étudier cette éventuelle cible thérapeutique, les chercheurs doivent la produire en

laboratoire en grandes quantités. Pour ce faire, ils utilisent une technique de génie génétique, appelée

« transformation bactérienne », grâce à laquelle ils transfèrent l’ADN d’un organisme à une bactérie

pour que celle-ci produise de grandes quantités d’ADN qu’ils introduisent par la suite dans d’autres

types de cellules pour que ces dernières produisent la cible thérapeutique de l’étude.

À cet effet, ils travaillent à partir d’une forme purifiée du gène produisant la protéine Mylip. Ils

l’unissent à un fragment d’ADN circulaire appelé « plasmide », puis l’introduisent dans des bactéries

pour que ces dernières produisent la réplication du matériel génétique.

Nous vous proposons dans le cadre de ce protocole de jouer le rôle de biotechnologues et de mener

à bien une transformation bactérienne !

� Macrophage

� LDL oxydé

� Oxydation du LDL

Génie génétique - 5 -

Organisation de l’atelier :

1. Nous allons effectuer une transformation de bactéries afin qu’elles contiennent l’ADN

responsable de la production de la protéine Mylip, et qu’elles agissent comme des bioréacteurs,

fabriquant le matériel génétique en grandes quantités.

2. Nous procéderons à la croissance d’une culture de bactéries dans un milieu adéquat nous

permettant de sélectionner les bactéries ayant incorporé le gène.

3. Nous purifierons le matériel génétique comportant le gène responsable de la production de la

protéine Mylip afin qu’il puisse être introduit dans d’autres types de cellules qui produiront la

protéine*.

* Compte tenu du fait que la durée de la croissance des bactéries est d’un jour et demi, la purification sera effectuée à partir

d’une culture de bactéries transformées préalablement préparée par les moniteurs.

Génie génétique - 6 -

Équipement et matériel nécessaires pour chaque groupe ou paillasse

2 tubes contenant des

bactéries dans de la

glace étiquetés avec le

nº 1 et 2.

(A) Bac porexpan +

glace

1 tube dans de la

glace contenant l’ADN

circulaire appelé

« plasmide pCR2.1-

Mylip ».

(B)

1 tube contenant le

milieu de culture

bactérienne « LB »

(C)

Micropipette de 20 µl et

de 200 µl

Pointes pour

micropipettes de 20 et

200 µl

Pointes pour

micropipettes de 20 et

200 µl

2 boîtes de Pétri

contenant de la gélose

et l’antibiotique

(D) ampicilline

Étaleurs en plastique

Bain-marie contenant

de l’eau distillée

Portoir flottant pour

tubes

Chronomètre

Récipient de résidus

solides

Récipients de résidus

liquides

Ruban adhésif

Feutre indélébile

1 tube contenant 1 ml

de culture bactérienne

(E)

1 tube contenant la

« Solution 1 » de

Miniprep (F)

1 tube contenant la

« Solution 2 » de

Miniprep (G)

1 tube contenant la

« Solution 3 » de

Miniprep (H)

1 tube contenant du «

chloropan » (I)

1 tube contenant de

l’« éthanol »

1 tube contenant de

l’eau ultra

pure (mEq).

Génie génétique - 7 -

(A) Bactéries permettant l’entrée d’ADN (appelées « compétentes XL1-blue »)

(B) ADN circulaire appelé « plasmide » (pCR2.1)

(C) Milieu de culture LB (Luria Bertani) : extrait de levure 5 g/l, tryptone 10 g/l, NaCl 5 g/l. Stériliser à

l’autoclave. Conserver au réfrigérateur.

(D) Boîtes LB/ampicilline : milieu de culture LB, gélose 1,6 %, ampicilline 100 µg/ml.

(E) Bactéries cultivées sur un milieu 2XYT, O.N. (16 heures)

(F) Solution 1 : 50 mM de glucose/25 mM de TrisHCl à pH 8,0/10 mM d’EDTA. Diluer dans de l’H2O

distillée.

(G) Solution 2 : 20 µl de détergent SDS (dodécyl sulfate de sodium) 10 %/4 µl de NaOH 10 N/176 µl

d’H2O mQ/pour chaque échantillon. Préparer en double exemplaire le jour de l’expérience.

(H) Solution de Miniprep 3 : 73,60 g d’acétate de potassium/28,75 ml d’acide acétique. Diluer dans de

l’H2O mQ jusqu’à un volume final de 250 ml.

