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Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen am Beispiel Sciadopitys verticillata (THUNB.) SIEBOLD & ZUCC. Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt im Lehrstuhl für Evolution und Biodiversität der Pflanzen vorgelegt von Diplom-Biologin Nicole Hille aus Dortmund Bochum 2008
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Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur ... · Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen am Beispiel

Aug 30, 2019

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Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur

Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen

am Beispiel Sciadopitys verticillata (THUNB.) SIEBOLD & ZUCC.

Dissertation

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt im

Lehrstuhl für Evolution und Biodiversität der Pflanzen

vorgelegt von

Diplom-Biologin

Nicole Hille

aus

Dortmund

Bochum 2008

Page 2: Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur ... · Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen am Beispiel

Referent: Prof. Dr. Th. Stützel

Korreferent: Prof. Dr. R. Tollrian

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„Das Gras wächst nicht schneller

wenn man daran zieht.“

Afrikanisches Sprichwort

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für meine Eltern

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INHALTSVERZEICHNIS

i

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................ i ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................... iv ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................... vi 1 EINLEITUNG ...................................................................................................... 1

1.1 Der pflanzliche Bauplan ........................................................................................................ 1

1.1.1 Das Meristem ............................................................................................................... 1

1.1.2 Blätter & Kurztriebe ..................................................................................................... 3

1.1.3 Ausgangspunkt: Doppelnadel-Problematik ................................................................ 4

1.2 Entwicklungsgenetische Lösungsansätze ............................................................................ 8

1.2.1 Pflanzliche Knox-Gene ................................................................................................ 10

1.2.2 Knox-Expression & der pflanzliche Bauplan ............................................................... 13

1.3 in-situ-Hybridisierung ............................................................................................................ 16 1.4 Ziel der Arbeit ....................................................................................................................... 17

2 MATERIAL & METHODEN ..................................................................................... 19

2.1 Pflanzenmaterial .................................................................................................................... 19

2.1.1 Materialsammlung ....................................................................................................... 19

2.1.2 Anzucht der Keimlinge ................................................................................................ 20

2.2 Morphologisch-anatomische Methoden ............................................................................... 20

2.2.1 Fixierung ...................................................................................................................... 20

2.2.2 Mikrotomtechnik .......................................................................................................... 20

2.2.3 Rasterelektropnenmikroskopie (REM) ......................................................................... 23

2.3 Molekulargenetische Methoden ........................................................................................... 24

2.3.1 Allgemeines . ................................................................................................................ 24

2.3.1.1 Primerdesign ................................................................................................... 24

2.3.1.2 Sequenzanalyse .............................................................................................. 24

2.3.2 Material für Molekulargenetische Methoden ............................................................... 24 2.3.2.1 Oligonukleotide ............................................................................................... 26

2.3.2.2 Plasmide ......................................................................................................... 27

2.3.2.3 Bakterienstämme ............................................................................................ 27

2.3.2.4 Kits .................................................................................................................. 28

2.3.2.5 Lösungen......................................................................................................... 28

2.3.3 Isolierung von RNA & DNA aus Pflanzen .................................................................... 29

2.3.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren .......................................................... 30

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INHALTSVERZEICHNIS

ii

2.3.5 cDNA-Synthese ........................................................................................................... 30

2.3.6 PCR - Amplifikation von DNA-Fragmenten .................................................................. 31

2.3.7 Agarose-Gelelektrophorese ......................................................................................... 32

2.3.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen .................................................. 32

2.3.9 Ligation von DNA-Fragmenten..................................................................................... 32

2.3.10 Kultivierung von E. coli .............................................................................................. 33

2.3.11 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli.................................................................. 34

2.3.12 Verdau von DNA mittels Restriktionsendonukleasen................................................. 34

2.3.13 DNA-Fällung (Phenolextraktion)................................................................................. 34

2.3.14 in-vitro-Transkription: Herstellung Digoxigenin-markierter RNA-Sonden .................. 35

2.3.15 Expressionsnachweis im Gewebe – in-situ-Hybridisierung ...................................... 36

2.3.15.1 Fixieren & Schneiden des Gewebes ............................................................. 37

2.3.15.2 Prähybridisierung .................... .................................................................... 38

2.3.15.3 Hybridisierung .............................................................................................. 40

2.3.15.4 Waschen nach der Hybridisierung................................................................ 41

2.3.15.5 Detektion des Signals ................................................................................... 41

2.3.15.6 Reaktionsstop ................................................................................................ 42

2.3.16 Heterologe Expression in E. coli ............................................................................... 42

2.4 Dokumentation ...................................................................................................................... 43

2.4.1 Mikroskopie & Bilderfassung ....................................................................................... 43

2.4.2 Digitalfotografie ........................................................................................................... 44

2.4.3 Bildbearbeitung ........................................................................................................... 44

3 ERGEBNISSE ..................................................................................................... 45

3.1 Morphologisch-anatomische Ausgangsbasis ...................................................................... 45

3.1.1 Morphogenese ............................................................................................................ 45 3.1.1.1 Sciadopitys verticillata - Kladodienentwicklung ............................................. 45

3.1.1.2 Abies homolepis - Nadelentwicklung ............................................................. 47

3.1.2 Leitbündelanschluss ................................................................................................... 49 3.1.2.1 Sciadopitys verticillata .................................................................................... 49

3.1.2.2 Abies homolepis ............................................................................................. 50

3.1.2.3 Pinus sylvestris ............................................................................................... 51

3.1.2 Anatomie der Sciadopitys-Kladodien ......................................................................... 52

3.1.3 Untersuchungen an Sciadopitys-Keimlingen .............................................................. 53

3.2 Primerdesign ......................................................................................................................... 60

3.3 Vorwort zu Methodenetablierung .......................................................................................... 63

3.3.1 Nukleinsäuregewinnung aus Gymnospermen ............................................................ 63

3.3.2 KNAT1 – Arabidopsis thaliana .................................................................................... 64

3.3.3 HBK1 – Picea abies ..................................................................................................... 67

3.4 Molekulargenetische Ansätze im Sciadopitys-Modell........................................................... 69

3.4.1 Funktionalitätstest mit PhyN1 ...................................................................................... 69

3.4.2 Test zur Synthese von cDNA ....................................................................................... 70

3.4.3 SvKnox – Suche nach Knox-Genen mit degenerierten Primern ................................. 70

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INHALTSVERZEICHNIS

iii

3.4.4 Sondenherstellung für SvKnox .................................................................................... 75

3.5 Expressionsnachweis für SvKnox ......................................................................................... 77

3.5.1 in-situ-Hybridisierung – Methodisch ........................................................................... 77

3.5.1.1 Fixieren & Schneiden des Gewebes .............................................................. 78

3.5.1.2 Prähybridisierung ........................................................................................... 80

3.5.1.3 Hybridisierung ................................................................................................ 81

3.5.1.4 Waschschritte ................................................................................................. 82

3.5.1.5 Detektion des Signals ..................................................................................... 82

3.5.1.6 Reaktionsstop ................................................................................................. 84

3.5.2 in-situ-Hybridisierung – Inhaltlich ................................................................................ 84

3.5.2.1 Expression in vegetativen Knospen ............................................................... 85

3.5.2.2 Expression in Blättern ..................................................................................... 88

3.5.3 Heterologe Expression von SvKnox ............................................................................ 91

3.6 Knox-Suche in Phyllocladus trichomanoides ....................................................................... 92

4 DISKUSSION ...................................................................................................... 94

4.1 Morphologische Ausgangssituation ..................................................................................... 94

4.2 Keimlingsentwicklung ........................................................................................................... 99

4.3 Methodenetablierung ............................................................................................................ 100

4.4 Knox & Sciadopitys ............................................................................................................... 101

4.5 Ursprung des Gymnospermenblattes .................................................................................. 105

4.6 Ausblick ................................................................................................................................ 106

5 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................... 108 6 LITERATURVERZEICHNIS ...................................................................................... 110 7 ANHANG ........................................................................................................... 116

DANKSAGUNG

LEBENSLAUF

ERKLÄRUNG

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ABBLIDUNGSVERZEICHNIS

iv

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abb. 1: Schematische Darstellung zum pflanzlichen Grundbauplan. ....................... 2

Abb. 2: Schematische Darstellung der Triebdifferenzierung bei Gymnospermen. ... 3

Abb. 3: S. verticillata, Theorien zur Doppelnadel-Problematik. .................................. 4

Abb. 4: S. verticillata, Habitus. ................................................................................... 5

Abb. 5: Morphologische Gegenüberstellung von S. verticillata & A. homolepis. ....... 7

Abb. 6: Thuja plicata, Schematische Darstellung des Sprossquerschnittes. ............ 8

Abb. 7: Schema zur unterschiedlichen Einflussnahme von KNOX-Transkriptions-

faktoren auf die Wachstumsregulierung. ....................................................... 11

Abb. 8: Schematischer Aufbau eines KNOX-Proteins. ............................................... 12

Abb. 9: Schematische Darstellung zum Scheitelmeristem (SAM). ............................. 14

Abb. 10: S. verticillata, Kladodienentwicklung. ............................................................ 46

Abb. 11: S. verticillata, Langtriebachse mit Schuppenblättern. ................................... 47

Abb. 12: A. homolepis, Nadelentwicklung. .................................................................. 48

Abb. 13: S. verticillata, Leitbündelanschluss der Kladodien. ....................................... 49

Abb. 14: A. homolepis, Leitbündelanschluss eines Nadelblattes. ............................... 50

Abb. 15: P. sylvestris, Leitbündelanschluss eines Kurztriebes. ................................... 51

Abb. 16: S. verticillata, Kladodium im Querschnitt. ...................................................... 52

Abb. 17: S. verticillata, reifer Same. ............................................................................. 54

Abb. 18: Keimungsreihe I: Fotodokumentation der Keimungsreihe K4. ...................... 56

Abb. 19: Keimungsreihe II: Schema & Lichtmikroskopische Aufnahmen (K4). ........... 57

Abb. 20: Keimungsreihe III: Fotodokumentation älterer Keimlinge aus K2. ................. 58

Abb. 21: Mikroskopische Aufnahmen zur Anlage der Primordien am Vegetations-

kegel. ............................................................................................................. 59

Abb. 22: Aminosäurenalignment zu Knox-Gensequenzen der Klasse 1. .................... 62

Abb. 23: A. thaliana, cDNA-Synthese von KNAT1 & Klonierungskontrolle durch

Restriktion. ..................................................................................................... 65

Abb. 24: A. thaliana, Primertest mit KNAT1-Fragment. ................................................ 66

Abb. 25: P. abies, Schema zum Primertest für dP-SvKnox und HBK1-Teilfragment. .. 68

Abb. 26: P. abies, Restriktionskontrolle für 359 bp-Insert. ........................................... 68

Abb. 27: S. verticillata, Primertest mit PhyN1-Fragment (579 bp) & Kontrolle der

cDNA-Synthese. ............................................................................................. 69

Abb. 28: S. verticillata, cDNA-Synthese mit dP-SvKnox & Klonierungskontrolle. ........ 71

Abb. 29: Schema der ermittelten Sciadopitys-Sequenz im Vergleich zur KNOX-

Proteinsequenz von P. abies (HBK1). ............................................................ 74

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ABBLIDUNGSVERZEICHNIS

v

Abb. 30: S. verticillata, Testgel zur Sondenherstellung. ............................................... 75

Abb. 31: S. verticillata, in-vitro–Transkription & Dot Blot. ............................................. 77

Abb. 32: Sciadopitys-Gewebe nach Proteinase K-Behandlung. ................................. 80

Abb. 33: Detektionslösung: Gewebe mit Rückständen des Färbesubstrats. ............... 83

Abb. 34: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten vegetativer

Knospen 6 Monate alter Keimlinge (I). .......................................................... 86

Abb. 35: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten vegetativer

Knospen 6 Monate alter Keimlinge (II). ......................................................... 87

Abb. 36: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten des terminalen

Sprossabschnittes 10 Wochen alter Keimlinge. ............................................ 89

Abb. 37: S. verticillata, in situ-Hybridisierung an Querschnitten von Keimblättern. .... 90

Abb. 38: Heterologe Expression von SvKnox. .............................................................. 91

Abb. 39: P. trichomanoides, cDNA-Synthese mit dP-SvKnox & Klonierungskontrolle. 92

Abb. 40: Schema der ermittelten Phyllocladus-Sequenz. ............................................ 93

Abb. 41: Sciadopitys-Kladodium und Nadelblätter im schematischen Querschnitt. ... 95

Abb. 42: Schema zur Transformationsreihe & Variabilität triebdifferenzierter

Systeme. ........................................................................................................ 97

Abb. 43: Schema zu genetischen Interaktionen am Scheitelmeristem. ....................... 99

Abb. 44: Schematische Darstellung ausgewählter Typen von Expressionsmustern

im Scheitelmeristem. ...................................................................................... 104

Abb. 45: Demonstration hypothetischer Expressionsmuster an REM-Aufnahmen

von A. homolepis & P. trichomanoides. ......................................................... 105

---

A1: Aminosäurenalignment zu Knox-Gensequenzen der Klassen 1&2. ................. 117

A2: Verifizierung der aus SvKnox abgeleiteten Aminosäurensequenz eines

Homöodomänen-Proteins der KNOX-Familie & der dazugehörigen

Nukleotidsequenz. ............................................................................................ 118

A3: S. verticillata, Astrablau-Safranin gefärbte Blattquerschnitte. .......................... 119

A4: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Querschnitten von Primärblättern. ...... 120

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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS vi

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

AK Antikörper AP Alkalische Phosphatase AS Aminosäure(n) BP Brevipedicellus, KNAT1 bp Basenpaare BSA Bovine (Rinder-) Serum

Albumin C Cuticula cDNA komplementäre DNA DEPC Diethyl-Pyrocarbonat DIG Digoxigenin DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease (d)NTP (Desoxy-)Ribonukleosid

Triphosphat dP degenerierter Primer ds DNA doppelsträngige DNA E Epidermis E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat Em Embryo En Endosperm (primäres) Es Embryosack FAA (FAE) Formalin-Alkohol-Eisessig for forward (5’-3’-Orientierung) H Hypodermis Ha Haare HBK Homeobox of KNOX class Hi Hilum HK Harzkanal Hy Hypokotyl IPTG Isopropylthiogalactosid K Kladodium kb Kilobasen KN1 Knotted1 KNAT Knotted-like aus A. thaliana KNOX Knotted1-like homeobox Ko Kotyledon/Keimblatt Kp Kladodienprimordium Ks Knospenschuppe KSp Kladodienspur KT Kurztrieb(achse) LB Leitbündel LS Leitbündelscheide LT Langtrieb(achse) M Marker MIA Multiple Image Alignment mRNA Messenger RNA

NBT/BCIP Nitroblau-Tetrazoliumsalz/

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat

NCBI National Center for Biotechnology Information

Np Nadel(blatt)primordium NSp Nadel(blatt)spur OD Optische Dichte P Primärblatt p. a. per analysis, zur Analyse Pa Papillen PBS Sodium-Phosphat-Puffer PCR Polymerase-Kettenreaktion PFA Paraformaldehyd(-Fixierung) Pp Palisadenparenchym pW Primärwurzel Pwo Pyrococcus woesei Ra Radicula/Keimwurzel REM Rasterelektronenmikroskopie rev. reverse (3’-5’-Orientierung) RNA Ribonukleinsäure (RNS) RNase Ribonuklease rpm Umdrehungen pro Minute S Stomata SAM shoot apical meristem (Scheitelmeristem) Sb Schuppenblatt SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Sp Schwammparenchym SR Stomatareihe Su Suspensor T Testa TALE Three Amino Acid Loop

Extension (PYP) TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer Taq Thermus aquaticus u unit (funktionelle Einheit) ü. N. über Nacht UTP Uridintriphosphat VK Vegetationskegel Wh Wurzelhals X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-

galactopyranosid ZSp Zweigspur

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EINLEITUNG 1

1 EINLEITUNG

1.1 Der pflanzliche Bauplan

Pflanzen sind ohne die Möglichkeit eines spontanen Standortwechsels im Unterschied zu

Tieren gezwungen, sich den jeweiligen Standortbedingungen mit allen Vor- und

Nachteilen anzupassen. Bei Pflanzen gleicher genetischer Konstitution kann die

phänotypische Ausprägung standortbedingt sehr variabel ausfallen. Im Verlauf der

pflanzlichen Entwicklung wird nur ein grundlegender Bauplan angelegt, der sich aus

Wurzel und Spross (= Sprossachse + Blätter) bzw. den drei universellen vegetativen

Grundorganen Wurzel, Sprossachse und Blatt zusammensetzt (Abb. 1). Die pflanzliche

Entwicklung zeichnet sich durch die Fähigkeit zur kontinuierlichen Anlage neuer Organe

aus, die auf der Aufrechterhaltung der meristematischen Aktivität in bestimmten

Bereichen des Pflanzenbauplans, den so genannten Meristemen, beruht. Ein Teil dieser

meristematischen Zellen bleibt das Pflanzenleben lang undifferenziert, während ein Teil

der Zellen ausdifferenziert und die Anlage lateraler Organe (z. B. Blätter) initiiert. Die

Grundlagen für ein besseres Verständnis der Diversität und Komplexität im Laufe der

Evolution (z. B. der Baupläne der Landpflanzen) werden unter dem Schlagwort „evo-

devo“ bzw. „evodevotics“ (evolutionary developmental biology) als einer neuen Disziplin,

zusammengefasst (THEISSEN et al, 2000; RAFF, 2000 & RAFF, 2007). Die Ansätze liegen

darin die morphologischen Veränderungen im Organismus über die Zeit mit

verschiedenen Disziplinen und aus verschiedenen Ansatzrichtungen zu betrachten und

zu einer gemeinsamen Aussage zu verbinden. Für Einblicke in die Evolution und deren

Formenvielfalt ist u. a. das Verständnis so genannter Entwicklungskontrollgene mit

entscheidend (SINGER & ASHTON, 2007).

1.1.1 Das Meristem

Der grundlegende Pflanzenbauplan wird schon im Zuge der Embryogenese festgelegt

und nicht verändert. Die ersten Organisationsschritte konzentrieren sich auf die

Festlegung der Hauptachsen (apikal-basal, dorsal-ventral, proximal-distal) und die

Formierung der zwei wichtigsten pflanzlichen Meristeme, des Spross- und des

Wurzelmeristems. Das Sprossmeristem ist Ursprung aller oberirdischen vegetativen und

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EINLEITUNG 2

generativen Organe, das Wurzelmeristem bringt die unterirdischen Pflanzenteile hervor.

Eine bedeutende Aufgabe der Meristeme liegt in der postembryonalen Organisation der

morphogenetischen Prozesse. Meristeme zeichnen sich durch zwei Eigenschaften aus,

die essentiell für ein kontinuierliches Wachstum des Pflanzenkörpers sind. Sie bringen

nicht nur immer neue Blätter, Blüten und Triebgewebe hervor, sondern sind darüber

hinaus auch gleichzeitig zur Selbstorganisation und Selbsterhaltung befähigt.

