Page 1
หลักการตรวจวัดดวยเครื่องวัดความเขมแสงPrinciple of photometric assay
���ก����ก����� ��ก����
Nephelometry Tubidimetry Tubidimetry Tubidimetry Tubidimetry ก��������������
��������ก���� ���� ��ก����������ก���
��� ก ก���!������"�#��
$���������%���������" �
� ��ก����AbsorptionAbsorptionAbsorptionAbsorptionphotometryphotometryphotometryphotometry
Reflectance photometry
$���������%���������" �
ความเขมของพลังงานแสง แปรผันตามจาํนวนโมเลกุลสาร
Fluorescent photometryFlame emission photometryFlame emission photometryFlame emission photometryFlame emission photometry ก���ก��'����"��ก( exited atom exited atom exited atom exited atom ��� flameflameflameflameChemiluminescent photometryChemiluminescent photometryChemiluminescent photometryChemiluminescent photometry ก���ก��'������$)(ก(�(��� �
1
Page 2
Absorption spectrophotometry
Atomic absorption spectrophotometry
การวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลาย
การวัดคาดูดกลืนแสงของอะตอมอิสระ
Emission photometry
Fluorometry
การวัดคาความเขมแสงที่ปลอยจากอะตอมอิสระ
การวัดคาการเรืองแสงของสารละลาย
การวัดความขุนของสารแขวนลอยTurbidimetry and nepleometry
Reflectometry
การวัดความขุนของสารแขวนลอย
การคาความเขมแสงสะทอนจากวัตถุ
2
Page 3
วัตถุประสงคการเรียน1. อธิบายวิธกีารคํานวณหาความเขมขนของสาร โดยใช
Beer and Lambert’s law2. บอกองคประกอบสําคัญและอธิบายหลักการทํางานของ
เครื่อง VIS/UV absorption spectrophotometerเครื่อง VIS/UV absorption spectrophotometer3. บอกปจจัยที่มีผลตอความถูกตองของการนํา Beer and
Lambert’s law มาประยุกตหาความเขมขนของสาร4. บอกวิธีการตรวจสอบเครื่อง VIS/UV absorption
spectrophotometer5. บอกวิธีการนํา test tube มาทําเปน cuvette6. บอกองคประกอบสําคัญและอธิบายหลักการทํางานของ6. บอกองคประกอบสําคัญและอธิบายหลักการทํางานของ
เครื่องวัดความเขมแสงแบบตางๆ7. บอกปจจัยที่มีผลตอความถูกตองของการวัดความเขมแสง
แบบตางๆ
3
Page 4
แสง(light)เปนพลังงานรูปแบบหนึ่ง มีคุณสมบัติคลายคลื่น
เปนรังสีแมเหล็กไฟฟา(electromagnetic radiant)
ความยาวคลื่น ; l จํานวนรอบการเคลื่อนที่/วินาที
ความถี่ ; n
4
Page 5
อัตราความเรว็การเคลื่อนที่ของแสง (c)
ในสูญกาศ ประมาณ 3.0x1010 ซม./วนิาที
คุณสมบัติของแสงคุณสมบัติของแสง
• อัตราความเร็วการเคลื่อนที่; c• ความยาวคลื่นแสง; λλλλ• ความถี่; νννν
C = νλ
5
Page 6
%�������� ����ก�� �*'�� ; E
E = hννννE = hννννh ��� Planck�s constant
6.62x10-27 erg.sec
cE = h
c
λλλλ6
Page 7
������ ���"+����'�!�����'
300 nmnmnmnm 400 500 600 700 800
������ ���"+�(Visible light)
���'�!�����'UV light
CosmicCosmicCosmicCosmicraysraysraysrays
GammaGammaGammaGammaraysraysraysrays