(I) Chloropan : 25 ml de phénol équilibré/24 ml de chloroforme/1 ml d’alcool isoamylique. Centrifuger

pendant 10 minutes à 3 000 tr/min.

Génie génétique - 8 -

Procédures 1 — TRANSFORMATION BACTÉRIENNE

Une transformation bactérienne est un processus biotechnologique grâce auquel les scientifiques

introduisent le matériel génétique responsable de la production d’une protéine en cours d’étude dans

une cellule bactérienne. Cette dernière agira comme un bioréacteur et produira des copies de ce

matériel génétique, qui pourra être introduit par la suite dans un autre type de cellule pour qu’elle

produise la protéine d’intérêt*.

Cet atelier se déroulera à partir du gène purifié de notre protéine « Mylip », qui a été introduite dans

un plasmide ou fragment d’ADN circulaire.

À partir de ce matériel génétique, nous effectuerons une transformation bactérienne, c’est-à-dire

l’introduction du gène responsable de la production de notre protéine dans la bactérie au moyen d’un

choc thermique, c’est-à-dire, en soumettant l’échantillon à différentes températures.

* Si la protéine d’intérêt est peu complexe, les bactéries transformées peuvent elles-mêmes déjà agir comme des bioréacteurs

pour produire la protéine.

Gène Mylip

Génie génétique - 9 -

Protocole pour la transformation bactérienne

1. Nous disposons de deux tubes contenant les bactéries dans de la glace. Chaque tube contient

une solution tampon qui favorisera la transformation grâce aux cations Ca2+ du sel CaCl2

contenu dans le tampon.

Que se passe-t-il ? Les cations Ca2+ préparent par l’action du

froid les membranes cellulaires pour qu’elles soient perméables

à l’ADN. Les ions Ca2+ se lient aux phospholipides de la

membrane cellulaire, neutralisant leurs charges négatives et

formant de petits pores au niveau de la membrane de la

bactérie.

2. Ajoutez l’ADN sous forme de plasmide aux bactéries : pipetez 10 µl de plasmide (tube P) à

l’aide de la micropipette de 20 µl et ajoutez-les au tube 2 contenant les bactéries. Couvrez le

tube puis mélangez délicatement en le tapotant avec le doigt. Le tube 1 sera le témoin

contenant des bactéries sans le plasmide.

Génie génétique - 10 -

Que se passe-t-il ? Les ions Ca2+ interagissent aussi avec les groupes

phosphates de l’ADN chargés négativement, ce qui leur permet de migrer vers la

membrane des bactéries, en l’absence de répulsions dues aux charges

électriques.

3. Laissez reposer les tubes 1 et 2 dans la glace pendant 15 minutes.

*En attendant, profitez-en pour effectuer la première étape du protocole de « croissance des bactéries transformées » (page

12).

4. Au bout de 15 minutes, placez les tubes 1 et 2 dans le bain-marie à 42 ºC pendant exactement

1 minute et 30 secondes.

Que se passe-t-il ? L’ADN circulaire ou plasmide pénètre à

travers les pores de certaines bactéries. Comment ? À 42 ºC,

l’élasticité de la membrane des bactéries augmente, ce qui

favorise l’entrée du plasmide à travers les pores.

Génie génétique - 11 -

5. Replacez les tubes 1 et 2 dans la glace pendant 2 minutes.

Que se passe-t-il ? La baisse de température

provoque la stabilisation des membranes et le

plasmide ayant déjà pénétré dans la cellule par les

pores restera à l’intérieur des bactéries.

Génie génétique - 12 -

2 — MULTIPLICATION DES BACTÉRIES TRANSFORMÉES

Après la pénétration du plasmide à l’intérieur des bactéries, il faut faire une multiplication de celles-ci

sur un milieu adapté et à une température adéquate. Compte tenu du fait que la transformation

bactérienne produit normalement un mélange présentant peu de transformations et des cellules non

transformées en abondance, une méthode permettant d’identifier les cellules ayant incorporé le

plasmide s’avère nécessaire.

Nous nous assurerons que seules les bactéries transformées se multiplient, en les faisant se multiplier

dans des boîtes de culture contenant un antibiotique. Vu que le plasmide comporte un gène qui fait

que les bactéries soient résistantes à ce médicament, seules les bactéries transformées se

développeront sous forme de colonies. À partir de ces colonies, nous pourrons continuer par la suite

uniquement la multiplication des bactéries produisant le gène d’intérêt.