Im Bereich des Sprossscheitels bzw. des Scheitelmeristems, kurz SAM (shoot apical

meristem), differenziert ein Teil der meristematischen Zellen, mit Determinierung neuer

Organe, aus und wird anschließend durch neu gebildete undifferenzierte Zellen

kompensiert bzw. wieder aufgefüllt. Die Anlage lateraler Organe, wie z. B. Blätter,

unterliegt dabei einem genauen Muster (Phyllotaxis). Die Blattform ist im Übergang aus

dem juvenilen zum adulten Stadium sehr variabel. Blätter und Blüten sind in ihrem

Wachstum begrenzte Strukturen, während z. B. Seitenzweige (z. T.) undeterminiert

bleiben. Histologisch lässt sich das Scheitelmeristem höherer Pflanzen in zwei Zonen

unterteilen. Die zentrale Zone umfasst die sich nur sehr langsam teilenden Initialzellen,

die Ausgangspunkt aller anderen meristematischen Zonen und der Selbsterhaltung sind.

Die periphere Zone zeichnet sich durch eine schnellere Zellteilung aus und bildet den

Ausgangspunkt der Organogenese (JACKSON et al., 1994; HAKE & JACKSON, 1995; ORI et

al., 2000; vergleiche 1.2.2: Abb. 9).

Abb. 1: Schematische Darstellung zum pflanzlichen Grundbauplan. (nach GIFFORD & FOSTER, 1989,verändert). Pflanzenkörper einer stark schematisierten Dikotylen mit Wurzel, Sprossachse und Blättern. Sprossachse und Blätter werden zusammengefasst als Spross bezeichnet. Das Meristem des Sprossscheitels (Scheitelmeristem) dient der Anlage aller oberirdischen Organe, das Wurzelmeristem dient der Anlage von Wurzeln. Seitenverzeigungen gehen aus axillären Meristemen hervor und inserieren jeweils in den Achseln von (Trag-)Blättern.

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EINLEITUNG 3

1.1.2 Blätter & Kurztriebe

Die meisten Blätter der rezenten Gymnospermen werden umgangssprachlich als Nadeln

bezeichnet, sind in Größe und Form jedoch variabel. Die nadelförmigen, länglichen und

mehr oder weniger stark abgeflachten Blätter finden sich hauptsächlich bei Koniferen

(z. B. Pinaceae und Taxaceae). Bei Sprosssystemen unterscheidet man generell solche,

die immer einheitlich aufgebaut sind und daher als nicht triebdifferenziert anzusprechen

sind von triebdifferenzierten Systemen bei denen man zwischen Lang- und Kurztrieben

unterscheidet. Bei Triebdifferenzierung ist das Vorkommen von Blättern an älteren

Zweigen (nach Abwurf der Langtriebblätter) auf die Kurztriebachse beschränkt. Bei den

Gymnospermen Abies (Abb. 2 A) und Torreya findet man z. B. undifferenzierte

Sprosssysteme. Alle Triebe inklusive ihrer Benadelung sind hier gleich gestaltet.

Abb. 2: Schematische Darstellung der Triebdifferenzierung bei Gymnospermen. A: gleich gestaltete Seitenaustriebe mit terminaler, vegetativer Knospe und spiralig an der Achse stehenden Nadeln. B: Kurztriebe in Form blattartig verbreiterter Kladodien (= Phyllokladien), Schuppenblätter der einzelnen Teilphyllokladien erkennbar. C: von Schuppenblättern eingehüllte, reduzierte Kurztriebachsen stehen in Achseln von spiralig angeordneten, schuppenförmigen Tragblättern des Langtriebes; an älteren Zweigen ausschließlich Kurztrieb-Nadeln vorhanden. D: „Schirm“ im Aufriss; terminale, vegetative Knospe umgeben von sog. Kladodien bzw. Kurztrieben, die in Achseln spiralig angeordneter Schuppenblätter des Langtriebes stehen und umgangssprachlich als Doppelnadeln bezeichnet werden.

A

C D

B

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EINLEITUNG 4

Bei Pinus sylvestris als Vertreter mit Triebdifferenzierung findet man, spätestens an im

zweiten Jahr unbenadelten Langtriebachsen, stark gestauchte 2-nadelige Kurztriebe. Die

Kurztriebachse selbst ist nicht sichtbar in eine Niederblattscheide eingehüllt, erkennbar

sind bei Pinus ausschließlich die Kurztriebnadeln (Abb. 2 C). In der Gattung Phyllocladus

kommen Kurztriebe in Form blattartig verbreiterter, photosynthetisch aktiver

Flachsprosse vor an deren Randbereichen die eigentlichen Blätter bis auf kleine

Schuppenblätter reduziert sind (Abb. 2 B). Ein weiteres Beispiel für eine Langtrieb-

Kurztrieb-Differenzierung findet sich in der Gattung Sciadopitys mit charakteristisch

schirmförmig angeordneten nadelartigen Kurztrieben, die auch als Doppelnadeln

bezeichnet werden (Abb. 2 D).

1.1.3 Ausgangspunkt: Doppelnadel-Problematik

Für ein evolutives Verständnis ist die Betrachtung von als sehr ursprünglich geltenden

Taxa mit Hilfe klassischer botanischer Methoden interessant. Im Zusammenhang mit der

Suche nach neuen Erkenntnissen für ein besseres Verständnis von der Funktion und

Evolution der Gymnospermenblätter scheint eine weitere Betrachtung von Sciadopitys

verticillata (THUNB.) SIEBOLD & ZUCC., als einem sehr ursprünglichen und damit sicherlich

phylogentisch aussagekräftigen Taxon, viel versprechend. Die Natur der Doppelnadeln

bzw. der Organcharakter der photosynthetisch aktiven Flachsprosse (Kladodien) bei

S. verticillata war wiederholt Thema verschiedener Arbeiten (ROTH, 1962; TROLL, 1937;

SCHNEIDER, 1913; GÖBEL, 1913, STRASBURGER, 1872; MOHL, 1871; ENGELMANN, 1868;

DICKSON, 1866). So lassen sich zur Klärung der morphologischen Natur der nadelartigen

Kladodien bzw. der „Blattentwicklung“ und deren mögliche phylogenetische Folgen grob

zwei Ansichten trennen (Abb. 3).

Abb. 3: S. verticillata, Theorien zur Doppelnadel-Problematik. A: „Verwachsungstheorie“-ENGELMANN

(1868); VON MOHL (1871); STRASBURGER (1872) & SCHNEIDER (1913); Vegetationspunkt des Kurztriebes erschöpft sich in der Bildung der beiden kongenital verwachsenen Blattanlagen, die basal-interkalar in gemeinsamer Basis wachsen (Pfeil), Hauptanteil der Doppelnadel: Blattgewebe. B: „Phyllokladientheorie“- DICKSON (1866); TROLL (1937); ROTH (1962); der Vegetationskegel des Sprosses/„phylloiden Stengels“ (DICKSON, 1866) baut die gesamte Doppelnadel auf, Hauptanteil der Doppelnadel: Achsengewebe; terminale Doppelspitze gedeutet als zwei Blattrudimente des Kurztriebes.

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EINLEITUNG 5

Die entsprechenden Untersuchungen zum Organcharakter der Sciadopitys-Kladodien

befassen sich stets mit der Frage welcher Anteil Blatt und welcher Anteil Sprossachse

ist. Gegenwärtig lässt sich als Ausgangsbasis stark vereinfacht festhalten, dass die

Zuordnung der Doppelnadeln rein anatomisch und morphologisch über ihre Stellung klar

zu Gunsten des Sprosscharakters zu treffen ist (z. B. ROTH, 1962). Die Doppelnadeln

sind demnach, aktuell als photosynthetisch aktive Flachsprosse anzusehen, weil sie in

der Achsel von Tragblättern inserieren und sind folglich auch als nicht blatthomolog zu

betrachten (Abb. 4).

Abb. 4: S. verticillata, Habitus. A: Solitärpflanze im Botanischen Garten Marburg. B: mit Schuppenblättern besetzter Langtrieb, der terminal die charakteristisch schirmförmig angeordneten Kladodien (K) bzw. Doppelnadel-artigen Kurztriebe trägt. C: Aufsicht auf vegetative Knospe im Zentrum des „Schirms“. Vegetationskegel und junge Blattanlagen unter Knospenschuppen (Ks) geschützt verborgen. D: Vegetative Knospe in lateraler Ansicht, spiralig angeordnete Schuppenblätter (Sb) des Langtriebs durch gestauchte Internodien terminal gehäuft, Kladodien aus Schuppenblattachseln entfernt (Pfeil).

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EINLEITUNG 6

Inwiefern an diesen Doppelnadel-artigen Kurztrieben bzw. Kladodien noch Blattanteile

vorhanden sind ist spekulativ. Im Kontext dieser Arbeit interessiert besonders, ob eine

Umgestaltung eines kompletten Kurztriebes bzw. einer Kurztriebachse hin zu einer

Struktur, die dann insgesamt als Blatt anzusprechen ist, nicht nur möglich sein kann,

sondern darüber hinaus, ob dies (noch) nachweisbar ist. Letzteres hieße stark

vereinfacht, dass in Teilen, die Blatt sind, hauptsächlich blattspezifische Gene aktiv sind

und in Sprossen demnach eher die Aktivität sprossspezifischer Gene zu erwarten ist.

Die umgangssprachliche Bezeichnung Doppelnadel für die Sciadopitys-Kladodien ist mit

Sicherheit nicht zuletzt das Resultat der sehr blattähnlichen Umgestaltung der

Kurztriebe. Wie weit die Ähnlichkeit der angesprochenen Kladodien mit normalen Nadeln

morphologisch, anatomisch und morphogenetisch (bereits) geht, bleibt allerdings offen.

Einzig das Vorkommen von Tragblättern schließt die Deutung als Blatt aus und bestätigt

gleichzeitig den Sprosscharakter. Würden die Tragblätter der Kladodien komplett

reduziert werden und fehlen, könnte man ihnen aufgrund ihrer Lage und

Entstehungsweise sowie ihres blattartigen anatomischen Aufbaus (STRASBURGER 1872;

ROTH, 1962) ohne weiteres reinen Blattcharakter zusprechen und sie für ganz

gewöhnliche Nadelblätter halten. Aufgrund dieser Tatsache gibt der bei Sciadopitys

gefundene Sachverhalt Anlass dazu, die nadelartigen Kurztriebe als ein einzelnes

Stadium („Momentaufnahme“) einer Transformationsreihe anzusehen, bei der ein axillärer

Kurztrieb sekundär in ein typisches Blatt umgewandelt wird. Als mögliche Folge wären

die umgewandelten Kurztriebe morphologisch nicht mehr von Blättern zu unterscheiden.

Die im Fall von Sciadopitys nur hypothetisch anzunehmende Reduktion von Tragblättern

kommt in anderen Pflanzenfamilien durchaus vor. Eine Reduktion bis zum vollständigen

Fehlen (Ablast) ist von den Tragblättern der Blüten bei Asteraceen und Eriocaulaceen

(Syngonanthus) bekannt. Innerhalb der Familie der Asteraceae ist die Reduktion von

Tragblättern der Einzelblüten (Spreuschuppen) im Bereich des Blütenstandes in einigen

Gattungen verbreitet und ein auf Gattungsniveau bestimmungsrelevantes Merkmal. Man

findet Reduktionen aber auch bei den männlichen Teilzapfen der Gymnospermengattung

Cephalotaxus, sowie bei den Teilkladodien von Phyllocladus. Bei Phyllocladus sind

Tragblätter soweit reduziert, dass man sie nur noch in frühen Entwicklungsstadien

nachweisen kann. Tragblattreduktionen sind also weder ungewöhnlich, noch auf

bestimmte Pflanzengruppen begrenzt.

Ausgehend von der Datenlage lässt sich im Fall von Sciadopitys als gedanklicher

Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen gegenwärtig eine Zwischenstellung

annehmen. Vorstellbar ist außerdem, dass dies als die Folge einer standortbedingten

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EINLEITUNG 7

Veränderung und einer daraus resultierenden Anpassung deutbar ist. Es gibt zahlreiche

Beispiele dafür, dass wieder benötigte Organe auf anderem Wege durch analoge

Bildungen ersetzt werden. Es ist aber nicht zwangsläufig möglich, eine auf demselben

Weg identisch wieder gewonnene Struktur von einer nie verloren gegangenen zu

unterscheiden. Dies kann auch als Grundgedanke dienen die Entstehungsweise von

Blättern (einiger anderer als ursprünglich immergrün geführter Taxa) vor dem

Hintergrund umgewandelter Kurztriebe neu zu hinterfragen. Morphologisch und

anatomisch hat die Nadel von Abies (z. B. A. homolepis) Ähnlichkeit mit dem Kladodium

von Sciadopitys (Abb. 5). Bis auf das Fehlen einer dem Tragblatt vergleichbaren Struktur

ist auch die Ontogenie sehr ähnlich. So stellt sich die Frage, ob es Nadelblätter gibt, die

sich in dieser Weise phylogenetisch von Kladodien herleiten lassen und ob Abies ein

solches Beispiel ist oder nicht. Sind Blätter also phylogenetisch mehrfach unabhängig

voneinander einmal direkt und einmal „über Umwege“ (transformierte Spross(-Systeme))

entstanden?

Die Beantwortung der Frage nach dem Organcharakter ist nicht immer einfach, sollte

aber dennoch stets inhaltlich erfolgen. Bei Sichtung der Rohdaten ist abzuwägen in wie

weit die Möglichkeit besteht, dass die Morphologie durch Funktionalität überlagert wird

und histologisch möglicherweise das Funktionelle überwiegt. Beispiele für derartige

funktionelle Überlagerungen finden sich u. a. in den Podocarpaceen-Gattungen

Acmopyle und Falcatifolium (KNOPF, persönliche Mitteilung) sowie in den Cupressaceae

(z. B. Thuja). Am Beispiel der Gymnosperme Thuja zeigt sich, dass die Form einer der

Abb. 5: Morphologische Gegenüberstellung von S. verticillata & A. homolepis. A: S. verticillata, terminales Ende eines Kladodiums im Bereich der ausgebuchteten Spitze (Pfeil), Oberseite des Kladodiums mit Längsfurche (oben) und zwei Stomatareihen (SR) auf der Kladodien-Unterseite (unten). B: A. homolepis, Nadelspitze mit terminaler Ausbuchtung (Pfeil), adaxiale Seite ohne Längsfurche (oben), abaxial (unten) mit deutlich sichtbaren, längsverlaufenden Stomatareihen.

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EINLEITUNG 8

Selektion unterliegenden Struktur immer mit deren Funktion in Einklang steht, wobei

letztere sogar die Morphologie dominieren kann. Dies ist besonders deutlich, wenn

bekannte und klar erkennbare morphologische Grundstrukturen durch funktionelle

Anpassungen überformt werden. Ein Beispiel findet sich im anatomischen Aufbau der

Kantenblätter von dorsiventral abgeflachten und plagiotrop ausgerichteten Zweigen bei

z. B. Thuja plicata oder Platycladus orientalis (Cupressaceae). Hier ist das üblicherweise

auf der morphologischen Blattoberseite lokalisierte Palisadenparenchym durch die

Ausrichtung der Zweige und entsprechend dem Lichteinfall im Bereich der

morphologischen Blattunterseite und dort besonders im Bereich der Licht exponierten

Kante des Blattes ausgebildet (Abb. 6 & TETZLAF, 2005). Schwieriger wird es, wenn die

funktionelle Überformung soweit geht, dass die morphologische Grundstruktur dadurch

noch stärker oder gar vollständig verschleiert wird. Es bietet sich also über den

morphologischen Ansatz hinaus an, die Nachweisbarkeit angenommener Organe über

den Einsatz von Genen zusätzlich zu überprüfen.

1.2 Entwicklungsgenetische Lösungsansätze

Blickt man zurück auf die vielen morphologisch-anatomisch geprägten Arbeiten mit

ihrem großen Beitrag zur Basis der Grundlagenforschung, zeigt sich, dass sich viele

evolutionsbiologische Fragestellungen/Fragen zur Biodiversität hervorragend über rein

anatomisch-morphologisch gewonnene Erkenntnisse lösen lassen. Die Erfahrung zeigt,

dass auf diese Weise gewonnene Ergebnisse sich meist auch genetisch zusätzlich

stützen lassen. Für die Fälle in denen über einen gewissen Punkt hinaus (z. B. durch

funktionelle Überlagerung) rein morphologisch-anatomisch keine zufrieden stellenden

Abb. 6: Thuja plicata, Schematische Darstellung des Sprossquerschnitts. Das eigentlich auf der morphologischen Blattoberseite zu erwartende Palisadenparenchym ist bei den gezeigten Kantenblättern auf der morphologischen Blattunterseite und dort in stark Licht exponierten Bereichen zu finden.

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EINLEITUNG 9

Antworten (mehr) zu erwarten sind, bietet es sich an bereits bestehende Ergebnisse mit

Entwicklungsgenetik zu kombinieren. Der bei Sciadopitys in Form der geschilderten

Kurztriebe vorliegende Sachverhalt ist also ein Fall für den weiterführende genetische

Untersuchungen lohnend erscheinen.

Ältere Angaben aus der Literatur und historischen Zeichnungen, bei denen subjektive

Einflüsse des Autors nie gänzlich auszuschließen sind, bieten in Kombination mit (aktuell)

erfassten Rohdaten (REM, Digitalfotografie etc.) diesbezüglich keine richtige Klärung. So

werden auch definitive Aussagen zum Ansatz der vermuteten Transformationsreihe

dieser Kladodien nicht plausibler oder nachvollziehbarer. Ausgehend von der aus

morphologischer Sicht stellungsbedingten Sprossnatur der Kladodien, erscheint es

interessant diese unter Zuhilfenahme so genannter Organidentitäts- oder

Entwicklungsgene erneut zu betrachten. Entwicklungsgene sind in der Lage anhand

ihres Expressionsmusters oder über Nachweis des von ihnen kodierten Transkriptions-

faktors die Organidentität z. B. in Gewebeschnitten anzeigen zu können. Ein solcher

Versuchsansatz macht schon vor Erscheinen der Organanlagen „Einblicke“ möglich.

Hinweise zu einem derart frühen Zeitpunkt könnten essentiell sein, wenn es wie hier mit

Sichtbarwerden junger Organanlagen für Aussagen zur Identität möglicherweise schon

zu spät ist. Die Kombination aus Histologie und Genetik bzw. die Methode des

Expressionsnachweises im Gewebe (siehe 1.3) findet in den letzten Jahren verstärkt für

Angiospermen, und zunehmend auch für Untersuchungen an einzelnen Gymnospermen-

Taxa Anwendung (z. B. SUNDÅS-LARSSON, 1998; GUILLET-CLAUDE et al., 2004 & BELMONTE

et al., 2007). Je nach Auswahl der eingesetzten Entwicklungsgene werden so Aussagen

zur pflanzlichen Morphogenese inklusive der Organdifferenzierung möglich. Die relativ

große Diskrepanz in der Anzahl der molekulargenetisch untersuchten Angiospermen und

damit einhergehenden veröffentlichten Sequenzen im Vergleich zu Gymnospermen

erklärt sich erstens durch die in Angiospermen anteilmäßig große Zahl wirtschaftlich

hochinteressanter Nutzpflanzen wie z. B. Zea mays (Mais). Zweitens steigern ein im

Vergleich zu Gymnospermen oftmals sehr viel kürzerer Generationswechsel (z. B.