XXXX----raysraysraysrays FarFarFarFarUVUVUVUV U
VU
VU
VU
V InfraredInfraredInfraredInfrared MicrowavesMicrowavesMicrowavesMicrowaves Radio wavesRadio wavesRadio wavesRadio waves
������ ��"�+ก!**,(electromagnetic radiant)
10 - 6
10 - 4
10 - 2
10 2
10 10 4
10 6
10 8
10 10
10 12nmnmnmnm
EnergyEnergyEnergyEnergy WavelengthWavelengthWavelengthWavelength
raysraysraysrays raysraysraysraysXXXX----raysraysraysrays
UVUVUVUV UV
UV
UV
UV InfraredInfraredInfraredInfrared MicrowavesMicrowavesMicrowavesMicrowaves Radio wavesRadio wavesRadio wavesRadio waves
7
Page 8
ความยาวคลื่น ( nm )
��-�������� ���"+�
��-��������
สีของแสงที่มองเห็น และ สีคูสมมาตร(สีของสารละลาย)
������ ���"+� ������
Violet
Blue
Green
Yellow
Yellow blue
Yellow
Red
Blue
400-435
435-500500-570
570-600
Yellow
Orange
Red
Blue
Green-blue
Green
570-600600-630630-700
8
Page 9
เครื่องวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลายนํามาใชสําหรับนํามาใชสําหรับ
วัดความเขมขนของสารละลาย
9
Page 10
Absorption spectrophotometryการวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลาย
Spectrophotometry
เครื่องวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลายเครื่องวัดคาดูดกลืนแสงของสารละลายSpectrophotometer หรือ Photometer
วัดความเขมแสงกอนและหลังใหแสงผานสารละลาย
10
Page 11
.�������-� Cuvette ������ cuvette
��$ก��/�����
"��%��������� .��������ก (exit slit)
��$ก��/�����%���������
������ก���������ก���
.��������ก (exit slit)
GratingPrism
Filters 11
Page 12
Band pass ��� .����� ����������������.��������ก(exit slit) -��������ก���������ก��������
100% peak height
Nominal band pass(width) and half-band pass(width)
100% peak height
50% peak height
half-band pass
Rad
iant Ene
rgy Intens
ity
λλλλ0λλλλ1 λλλλ2
Band pass
half-band pass
Rad
iant Ene
rgy Intens
ity
Wavelength, nm12
Page 13
แสงกอนผานตัวกลางความเขมแสง = IO
แสงผานตัวกลางความเขมแสง = IS
แสงกอนผานตัวกลางความเขมแสง = IO
แสงผานตัวกลางความเขมแสง = IR
Transmittance (T) =IS =
IS
% Transmittance (%T) = 100T
Transmittance (T) =IS =
IS
IO IR
13
Page 14
แสงกอนผานตัวกลางความเขมแสง = IR
แสงผานตัวกลางความเขมแสง = IS
I ITransmittance (T) =
IS =IS
IO IR
% Transmittance (%T) = 100T
Absorbance (A) = - log T = log1TT
หรือ Optical Density (O.D.) = logIR
IS
14
Page 15
ความสัมพันธระหวาง A และ %T
Absorbance (A) = log1TT
Absorbance (A) = log100
100T
Absorbance (A) = log 100 – log 100T
A = 2 – log %T
15
Page 16
Beer’s LawBeer’s Law
A = a b CA = a b C
16
Page 17
b = ความกวาง หรือ ระยะทางที่แสงผาน( cm )