Ampicilline

Gène Mylip

Gène de résistance à l’ampicilline

Ampicilline

Génie génétique - 13 -

Protocole pour la croissance des bactéries transformées

1. Étiquetez les boîtes dans lesquelles vous ferez la multiplication des bactéries. Une boîte sera la

boîte témoin contenant des bactéries sans plasmide, et l’autre sera celle dans laquelle vous

ferez la multiplication des bactéries avec le plasmide.

2. À l’aide de la micropipette de 200 µl, ajoutez 500 µl de milieu de culture bactérienne « LB »

contenant des nutriments aux tubes 1 et 2. Couvrez les tubes puis mélangez délicatement en

les tapotant avec le doigt.

3. Incubez le mélange dans le bain-marie à une température de 37 ºC pendant 30 minutes.

Que se passe-t-il ? Pendant la durée de cette phase

d’incubation, les bactéries ont le temps de se multiplier, de

manière que lors de la duplication de leur ADN elles génèrent

aussi une copie de l’ADN plasmidique contenant le gène

d’intérêt.

* En attendant la multiplication des bactéries, vous pouvez commencer la troisième étape de cet atelier qui consiste à isoler le

matériel génétique des bactéries (page 16).

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4. À l’aide de la micropipette de 200 µl (utilisez une nouvelle pointe à chaque prélèvement),

ajoutez les bactéries (100 à 200 µl) des tubes 1 et 2 aux boîtes de gélose contenant aussi

l’antibiotique ampicilline.

5. Étalez les bactéries sur la surface de chaque boîte de gélose à l’aide d’un étaleur en plastique

stérile pour chacune. Appliquez un mouvement circulaire à la boîte tout en déplaçant l’étaleur

d’avant en arrière. Fermez les boîtes avec un peu de ruban adhésif et annotez dessous vos

initiales, la date et le type de bactérie.

Génie génétique - 15 -

6. Incubez les boîtes retournées à 37 ºC et observez le résultat obtenu le lendemain. Si vous ne

disposez pas d’un incubateur, laissez simplement les bactéries se multiplier pendant deux jours

à température ambiante.

Génie génétique - 16 -

3 — NOUS ISOLONS LE MATÉRIEL GÉNÉTIQUE OBTENU

À partir des bactéries transformées qui se sont multipliées en formant des colonies, les scientifiques

prélèvent un échantillon et l’ensemencent sur un autre milieu de culture contenant des nutriments afin

d’en obtenir de grandes quantités. Il faut isoler par la suite le matériel génétique produit par les

bactéries, c’est-à-dire, le séparer des autres composants bactériens tels que l’ARN, l’ADN de la

bactérie ou les protéines. Pour isoler le plasmide, les scientifiques suivent un protocole connu sous le

nom de Miniprep. Cette technique permet de séparer l’ADN sous forme de plasmide au moyen de

différents solvants et de centrifugations, qui écartent les différents composants cellulaires.

L’ADN purifié sera très utile pour les scientifiques pour mener à bien des expériences ultérieures afin

d’étudier sa fonction dans la régulation du cholestérol et dans l’athérosclérose et de mettre au point de

nouveaux médicaments.

Compte tenu du fait que le processus de multiplication de grandes quantités de bactéries nécessite

plus d’un jour et demi, nous utiliserons pour l’atelier une culture préalablement préparée par les

moniteurs.

SOLUTION 2 Gène de résistance à l’ampicilline

SOLUTION 2 CHLOROPAN ÉTHANOL Gène Mylip

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Protocole pour purifier l’ADN plasmidique de la culture bactérienne (Miniprep)

1. Centrifugez le tube de culture bactérienne à la vitesse maximale pendant 30 secondes, puis

éliminez le liquide surnageant.

Que se passe-t-il ? Les cellules se séparent du

milieu de culture dans lequel elles se sont

multipliées, qui contient normalement des restes de

cellules et d’autres molécules que nous voulons

éliminer.

2. Éliminez ensuite le liquide surnageant et remettez en suspension le précipité avec 100 µl de la

solution 1 à l’aide de la micropipette de 200 µl, puis mélangez avec la même pipette.

Que se passe-t-il ? Les bactéries sont remises en suspension pour continuer la purification,

mais à une concentration plus élevée car elles seront dans un moindre volume. La solution 1 est

une solution tampon qui empêchera la dénaturalisation de l’ADN circulaire sous forme de

plasmide, qui se produit si le pH dépasse 12,6.