Arabidopsis) und ein (methodisch) einfacherer Gewebeaufschluss (Vorkommen weniger

stark verholzter Strukturen z. B. im Knospenbereich, etc.) die Attraktivität der

Angiospermen für genetische Ansätze. Ein kompletter Generationszyklus (Aussaat bis

Ausreifen der neuen „Samengeneration“) dauert bei A. thaliana gerade einmal ca.

sechs bis acht Wochen. Die Samen von S. verticillata benötigen allein für die Keimung

schon fast doppelt so lange (3 bis 4 Monate). Die Sciadopitys-Keimlinge bilden innerhalb

ihres ersten Lebensjahres zusätzlich zu den beiden Kotyledonen nur zwei weitere Blätter,

die Primärblätter, aus (http://www.schirmtanne.de/sciadopitys_verticillata.php).

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EINLEITUNG 10

Gensequenzen einer aus molekularer Sicht scheinbar eher unpopulären Gymnosperme

wie Sciadopitys, gerade in Bezug auf Entwicklungsgene (!), sind in Gen-Datenbanken

aktuell nicht vorhanden.

1.2.1 Pflanzliche Knox-Gene

Knox-Gene gehören zur großen Gruppe der Homöobox-Gene. Homöobox-Gene bzw.

von ihnen kodierte Homöodomänen-Proteine wurden im tierischen Organismus, speziell

Drosophila, erstmals entdeckt (GEHRING, 1987). Der Name ergibt sich aus einer Mutation,

die homologe Strukturen betraf. Ein klassisches Beispiel ist eine Mutation im

Antennapedia-Gen, die zur Folge hat, dass anstelle von Antennen Beine ausgebildet

wurden (MC GINNIS & KRUMLAUF, 1992).

Bekannt und benannt wurden pflanzliche Knox-Gene im Zusammenhang mit der

Entdeckung des knotted1 (kn1)-Gens aus einer Mutante von Zea mays. Kn1, das erste

aus einer Pflanze isolierte Gen, das ein Homöobox-Motiv enthält wird bei normaler

Expression nur im Scheitelmeristem und sehr jungen Teilen der Sprossachse, nicht

jedoch in Blättern exprimiert (HAKE et al., 1989; VOLLBRECHT et al., 1991). In der

Überexpressions-Mutante („gain-of-function“) zeigte sich eine ektopische Expression in

Blättern (HAKE & ORI, 2002), die knotenartige Auswüchse im Bereich der Blattspreiten zur

Folge hatte (SMITH et al., 1992). Das Kn1-Gen wird seitdem für die Isolierung immer

neuer Vertreter der Knox (knotted1-like homeobox)-Gen-Familien aus Mais und vielen

anderen Spermatophyten wie beispielsweise den Angiospermen Arabidopsis (STM:

LONG et al., 1996; KNAT: LINCOLN et al., 1994) und Oryza (OSH1: MATSUOKA et al., 1993)

oder der Gymnosperme Picea abies (SUNDÅS-LARSSON et al., 1998) etc. genutzt. Das

Gen ist damit Ausgangspunkt einer Vielzahl von Arbeiten zu verschiedenen durch

Knox-Gene gesteuerte morphogenetische Prozess (Abb. 7). Die Knox-Gene bieten sich

im Zusammenhang mit der angesprochenen Morphogenese-Thematik als „Werkzeuge“

für die Analyse von Meristemfunktion und die daraus resultierende Diversität pflanzlicher

Baupläne besonders an. Sie eignen sich in vielen Fällen als hervorragende Zeiger

morphogenetischer Ereignisse (SINHA et al., 1993; LINCOLN et al., 1994). Die Produkte

dieser regulatorischen Gene sind, abhängig von deren räumlichen und zeitlichen

Expressionsmustern, in vielen Bereichen der Organentwicklung beteiligt. Ihnen kommt

demnach als Transkriptionsfaktoren eine wichtige (regulatorische) Kontrollfunktion

speziell bei der spezifischen Zelldifferenzierung zu (z. B. HAKE & JACKSON, 1995). Neben

KNOX gehören auch die Familien BELL, HD-Zip, PHD-finger, GLABRA2 und PALE zur

großen Gruppe der Homöobox-Gene (CHAN et al., 1998).

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EINLEITUNG 11

Allen gemeinsam ist ein als Homöodomäne bezeichneter 61 Aminosäuren umfassender

konservierter Bereich, der von der Homöobox kodiert wird. Funktionell ist die

Homöodomäne über das „helix-turn-helix“-Motiv für die Protein-DNA-Interaktion

verantwortlich (VOLLBRECHT, 1991 & GEHRING et al., 1994). Homöodomänen-Proteine

funktionieren als DNA-abhängige Transkriptionsregulatoren (GEHRING et al., 1994). Als

Transkiptionsfaktoren stellen sie nur eine Komponente in einer langen Signalkaskade

(vom Kern ausgehend) dar. Sie regulieren über sequenzspezifische DNA-Bindungen

andere Gene, aktivieren und/oder unterdrücken (JAYNES & O’ FARRELL, 1989)

Transkriptionsenzyme, Signalmoleküle bzw. -proteine. Neben der Regulation anderer

Transkriptionsfaktoren verfügen sie über die Fähigkeit zur Autoregulation, indem sie an

regulatorische Sequenzmotive ihrer eigenen Gene binden und so ihre eigene Expression

steuern (HAYASHI & SCOTT, 1990). Die Ähnlichkeit in der Aminosäurensequenz der

Homöodomäne und weitere ebenfalls mehr oder weniger stark konservierte

Proteinmotive außerhalb der Homöodomäne sind ausschlaggebend für die Unterteilung

in die oben angeführten sechs verschiedenen Homöobox-Gen-Familien. Darüber hinaus

dienen die zusätzlichen, konservierten Domänen der Festlegung der verschiedenen

Homöobox-Gene selbst (CHAN et al., 1998).

Abb. 7: Schema zur unterschiedlichen Einflussnahme von KNOX-Tanskriptionsfaktoren auf die Wachstumsregulierung (nach HAY et al., 2004; verändert). KNOX greift regulierend in das Hormongleichgewicht ein und so möglicherweise indirekt auf die Zellwandstruktur (Gibberilinsäure und Auxin aktivieren die Expression der Zellwand-lösenden Proteine, der Expansine). KNOX reguliert direkt die Biosynthese der Zellwand wodurch die Zelldifferenzierung unterdrückt wird. KNOX aktiviert die Cytokinin-Biosynthese, die ihrerseits die Zellteilung aktiviert. KNOX unterdrückt die Gibberilin-Biosynthese, die möglicherweise die Anordnung des Cytoskelets reguliert, dass die Zelldifferenzierung kontrolliert. Veränderte Zellteilung und Regulierung der Expression der KNOX-Gene könnten zusammenhängen.

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EINLEITUNG 12

Die Proteine der Knox-Familie zeigen einen ihnen eigenen, gleichen Aufbau (Abb. 8).

Strukturell zeichnen sich alle KNOX-Proteine neben ihrer nahe dem C-Terminus

lokalisierten Homöodomäne durch den Besitz zwei spezieller, konservierter Motive

N-terminal („upstream“) der Homöodomäne aus. Dabei handelt es sich um die ELK- und

die KNOX-Domäne (BÜRGLIN, 1997). Die ELK-Domäne (VOLLBRECHT et al., 1991) ist ein in

allen Mitgliedern der Knox-Familie hochkonservierter Bereich, der nach seinen ersten

drei Aminosäuren benannt ist. Funktionell ist das ELK-Motiv an

Protein-Protein-Bindungen beteiligt (BÜRGLIN, 1997). Das Sequenzelement der

ELK-Domäne kommt nur bei Vertretern pflanzlicher TALE-Proteine vor (SUNDAS-

LARSSON et al., 1998). Als KNOX-Domäne wird ein ca. 100 Aminosäuren umfassender,

stark konservierter Bereich N-terminal von ELK bezeichnet. Das Motiv ist ebenfalls

wichtig für Protein-Protein-Interaktionen (MÜLLER et al., 2001). Ein kleiner, weniger

konservierter Bereich zwischen der KNOX- und ELK-Domäne wird als GSE-Box

bezeichnet (BÜRGLIN, 1997). Die Homöodomäne beinhaltet drei α-Helix-Motive. Aufgrund

des Vorkommens von drei zusätzlichen Aminosäuren (PYP) im Bereich („loop“) zwischen

dem Helix I- und dem Helix II-Motiv wird sie zur Familie der so genannten „TALE (three

amino acis loop extension) Superclass“ gezählt. Zur TALE-Familie der Homöodomänen

in Pflanzen zählt neben KNOX auch BEL-like (BELL) (BERTOLINO et al., 1995;

BÜRGLIN, 1997). Das dritte α-Helix-Motiv (Helix III) (GEHRING et al., 1994;

KERSTETTER et al., 1994), die sogenannte „recognition helix“, ist für die Erkennung und

den sequenzspezifischen Kontakt mit DNA zuständig. Als sequenzspezifische

DNA-Bindeproteine regulieren Homöodomänen-Proteine die Expression spezifischer

Gruppen von Zielgenen (AFFOLTER et al., 1990 & HAYASHI & SCOTT, 1990). Obwohl die

verschiedensten Homöodomänen strukturidentisch sind, können sie unterschiedliche

DNA-Bindungsbereiche erkennen (KERSTETTER et al., 1994).

Knox-Gene werden abhängig von bestimmten Aminosäureresten innerhalb der

Homöodomäne, Intronposition(en) und Expressionsmustern in zwei unterschiedliche

Klassen, Knox-Gene der Klasse 1 und Klasse 2 eingeteilt (KERSTETTER et al., 1994;

Abb. 8: Schematischer Aufbau eines KNOX-Proteins. (Darstellung nach SAKAMOTO et al., 2001;verändert). KNOX-Protein mit den für nahezu alle pflanzlichen KNOX-Proteine typischen Motiven der KNOX, ELK- und Homöodomäne, sowie der GSE-Box. Die zur TALE-Gruppe zählende Homöodomäne setzt sich aus drei α-Helices, mit Helix-turn-Helix-Motiv für die DNA-Bindung inklusive eines charakteristischen PYP-Motivs („PYP-loop“) zusammen.

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EINLEITUNG 13

REISER et al., 2000). Ein Vorkommen bestimmter Klassen von Knox-Genen ist nicht nur für

mono- und dikotyle Angiospermen (s. o.), Moose (CHAMPAGNE & ASHTON, 2001) und

Farne (SANO et al., 2005), sondern auch für Gymnospermen durch SUNDAS-LARSSON

et al. (HBK, 1998) gezeigt worden. Die Homöodomäne beider Klassen zeigt einen hohen

Grad an Übereinstimmung, hauptsächlich im Helix III-Motiv. Vermutlich interagieren sie

mit ähnlichen DNA-Sequenzen, aber schon kleinste Strukturveränderungen (außerhalb

der Helix III und im N-terminalen Abschnitt der Homöodomäne) führen dazu, dass sich

das DNA-Bindeverhalten und/oder die Protein-Interaktion für beide Klassen

unterscheiden (CHAN et al., 1998). Während Klasse 1-Gene hauptsächlich für die

Identitätsgebung und Meristemregulation zuständig sind (vergleiche 1.2.2), zeigen

Klasse 2-Vertreter ein sehr vielfältigeres Einsatzfeld, ggf. agieren sie erst in späteren

Stadien der Entwicklung (CHAN et al., 1998). Sowohl Klasse 1 und Klasse 2-Gene, als

auch die Knox-Familie selbst sind Monophyla (BÜRGLIN, 1997; BARATHAN et al., 1999;

REISER et al., 2000). Untersuchungen an Pflanzenlinien vor Beginn der Landpflanzen

(z. B. der Grünalgen Acetabularia acetabulum, SERIKAWA & MANDOLI, 1999) kamen zu

dem Ergebnis, dass die Duplikation der beiden Klassen erst vor 500 Millionen Jahren,

nach Formierung der Landpflanzen-Linie, auftrat (HAKE et al., 2004). Laut SINGER &

ASHTON (2007) kann man für Klasse 1 festhalten, dass eine heterologe Expression ihrer

Gene bzw. die resultierenden Phänotypen die Vermutung nahe legen, dass man den

Klasse 1-Genen nur entfernt verwandter Pflanzenvertreter wie Arabidopsis, Picea und

Ceratopteris durchaus eine homologe Funktion zusprechen kann (z. B.

HARRISON et al., 2005).

1.2.2 Knox-Expression & der pflanzliche Bauplan

Die pflanzliche Entwicklung zeigt gravierende Unterschiede zur Entwicklung von Tieren.

Pflanzliche Organe können zeitlebens neu gebildet werden. Der Grund liegt im

Vorhandensein spezieller, unbegrenzt teilungsfähiger Zellen, deren Zellverbände als so

genannte Meristeme erhalten bleiben. In Tieren kann man dies allenfalls auf totipotente

Stammzellen mit selbst erhaltenden Eigenschaften übertragen.

Für die Bildung aller oberirdischen Pflanzenteile hat das eingangs erwähnte

Scheitelmeristem eine besondere Bedeutung. Es ist über die Fähigkeit zur

Selbsterhaltung eine essentielle Quelle für meristematische Zellen bzw. Wachstum. Zwei

weitere sehr wichtige Aufgaben kommen dem Scheitelmeristem als Ursprungszentrum

von lateralen Organen wie Blättern, sowie weiteren axillären Meristemen und als

„Schaltzentrale“ im Zuge der Primordien(an)ordnung bzw. Phyllotaxis zu (MC STEEN &

HAKE, 1998; Abb. 9 A). Die im Bereich des Scheitelmeristems bei Anlage neuer

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EINLEITUNG 14

Organprimordien ablaufenden Prozesse sind sehr komplex. Die Abläufe/Muster werden

zusätzlich zur Gen-abhängigen Expression noch über An- und Abwesenheit von

Hormonen beeinflusst. HAY et al. (2004) beschreibt, dass sich die verschiedenen Gene

nicht nur wechselseitig beeinflussen, sondern auch die Hormonaktivität regulierend auf

die Aktivität der KNOX-Proteine im Apex Einfluss nimmt. Verallgemeinert lässt sich

sagen, dass die Knox-Expression (eines Klasse 1 Gens wie z. B. Kn1 oder Stm) auf das

Sprossmeristem beschränkt ist und während der Blattentwicklung fehlt (seltener nur stark

herunterreguliert ist). Die Meristemzellen, die den Ursprung einer neuen Blattanlage

bilden (Plastochron 0/P0 Stadium, vgl. Abb. 9 B), verlieren die Expressionstätigkeit schon

vor ersten (sichtbaren) Anzeichen einer Blattanlage (HAKE et al., 2004).

Die Genprodukte beeinflussen zwar die Anlage von Blättern, sind im Blatt selber aber

nicht zu finden (SMITH et al., 1992; JACKSON et al., 1994). Die Expressionsmuster für

einfache und zusammengesetzte Blätter können variieren. Das Expressionsmuster ist

also allgemein eher mit dem Entwicklungsstadium des Blattprimordiums und nicht

zwangsläufig mit der endgültigen Blattmorphologie korreliert (BARATHAN et al., 2002 &

HAKE et al., 2004). So wichtig es für die Blattidentität ist die Expression bestimmter Gene

in Blättern abzuschalten, so wichtig ist aber auch, dann bestimmte Gene anzuschalten

Abb. 9: Schematische Darstellung zum Scheitelmeristem (SAM). Expressionsmuster eines Klasse 1Knox-Gens wie Kn1 oder Stm im vegetativen Meristem (nach MC STEEN & HAKE 1998, JACKSON et al., 1994 & HAY et al., 2004, jeweils verändert). Das SAM übernimmt die Aufgabe der Selbsterhaltung, Bildung von Blättern und axillären Meristemen sowie Phyllotaxis. Zellen der zentralen Zone dienen der Selbsterhaltung des SAM und teilen sich weniger häufig. Zellen des peripheren Bereichs teilen sich häufig und sind Ausgangspunkt für die Organogenese (nur Zellen im Bereich des (Blatt-)Primordiums differenzieren aus). P0-P2 stehen für die (ontogenetischen) Zeitintervalle, Plastochrone, zwischen der Anlage der Blattprimordien mit P1 als jüngstem Primordium bzw. jüngstem Blatt. P0 steht für den Bereich wo das nächste Primordium zu erwarten ist und die Expression des eigentlich im gesamten Meristem exprimierten Klasse 1-Gens unterdrückt ist/fehlt. Axilläre Meristeme entstehen in Blattachseln. A: Schematischer Querschnitt durch SAM. B: SAM, in lateraler Ansicht, keilförmig angeschnitten.

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EINLEITUNG 15

(MC STEEN & HAKE, 1998). Pflanzliche Zellen geben über ihr Wuchsverhalten Antwort auf

Umweltbedingungen, erkennbar anhand ihrer Anpassungsfähigkeit und Koordination

ihrer Aktivität. Die wichtigste funktionelle Gemeinsamkeit aller Knox-Gene in der

Morphogenese der Pflanzen liegt in der Kontrolle der Zelldifferenzierungsprozesse und

der Formierung bestimmter Muster im pflanzlichen Bauplan. Die undifferenzierten

Meristemzellen differenzieren nach speziellen Mustern aus und bringen so laterale

Organe hervor. Mustervariationen sind Form gebend, indem sie im Zuge der vegetativen

Entwicklung Einfluss auf die Anlage von Blattformen, Leitbündelanschlüsse und

Phyllotaxis nehmen. Die unterschiedliche Genexpression ist im Hinblick auf verschiedene

Wuchsformen ein entscheidender evolutiver Mechanismus (HAKE & JACKSON, 1995).

Ein Verständnis der entstehenden Expressionsmuster bzw. von ektopischer Expression

wird erleichtert, wenn man auf mutationsbedingte Phänotypen (mit verändertem

Zellschicksal und anderem Teilungsverhalten) zur Illustration der Entwicklungsschritte

zurückgreift. Ein hoher Expressionslevel in transgenen Pflanzen bedingt einen Wechsel

hin zum Meristem und niedrigere Level verändern die entstehenden Zelltypen. Durch

(nicht letale) rezessive Wildtyp-Mutanten und spezielle induzierte Transformanten (Mono-

und Dikotyle sind kompatibel, SINHA et al., 1993) werden Aussagen und Analysen des

Gens und seiner Genprodukte möglich. Rezessive Mutationen informieren über die Rolle

des Genproduktes in der frühen Entwicklung (bezogen auf das Meristem). Eine

dominante Überexpression bzw. die so genannten „gain-of-function“-Phänotypen,

machen über ihr dosisabhängiges Erscheinungsbild Veränderungen im Bauplan

vorhersehbar (HAKE & JACKSON, 1995). Klasse 1 wird im Scheitelmeristem exprimiert. Die

Expression von Klasse 2 ist nicht so klar definiert (KERSTETTER et al., 1994,

SERIKAWA et al., 1996 & SERIKAWA et al., 1997). Ihre Expression ist nicht auf bestimmte

Gewebe beschränkt, sondern abhängig von Ort (Zelltyp) und Zeit der Expression in der

Pflanze sehr variabel, sie kommt in den meisten Geweben, jedoch nie im Meristem vor.

Aufgrund fehlender mutationsbedingter Phänotypen ist die Klasse 2-Funktion nicht so

klar beschreibbar wie die der Klasse 1-Gene (SERIKAWA et al., 1997).