Incident Light [ Io ] Transmitted Light [ It ]
C = ความเขมขนของสารละลาย หรอื ความเขมขนของตัวถูกละลาย
b
*ตัวทําละลายไมดดูกลืนคลื่นแสง( g/L)
b
b b
ααααA C
C ก-#0�, b �����
b ก-#0�, C �����
Beer�s law
Lambert�s law
A = a b C
A bααααb ก-#0�, C �����Lambert�s law
17
Page 18
A = a b CBeer and Lambert’s Law
ถา C มีหนวยเปน g/La : absorptivity coefficient (สัมประสิทธิ์การดดูกลืนแสง)
ถา C มีหนวยเปน mole/L
L . g-1.cm-1
ถา C มีหนวยเปน g/L
L . mol-1.cm-1
ε ε ε ε : molar absorptivity coefficientถา C มีหนวยเปน mole/L
18
Page 19
วัดคาการดูดกลืนแสงของสารละลาย NADH ที่ความยาว คลื่น 340 nm โดยใช cuvette กวาง 1 ซม. ไดคาเทากับ 0.350 เมื่อคํานวณความเขมขนของ NADH จะไดดังนี้
C = 5.6x10-5 mol/L
0.350 = 6.22x103 L.mol -1.cm -1 x 1 cm x C
A = ε ε ε ε bC
( molar absorptivity of NADH ที่ 340 nm = 6.22x103 L.mol-1.cm-1 )
C = 5.6x10-5 mol/L
= 5.6x10-5 x 106 µµµµmol/L
= 56 µµµµmol/L
19
Page 20
0.8
Absorbency[A] A = ab C
กราฟมาตรฐานสําหรับเทียบคา
0.2
0.4
0.6
0.8
Sample absorbance
Sample
concentration
0.0
0.2
0 100 200 300 400
Concentration[C]
concentration
20
Page 21
100.00
%T (plot on linear scale)%T = 10(2-abC)
A = a b C 2-log%T = abC Log%T = 2-abC
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00 %T = 10(2-abC)
Sample
concentration0.00
20.00
0 100 200 300 400
Concentration[C]
concentration
21
Page 22
100.00
%T (log scale) Log %T = -a bC + 2
A = a b C 2-log%T = abC Log%T = 2-abC
10.00
100.00
Sample
1.00
0 100 200 300 400
Concentration[C]
Sample
concentration
22
Page 23
Astd = ab Cstd
A = ab C
หลอด standard
หลอด sample
คํานวณเทียบกับหลอดมาตรฐาน
Aunk = ab Cunk หลอด sample
Calculation FactorAstd =Cstd
Aunk Cunk
หรือCunk =Aunk x CstdAstd
Cunk =Cstd x AunkAstd
23
Page 24
Absorption of standard solution = 0.500
Absorption of sample solution = 0.350
Standard concentration = 200 mg/dl
(Astandard)
(Asample)
Cal. factor
Cunk =Aunk x CstdAstd
Cunk =0.350
X 2000.500
= 140 mg/dl
Cal. factor0.500
24
Page 25
ขอควรระวัง! การคํานวณ & การเทียบจากกราฟผลคํานวณที่ได ตองไมเกิน linearity
Absorbace[A]
A = abC เปน Linear equation
linearity
Slope = ab = ∆∆∆∆Astd
∆∆∆∆Cstd
Absorbace[A]
Calculation Factor
AStd
AUnk1
AUnk2
linearity
1=
Cstd
slope Astd
∆∆∆∆AstdCalculation Factor
CUnk1 CUnk2CStd
AUnk1
Concentration [C] Cunk = Aunk xCstd
Astd
∆∆∆∆Astd
∆∆∆∆Cstd
00
25
Page 26
I4 I3
I4 I4 &'()*)ก,-./01
)*)ก,-./01&)2 1 0(4.
ก567085,9,8:'7;48'<=2'=2.'8ก>
I4
I3
I3 I2
I3 I2 I1I4
)*)ก,-./01&)2 2 0(4.
)*)ก,-./01&)2 3 0(4.
I1I2I3 I?
I?
I4
I4
)*)ก,-./01&)2 ?