3. Ajoutez 200 µl de la solution 2 puis mélangez délicatement par retournement.

Que se passe-t-il ? La solution 2, contenant

un détergent, détruit les membranes de

phospholipides des bactéries, libérant ainsi

l’ensemble du contenu cellulaire dans le milieu,

grâce à un processus appelé « lyse

bactérienne ». Cette solution contient aussi

une base forte (hydroxyde de sodium, NaOH)

qui provoque la dénaturalisation des protéines

impliquées dans le maintien de la structure de

la membrane cellulaire du propre ADN de la

bactérie. En revanche, l’ADN plasmidique n’est

pas affecté en raison du pH inférieur à 12,6.

SOLUTION 2

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4. Ajoutez 150 µl de la solution 3 puis mélangez par retournement.

Que se passe-t-il ? La solution 3 est une solution

acide d’acétate de sodium, permettant de neutraliser

le pH de la solution et d’interrompre le processus de

lyse. Au cours de cette étape, la plus grande partie

du contenu cellulaire, tel que les protéines et les

phospholipides des membranes ainsi que le propre

ADN de la bactérie, précipite pour former un précipité

blanc. Le propre ADN de la bactérie, déjà dénaturalisé, forme un complexe insoluble qui précipite,

grâce au fait que les ions K+ se lient aux groupes phosphates de l’ADN, neutralisant ainsi leur charge

négative.

5. Ajoutez 350 µl de chloropan, mélangez bien par retournement puis centrifugez pendant 3

minutes à la vitesse maximale pour séparer le plasmide contenant le gène de la Mylip.

Que se passe-t-il ? Cette étape permet de séparer

l’ADN plasmidique des autres contenus cellulaires tels

que les protéines, les lipides et d’autres acides

nucléiques. Le chloropan est un mélange de solvants

organiques contenant du phénol et du chloroforme.

Ces solvants dissolvent les molécules hydrophobes,

telles que les lipides de la membrane, et dénaturalisent

les protéines en les rendant insolubles dans l’eau. Lors

de la centrifugation, nous séparons le mélange en deux phases : les phospholipides et les protéines

cellulaires restent en solution dans la phase inférieure de chloropan ou attrapées dans l’interphase

entre les deux phases sous forme d’un précipité blanc. L’ADN plasmidique restera dans la phase

aqueuse supérieure, car ses charges électriques n’ont pas été neutralisées, et il est donc soluble dans

l’eau.

6. Transférez la phase aqueuse supérieure transparente dans un nouveau tube à l’aide de la

pipette de 200 µl.

SOLUTION 3

CHLOROPAN

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7. Ajoutez 900 µl d’éthanol à 100 % à l’aide de la pipette de 200 µl, puis mélangez bien. L’éthanol

provoque la précipitation de l’ADN plasmidique de la solution aqueuse.

8. Centrifugez pendant 5 minutes à la vitesse maximale. Observez le précipité qui est l’ADN sous

forme de plasmide.

9. Enlevez la TOTALITÉ de l’éthanol à l’aide de la pipette de 200 µl.

10. Remettez en suspension le précipité d’ADN plasmidique dans 20 µl d’H2O purifiée.

Gène de résistance à l’ampicilline

ÉTHANOL Gène Mylip

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Résultats et discussion

1. Faites un schéma du processus de transformation bactérienne et expliquez à quoi il sert dans la

ligne de recherche de la mise au point de nouveaux médicaments contre l’athérosclérose.

2. Expliquez, à l’aide d’un schéma, ce qu’est un choc thermique.

3. Pour que les bactéries se multiplient, vous devez utiliser une boîte de culture contenant un

antibiotique. Pourquoi ?

4. Qu’est-ce qu’une colonie de bactéries ?

5. Dans laquelle des deux boîtes ensemencées, la boîte témoin ou celle des bactéries

transformées, obtiendrez-vous des colonies ? Pourquoi ?

Génie génétique - 21 -

6. À partir des colonies qui se sont formées, comment obtient-on de multiples copies du gène

d’intérêt ?

7. Comment peut-on faire précipiter l’ADN bactérien et l’ADN d’intérêt ? Complétez l’explication à

l’aide d’un schéma.

8. Vous avez réussi à isoler de multiples copies de l’ADN d’intérêt grâce à la technique de

séparation appelée « Miniprep ». Que font les scientifiques après avoir obtenu cet ADN ?

Chercheurs ayant contribué avec des contenus : Theresa León, Jonathan Matalonga, Université

de Barcelone

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