Neben verschiedenen Modellen zur Blattentwicklung existieren für Monokotyle und

Dikotyle eigene Modelle zur Knox-Gen-Expression in der Embryo-, Sämlings- und

Infloreszenzentwicklung. Die Expression der Knox-Gene selbst ist auf vielfältigste Weise

und auf verschiedensten Leveln reguliert (HAKE et al., 2004). Bezogen auf den eingangs

erwähnten universellen Bau der Kormophyten (Abb. 1) bergen also die Expressions-

muster von Knox-Genen Hinweise auf die Organidentität und die Möglichkeit untersuchte

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EINLEITUNG 16

Strukturen einem der drei vegetativen Grundorgane im pflanzlichen Bauplan zuzuordnen

und Aussagen über die Homologieverhältnisse zu machen.

Gegenwärtig nimmt erstens die Zahl der diesbezüglich untersuchten Gymnospermen

(gemessen an der Vielzahl von Untersuchungen an Angiospermen) immer weiter zu.

Zweitens ist mit der Arbeit von HIRAYAMA et al. (2007) auch der erste Schritt

unternommen umgestaltete Organe mit Sonderfunktion wie Phyllokladien (blattartige

Flachsprosse) näher zu untersuchen, bei denen die Zusammensetzung aus den

Grundorganen nicht immer hinreichend klar ist. Untersuchungen zu derartigen

„innovativen“ Organen (z. B. aus der Angiospermengattung Ruscus und der

Gymnospermengattung Phyllocladus) die zur morphologischen Differenzierung

beitragen sind wichtig. Während die Zusammensetzung für Phyllocladus in diesem

Zusammenhang einfach ist (RIEGER, 2002; BELL, 1991 & TOMLINSON et al. 1987), bleibt

Ruscus laut HIRAYAMA et al. (2007) morphologisch ein Problem. Mit Hilfe dieser

Versuchsansätze, könnte es einerseits möglich sein eine intermediäre Organidentität von

z. B. Phyllokladien zu belegen (vergleiche HIRAYAMA) und andererseits auch die

Wahrscheinlichkeit vermuteter Transformationsreihen für die blattartigen Kurztriebe bei

Sciadopitys zu überprüfen.

1.3 in-situ-Hybridisierung

Die in-situ-Hybridisierung ist ein Verfahren mit dem die mRNA eines bestimmten Gens

(im Gewebeschnitt) sichtbar gemacht wird und anhand dessen die für das Gewebe oder

die Zelle typische Proteinexpression ggf. inklusive des zeitlichen Verlaufes

nachvollziehbar wird (MÜHLHARDT, 2003).

Die ursprünglich im Zuge zytologischer Präparationen etablierte Methodik der

in-situ-Hybridisierung beruht auf der spezifischen Bindung einer markierten Sonde

(Nukleinsäure-Probe) im Gewebeschnitt unter selektiven Bedingungen. Für die Botanik

wurde diese Methodik erst später angepasst, um als diagnostisches Werkzeug zur

Detektierung von Pflanzenpathogenen, Genomanalysen von Pflanzengenen oder für

Expressionsstudien der mRNA und ihrer Proteinen im Gewebe eingesetzt zu werden.

Allen bestehenden Hybridisierungsvarianten liegt zu Grunde, dass die gewählte Sonde

an eine komplementäre Sequenz im Gewebe unter Bildung einer stabilen Hybride bindet

und anschließend histologisch detektierbar ist. Im Rahmen dieser Arbeit kommen so

genannte Antisense-mRNA-Transkripte zum Einsatz, die im pflanzlichen Gewebeverband

die genaue, temporäre Expression der Sense-mRNA-Zielsequenz lokalisieren. Die

Page 27: Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur ... · Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen am Beispiel

EINLEITUNG 17

verwendeten Sonden (Riboproben) lassen sich sowohl radioaktiv als auch nicht

radioaktiv (Fluoreszenzfarbstoff oder Antikörper, Bindungsproteine) markieren. Die

Sensitivität beider Detektionsvarianten ist mittlerweile vergleichbar hoch. Auch geringe

Kopienzahlen von mRNA (auch in einzelnen Zellen) sind detektierbar. Ein sehr gängiger

Marker ist hierbei Digoxigenin, kurz DIG, ein Steroid aus Blüten und Blättern der

Digitalis-Pflanze. Es ist im Vergleich zum Biotin-Marker sensitiver. In der Regel werden

Marker an UTPs gekoppelt und sind über einen enzymgebundenen Antikörper (z. B.

Alkalische Phosphatase) gegen das verwendetet Marker-Molekül (z.B. Anti-DIG) unter

Entstehung eines chromogenen Substrates (z. B. BCIP/NBT) sichtbar und nachweisbar.

Das Verfahren bietet den Vorteil, dass sowohl eine gleichzeitige Ko-Lokalisation

verschiedener RNAs in ein und derselben Probe unter Einsatz verschiedener Marker, als

auch die gleichzeitige Detektion von RNA und dazugehörigem Protein möglich ist

(ZACHGO, 2002). Durch Einsatz der Doppelmarkierung („double labeling“) zeigte

JACKSON (2002), dass Kn1-mRNA und das zugehörige Protein an unterschiedlichen

Orten lokalisierbar waren und Proteine über Plasmodesmata „wandern“ können.

1.4 Ziel der Arbeit

Über die reine Anwendung der klassischen morphologisch-anatomischen Methodik

hinaus erscheint es viel versprechend, diese mit genetischen Versuchsansätzen zu

kombinieren, um neue und/oder zusätzliche Hinweise und unterstützende Aussagen zur

Funktion und Evolution der Gymnospermenblätter zu ermöglichen. Stellenweise liefern

die erfassten Rohdaten zur Morphogenese allein keine eindeutigen Aussagen zum

Organcharakter. Fragen zu Makroevolution könnten daher erst durch Kombination

molekularer Daten besser beantwortet werden. Die Paläobotanik bzw. Vergleiche mit

fossilen Funden aus der Anfangszeit der Gymnospermen sind insofern problematisch,

als man nicht sicher sein kann wie „komplett“ die Angaben zu Relikt- und Ur-Habitaten

sind. Außerdem lassen fossile Funde viel Spielraum für Spekulationen. Aussagen über

die Homologie oder Analogie rezenter Strukturen (z. B. über vergangene

standortbedingte Anpassungen) sind nur schwer möglich.

Vor diesem Hintergrund erscheint eine Methodenetablierung zum Expressionsnachweis

von Genen direkt im entscheidenden Gewebeverband eines so ursprünglichen

Gymnospermen-Taxons wie der Japanischen Schirmtanne, S. verticillata, angebracht.

Selbst in kladistischen Analysen unter Verwendung verschiedenster

(morphologischer/genetischer) Parameter und der über die Jahre ständig wechselnden

Zuordnung zu den verschiedensten Gymnospermen-Familien (FARJON, 2005) entsteht

Page 28: Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur ... · Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen am Beispiel

EINLEITUNG 18

häufig der Eindruck eines „Mischorganismus“, dessen Zuordnung sich als verwirrend

erweist. Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher erstens die allgemeine Etablierung der

angesprochenen genetischen Methoden wie z.B. die in-situ-Hybridisierung, inklusive der

Adaption an Sciadopitys, am Lehrstuhl zu realisieren. Zweitens soll über eine

Methodenetablierung für ein ursprüngliches Gymnospermen-Taxon, mit S. verticillata als

Modellgymnosperme, im Speziellen eine Knox-Gen-Sequenz aus S. verticillata

vergleichbar mit dem HBK-Gen aus P. abies (SUNDÅS-LARSSON et al., 1998) identifiziert

werden und entsprechende Primer für ein Klasse 1 Knox-Gen erstellt werden.

Bei den „Doppelnadeln“ bzw. Kladodien von Sciadopitys ist morphologisch eindeutig,

dass es sich um einen Spross handelt. Unklar ist, welchen Anteil Sprossachse und

möglicherweise vorhandene Blätter an Kladodien haben. Die Frage ist, ob sich die

Sprossnatur genetisch belegen lässt. Gelingt es, so schließt sich als nächstes die Frage

an, ob andere Gymnospermennadeln, die morphologisch sehr ähnlich, aber durch die

Stellung eindeutig als Blätter anzusehen sind, nicht ebenfalls umgewandelte Sprosse

sind. Führt die Studie zum Erfolg, bedeutet das, dass möglicherweise eine

polyphyletische Entstehung des Gymnospermenblattes belegt werden kann. Führt sie

nicht zum Erfolg, bedeutet es, dass in manchen Fällen die Auflösung morphologischer

Verfahren höher sein kann, als die genetischer Techniken.

Page 29: Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur ... · Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen am Beispiel

MATERIAL & METHODEN

19

2 MATERIAL & METHODEN

2.1 Pflanzenmaterial

2.1.1 Materialsammlung

Die Sammlung und Probenentnahme erfolgten jeweils angepasst an die Erfordernisse

der verschiedenen Versuchsansätze. Das Material für Entwicklungsreihen wurde in

regelmäßigen, etwa 1-wöchigen Intervallen gesammelt. Die Proben für die genetischen

Ansätze wurden punktuell, d. h. im möglichst optimalen Entwicklungsstadium frisch und

zeitnah zum Versuchsbeginn entnommen. Zusätzlich wurde das für die Hybridisierung

gesammelte Material unmittelbar nach Entnahme und eventuell nötiger

Präparation/Fixierung gekühlt aufbewahrt. Material für die Isolierung von RNA oder DNA

wurde direkt nach Entnahme in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis Schock gefroren

und anschließend bei -80 °C gelagert. Knospen (vegetative und generative) und Blätter

stammen hauptsächlich aus dem Freiland des Botanischen Gartens Bochum (BGBO).

Samen und junge weibliche (♀) Zapfen von S. verticillata wurden größtenteils im Freiland

des Botanischen Gartens in Marburg (BGM) gesammelt (Tab. 1).

Tab. 1: Übersicht des verwendeten Pflanzenmaterials.

Art Pflanzenteil Herkunft

Abies homolepis SIEBOLD &

ZUCC.

Nadeln & Triebe

vegetative Knospen

BGBO, Freiland

BGBO, Freiland

Arabidopsis thaliana L. Blätter/Grundblattrosette BGBO, Freiland

Phyllocladus trichomanoides D.

DON. var. trichomanoides

Phyllokladien

vegetative Knospen

BGBO, Freiland

BGBO, Freiland

Picea abies (L.) H. KARST. var.

abies

Nadeln

vegetative Knospen

BGBO, Freiland

BGBO, Freiland

Pinus sylvestris L. Langtriebe & Kurztriebe/Nadeln BGBO, Freiland

Sciadopitys verticillata

(THUNB.) SIEBOLD & ZUCC.

Kladodien & Langtriebe

vegetative & generative Knospen

junge ♀ Zapfen & Samen (versch. Stadien)

reife Zapfen & Samen

angekeimte Samen & Keimlinge

BGBO, Freiland

BGBO, Freiland

BGM, Freiland

BGBO/BGM, Freiland

BGBO, Warmhaus

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MATERIAL & METHODEN

20

2.1.2 Anzucht der Keimlinge

Die Anzucht der keimfähigen Samen aus Marburg erfolgte im Botanischen Garten

Bochum unter Warmhaus-Bedingungen bei 22 °C, mit Lüftung ab 26 °C. Ausgesät wurde

in ein Torf-Sand-Gemisch (inklusive Drainageschicht) mit einer dünnen Abschlussschicht

aus reinem Sand. Um die Substratoberfläche abzudunkeln und vor Austrocknung zu

schützen wurde das Pflanzgefäß bis zum Auflaufen der Samen abgedeckt. Gewässert

wurde einmal täglich, direkt auf das Substrat ohne die Keimlinge selbst zu benetzen. Im

Zeitraum von Ende Oktober bis März wurde von 6.00 bis 22.00 h zusätzlich beleuchtet

(OSRAM L 58/77, Fluora). Die entnommenen Samen bzw. Keimlinge wurden mit Hilfe von

RNAse-freiem Wasser von Substratresten gereinigt. Bei Schädlingsbefall wurde mit

Confidor WG70 (BAYER) als 0,03 %ige Lösung und/oder Mesurol® Schneckenkorn

(BAYER) behandelt.

2.2 Morphologisch-anatomische Methoden

2.2.1 Fixierung

Das gesammelte Pflanzenmaterial (siehe 2.1) wurde in FAA, einem Gemisch aus

Formalin, Ethanol und Eisessig, unmittelbar nach dem Sammeln für mindestens 72 h

fixiert und anschließend in Ethanol (70 %) überführt (kurz waschen) und gelagert.

Präpariert wurde unter einer Stereolupe Stemi SV11 von ZEISS bei bis zu 40 facher

Vergrößerung in Ethanol (70 %).

FAA (100 ml)

Ethanol (70 %, vergällt)

Formalin (37 %)

Eisessig (99-100 % ige Essigsäure)

90 ml

5 ml

5 ml

2.2.2 Mikrotomtechnik

Für die Herstellung von Serienschnitten in Paraffintechnik wurden die anatomisch zu

untersuchenden Präparate entwässert und für mindestens 24 h in Ethanol (70 %)

inkubiert (2.2.1). Die Überführung in HISTOWAX® (HISTOLAB PRODUCTS AB) erfolgte

mittels tertiärem (tert.) Butanol (Schmelzpunkt 25 °C) als Intermedium (GERLACH, 1984)

bei 37 °C im Wärmeschrank. Die Präparate wurden dabei für mindestens 24 h in

folgenden Lösungen (I-VI) belassen:

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MATERIAL & METHODEN

21

Lösung I: 20 ml tert. Butanol, abs. + 50 ml Ethanol (96 %), vergällt + 30 ml Aqua dest.

Lösung II: 35 ml tert. Butanol, abs. + 50 ml Ethanol (96 %), vergällt + 15 ml Aqua dest.

Lösung III: 55 ml tert. Butanol, abs. + 45 ml Ethanol (96 %), vergällt

Lösung IV: 100 ml tert. Butanol, abs. + Eosin

Lösung V: 100 ml tert. Butanol, abs.

Lösung VI: 100 ml tert. Butanol, abs.

Um die Objekte auch im Wachsblock sichtbar zu machen und im weiteren Arbeitsverlauf

besser ausrichten zu können, wurde dem tertiären Butanol der Farbstoff Eosin

beigemischt. Das Eosin löst sich im Verlauf des Färbevorganges durch Alkohol wieder

heraus. Die entwässerten Proben wurden mit reinem tertiärem Butanol in Glasdosen mit

Rillendeckel übertragen und der Glasbehälter mit Wachskugeln aufgefüllt. Die Proben

wurden bei 63 °C für zwei bis drei Tage im verschlossenen Gefäß gelagert. Zum

Verdampfen wurden die Deckel entfernt und die Gefäße für zwei bis drei weitere Tage im

Wärmeschrank belassen.

Einbetten:

Das Einbetten der Proben in Wachs (Schmelzpunkt HISTOWAX® bei ca. 58 °C) erfolgte

nach GERLACH (1984). Nach dem Einbetten wurden die Wachsblöcke zugeschnitten und

mittels eines Rotationsmikrotoms MOD 1130/Biocut (REICHERT JUNG) mit automatischem

Objektrückzug 10 µm dicke Serienschnitte der Objekte angefertigt. Im Anschluss wurden

die fertigen Schnittbänder mit Eiweißglycerin (Glycerin/Hühnereiweiß 1:1, nach

MAYER; GERLACH 1984, S. 99 f) auf Objektträger geklebt und bei ca. 40 °C für 1 bis 2 h

getrocknet. Um ein Zerreißen der Schnitte während des Schneidens zu verhindern bzw.

zu verringern, wurden die entsprechenden (Paraffin-) Blöcke mit Glycerin behandelt. Es

ist hilfreich, die entsprechend angeschnittenen Blöcke entweder für ca. 24 h in Glycerin

einzulegen oder die Schnittfläche während des Schneidens wiederholt mit Glycerin zu

bestreichen. Ein Zerreißen ist gehäuft bei kompakten Knospen und stark cutinisierten

Strukturen (z. B. Nadeln) zu erwarten, da hier das Eindringen des Wachses in das Objekt

erschwert wird. Auch verholzte Objekte erwiesen sich nach einer Behandlung mit

Glycerin als besser schneidbar.

Färben:

Das Färben der Schnitte erfolgte mittels einer Safranin-Astrablau-Färbung nach

GERLACH (1984, S. 128 f) und wurde wie folgt modifiziert. Dem Färben der Schnitte ging

das Entfernen des Wachses mittels Roticlear® (ROTH), anstelle von Histol, voraus.

Anschließend wurden die Schnitte als Vorbereitung auf das Anfärben über eine

absteigende Alkoholreihe auf die wässrige Safranin-Astrablau-Färbung vorbereitet:

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MATERIAL & METHODEN

22

Roticlear I 10 min.

Roticlear II 10 min.

Roticlear/Isopropanol (abs.), 1:1 5 min.

Isopropanol (abs.) 5 min.

Etahnol (96 %) 5 min.

Ethanol (70 %) 2 min.

Ethanol (50 %) 2 min.

Aqua dest. 2 min.

Anfärben der Schnitte:

Astrablau (0,5 g in 2 % iger Weinsäurelsg.) 5 min.

Aqua dest. kurz waschen

Aqua dest. kurz waschen

Aqua dest. kurz waschen

Safranin (1 % w/v) 5 min.

Aqua dest. kurz waschen

Aqua dest. kurz waschen

Aqua dest. kurz waschen

Verholzte Zellwände (Lignin) werden mit Safranin rot, reine Cellulose(wände) mit

Astrablau blau angefärbt. Um einer Pilzinfektion vorzubeugen, ist dem Astrablau eine

Messerspitze Phenol zugesetzt. Eine bleibende Überfärbung der Schnitte ist durch

Differenzieren nach Augenmaß zu vermeiden:

Aqua dest. + 3 Tropfen HCl (5 %)

Im Anschluss an das Differenzieren erfolgte die Entwässerung und Überführung in

Roticlear, um die Serienschnitte für das Eindecken vorzubereiten:

Ethanol (70 %) kurz waschen

Ethanol (96 %) kurz waschen

Isopropanol (abs.) 2 min.

Roticlear I 5 min.

Roticlear II 5 min.

Roticlear III 5 min.

Für die Herstellung von Dauerpräparaten wurden die Schnitte mit ENTELLAN® NEU

(MERCK) eingedeckt. Zusätzlich wurden mit einem Handmikrotom (ALLMIKRO) einzelne

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MATERIAL & METHODEN

23

Gewebeschnitte von frischem Pflanzenmaterial (bzw. 24 h FAA-fixierten Proben) für die

Fluoreszenzmikroskopie hergestellt.

2.2.3 Rasterelektronenmikroskopie (REM)

Die in 70 %igem Ethanol aufbewahrten und präparierten Proben wurden vor der

rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung für 12 h zur chemischen Entwässerung

in FDA (Formaldehyd-Dimethyl-Acetal; FLUKA) überführt. Darüber hinaus fungiert FDA als

Intermedium bei der Critical-Poit-Trocknung (GERSTERBERGER & LEINS, 1978) und wurde

im Verlauf des Trocknungsvorganges durch das eigentliche Trocknungsmedium CO2

ersetzt, welches im flüssigen Aggregatzustand (50 bar/10 °C) vorliegt und dessen

Kritischer Punkt bei 42 °C/73 bar erreicht wird. Verwendet wurde ein Critical Porint Dryer

CPD 030 der Firma BALZERS/BAL TEC AG.