)*)ก,-./01&)2 ????26
Page 27
1. สารละลายมีความเขมขนมากเกินไป
ปจจัยที่ทําใหคา A และ C ไมเปนตาม Beer’s Law
2. คลื่นแสงที่ใชวัดไมใชแสงความยาวคลื่นเดียว
3. มีแสงนอกระบบการวัด(stray light)มาก
4. ตัวทําละลายรบกวนระบบการวัดความเขมแสง เชน
ดูดกลืนแสงที่ใชวัดดวย ปลอยคลื่นแสงอื่นออกมา ดูดกลืนแสงที่ใชวัดดวย ปลอยคลื่นแสงอื่นออกมา
5. ผิวของภาชนะที่ใชวัด(cuvette)ไมเรียบเสมอกัน
27
Page 28
∆∆∆∆A
Substrate depletionA
∆∆∆∆T
∆∆∆∆A
Lag pahse
Time
Lag time Interval reading Continuous-monitoring assay(Kinetic assay or Rate assay)
Fixed-time for Reading
1st Read 2nd Read
(Kinetic assay or Rate assay)
Two-point kinetic assayor Two-point rate assay
End-point assay
28
Page 29
Glucose + o-toluidine ----> glucosamine complex
$)(ก(�(�'����� glucose ����01� o-toluidine
max 630 nmλλλλWater / Standards / Samples + ReagentWater / Standards / Samples + Reagent
Incubation
�� Abs / %T Calculation
Blank Standards Samples
�����ก�� Standard curve
29
Page 30
กราฟมาตรฐานสําหรับการตรวจวัดกูลโคสดวยวิธีo-toluidine reaction ( 10 ม.ค. 2555 )
1.200
1.4001.600
63
0 n
m
0.200
0.4000.600
0.800
1.0001.200
Ab
sorb
ance
at
63
0
Linearity ของการตรวจวัด
0.0000.200
0 200 400 600 800 1,000 1,200กูลโคส (mg/dL)
Ab
sorb
ance
at
30
Page 31
L-lactate + NAD+ Pyruvate + NADHLDH
LDH(Lactate dehydrogenase) Activity Measurement
A = abCA = abC
C = A
=A
εεεεbεεεε (
L) x b (cm)
moles x cm
NADH = A
moles/L of total solution volumeεεεεb
31
Page 32
1 U/L = µµµµmoles/minute/L of sample volume
1 U = µµµµmol/minute
นิยามของ Enzyme activity :
NADH = A
moles/L NADH = A
moles/L of total solution volumeεεεεb
NADH = ∆∆∆∆A/min
moles/minute/L of total solution volumeεεεεb
NADH = ∆∆∆∆A/min x 106
µµµµmoles/minute/L of total solution volumeεεεεb
NADH = µµµµmoles/minute/L of total solution volumeεεεεb
NADH = ∆∆∆∆A/min x 106
xTotal Reaction solution volume
εεεεb Sample volume
µµµµmoles/minute/L of Sample volume32
Page 33
สูตรคํานวณคา Enzyme activity(ตรวจวัดโดยวิธี Kinetic assay)
Enzyme (IU/L) = ∆∆∆∆A/min x 106
xTotal Reaction solution volume
εεεεb Sample volume
Calculation FactorCalculation Factor
33
Page 34
ตัวอยาง: Sample volume (0.1 ml)+ Reagent volume (3.0 ml)
0.010 A/min
( εεεε of NADH ที่ 340 nm = 6.22x103 L⋅⋅⋅⋅mol-1⋅⋅⋅⋅cm-1 )
Enzyme (IU/L) = ∆∆∆∆A/min x 106
xTotal Reaction solution volume
εεεεb Sample volume
0000....010010010010 x 106 3.1
= 49.8 ~ 50 U/L
Enzyme (IU/L) = 0000....010010010010 x 106
x3.1
6.22 x 103 x 1.0 0.1
34
Page 35
ก�'���������2%ก�'���������2%����������� ก������-��
������������
35
Page 36
ก�$����� � ก'���-���� ����������Wavelength calibration
Amplifier &
GratingEntrance Slit
0.852Energy Lamp
Amplifier &
Display device
Mirror
Monochromator Cuvette
Photodetector
Mirror
630 nm
36
Page 37
Holmium oxide
241.5 + 0.2
279.4 + 0.3
287.5 + 0.35
333.7 + 0.55
Peak(nm)
Potassium dichromate solution
0.04 g/L in 0.5 N KOH
Peak=> 374+4 nm
Cobalt chloride solution333.7 + 0.55
360.9 + 0.75
418.4 + 1.1
453.2 + 1.4
536.2 + 2.3
637.2 + 3.8
Cobalt chloride solution
44 g/L in 1% HCl
Peak=> 512+5 nm
Peak=> 540+4 nm
Oxyhemoglobin solution
Red cell in 0.05% NH4OH
Didymium filter :
Peak => 585 nm
Peak=> 540+4 nm
576+4 nm
37
Page 38
Absorbance accuracy
Potassium dichromate solution
120 mg/L in 0.01 N H2SO4 257 nm => 1.738+0.03 Abs.
ก�'�������� � ก'���-��ก� ก������
Copper sulfate solution
Cobalt sulfate solution
4 g% in 1%H2SO4
4 g% CoSO .(HN ) SO .6H O in 1%H SO
357 nm => 1.288+0.02 Abs.
650 nm => 0.448 Abs.
510 nm => 0.48 Abs.
4 g% CoSO4.(HN4)2SO4
.6H2O in 1%H2SO4
Neutral density filters
38
Page 39
Absorbance linearity
ก�'�������� �$3�����'��-����ก� ก������
Copper sulfate solution in 1%H2SO4
0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g%
Potassium dichromate solution in 0.5 N KOH
0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g%
Stray light checking
ก�'�����������ก��Stray light checking
ก�'�����������ก��Stray light filter ����� ��'( ก�����������!�" => 0 %T "��� '����- Abs. ก��%�(�
39
Page 40
Cuvette calibration
A + 0.002 Abs.
%T + 0.5%T
Incident light
0.01 g%(w/v) Potassium ferricyanide420 nm
40
Page 42
Function KeyF1, F2, F3, F4
Specific Function Keys
Display Screen
Specific Function KeysGo to λAuto ZeroEnterReturnStart/Stop
������(����
Numeric KeysSample HolderMulti-cell holderSipping cell holder
42
Page 44
Initialization
ROM Check :
RAM Check :
λλλλ Org.(coarse) :
: Pass
λλλλ Org.(coarse) :
Multi-Cell Org. :
W Lamp Energy :
λλλλ Org.(fine) :
D2 Lamp Energy :D2 Lamp Energy :
λλλλ Check :
44
Page 45
Menu
1. Photometric measurement
2. Option prog pack
500.00 nm 0.000A
2. Option prog pack
3. Utilities
Select item No.
Params
F1 F2 F3 F4 45
Page 46
Photometric
λλλλ :
500.0 nm500.0 nmData:
0.000 ABSSelect item No.
%T / ABS SmplCntl DataDisp SavParam
F1 F2 F3 F4 46
Page 47
Photometric 500.00 nm 0.236A
Smpl No. ABS. K*ABS1 0.237 0.23661 0.237 0.2366
2
Smpl No. SmplCntl Factor K 1.000
F1 F2 F3 F4
=
47
Page 48
Sample control
1. Sample module: Sipper
2. Pump speed: Fast
500.00 nm 0.000A
3. Sipping time: 4.0 sec.
4. Dwell time: 1.0 sec.
5. Purge time: 4.0 sec.
6. No. of rinses: 0
Select item No.
Manu.Sip
F1 F2 F3 F4
Off
48
Page 50
-�0�'��$)(��'(��ก��.�������� Shimadzu
1. ����ก mode �� ABS/%T & '�0��� λλλλ ���'���ก��.���2. ��� cuvette ������������ blank ����.������ cuvette
$45���� sample holder$45���� sample holder
3. ก Auto Zero �%���$����� �"�!� 0.000ABS/100%T
4. �1 cuvette ������������ blank ��ก5. ����������'������ ����� cuvette ������5. ����������'������ ����� cuvette ������
������ '������ ����.������ cuvette $45������������
50
Page 51
-�0�'��$)(��'(��ก��.�������� Shimadzu(�.� sipper unit)
1. ����ก mode �� ABS/%T & '�0��� λλλλ ���'���ก��.���2. '�0��$��ก� ก��1��-�� sipper unit
3. '�0� sipper �"��1����� Manual On3. '�0� sipper �"��1����� Manual On
4. �01ก������� flow-cell
5. ������ blank �"������ ��� flow-cell
6. ก Auto Zero �%���$����� �"�!� 0.000ABS/100%T6. ก Auto Zero �%���$����� �"�!� 0.000ABS/100%T
7. ������ blank ��ก & ก Return
8. ��������'������51
Page 52
'�0�ก��� photometric mode !�
ก����$)(��'(ก���ก���0� ��$��� (�ก��.��������spectrophotometer ��������'��!$��0
'�0�ก��� photometric mode !�'�0� mode ก���!� ( ABS / %T )
'�0� λλλλ ����.���!�'�0� λλλλ ����.���!�set blank !�
52
Page 53
Sample control
1. Sample module: Sipper
2. Pump speed: Fast
500.00 nm 0.000A
3. Sipping time: 4.0 sec.
4. Dwell time: 1.0 sec.
5. Purge time: 4.0 sec.
6. No. of rinses: 0
Select item No.