Für die Präparation der Vegetationskegel von S. verticillata erwies es sich als vorteilhaft

die Objekte nach der Trocknung (unmittelbar vor dem Aufkleben) nachzupräparieren. Je

nach Präparatgröße erfolgte das Aufbringen der Objekte auf die massiven

Aluminiumzylinder entweder mit Leit-C (NEUBAUER CHEMIKALIEN) oder Leit-Tabs der Firma

PLANO. Zur Vorbereitung auf das Rasterelektronenmikroskop werden Objekte mit Hilfe

eines Sputtergerätes SCD von BALZERS mit einer dünnen Schicht Gold belegt. Für

Gymnospermenknospen erwies sich eine Besputterungszeit von ca. 5 min. als optimal.

Abhängig von der jeweiligen Oberflächenstruktur der Objekte musste teilweise

nachträglich erneut besputtert werden.

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MATERIAL & METHODEN

24

2.3 Molekulargenetische Methoden

2.3.1 Allgemeines

Spezielle Abwandlungen bzw. Varianten der angegebenen Protokolle und

Arbeitsschritte, sowie genauere Angaben zu jeweils speziell verwendeten Primern etc.

werden im Folgenden eher allgemein behandelt. Die betreffenden Arbeitsschritte

werden, im Zuge der Methodenetablierung für Gymnospermen, im entsprechenden

Ergebnisteil aufgegriffen und Objekt bezogen(er) besprochen.

2.3.1.1 Primerdesign

Über die Suche in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), kurz NCBI, wurden bekannte Gensequenzen aus-

gewählter Pflanzen ermittelt. Zum Erstellen degenerierter Primer wurden entsprechende

Gensequenzen aus Angio- und Gymnospermen ausgewählt und in einem Alignment

unter Anwendung des Programms VectorNTI (INVITROGEN) verglichen. Hergestellt wurden

abhängig vom jeweiligen Versuchsansatz auch spezifische Primer. Die Synthese der

Primer aus der angegebenen Basensequenzen erfolgte durch die Firma MWG BIOTECH

(http://www.mwg-biotech.com).

2.3.1.2 Sequenzanalyse

Die zur Verifizierung von Klonierungsprodukten nötige Sequenzierung der DNA wurde

von der Firma MWG BIOTECH (http://www.mwg-biotech.com) durchgeführt. Ein

anschließender Abgleich der erhaltenen mit bereits vorhandenen Sequenzen erfolgte

über die Datenbank-eigene BLAST-Funktion von NCBI (Blast Search:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast).

2.3.2 Material für molekulargenetische Methoden

Die in diesem Kapitel verwendeten Lösungen und Medien werden, sofern nicht allgemein

im Abschnitt Lösungen erläutert, im jeweils zugehörigen thematischen Versuchsabschnitt

bzw. Methodenteil direkt aufgeführt. Sämtliche Lösungen für die in-situ-Hybridisierung

oder andere RNase-sensitive Schritte wurden mit Diethyl-Pyrocarbonat (0,1 %)-

behandeltem Aqua dest. (DEPC-H2O) und Chemikalien in p.a.-Qualität (frisch) angesetzt.

Die entsprechenden Lösungen und entsprechendes Material (Glasware etc.) wurden

autoklaviert bzw. sterilisiert. Die verwendeten Chemikalien, Verbrauchsmaterialien,

Enzyme etc. sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Page 35: Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur ... · Morphologische und entwicklungsgenetische Studien zur Blattentwicklung und Blattevolution bei Gymnospermen am Beispiel

MATERIAL & METHODEN

25

Tab. 2: Verwendete Materialien.

I. Chemikalien:

Acrylamid

BCIP/NBT (SIGMAFAST™)

Borsäure

Bromphenolblau

BSA, Fraktion V

CaCl2

Chloroform

Coomassie Brilliant Blue R250

Denhardt’s Lösung

DEPC

Dextransulfat (Natriumsalz)

EDTA (Titriplex)

Eosin

Essigsäure (100 %)

Essigsäureanhydride

Ethanol p.a

Ethidiumbromid

Formaldehyd (37 %)

Formamid

Glucose

Glutathion

Glycin

Glycerin

HCl (36-38 %)

HCl (2M, Lsg.)

IPTG

Isopropanol

KCl

Lithiumchlorid

MgCl2.6 H20

ß-Mercaptoethanol

Methanol

NaCl

Na2HPO4.2 H2O

NaH2PO4.H2O

NaOH (Pellets)

NaOH (4M, Lsg.)

Natriumacetat

OrangeG

Paraformaldehyd (16 %)

Polyvinylalkohol

Roti-Histol

SDS

APPLICHEM

SIGMA ALDRICH

APPLICHEM

SIGMA-ALDRICH

APPLICHEM

J. T. BAKER, BAKER ANALYZED

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

SIGMA-ALDRICH

APPLICHEM

APPLICHEM

APPLICHEM

MERCK

WALDECK DIVISION CHROMA

VWR LABORHANDEL

SIGMA-ALDRICH

MERCK

APPLICHEM

J. T. BAKER, BAKER ANALYZED

VWR-NORMAPUR

J.T. BAKER

MERCK

APPLICHEM

J.T. BAKER

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

APPLICHEM

APPLICHEM

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

APPLICHEM

MERCK

J. T. BAKER

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

RIEDEL-DE HAEN

J.T. BAKER, BAKER ANALYZED

APPLICHEM

ELECTRON MICROSCOPY SCIENCE

MERCK

ROTH

APPLICHEM

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MATERIAL & METHODEN

26

Select Pepton

Triethanolamin

Tris

TrisHCl

Trypton

Tween 20

x-Gal

BD BIOSCIENCE

FLUKA/BIOCHEMIKA

APPLICHEM

APPLICHEM

APPLICHEM

APPLICHEM

APPLICHEM

II. Verbrauchsmaterial:

Agar

Agarose

Ampicillin

Entellan

Histowax

Paraplast Plus

PROTRAN BA85 , 0,45 µm /Ø 82 mm

POLYSINE™ Microscope Slides, precleaned;

BD BIOSCIENCE

BIOZYM

APPLICHEM

MERCK

HISTOLAB PRODUCTS AB

TYCO HEALTHCARE/KENDALL

WHATMAN

ESCO/ERIE SCIENTIFIC COMPANY

III. Enzyme & Sonstiges

PWO-Polymerase (1 u/µl)

Taq-Polymerase (5 u/µl)

T4-DNA-Ligase (1u/µl)

T7-Polymerase (1u/µl)

ProteinaseK-Lsg. (20mg/ml)

RevertAid™ H Minus M-MuLV Reverse Transkriptase (200u/µl)

RNaseA (10 mg/ml)

Restriktionsendonukleasen

*

Yeast tRNA

GeneRuler TM 100bp DNA LadderPlus (0,5 µg/Spur)

Hefe-Extrakt

DIG RNA Labeling Mix (DIG UTPs)

Nukleasefreies H2O, Molecular Biology Grade

SDS-Marker (MW-SDS-70L, 66 kDa)

PEQLAB

PEQLAB

FERMENTAS

FERMENTAS

APPLICHEM

FERMENTAS

APPLICHEM

NEW ENGLAND BIOLABS (NEB)

*

INVITROGEN (LIFE TECHNOLOGIES)

FERMENTAS

BD BIOSCIENCE

ROCHE

EPPENDORF

SIGMA-ALDRICH

2.3.2.1 Oligonukleotide

Die in dieser Arbeit verwendeten spezifischen und degenerierten Primer (dP) sind in

Tabelle 3 aufgelistet.

Tab. 3: Verwendete Primer.

Primer Sequenz

dP-SvKnox for1

dP-SvKnox for2

dP-SvKnox rev1

5’-CCRGARYTMGAYCARTTYATGGARGCWTAC –3’

5’-AAGAARAARAAGAAAGGDAARCTYCC –3’

5’-GGRAGYTTHCCTTTCTTYTTYTTCTT –3’

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MATERIAL & METHODEN

27

dP-SvKnox rev2

Knat1 for

Knat1 rev

PaHbk1 for

PaHbK1rev

PhyN1 for

PhyN1 rev

SvSondeKnox for1

SvSondeKnox for2

SvSondeKnox rev1

SvSondeKnox rev2

SvGST for

SvGST rev

5’-ATRAACCAATTRTTKATTTGYTTYTGATCYARCCC–3’

5’–GGAATTCCATGGAAGAATACCAGC –3’

5’–GGGGTACCCCTTATGGACCGAGACG -3’

5’-CCTCGAGGGTACCCATGGAGCACCTGAATGCAG -3’

5’-GCGGCCGCGAGCTCGTTAGCAATCCAAATGATAGCC –3’

5’–CGAATTGGGTACCGATGATCATGGGGAGGTGAT –3’

5’–GCTGGAGCTCGATGTTGGGCTTCTGAGTGA –3’

5’–CCGAGCTCGAAGATTGCAGCACTGGTGAA –3’

5’–CTCAAGCTTAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTTC –3’

5’–CCGAGCTCAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTTC –3’

5’–CTAAGCTTGAAGATTGCAGCACTGGTGAA –3’

5’–CAGTGAATTCCCGGAGTTAGATCAATTTATGGA –3’

5’–GCCCTCGAGAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTT –3’

2.3.2.2 Plasmide

Für die Klonierung von erstellten PCR-Fragmenten kamen folgende Plasmide zum

Einsatz:

Tab. 4: Verwendete Plasmide.

Plasmid Quelle

pBlueskript® SK +

pCR II TOPO

pJET 1.2

pGEM-11Zf

pGEX-4T1

STRATAGENE

INVITROGEN

FERMENTAS

PROMEGA

GE HEALTHCARE

2.3.2.3 Bakterienstämme

Zur Amplifikation von DNA und zur heterologen Expression wurden verschiedene

Stämme von E. coli verwendet:

Tab. 5: Verwendete Bakterienstämme.

Stamm Genotyp Quelle

DH5α*

TOP10

BL21(DE3)

F-Ф80dladacZ∆M15, rec A1, end A1, gyrA96, thi-1, hsd R17, (rK-mK-), sup E44, rel A1, deo R, (lac ZYA-arg F) U169 F- mcr A ∆(mrr-hsd RMS-mcr BC) Ф80lac Z∆M15 ∆lacX74 rec A1 deo R ara D139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) end A1 nup G F- ompT hsdSB(rB

-mB-) gal dcm (DE3)

HANAHAN, 1983

INVITROGEN

INVITROGEN

*nur für Amplifkation der Vektoren verwendet

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MATERIAL & METHODEN

28

2.3.2.4 Kits

Im Rahmen dieser Arbeit wurden für verschiedene molekularbiologische Arbeiten

unterschiedliche Kits verwendet. Die verwendeten Kits sind in Tabelle 6 aufgelistet.

Tab. 6: Verwendete Kits.

Methode Produkt (Hersteller)

Isolierung von Nukleinsäuren

Aufreinigung von Nukleinsäuren

cDNA-Synthese

Gelelution/Extraktion

Ligation

Sondenherstellung/Markierung

Detektion

- Rneasy Plant Mini Kit for Isolation of Total RNA from Plant

Cells and Tissue and Filamentous Fungi (QIAGEN)

- DNeasy Plant Mini Kit for Isolation of Total DNA from

Plant Cells and Tissue (QIAGEN)

- FastPlasmid® Mini Kit (EPPENDORF)

- RNA-Clean up Kit (MACHERYNAGEL)

- Revert Aid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit

(FERMENTAS)

- Perfectprep® Gel Cleanup Kit (EPPENDORF)

- GeneJet PCR Cloning Kit (FERMENTAS)

- TA Cloning Kit (INVITROGEN)

-Transcript AidTM T7 High Yield Transcription Kit

(FERMENTAS)

- DIG Nucleic Detection Kit (ROCHE)

2.3.2.5 Lösungen

Verwendung fanden folgende Puffer und Stammlösungen. Weitere, aus den

Stammlösungen angesetzte Lösungen, sind direkt in den jeweiligen Versuchsabläufen

aufgeführt.

DEPC-H2O, 1000 ml:

1 ml DEPC auf 1000 ml Aqua dest.,

über Nacht rühren (Abzug!),

im Anschluss autoklavieren!

Dextransulfat:

10 g Dextransulfat in 15 ml

DEPC-H2O

DNA-Probenpuffer (4x):

40 % (w/v) Saccharose

0,1 % (w/v) OrangeG

DNA-Probenpuffer (5x):

50 % (w/v) Glycerin

0,1 % (w/v) Bromphenolblau

NTE, pH 8,0:

0,5 M NaCl

10 mM Tris-HCl

1 mM EDTA

Puffer 1, pH 7,5:

100 m Tris-HCl

150 mM NaCl

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MATERIAL & METHODEN

29

Puffer 2, pH 9,5:

100 mM Tris-Base

100 mM NaCl

50 mM MgCl2

PBS (10x):

1,3 M NaCl

0,07 M Na2HPO4

0,03 M NaH2PO4

DEPC-H2O ad 1000 ml

Proteinase K-Puffer:

20 mM Tris-HCl, pH 7,0

2 mM CaCl2

Salze (10x):

3 M NaCl

0,1 M Tris

0,05 M EDTA

0,5 M NaH2PO4·2 H2O

0,5 M Na2HPO4

SSPE (20x), pH 7,4:

3M NaCl

20 mM EDTA

200 mM NaH2PO4·2 H2O

TBE (1x), pH 8:

90 mM Trisbase

90 mM Borsäure

2, 5 mM EDTA

2.3.3 Isolierung von RNA & DNA aus Pflanzen

Die Isolierung der Gesamt-RNA aus Pflanzenmaterial (vergleiche 2.1, Tab. 1) erfolgte

mittels RNeasy Plant Mini Kit von QIAGEN (Tab. 6). Hierzu wurde das Pflanzenmaterial in

flüssigem Stickstoff pulverfein gemörsert. Die Isolierung erfolgte nach Angaben des

Herstellers inklusive aller Optionalschritte und unter Verwendung des RLT-Puffers.

Eingesetzt wurden max. 100 mg des Gewebepulvers. Nach Zugabe von 450 µl RLT-

Puffer wurden die Zellen unter vortexen und zusätzlicher 1 bis 3 min. Inkubation bei

56° C unter Zuhilfenahme eines Mini-Pistills lysiert. Zum Scheren der DNA und zur

weiteren Homogenisierung bzw. Reduktion der Viskosität wurde die Probe durch einen

Filter (QIASHREDDER) zentrifugiert (2 min./13.000 rpm). Der wässrige Überstand wurde

mit 0,5 Volumen Ethanol (100 %) versetzt. Die Probe wurde komplett auf einen Filter

gegeben und durch Zentrifugation (15 sec./10.000 rpm) an eine Silica-Gelmembran

gebunden. Die Membran wurde im Anschluss dreimal gewaschen: mit 700 µl RW1-Puffer

und Zentrifugation für 15 sec. bei 10.000 rpm, mit 500 µl RPE-Puffer inklusive einer

Zentrifugation für 15 sec. bei 10.000 rpm und 500 µl RPE für 2 min. Durch 1 min.

Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit wurde die Membran getrocknet. Die RNA

wurde mit 30 µl RNase freiem H2O eluiert.

Für die DNA-Isolierung aus Pflanzenmaterial wurde das DNeasy Plant Mini Kit der Firma

QIAGEN (Tab. 6) verwendet. Nach Herstellerangaben wurde das Stickstoff-gemörserte

Gewebepulver (max. 100 mg frisch oder 20 mg trocken) mit 400 µl des mitgelieferten

A1-Puffers und 4 µl RNAse (100 mg/ml Stock) versetzt und durch vortexen, sowie mit

Mini-Pistill homogenisiert. Unter zwei- bis dreimaligem Invertieren folgte eine Inkubation

des Lysats für 10 min. bei 65 °C, gefolgt von einer Zugabe von 130 µl des Kit-eigenen

AP2-Puffers, mischen und inkubieren für 5 min. auf Eis. Optional wurde abhängig vom

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MATERIAL & METHODEN

30

jeweiligen Lysat zusätzlich bei 14.000 rpm für 5 min. zentrifugiert. Im Anschluss wurde

das komplette Lysat (ggf. Überstand aus Optionalschritt) für 2 min. bei 14.000 rpm durch

einen Filter (QIASHREDDER) zentrifugiert. Dem Überstand wurde zum Klären des Lysats

1,5 Volumen des AP3/E-Puffers (Mischen durch Pipettieren) zugegeben, dann auf eine

Silica-Gelmembran gegeben und 1 min. bei 8.000 rpm zentrifugiert. Die Membran wurde

anschließend mit 500 µl AW-Puffer und Zentrifugation bei 8.000 rpm 1 min. und erneut

mit 500 µl AW-Puffer für 2 min. und 14.000 rpm gewaschen. Die Matrix-gebundene DNA

wurde durch Inkubation mit 100 µl AE-Puffer bei Raumtemperatur und anschließender

Zentrifugation (1 min./8.000 rpm) eluiert. Der Elutionsschritt kann wiederholt werden.

Teilschritte des Kit-eigenen Protokolls wurden, entsprechend einer für Gymnospermen-

optimierten Vorgehensweise nach DOULIS et al. (2000), durchgeführt. Diese Optimierung

beinhaltet in Kürze die Durchführung aller optionalen Schritte der Kit-Vorschrift, die

Vorbehandlung des Mörsers, den Einsatz eines Einweg-Mini-Pistills zur Homogenisierung

(s. o.), die Aufnahme des geklärten Lysats (nach QIASHREDDER Membran) in

0,5 Volumen AP3E und 1 Volumen Ethanol (96-100 %), sowie eine additive

Vakuumbehandlung bei der Zentrifugation zum Trocknen der Membran.

2.3.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Nukleinsäurekonzentrationen wurden mit einem Spektralphotometer (Ultraspec 3000

pro, AMERSHAM) durch Absorbtionsmessung bei 260 nm bestimmt. Eine OD260 von 1

entspricht einem Gehalt von ca. 40 µg RNA oder 50 µg doppelsträngiger DNA. Der

Quotient OD260/OD280, als Maß für die Reinheit der Nukleinsäuren, sollte zwischen 1,8 und

2 liegen.

2.3.5 cDNA-Synthese

Die unter 2.3.3 isolierte Gesamt-RNA wurde mittels Reverser Transkription in DNA

umgeschrieben. Für die Synthese wurde das First Strand cDNA Synthesis Kit (Tab. 6)

der Firma FERMENTAS verwendet. Für die Erstrangsynthese wurde nach

Herstellerangaben ein 12 µl-Ansatz aus 10 ng-5 µg der RNA, 1 µl Olig(dT)18-Primern

(0,2 µg/µl) und RNase freiem H2O auf Eis pipettiert, 3-5 sec. anzentrifugiert und bei 70 °C

für 5 min. inkubiert. Nach anschließender kurzer Inkubation auf Eis und kurzem

Anzentrifugieren wurde die Probe auf Eis mit 4 µl 5x Reaktionspuffer, 1 µl Ribonuklease-

Inhibitor (20u/µl) und 2 µl 10mM dNTP Mix versetzt. Der Mix wurde kurz zentrifugiert und

für 5 min. bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl Reverser Transkriptase (H Minus,

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MATERIAL & METHODEN

31

200 u/µl, Tab. 2 III) wurde 60 min. bei 42 °C inkubiert. Der Reaktionsstop erfolgte bei

70 °C/ 10 min. und Abkühlen auf Eis.

Als Template für die Zweitstrangsynthese wurden 2 µl (10 ng-0,5 µg) des aus der

Erstrangsynthese gewonnenen Produktes eingesetzt. Das Protokoll des Herstellers für

die Amplifizierung wurde in Abhängigkeit der Oligonukleotidsequenz und der Länge des

zu amplifizierenden DNA-Fragments angepasst. Die Annealing-Temperatur war Primer-

spezifisch, die Elongationszeit Template-spezifisch anzupassen. Die Zweitstrang-

synthese erfolgte mittels PCR (siehe 2.3.6), unter Verwendung einer Taq-Polymerase

(PEQLAB).

2.3.6 PCR – Amplifikation von DNA-Fragmenten

Die Protokolle der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden in Abhängigkeit der

Oligonukleotidsequenzen und der Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragments nach

Angaben des „PCR Applications Manual“ (ROCHE) optimiert. Als Template wurden

Plasmid-DNA (10 ng) oder einzelsträngige DNA (10 ng-0,5 µg) aus einer Reversen

Transkription eingesetzt. Verwendet wurde entweder eine Pwo-Poylmerase (PEQLAB) mit

3’-5’-Exonuklease-Aktivität oder eine Taq-DNA-Polymerase (PEQLAB) nach Hersteller-

angaben.

Ansatz (50 µl)

Denaturiert wurde initial bei 2 min./95 °C und zyklisch für je 30 sec./95 °C, das Annealing

findet bei Primer-abhängigen 45-55 °C für 30 sec. statt. Elongiert wird bei 72 °C, wobei

die Elongationszeit Polymerase-, als auch Template-abhängig variiert (Taq: 1 min./kb;

Pwo: 2 min./kb). Alle PCR-Reaktionen wurden im T3-Thermocycler der Firma BIOMETRA

durchgeführt.

Programm:

95 °C

95 °C

x °C

72 °C

72 °C

4 °C

2 min.

30 sec.

30 sec.

x min.

10 min.

Pause

Template (10 ng)

10x Reaktionspuffer (inkl. MgCl2)

5x dNTPs

DNA-Polymerase (1u/µl)

Primer for (100 pmol)

Primer rev (100 pmol)

Aqua dest.

x µl

5 µl

10 µl

x µl

0,5 µl

0,5 µl

ad 50 µl

30x

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MATERIAL & METHODEN

32

2.3.7 Agarose-Gelelektrophorese

Die zu analysierenden DNA-Proben wurden mit DNA-Probenpuffer (siehe 2.3.2.5)

versetzt und je nach Fragmentgröße in 1-2 %igen horizontalen Agarose-Gelen

aufgetrennt. Die Agarose (BIOZYM) wurde in 1x TBE-Puffer (siehe 2.3.2.5) aufgelöst und

mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid (APPLICHEM) versetzt. Die Probe wurde zusammen mit

DNA-Probenpuffer (5x oder 4x) auf das Gel aufgetragen. Es wurden beispielsweise

jeweils 5 µl Probe (1/10 eines PCR-Ansatzes) mit je 1,25 µl des 5x Probenpuffers

versetzt. Die Elektrophorese erfolgte bei 140 Volt für 1 h bei Raumtemperatur. Als Marker

wurden 5 µl des GeneRuler 100bp DNA LadderPlus (FERMENTAS) aufgetragen.

2.3.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Fragmente wurden unter präparativem

UV-Licht ausgeschnitten und mit dem Gelextraktions-Kit der Firma EPPENDORF (Tab. 6)

nach Protokoll aus dem Gel eluiert. Je ausgeschnittenem Gelstück wurde in 3 Volumen

des Bindungspuffers aufgenommen und für 10 min. bei 50 °C und 1000 rpm aufgelöst.

Die Lösung wurde mit 1 Volumen Isopropanol versetzt, invertiert und auf eine Silica-

Gelmembran gegeben. Nach Zentrifugation wurden 750 µl Waschpuffer auf die Säule

gegeben und erneut zentrifugiert. Der reine Zentrifugationsschritt wurde zum Trocknen

der Säule wiederholt. Die Elution erfolgte durch zentrifugieren mit 30 µl Elutionspuffer

durch pH-Veränderung. Alle Zentrifugationsschritte erfolgten für 1 min. bei 8000 rpm.

Das Eluat wurde bei -20° C gelagert. Um die DNA-Konzentration im Eluat zu erhöhen

wurde in Einzelfällen nur mit 10 µl Elutionspuffer eluiert.

2.3.9 Ligation von DNA-Fragmenten

Als Vorbereitung auf die Transformation in E. coli erfolgte der Einbau des Insert in einen

Vektor bzw. ein Plasmid unter Verwendung des GeneJet PCR Cloning Kit der Firma

FERMENTAS. Die Durchführung richtete sich nach den Angaben des Herstellers. Die

Ligation von Insert (ca. 150 ng DNA) und Vektor (ca. 50 ng DNA) erfolgte mit 1 unit (u)

der Kit-eigenen T4-DNA-Ligase und 10x Ligasepuffer ü. N. bei 16 °C in einem Volumen

von 20 µl. Zur Klonierung von DNA-Fragmenten ohne freie Überhänge wurde alternativ

das TA-Klonierungs Kit der Firma INVITROGEN (Tab. 6) nach Angaben des Herstellers

verwendet.

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MATERIAL & METHODEN

33

Ligationsansatz

DNA

Vektor

steriles H2O

Ligationspuffer

Ligase

4 µl

2 µl

2 µl

1 µl

1 µl

Zur Vermehrung des Insert wurde anschließend die Hälfte des Ligationsansatzes in

CaCl2-kompetente E. coli-Zellen (TOP 10, INVITROGEN) transformiert, indem 50 µl der

Zellen (2.3.2.3) auf Eis aufgetaut und nach Zugabe der zu amplifizierenden, ligierten

DNA und einer anschließenden Inkubation von 15 bis 30 min. auf Eis, einem Hitzeschock

für 30 sec. bei 42 °C unterzogen wurden. Der Aufnahme der Zellen in 250 µl SOC-

Medium (s. u.) folgte eine Inkubation für 1 h bei 37 °C und 350 rpm .

SOC-Medium (1000 ml)

1 % (w/v) Trypton

0,5 % (w/v) Hefeextrakt

60 mM NaCl

2,5 mM KCl

10 mM MgCl2

20 mM Glucose

Aqua dest. ad 1000 ml

pH 7,0 mit NaOH, autoklavieren

Nach Sedimentation der Zellen (1 min./13.000 rpm) wurden diese in 50 µl Medium

resuspendiert und auf Selektivplatten (LBamp) ausplattiert, die zur Blau/Weiß-Selektion

mit 80 µl eines X-Gal/IPTG-Gemisches (1:1) versetzt waren. Die Vermehrung der

positiven (weißen) Klone erfolgte wie in 2.3.10 beschrieben.

2.3.10 Kultivierung von E. coli

Die Anzucht der E. coli-Stämme erfolgte in LB-Vollmedium, je nach Bedarf auf

Festagarplatten oder in Flüssigkultur (Kulturvolumen 1/10 bis 1/5 des Gefäßvolumens).

Hierzu wurde eine LB-Kultur (3 ml) mit einer einzelnen Bakterienkolonie angeimpft und

auf einem Rundschüttler über Nacht (ü. N.) bei 37° C inkubiert.

LB-Medium,pH 7,5

0,5% (w/v) Hefeextrakt

1 % (w/v) Select-Pepton

1 % (w/v) NaCl

pH 7,5 mit NaOH

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MATERIAL & METHODEN

34

Zur Verwendung von LB-Festagarplatten wurde dem Flüssigmedium 14 % Agar (BD

BIOSCIENCE) zugegeben. Das LB-Medium wurde bei 120 °C, 20 min. autoklaviert.

Transformanten wurden unter Selektionsdruck mit Ampicillin (100 µg/ml Medium,

APPLICHEM) angezogen.

2.3.11 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli

Die Präparation der zu amplifizierenden Plasmid-DNA erfolgte unter Verwendung des

Plasmidisolierungs-Kit der Firma EPPENDORF (Tab. 6). Hierzu wurden 1,5 ml einer

ü. N.-Bakterienkultur in einer Tischzentrifuge für 1 min. bei 13.000 rpm sedimentiert und

anschließend durch Zugabe von 400 µl 4 °C kaltem Lysis-Puffers durch 30 sec. vortexen

lysiert. Nach 3 min. Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Ansatz auf eine Silica-

Gelmembran gegeben. Nach Zentrifugation für 30-60 sec. bei 13.000 rpm wurden 400 µl

des Waschpuffers aufgetragen und erneut für 30-60 sec. bei 13.000 rpm zentrifugiert.

Die gebundene DNA wurde durch eine erneute Zentrifugation (1 min./13.000 rpm)

getrocknet. Die Elution erfolgte nach Zugabe von 50 µl des mitgelieferten Elutionspuffers

durch pH-Veränderung und anschließender Zentrifugation für 1 min. bei 13.000 rpm. Das

Eluat kann sofort weiterverwendet oder bei -20°C zwischengelagert werden.

2.3.12 Verdau von DNA mittels Restriktionsendonukleasen

Die eingesetzten Restriktionsenzyme richteten sich jeweils nach der weiteren

Verwendung der geschnittenen Fragmente (glatte „blunt“ oder überstehende „sticky“

DNA-Enden). Die Restriktion erfolgte unter den vom Hersteller der

Restriktionsendonukleasen (NEW ENGLAND BIOLABS) empfohlenen Bedingungen und im

empfohlenen Puffersystem. Die eingesetzte Enzymmenge richtete sich nach der

jeweiligen DNA-Konzentration, die Ansatzgröße nach der Weiterverwendung. Der Ansatz,

aus Restriktionspuffer (10x), BSA (10x), Plasmid-DNA bzw. PCR-Produkt, Restriktions-

enzym und Aqua dest. wurde 1,5 bis 2 h bei 37 °C inkubiert und zur Überprüfung auf ein

Agarosegel (siehe 2.3.5) aufgetragen.

2.3.13 DNA-Fällung (Phenolextraktion)

Wässrige DNA-Lösungen wurden durch Zugabe eines identischen Volumens einer

Phenol/Chloroform-Mischung (1:1) von Proteinresten gereinigt. Der Ansatz wurde für

5 min. bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Vorgang wurde solange wiederholt bis keine

Interphase mehr sichtbar war. Der komplette wässrige Überstand wurde anschließend

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MATERIAL & METHODEN

35

mit Chloroform extrahiert und die DNA präzipitiert, indem der Lösung Natriumacetat (pH

5,5) in einer Endkonzentration von 0,4 M zugesetzt wurde. Anschließend wurden

1,25 Volumen eiskaltes Isopropanol zugegeben und bei Raumtemperatur für 45 min.

inkubiert. Die Sedimentation der DNA erfolgte durch Zentrifugation (10 min./13.000 rpm)

bei 4 °C und zweimaliges Waschen mit Ethanol (70 %). Das Sediment wurde

abschließend bei 55 °C für 10 min. getrocknet und in nukleasefreiem Wasser (Tab. 2 III)

resuspendiert.

2.3.14 in-vitro-Transkription: Herstellung Digoxigenin-markierter

RNA-Sonden

Die Digoxigenin (DIG)-markierten Antisense-mRNA-Sonden sowie entsprechende

(Sense–)Kontrollen wurden unter Verwendung des in-vitro–Transkriptions-Kits von

FERMENTAS (Tab. 6) nach Herstellerangaben synthetisiert. Die Markierung erfolgte in

Kombination mit dem DIG RNA Labeling Mix von ROCHE. Als Sondentemplate diente ein

linearisierter Vektor inklusive der einklonierten DNA-Matritze mit vorgelagerter

Promotorsequenz für die verwendete T7-RNA-Polymerase. Der restringierte Vektor wurde

gefällt (siehe 2.3.13) und in einer finalen Konzentration von 1 µg/Ansatz im

in-vitro-Transkriptionsansatz (20 µl) eingesetzt. Der Ansatz wurde bei 37 °C für 4 bis 8 h

inkubiert.

Transkriptionsansatz (20 µl)

Transkriptionspuffer (5x)

DIG-RNA Labeling Mix (ROCHE)

Sondentemplate (1µg)

T7-Polymerase

RNase freies H2O

4 µl

8 µl

x µl

2 µl

ad 20 µl

Anschließend wurde das DNA-Template durch Zugabe von 2 µl DNase I und Inkubation

für 15 min. bei 37 °C verdaut. Die RNA-Sonde wurde zur Beseitigung verbliebener freier

Nukleotide nachfolgend mit 2 µl 0,5 M EDTA bei 65 °C, 10 min. gefällt. Für die

nachfolgende Aufreinigung der RNA mittels RNA-Clean up-Kit (MACHERY-NAGEL) wurde

der Ansatz unter Zugabe von 76 µl DEPC-H2O auf 100 µl aufgefüllt. Aufgereinigt wurde

über eine Affinitätssäule unter Zugabe von 600 µl RA1-Puffer und Zentrifugation

(30 s/10.000 rpm), sowie Zugabe von 700 µl RA3-Puffer und Zentrifugation für 30 s,

10.000 rpm. Nach Zentrifugation (2 min./10000 rpm) mit 350 µl RA3-Puffer wurde

zweimal mit je 40 µl des mitgelieferten DEPC-H2O und 1 min. Zentrifugation bei

10000 rpm eluiert. Die Proben wurden bis zum Gebrauch bei -80 °C gelagert.

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MATERIAL & METHODEN

36

Die anschließende Quantifizierung mittels Dot Blot-Analyse wurde nach Angaben von

ZACHGO (2002), leicht abgewandelt, durchgeführt. Als Kontrolle dienten unmarkierte

Antisense-mRNA-Sonden bzw. (markierte) Sense-mRNA-Sonden. Die Anti-DIG-

AP-konjugierten Antikörper und die Blocking Reagenz sind Komponenten des

DIG Nucleic Detection Kit von ROCHE. Als Positivkontrolle kann auch eine bereits

getestete mRNA-Sonde dienen.

Dot Blot:

Für die Quantifizierung nach ZACHGO (2002) wurden die markierte RNA-Sonde und die

Kontrolle jeweils mit nukleasefreiem Wasser (EPPENDORF, Tab. 2 III) im Verhältnis 1:10,

1:100 und 1:1000 verdünnt. Anschließend wurde je 1 µl der unverdünnten Probe und je

1 µl der verdünnten Proben auf eine Nitrocellulosemembran (PROTRAN BA85,

0,45 µm/Ø 82 mm, WHATMAN) aufgetragen und danach wie folgt denaturiert, neutralisiert,

equilibriert und geblockt:

NaOH (0,2 M) 5 min.

2x SSPE 5 min.

Puffer 1 + Tween 20 (0,1 %) 5 min.

Puffer 1 + Tween 20 (0,1 %) + Blocking Reagenz (0,5 %) 20 min.

Puffer 1 + Antikörperlösung (1:3000, verdünnt in Puffer 1) 50 min.

Puffer 1 + Tween 20 (0,1 %) 5 min.

Puffer 1 + Tween 20 (0,1 %) 5 min.

Puffer 1 + Tween 20 (0,1 %) 15 min.

Puffer 2 5 min.

Nach dem Equilibrieren in Puffer 2 wurde die Membran bis zum Sichtbarwerden des

Signals in einer Färbelösung aus Puffer 2 (10 ml) mit einer Tablette SIGMAFAST™

BCIP/NBT (SIGMA ALDRICH) für ca. 10 min. inkubiert. Die Zeit bis zum Erscheinen des

Signals kann sondenabhängig variieren.

2.3.15 Expressionsnachweis im Gewebe - in-situ-Hybridisierung

Die Durchführung der in-situ-Hybridisierung erfolgte in Anlehnung an die Methode nach

ZACHGO (2002) unter Verwendung des „In Situ Hybridization Protocol using Digoxigenin-

labeled probes on tissue sections (Stand April 2003)“ der Arbeitsgruppe von

DR. S. GLEISSBERG, Institut für Spezielle Botanik der Universität Mainz. Gegebenenfalls

erforderliche, objektabhängige Abweichungen vom angegebenen Protokoll werden im

Ergebnisteil 3.5.1 ausführlich behandelt und daher im Methodenteil nicht speziell

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MATERIAL & METHODEN

37

vermerkt. Die nachfolgende Unterteilung dient primär der Übersicht, die Teile stehen

aber meist im engen Zusammenhang. Die Versuchsschritte ohne spezielle

Temperaturangaben erfolgen bei Raumtemperatur.

2.3.15.1 Fixieren & Schneiden des Gewebes

Für die Fixierung des Gewebes wurden zwei unterschiedliche Varianten genutzt.

Abzuwägen ist hier der Einfluss des Fixativs auf die Konservierungseigenschaft und die

Anfärbbarkeit des zu bearbeitenden Gewebes. Ausschlaggebend für die Verwendung

des gewählten Fixativs sollte das jeweilige Gewebe und das gewollte bzw. zu

erwartende Fixierungsergebnis sein. Fixiert wurde unter Einsatz des unter 2.2.1

beschriebenen FAA-Gemisches oder einer 4 %igen Paraformaldehydlösung (PFA) nach

ZACHGO (2002). Die Lösungen wurden immer frisch angesetzt und auf Eis gelagert. Das

Einbringen des Objekts in das gekühlte Fixativ erfolgte direkt, die Proben durften

nachfolgend zu keiner Zeit mehr trocken fallen. Für eine optimale Penetration der Probe

war es erforderlich zu Beginn solange unter Vakuum zu fixieren bis die Proben

absanken. Die Vakuumbehandlung erfolgte unter Zugabe eines Detergenz (ca. 0,1 %

Tween20 oder TritonX) für 30 bis 60 min. auf Eis.

Aufgrund der Flüchtigkeit einiger Fixativbestandteile wurde am Ende der

Vakuumbehandlung ein Fixativ-Wechsel durchgeführt. Die Proben wurden bei 4 °C über

Nacht (ü. N.), unter ständiger Bewegung im Fixativ inkubiert. Die komplette Fixierdauer

richtete sich nach den Penetrationseigenschaften des Fixativs und der Probengröße

(Gewebsstärke). Eine 4 %ige Paraformaldehyd-Lösung penetriert 2 mm Gewebe in 1 h

bei Raumtemperatur (ZACHGO, 2002). Zum Waschen wurden die Objekte bei 4 °C

zweimal für je 30 min. in 1x PBS inkubiert.