Manu.Sip
F1 F2 F3 F4
On
53
Page 54
�1���56ก"� "�� 23-27
54
Page 55
������'��ก��
Reflectometry
ก����� �-� ����������ก��'��
Optical Density "��� A
A = log (I /I )���ก������'��ก�� ������'��ก��
�� �-� ��� ISA = log (IO/IS)
���ก������'��ก���� �-� ��� IO
���ก���ก�����(���'���� �-� ��� R
Reflection Density; DR�� �-� ��� RO
����������ก�(���'���� �-� ��� Rtest
Reflection Density; DR
DR = log (RO/Rtest)
55
Page 56
Filters "��� Wavelength
Reflectance spectrophotometer���� �-� ����������ก�(�-����
Light
Source Slit
Wavelength Selector
Collimating len "��� Slit
Test surface
DetectorReadout device
Collimating len "��� Slit
56
Page 57
o
Compounds ( A+Cl
- )
heat� �� ก��� hvGround state
Combustion process
Atomic absorption spectrophotometry
A+ vapor + e
- -----> A
o vapor
� �� ก��� hv
A* vapor
Ground state
Excited state ( unstable )
hv heat
OxygenOxide
High temperature
Vaporized atoms in the group state (Ao ) absorb light at very narrowly
defined wavelengths. [ 0.001 - 0.01 nm ]
Excited state ( unstable )Oxygen
Oxide
57
Page 58
Hollow-cathode
Monochromator
Photomultiplier tube
Readout device
Line spectrum light
cathode lamp Chopper Burner
tube
Sample solution
���/$��ก��%�0�7�-������������� ก������-����'� ���/$��ก��%�0�7�-������������� ก������-����'�
Atomization = convert chemicals to atomic vapor
Nebulization= convert solution to a fine spray or aerosol
Burner
58
Page 59
Burner head
Flow spoiler
Type of burner Total consumption burner
Premix burner ( laminar-flow burner )
Fuel gas
Oxidant
Flow spoiler retaining screw
Nebulizer
Burner head locking ring
Pressure relief vents
Sample capillary
Nebulizer
Nebulizer oxidant
Flow spoiler
Nebulizer adjusting knob
To waste59
Page 60
Chemical interference �.�� phosphate ions
$8����������1�"��ก(�� �(%���ก���
Calcium phosphates ----------------> Ca2+
��� metal ������ก�� phosphate ions
!��ก����!$�� diluent
��� metal ������ก�� phosphate ions
!��ก����!$�� diluent
�.�� lanthanum ions
60
Page 61
Ionization interference
A0
--------------------------------> A+
+ e-Higher temperature
o + -M
o --------------------------------> M
++ e
-(excess)
�������� ionized ���ก���-�!$�"� ก%� �%�����!� � free electron!$�1�"� ionized atom ก��� �$3� vapor atom
Ao
<------------------------------- A+
+ e-(excess)
M --------------------------------> M + e (excess)
!� � free electron!$�1�"� ionized atom ก��� �$3� vapor atom
"��� ������������"����"2 ('�1 �.��air-acetylene combustion
61
Page 62
Matrix interference
�ก(�ก�� �'ก'����"��� sample solution
ก�� standard solution �1�"�ก��ก(��'� �(����ก(�ก�� �'ก'����"��� sample solution
ก�� standard solution �1�"�ก��ก(��'� �(����ก(�����������'��ก��
�.�� protein matrix ���'��ก�� ���1�"���'�ก�!"��-� nebulizer !�'��ก���.�� protein matrix ���'��ก�� ���1�"���'�ก�!"��-� nebulizer !�'��ก��
62
Page 63
Burner problems� '1�"���-�� burner ! ��" �� � ����ก$�ก �1�"���ก9�� flame ! ������� ����ก$�ก �1�"���ก9�� flame ! ������
�$3�$8:"���%�!����� ก��ก�'�����63
Page 64
Emission interference
Ao
+ heat ---------------------> A*
hv
80% 20%
Hollow-cathode
Monochromator
Photomultiplier tube
Readout device
Line spectrum light
cathode lamp
Chopper
Burner
Sample solution
64
Page 65
Flame photometry or Flame emission photometry
���� �-� ������$�����ก��'� �(����.�� �.��� Na / K / Ca
Burner
Wavelength selector( filters)
Photomultiplier
tube
Readout device
Emission light