Variante I:

4 % Paraformaldehydlösung (PFA, 40 ml)

16% Paraformaldehyd (1 Ampulle)

10x PBS

DEPC-H2O

→ optional: Zugabe von Tween20 (o. TritonX)

10 ml

4 ml

26 ml

Variante II:

Das FAA-Gemisch (vergleiche 2.2.1) wurde frisch und in p.a.-Qualität hergestellt. Fixiert

wurde 72 h bei 4 °C. Anschließend wurden die Proben zweimal jeweils 5 min. in

70 %igem Ethanol auf Eis gewaschen (vgl. ZACHGO, 2002) und ü. N. in 70 %igem Ethanol

belassen. Bei Bedarf erfolgte eine ca. 10 min. Vakuumbehandlung (aber ohne

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MATERIAL & METHODEN

38

Detergenz) mit anschließendem Fixativwechsel. Die Dehydrierung erfolgte wie

nachfolgend beschrieben, beginnend mit dem 70 %igen Ethanol-Schritt.

Als Vorbereitung auf die Paraffinbehandlung wurde über eine aufsteigende Alkoholreihe

dehydriert und in Roti-Histol von ROTH (als Intermedium) überführt:

Ethanol 30 % 60 min.

Ethanol 50 % 60 min.

Ethanol 70 % 60 min.

Ethanol 85 % 60 min.

Ethanol 95 % (w/Eosin) 60 min.

Ethanol 100 % 60 min.

Ethanol 100 % 60 min.

Ethanol 100 % : Roti-Histol (1:1) 60 min.

Roti-Histol 100 % 60 min.

Roti-Histol 100 % 60 min.

Anschließend wurden die Proben in einen Glasbehälter überführt mit Roti-Histol bedeckt

und mit ausreichend (1/5 Volumen) frischem Paraplast Plus (Schmelzpunkt 56 °C, TYCO

HEALTHCARE/KENDALL) oder HISTOWAX® (Schmelzpunkte 56-58 °C, HISTOLAB PRODUCTS

AB) überschichtet. Die Proben wurden eine Woche lang in Wachs belassen und bei ca.

60 °C gelagert. Um Rückstände des Intermediums Roti-Histol zu entfernen, erfolgte ein

täglicher Wachsaustausch und ein einmaliger Wechsel des Glasbehälters. Die

Vorgehensweise beim Einbetten, Aufblocken und Schneiden ist identisch mit der im

histologischen Teil 2.2.2, wobei hier allerdings ausschließlich sterile Geräte etc.

verwendet wurden. Die 10 µm starken Gewebeschnitte wurden auf

Polylysin-beschichteten Objektträger (POLYSINE™ Microscope Slides, ESCO/ERIE

SCIENTIFIC COMPANY) mittels DEPC-H2O bei 40 °C staubgeschützt gestreckt und ü. N. bei

40 °C, unter Verwendung eines Staubschutzes, getrocknet. Die trockenen Schnitte

wurden bis zum Gebrauch bei 4 °C gelagert.

2.3.15.2 Prähybridisierung

Die ü. N. getrockneten Gewebeschnitte aus 2.3.15.1 wurden in mehreren aufeinander

folgenden Schritten deparaffinisiert und auf die Hybridisierungsreaktion (siehe 2.3.15.3)

vorbereitet.

Deparaffinisierung:

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MATERIAL & METHODEN

39

Roti-Histol (2x gebraucht) 5 min.

Roti-Histol (1x gebraucht) 5 min.

Roti-Histol (frisch) 5 min.

Roti-Histol:EtOH (1:1) 5 min.

100% EtOH 5 min.

100% EtOH 5 min.

95% EtOH in 0,85% NaCl 2 min.

85% EtOH in 0,85% NaCl 2 min.

70% EtOH in 0,85% NaCl 2 min.

50% EtOH in 0,85% NaCl 2 min.

30% EtOH in 0,85% NaCl 2 min.

0,2 M HCl 20 min.

DEPC-H2O 10 sec.

DEPC-H2O 10 sec.

2x SSPE 20 min., 70 °C

Proteinase K (5 µg/ml) in 37 °C warmem DEPC-H2O 37 °C, 20 min.

2x SSPE 5 min.

100mM Triethanolamine, pH 8

+ 0,5 % Essigsäure-Anhydride unter Rühren 10 min.

2x SSPE waschen

2x SSPE waschen

0,85 % NaCl kurz

30 %Ethanol* kurz

50 % Ethanol* kurz

70 % Ethanol* kurz

85 % Ethanol* kurz

95 % Ethanol* kurz

100 % Ethanol* kurz

100 % Ethanol* kurz

Die Proben können bei 4° C in geschlossener Küvette mit etwas 100 % Ethanol für einige

Stunden (zwischen)gelagert werden. Die letzte Ethanol-Reihe (*) kann für den im

Anschluss an die Detektion anstehenden Dehydrierungsschritt (siehe 2.3.15.6)

aufgehoben werden.

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MATERIAL & METHODEN

40

2.3.15.3 Hybridisierung

Im Anschluss an die Deparaffinisierung erfolgte die Hybridisierung der Proben:

Hybridisierungslösung (8 ml)

Formamide

50% Dextransulfat

10x Salze (RT)

tRNA 10 mg/ml

50x Denhardt’s Reagenz

DEPC-H2O

4 ml

2 ml

1 ml

100 µl

200 µl

700 µl

Die Hybridisierungslösung der Proben ist frisch anzusetzen und kann bis zum Gebrauch

bei 55 °C gelagert werden. Die benötigte Lösungsmenge variierte. Als Richtwert wurde

mit 400 µl Hybridisierungslösung pro Objektträger kalkuliert. Es wurden gleichzeitig

Ansätze mit verschiedenen Sondenkonzentrationen und Kontrollen vorbereitet.

Probenvorbereitung:

Vor der eigentlichen Hybridisierung wurden die Schnitte für 30 min. bei 55 °C inkubiert.

Die Objektträger wurden in einer Hybridisierungskammer (verschließbare Box,

chloroformgereinigt) so auf Schienen gelagert, dass sie weder untereinander noch mit

dem 4x SSPE getränkten Filterpapier des Kammerbodens in Kontakt kamen. Die Ecken

jedes Objektträgers wurden mit Abstandshaltern (Glassplitter) für das Deckglas

versehen. Proben und Kontrollen sind immer in getrennten Hybrisierungskammern zu

lagern.

Sondenmix:

Die optimale Konzentration der Antisense-mRNA-Sonde wurde vorab per Dot Blot

(2.3.14) ermittelt. Die entsprechende Menge Antisense-mRNA-Sonde wurde mit der

55 °C warmen Hybridisierungslösung auf ein Endvolumen von 50 µl pro Objektträger

aufgefüllt und durch Invertieren gemischt. Für die Kontrollansätze wurde entsprechend

verfahren, jedoch mit unmarkierter Sonde, mit Sense-Sonde oder ohne Sonde/nur mit

Hybridisierungslösung. Der Mix aus Hybridisierungslösung plus Sonde wurde dann für

2 min. bei 80 °C, anschließend 5 min. auf Eis inkubiert und kurz anzentrifugiert. Nach

Zentrifugation wurde mit weiteren 350 µl warmer Hybridisierungslösung (55 °C) auf ein

Endvolumen von 400 µl je Objektträger aufgefüllt und durch vorsichtiges Pipettieren

homogenisiert. Die Gewebeschnitte wurden je Objektträger mit 400 µl des kompletten,

warmen (55 °C) Sondenmixes (in verschlossener Hybridisierungskammer) ü. N. bei

konstanten 55 °C hybridisiert.

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MATERIAL & METHODEN

41

2.3.15.4 Waschen nach der Hybridisierung

Die Deckgläschen wurden vorsichtig mit warmem 3x SSPE (45 °C) abgespült. Die

Gewebeschnitte wurden dann wie folgt gewaschen und währenddessen leicht bewegt:

3x SSPE 30 min., 45 °C

3x SSPE 30 min., 45 °C

3x SSPE 30 min., 45 °C

NTE 20 min., 37 °C

RNase A (20 µg/ml) in NTE 30 min., 37 °C

NTE 5 min., 37° C

NTE 5 min., 37° C

1,5x SSPE 30 min., 52 °C

1x SSPE 30 min., 52 °C

0,4x SSPE 30 min., 52 °C

2.3.15.5 Detektion des Signals

Antikörperinkubation:

Vor der eigentlichen Behandlung mit Anti-DIG-Antikörpern wurden die Objekte wie folgt

vorbehandelt:

Puffer 1 5 min.

Puffer 1 + 0,5 % Blocking Reagenz 30 min

Puffer 1 + 1 % BSA + 0,1 % Tween 20 30 min.

Für die Antikörperinkubation der Schnitte mit 300 µl verdünnter Antikörperlösung wurden

die Anti-DIG-AP-konjugierten Antikörper aus dem DIG Nucleic Detection Kit von ROCHE

mittels Puffer 1 + 0,1 % BSA im Verhältnis 1:3000 verdünnt. Inkubiert wurde in einer

geschlossenen Box für 1 h bei Raumtemperatur (Deckgläschen auflegen) ohne Kontakt

zum Aqua dest.-getränkten Filterpapier (Schienen). Daran schlossen sich mehrere

Waschschritte an:

Puffer 1 + 0,1 % BSA & Tween 20 20 min.

Puffer 1 + 0,1 % BSA & Tween 20 20 min.

Puffer 1 + 0,1 % BSA & Tween 20 20 min.

Puffer 1 + 0,1 % BSA & Tween 20 20 min.

Puffer 2 + 0,1 % Tween 20 5 min.

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MATERIAL & METHODEN

42

Anschließend wurden Boden, Kanten und Beschriftungsfeld der Objektträger getrocknet

und auf Schienen in eine mit Aqua dest. befeuchtetem Filterpapier ausgelegte Box

gegeben. Die geschlossene Box ist komplett vor Lichteinstrahlung zu schützen.

Außerdem wurden die Objektträger mit Abstandshaltern für die Deckgläser versehen.

Die Detektionslösung bestand aus einer Tablette SIGMAFAST™ BCIP/NBT (SIGMA

ALDRICH), die in 10 ml Polyvinylalkohol, DEPC-H2O oder Puffer 2 für mind. 2,5 h Rotation

bei 37 °C und vor Licht geschützt gelöst wurde. Bei reduziertem Raumlicht wurden dann

mindestens 200 µl Detektionslösung pro Objektträger auftragen, jeweils mit Deckglas

versehen und die Schnitte dann für 1 bis 4 Tage lichtgeschützt inkubiert bis sich das

Signal entwickelte. Gegebenenfalls musste Detektionslösung nachgegeben werden.

2.3.15.6 Reaktionsstop

Nach der Detektion wurden die Deckgläser mit Aqua dest. abgelöst und die Objekte zum

Stoppen der Reaktion 5 min. in Aqua dest. inkubiert:

Die Gewebeschnitte (siehe 2.3.15.1) wurden dann über eine aufsteigende Alkoholreihe

(30 % Ethanol - 50 % Ethanol - 70 % Ethanol - 85 % Ethanol - 95 % Ethanol -

100 % Ethanol - 100 % Ethanol aus Prähybridisierung*2.3.15.2) für jeweils 30 sec.

dehydriert, dabei ist zu beachten, dass Ethanol das Signal abschwächt (Auswaschen

des Signals). Anschließend wurden die Objektträger mit ENTELLAN® NEU (MERCK)

blasenfrei eingedeckelt.

2.3.16 Heterologe Expression in E. coli

Für die heterologe Expression wurden Fusionskonstrukte in den E. coli-Stamm BL21(D3)

(Tab. 5) transformiert. Die Anzucht der Transformanten erfolgte in LBamp-Medium

(37 °C, ü. N.). Die Kultur wurde auf eine optische Dichte OD600 von 0,1 in 500 ml des

Mediums verdünnt und bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte OD600 von 0,6 kultiviert.

Es folgte eine Induktion mit 0,4 mM IPTG für 4 h bei 30 °C. Die Zellen wurden

anschließend bei 16.000 rpm für 10 min. sedimentiert. Die induzierten Zellen wurden in

10 ml/g Zellen 1x PBS-Aufschlusspuffer (pH 7,4 ) resuspendiert. Der Zellaufschluss

erfolgte mechanisch mittels French Press-Apparatur (Homogenisator von SLM

INSTRUMENTS). Das Homogenat wurde zur Abtrennung von unlöslichen Bestandteilen für

30 min. bei 16.000 rpm zentrifugiert. Die anschließende Affinitätsaufreinigung erfolgte

nach Angaben des Säulenmaterial (Glutathion-Sepharose 4B)-Herstellers

(GE HEALTHCARE). Hierfür wurde der Überstand aus der Zentrifugation über eine

äquilibrierte Säule mit 0,5 ml Säulenmaterial gegeben. Die Säule wurde mit dem

20 fachen Volumen Aufschlusspuffer gewaschen und die Proteine anschließend in zwei

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MATERIAL & METHODEN

43

Schritten mit je 500 µl Elutionspuffer (50 mM Tris/HCl, pH 8,0 mit 10 mM Glutathion)

eluiert.

Zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen

wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach LAEMMLI (1970)

durchgeführt. Als Gelapparatur wurde das System Mini Protean II der Firma BIORAD

verwendet. Die Auftrennung erfolgte in 1x Elektrophoresepuffer bei konstanten 30 bis

60 mA für 1 h. Die Polyacrylamid-Konzentration des Trenngels lag bei 12,5 %. Die

Proteine wurden nach LLOYD (1996) unter Verwendung des Farbstoffes Coomassie

Brilliant Blue R250 (SIGMA-ALDRICH) angefärbt.

2.4 Dokumentation

2.4.1 Mikroskopie & Bilderfassung

Die Aufnahme und Erfassung des entstanden Bildmaterials mittels Lichtmikroskop ist für

die aus den verschiedenen Versuchsansätzen resultierenden Gewebeschnitte

(vergleiche 2.2.2 & 2.3.15.1) identisch.

Lichtmikroskopie:

Die angefertigten Gewebeschnitte (2.2.2) wurden mit einem Lichtmikroskop Axioplan von

ZEISS mittels Hellfeld-(Durchlicht-)Mikroskopie untersucht. Für eine Betrachtung von

Frischpräparaten wurde die Fluoreszenzmethode unter Verwendung des

Filtersatzes 09 (BP 450-490, FT 510, LP 515) verwendet. Die Aufnahmen wurden mit der

Kamera ColorView (SOFT IMAGING SYSTEMS) aufgenommen und mit dem

Computerprogramm analySIS® der Firma SOFT IMAGING SYSTEMS erfasst.

Coomassie-Färbung

0,5 % (w/v) Coomassie-Blau

10 % (w/v) Essigsäure (100 %)

40 % (w/v) Methanol

SDS-Laufpuffer (10x)

250 mM Tris

1,92 M Glycin

1 % (w/v) SDS

Sammelgelpuffer

0,5 M Tris/HCl, pH 6,8

0,4 % (w/v) SDS

Trenngelpuffer

1,5 M Tris/HCl, pH 8,8

0,4 % (w/v) SDS

SDS-Probenpuffer (4x)

250 mM Tris/HCl, pH 6,8

40 % (w/v) Glycerin

8 % (w/v) SDS

20 % (v/v) ß-Mercaptoethanol

0,2 % (w/v) Bromphenolblau

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MATERIAL & METHODEN

44

Rasterelektronenmikroskopie:

Für die Untersuchung der Präparate diente ein Rasterelektronenmikroskop DSM 950 von

ZEISS. Die Bilder wurden mit dem Computerprogramm DIPS (DIGITAL IMAGE PROCESSING

SYSTEM 2.2) mit einer Auflösung von 2000 x 2000 Pixel erfasst und aufgenommen. Der

Bildinhalt wurde über die Aufnahme hinaus nicht weiter nachbearbeitet.

2.4.2 Digitalfotografie

Die Fotodokumentation der Versuchspflanzen bzw. relevanter Pflanzenteile erfolgte unter

der Verwendung der Digitalkameras PowerShot S2 IS von CANON und COOLPIX 990

bzw. 995 der Firma NIKON. Falls erforderlich wurden die Objekte unter der Stereolupe

Stemi SV11 (ZEISS) mit Hilfe der angeschlossenen Digitalkamera ColorView (SOFT

IMAGING SYSTEMS) fotografiert. Inhaltliche Veränderungen wurden am Bildmaterial nicht

vorgenommen.

2.4.3 Bildbearbeitung

Die Gestaltung von Abbildungen und Schemazeichnungen entstand unter Verwendung

der Computerprogramme CORELDRAW® 12 und X3, die Tafelmontage erfolgte mit

ADOBE® Photoshop® 7.0. Die Größe einzelner Objekte erforderte eine nachträgliche

Montage großer Übersichtsbilder aus mehreren Einzelbildern bzw. Teilaufnahmen und

erfolgte über das programmeigene Multiple Image Alignment (MIA) der

Aufnahmesoftware (analySIS®, SOFT IMAGING SYSTEMS) direkt bei der Erfassung der

lichtmikroskopischen Aufnahmen (2.4.1). Gelfotos (aus Videodokumentationsanlage von

BIORAD) wurden komplett oder in Teilen eingescannt und sofern erforderlich (für eine

bessere Darstellung) ausschließlich technisch nachbearbeitet (Helligkeit/Kontrast).

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ERGEBNISSE 45

3 ERGEBNISSE

3.1 Morphologisch-anatomische Ausgangsbasis

3.1.1 Morphogenese

3.1.1.1 Sciadopitys verticillata – Kladodienentwicklung

Für die Studien zur Morphogenese der Kladodien von S. verticillata wurden über einen

Zeitraum von ca. sechs Monaten vegetative Knospen entsprechend unterschiedlicher

Entwicklungsstufen gesammelt. Hierfür wurden in Serie angefertigte Gewebeschnitte

jedes einzelnen Stadiums lichtmikroskopisch untersucht. Zum besseren Verständnis

wurden gleich alte Stadien parallel auch rasterelektronenmikroskopisch betrachtet, um

zusätzlich einen räumlichen Eindruck zu erlangen. Die Primordien der Kladodien

inserieren jeweils in der Achsel schuppenförmiger Tragblätter bzw. Knospenschuppen

(Abb. 10 A-F). Bei den Tragblättern handelt es sich um die schuppenförmig

ausgebildeten Langtriebnadeln. Diese stehen im terminalen Bereich des Langtriebes

durch Stauchung der Internodien dicht zusammengerückt, verholzen im Zuge der

Entwicklung zunehmend und umhüllen den Vegetationspunkt des Langtriebes

schützend. Innerhalb einer Knospe sind unterschiedlich weit entwickelte Primordien

erkennbar, die jüngsten im Bereich des Vegetationskegels, die älteren Primordien weiter

basal (Abb. 10 A-B). Eine doppelte Spitze, wie sie für die ausdifferenzierten Kladodien

(Doppelnadeln) charakteristischerweise erkennbar ist, ist an jungen Primordien nicht

vorhanden und bildete sich erst im Verlauf der Morphogenese aus. Die ersten jungen

Primordien sind ab Anfang August als leichte dreieckige Erhebungen sichtbar. Ältere

Stadien, von Mitte Oktober, sind von umgekehrt V-förmiger Gestalt und zeigen bereits

erste Ansätze für eine Doppelspitze in Form lateraler Erhebungen (Abb. 10 C & E).

Ausgehend von diesem Stadium ist für die ältesten Primordien bereits ein leichter

Längenzuwachs zu verzeichnen (Abb. 10 E-F). Das in Abb. 10 E gezeigte Stadium war

gegen Anfang November für alle Primordien einer Knospe erreicht und stellt das Stadium

dar, in dem die Knospen den Winter überdauern.