Burnertube
Sample
solution65
Page 66
Error in flame photometry
Altered flame temperature => alteration of emission light
Inadequate selectivity of wavelengthInadequate selectivity of wavelength
Differences in viscosities of the standards and samples
=> difference in aspiration rate --> alteration of emission light
Molecular emission bands
Cyanide �"� emit spectral bands ���;01;���ก�� spectral lines Cyanide �"� emit spectral bands ���;01;���ก�� spectral lines -��metal ions '��<
66
Page 67
Fluorometry
���� �-� -���������$����ก��"����กก��'��������������
TransmittedLight
Scattered
Absorbed
TransmittedLight
No loss of energy
No change of energy
same wavelength beforeand after it interacts withthe matterthe matterEnergy loss
Some energy loss and Reemitted light
Fluorescence and Phosphorescence
67
Page 68
First monochromator Excitation slit
Sample in cuvette
Basic components of fluorometer
Second monochromator
Light source
Emission slit
Detector
Readout device
• Solvent• Solvent
• pH of solution
• Temperature
• Absorbance of solution
• Interfering or specifically quenching compounds
Fluorescence signal
-#0�ก��$8����'��<! �����ก(� 0.1 A
68
Page 69
Interaction of light with particles
Reflected
TransmittedLight
ScatteredAbsorbed
Detection of scattered light
Turbidity Detects the reduction in the light transmission caused by particle formation,
Nephelometry Detects a portion of light that is scattered at a variety of angles.
transmission caused by particle formation, and its quantifies the residual light transmitted.
69
Page 70
Interaction of light with particles
Small particles: d < 0.1 λλλλ( Rayleigh theory )
Light scattered symmetrically, but minimally at 90o
Very large particles: d >0.1 λλλλLight mostly scattered forward
( Rayleigh-Debye theory )
( Mie theory )
but minimally at 90o
Large particles: d < λλλλ
90 45
Light scattered preferentially forward
( Rayleigh-Debye theory )
70
Page 71
= 15-90
Light source
Collimating
Slit Sample Cuvette
θ
Basic components of nephelometer
Particle diameters of Antigen-antibodies complex :
250 - 1,500 nm
= 15-90Collimating
len
Filter
Stray light traps
DetectorSignal
θ
250 - 1,500 nm
�� �����������.��� => 320 - 650 nm
71
Page 72
Absorption photometryAbsorption photometryAbsorption photometryAbsorption photometry---- solutionsolutionsolutionsolution---- vaporized atomvaporized atomvaporized atomvaporized atom
Beer’s LawBeer’s LawBeer’s LawBeer’s Law�1����ก�� εεεε "���
ก��1���"$�( �������(�ก��(����"/
---- vaporized atomvaporized atomvaporized atomvaporized atom---- vaporized moleculesvaporized moleculesvaporized moleculesvaporized molecules
Reflectance photometryReflectance photometryReflectance photometryReflectance photometry
Turbidity photometryTurbidity photometryTurbidity photometryTurbidity photometryNephelometryNephelometryNephelometryNephelometry
�1����ก�� εεεε "��������ก�� standardsstandardsstandardsstandards
Beer’s LawBeer’s LawBeer’s LawBeer’s Law�����ก�� standardsstandardsstandardsstandards
Emission photometryEmission photometryEmission photometryEmission photometryFluorescent photometryFluorescent photometryFluorescent photometryFluorescent photometryChemiluminescent photometryChemiluminescent photometryChemiluminescent photometryChemiluminescent photometry
�1��� ���� �-� ��������ก�� StandardsStandardsStandardsStandards
72