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ERGEBNISSE 46

Abb. 10: S. verticillata, Kladodienentwicklung. Vegetative Knospe, rasterelektronenmikroskopischeAufnahmen (A, C & E) & lichtmikroskopische Aufnahmen von Längsschnitten (B, D & F). A: Ende August, Knospe mit Kladodienprimordien (Kp) verschiedenen Alters in den Achseln von Schuppenblättern (Knospenschuppen, Ks) inserierend. B: medianer Längsschnitt (MIA) durch Knospe mit erkennbarer Langtriebachse (LT). C: Mitte September, junges Primordium mit deutlicher Doppelspitze (Pfeile). D: junges Primordium im Bereich der lateralen Erhebung längs getroffen, Tragblatt deutlich erkennbar. E: Mitte Oktober, Längenzuwachs durch Streckungswachstum, zunehmend von Haaren (Ha) eingehüllt. Vegetationskegel (Vk). F: älteres Primordium, von Oktober, im Längsschnitt.

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ERGEBNISSE 47

Die weitere Entwicklung bis zum Austrieb im März/April besteht hauptsächlich in einem

weiteren Längenzuwachs infolge des wieder einsetzenden Streckungswachstums. Junge

Austriebe zeigen schirmförmig angeordnete Kladodien, die jeweils in den Achseln von

terminal dicht gedrängt stehenden, verholzten Langtriebnadeln/Schuppenblättern

stehen. Die Schuppenblätter sind kurz nach Austrieb grün und verholzen mit zu-

nehmendem Alter (Abb. 11 A-B). In den Blattachseln der basal stehenden

Langtriebblätter (Abb. 11 B C) sind keine Kladodienaustriebe erkennbar. Im Gegensatz

zum terminalen Bereich werden basal zwar achselständige Kurztriebprimordien angelegt

(Abb. 11 D-E), treiben aber nicht aus. Eine Austriebförderung der Kladodien ist auf den

terminalen Bereich beschränkt und erscheint für basale Langtriebbereiche unterdrückt

(Abb. 11, C & E).

3.1.1.2 Abies homolepis – Nadelentwicklung

Die zeitliche Abfolge bei der Anlage der Nadelprimordien ist der bei Anlage der

Kladodien sehr ähnlich. Gegen Ende August sind innerhalb einer Knospe spiralig

angelegte Primordien von unterschiedlicher Größe ausgebildet (Abb. 12 A -C). Die

jüngsten Primordien mit leicht elliptischer Form sind im Bereich des Vegetationskegels

erkennbar, während die älteren Primordien, annähernd rautenförmiger Gestalt, weiter

basal angelegt sind. Tragblätter sind nicht vorhanden (Abb. 12 B & E). Gegen Ende der

Winterruhe Anfang Februar ist an den verlängerten Nadelprimordien bzw. jungen

Nadelblätter eine Doppelspitze (Abb. 12 D) bzw. terminale Einbuchtung erkennbar.

Abb. 11: S. verticillata, Langtriebachse mit Schuppenblättern. A: Detail eines jungen, grünen Schuppenblattes (Sb) kurz nach Austrieb. B: Schuppenblätter des Langtriebes (LT), mit zunehmendem Alter verholzend. C: verholztes Schuppenblatt, im Detail. D: Kladodienrudiment (K*) eines basalen Schuppenblattes, in weiterer Entwicklung gehemmt. E: fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines frischen Kladodienrudiments in Schuppenblattachsel im Längsschnitt (Handschnitt); chlorophyllhaltiges Gewebe erscheint rot.

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ERGEBNISSE 48

Abb. 12: A. homolepis, Nadelentwicklung. Vegetative Knospe, rasterelektronenmikros-kopische Aufnahmen (A, C & D) & lichtmikros-kopischen Aufnahmen von Längsschnitten (B & D). A: Ende August, Knospe mit Nadelblatt-primordien (Np) verschiedenen Alters. B: medianer Längsschnitt (MIA) durch Knospe mit erkennbarer Langtriebachse (LT); C: junge Primordien Ende August; D: junge Nadel mit deutlicher Doppelspitze (Pfeile); E: Nadelblattprimordium im Detail, Tragblätter sind nicht erkennbar. Vegetationskegel (Vk).

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ERGEBNISSE 49

3.1.2 Leitbündelanschluss

3.1.2.1 Sciadopitys verticillata

Aus Serienquerschnitten im Bereich der terminal gestauchten Schuppenblätter der

Langtriebachse mit schirmförmig angeordneten Kladodien (Abb. 13 A-B) ist erkennbar,

dass die Leitbündel der zukünftigen Kladodien im Gewebe des Zentralzylinders des

Langtriebes als keilförmige Struktur (Abb. 13 C-F) heraus ziehen. Im weiteren Verlauf teilt

sich jedes der Bündel in radialer Richtung in zwei gleichgroße Untereinheiten

(Abb. 13 D-E) auf. Die beiden aus Phloem und Xylem bestehenden Untereinheiten

ziehen als zwei separate Leitbündel (Abb. 13 F) in das Kladodium (F, Umriss als grüne

Linie) ein. Ein Anschluss von Leitbündeln der Tragblätter an den Zentralzylinder ist nicht

erkennbar (Abb. 13 B).

Abb. 13: S. verticillata, Leitbündelanschluss der Kladodien. A: Schema zum Bereich der angefertigten Querschnittserie. B: Lichtmikroskopische Aufnahme der Langtriebachse im Querschnitt (MIA) mit verschiedenen Kladodienspuren (KSp) im Bereich des Zentralzylinders. C-F: Detail einer keilförmigen Kladodienspur; keilförmige Spur aus Phloem (blau) und Xylem (rot) zieht aus Zentralzylinder des Langtriebes (links unten) nach radial (C) in Richtung des Kladodiums und gliedert sich dabei in zwei Teilbündel (D-E), die als seperate Leitbündel in das Kladodium (grüne Linie) einziehen. G: Schema zur keilförmig herausziehenden Kladodienspur mit entsprechender Lücke im Zentralzylinder.

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ERGEBNISSE 50

3.1.2.2 Abies homolepis

Der Leitbündelanschluss von Nadelblättern an die Hauptachse erfolgt über die

Ausbildung einer Blattlücke (Abb. 14 D) im Bereich des Zentralzylinders. Ein Querschnitt

einer Schnittserie durch die Hauptachse im Bereich einer herablaufenden

Nadelblattbasis (Abb. 14 A-B) zeigt, dass eine aus Phloem und Xylem bestehende

keilförmige Leitbündelstruktur (Abb. 14 C) in radialer Richtung aus dem Zentralzylinder

heraus nach distal zum Nadelblatt zieht. Im medianen Bereich des ausdifferenzierten

Blattes liegt es in zwei Teilbündeln vor.

Abb. 14: A. homolepis, Leitbündelanschluss eines Nadelblattes. A: Schema zur Lage der angefertigten Querschnitte. B: Lichtmikroskopische Aufnahme der Hauptachse im Bereich herausziehender Nadelblattspuren (NSp). C: Detail einer aus dem Zentralzylinder (links unten) herausziehenden, keilförmigen Nadelblattspur, bestehend aus Phloem (blau) und Xylem (rot) unter Ausbildung einer Blattlücke. D: Schema zur keilförmig aus dem Zentralzylinder herausziehenden Blattspur mit Blattlücke.

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ERGEBNISSE 51

3.1.2.3 Pinus sylvestris

In Serienschnitten durch die Langtriebachse im Bereich eines abzweigenden

zweinadeligen Kurztriebes (Abb. 15 A-B) zeigt sich, dass das Leitgewebe der nicht

sichtbaren Sprossachse des Kurztriebes über Abschnürung einer zylinderförmigen

Zweigspur (Abb. 15 C-D) aus dem Zentralzylinder der Langtriebachse hervorgeht. Der

sich nach radial, in Richtung des Kurztriebes, abgliedernde neue Zylinder besteht aus

einem zentralen parenchymatischen Bereich, der ringförmig von Xylem- und Phloem-

Elementen umgeben ist (Abb. 15 C).

Abb. 15: P. sylvestris, Leitbündelanschluss eines Kurztriebes. A: Schema zur Lage der angefertigten Querschnitte durch die Langtriebachse im Bereich des Kurztrieb-Anschlusses. B: Lichtmikroskopische Aufnahme der Hauptachse im Bereich einer herausziehenden Kurztriebspur (Zweigspur, ZSp). C: Detail einer sich vom Zentralzylinder (links unten) abschnürenden, zylinderförmigen Zweigspur der in Aufsicht nicht sichtbaren Kurztriebachse, bestehend aus einem zentralen Parenchym umgeben von jeweils einem Ring Xylem (rot) und Phloem (blau); D: Schema zum Abschnüren einer zylinderförmigen Zweigspur vom Zentralzylinder.

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ERGEBNISSE 52

3.1.2 Anatomie der Sciadopitys-Kladodien

Im medianen Querschnitt (Abb. 16) durch ein ausdifferenziertes Kladodium sind

charakteristische Blattkomponenten erkennbar. Jede der beiden kreisförmigen Hälften ist

der Länge nach von einem Leitbündel (mit eigener Leitbündelscheide) durchzogen.

Außerhalb der Leitbündelscheiden finden sich als Schwammparenchym

anzusprechende parenchymatische Mesophyllzellen. Ein Palisadenparenchym ist im

Anschluss an das Schwammparenchym auf der Kladodienoberseite lokalisiert. Nach

außen ist das Kladodium von einer einschichtigen, dickwandigen Epidermis umgeben,

der eine Cuticula aufgelagert ist. Nach innen folgt auf die Epidermis eine Hypodermis mit

stark sklerenchymatischen Zellen. Die Hypodermis ist im Bereich der Stomata

unterbrochen. Die Stomata finden sich nur auf der Kladodienunterseite. In Aufsicht auf

die Unterseite eines Kladodiums sind die Stomata entlang einer unterseits verlaufenden

Furche als zwei helle Längsreihen erkennbar (vergleiche 1.1.3: Abb. 5). Im marginalen

Bereich des Kladodiums sind Harzkanäle erkennbar, deren Zahl abhängig von der Höhe

des geführten Querschnittes variierte.

Abb. 16: S. verticillata, Kladodium im Querschnitt. Lichtmikroskopische Aufnahme (MIA) des medianen Querschnitts durch ein ausdifferenziertes Kladodium mit typischen Blattkomponenten. Cuticula (C); Epidermis (E); Harzkanal (HK); Hypodermis (H); Leitbündel (LB); Leitbündelscheide (LS); Palisardenparenchym (Pp); Schwammparenchym (Sp); Papillen (P); Stomata (S).

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ERGEBNISSE 53

3.1.3 Untersuchungen an Sciadopitys-Keimlingen

Von Pinus-Keimlingen her ist bekannt, dass an Keimlingen auch dann noch normale

Langtriebblätter gebildet werden, wenn adulte Pflanzen solche nicht mehr zeigen. Daher

lag es nahe an Keimlingen nach für die Fragestellung relevanten Übergangs- und

Entwicklungsstadien zu suchen und diese dann z. B. für in-situ-Hybridisierungen zu

nutzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher fünf verschiedene Untersuchungsreihen

an Keimlingen (K1-K5) angesetzt, um Informationen über die allgemeine Keimungsdauer

und das erste Auflaufen der Samen inklusive der zu erwartenden Keimungsraten zu

erhalten. Ziel war es festzustellen, wann nach Erscheinen der ersten vier normalen

Blätter, in Gestalt von Kotyledonen und Primärblättern, die ersten Anlagen für Kladodien

zu erwarten sind bzw. sichtbar werden.

Von den gesammelten Samen der Sciadopitys-Exemplare im Botanischen Garten

Bochum, erwies sich nur ein Teil als befruchtet und keimfähig. Das aus Bochum

stammende Sattgut stand nur in geringen Mengen zur Verfügung. Aus diesem Grund

wurde auf ein Exemplar des Botanischen Gartens in Marburg ausgewichen, das

weibliche Zapfen mehrerer Jahrgänge bis in den Bereich der bodennahen Seitenzweige

ausbildet und keimfähiges Saatgut in größeren Mengen bietet, welches sehr gut

zugänglich ist und daher in allen beschrieben Keimungsversuchen Verwendung fand.

Das eingesetzte reife Saatgut wurde für alle Ansätze mit Ausnahme von K2 im November

aus zweijährigen, weiblichen Zapfen entnommen, für K2 wurde im Februar gesammelt.

Das Saatgut wurde nicht stratifiziert. Aus den fünf verschiedenen Ansätzen lässt sich

anhand der gesammelten Beobachtungen zusammenfassend festhalten, dass bei

Verwendung von frisch gesammelten Samen die besten Ergebnisse erzielt wurden. Ein

Jahr bei Raumtemperatur gelagerte Samen verloren ihre Keimfähigkeit (bis auf eine

Ausnahme; K3).

Insgesamt vergingen ca. (sieben bis) acht Wochen von der Aussaat bis zum Auflaufen

der ersten Samen. Die Ausfallquote bis zum Auflaufen lag bei ca. 20 %. Ausfälle nach

der Keimung (weitere 5-10 %) gingen auf Wasseransammlungen im Bereich des

Vegetationskegels (K1) und Fraßschäden durch Schnecken und Tausendfüßler (K4)

zurück. Erstere führten bei K1 zum Ausfall einzelner Pflanzen durch die unter

Warmhaus-Bedingungen geförderte, resultierende Fäulnis. Schädlinge bedingten den

Totalverlust von einzelnen Keimlingen, bei K4, durch Fraß. Zu den Ausfällen vor

Auflaufen der Samen musste auch ein nachträglich bemerkter Befall vermutlich durch

Nematoden gezählt werden, der in unterschiedlich starkem Ausmaß an frisch

ausgesäten Samen (nach drei bis vier Tagen) auftrat. Die betroffenen Ansätze wurden

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ERGEBNISSE 54

entsprechend mit Confidor und Schneckenkorn (vergleiche 2.1.1) behandelt. Ein

negativer Einfluss auf die Keimlingsentwicklung bei Kontrollversuchen an pikierten

Keimlingen aus K4 war nicht zu beobachten. In Kombination von Ergebnissen aus K4 mit

denen aus K2 (ca. 1 Jahr älter) zeigte sich, dass ein Auflaufen der Samen sehr

gleichmäßig war (max. mit 2 bis 3 Tagen Unterschied). Die Keimlinge der erst im Februar

gesammelten Samen, mit entsprechend längerer natürlicher Kälteperiode, unterschieden

sich hinsichtlich des gleichmäßigen Auflaufens der Samen nur minimal von den im

November gesammelten.

Die K4-Keimlinge wurden für eine Dokumentation der Keimlingsentwicklung über einen

Zeitraum von zehn Wochen (W1-10) gesammelt. Bis zur fünften Woche wurde in 7-

tägigen Abständen, ab Woche fünf in Abständen von drei bis vier Tagen gesammelt. In

den Samen (Abb. 18 A, Detail) ist, wie für Spermatophyten üblich, zum Zeitpunkt der

Aussaat (W0) bereits ein reifer Embryo mit jungen Kotyledonen erkennbar (Abb. 17 A &

Abb. 18 A). Die Radicula (Keimwurzel) und der Suspensor des ca. 1,5 mm großen

Embryos (Abb. 17 B) sind zur Mikropyle/zum Hilum hin orientiert (Abb. 19 B & D), die

Kotyledonen weisen in die entgegen gesetzte Richtung.

Innerhalb der ersten vier Wochen ist, speziell für Sciadopitys, ein Wachstum der jungen

Kotyledonen und der Radicula, bzw. eine Differenzierung des Gewebes im Bereich des

Sprossscheitels und des Wurzelscheitels, zu beobachten (Abb. 19 B-D). Nach vier bis

fünf Wochen ist an der Basis der Kotyledonen ein Vegetationskegel deutlich erkennbar

(Abb. 19 E). Ab ca. fünf Wochen nach Aussaat wächst die Primärwurzel (durch den

Embryosack) aus der Öffnung der Mikropyle in das Substrat ein (Abb. 18 B). Zum

Zeitpunkt der Samenkeimung sind die Samen noch vollständig von Substrat bedeckt

Abb. 17: S. verticillata, reifer Same. A: Schematische Darstellung, median im Bereich der Mikropyle und des Hilums geführter Längsschnitt durch einen geflügelten Samen, Stadium mit reifem Embryo entspricht dem Stadium W0 zum Zeitpunkt der Aussaat für alle fünf Keimungsversuche (K1-K5). B: Rasterelektronenmikrospkopische Aufnahme eines präparierten, reifen Embryos (W0).

A B

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ERGEBNISSE 55

(Abb. 19 A, W1-5). Im Längsschnitt durch einen solchen Samen, von Sciadopitys, sind

bereits ergrünte Kotyledonen sichtbar (Abb. 18 B, Detail). Ab Ende der sechsten Woche

nach Aussaat ist ein Teil des Hypokotyls an der Substratoberfläche erkennbar

(Abb. 18 C W 6-7). Durch Streckung des Hypokotyls (siebte Woche) wird der Same

mitsamt den Kotyledonen an die Oberfläche des Substrats (Abb. 18 C-D) gehoben. Die

Kotyledonen verbleiben hier bis ca. zum Ende der siebten Woche im Samen (Abb. 19 A).

Ab Ende der achten Woche nach Aussaat hat die Mehrzahl der Sciadopitys-Keimlinge

jeweils beide Kotyledonen vollständig entfaltet (Abb. 18 E-F). Die jungen Keimpflanzen

sind im 2-Blatt-Stadium ca. 5 cm groß (Abb. 18 F). Im Längsschnitt durch den in Aufsicht

noch nicht sichtbaren Bereich des Vegetationskegels (vergleiche Abb. 21 A) sind in der

neunten/zehnten Woche die zwei ersten (und in diesem Falle einzigen) jungen

Primordien der Primärblätter zu erkennen (Abb. 21 E & Abb. 36 A).

Bei sechs Monaten alten, ca. 12 cm großen Sämlingen (K2) ist eine von grünen

Schuppenblättern eingehüllte, terminale Knospe sichtbar. Außerdem sind zusätzlich zu

den Kotyledonen die zwei vollständig entwickelten Primärblätter zu erkennen, die in den

Lücken zwischen den Kotyledonen (4-Blatt-Stadium, Abb. 20 A-D) stehen. In einem

medianen Längsschnitt durch den Knospenbereich eines 4-Blatt-Stadiums (Abb. 21 B-C)

sind am Vegetationskegel die Primordien der ersten Kladodien erkennbar. Jedes

Kladodium inseriert jeweils in der Achsel eines eigenen Tragblattes. Nach ca. einem Jahr

ist mit Ausbildung der ersten beiden achselständigen Kladodien ein 4+2-Stadium

(Abb. 20 E) erreicht. Die jungen Kladodien sind anhand einer deutlich ausgebildeten

Doppelspitze (Abb. 20 F, Pfeil) und einer erkennbaren Längsfurche (Abb. 20 G) gut von

den Keim- und Primärblättern unterscheidbar. Als Tragblätter der jungen Kladodien sind

kleine grüne, schuppenförmige Blätter sichtbar (Abb. 20 D).

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ERGEBNISSE 56

Abb. 18: Keimungsreihe I: Fotodokumentation der Keimungsreihe K4. A: Same zum Zeitpunkt der Aussaat W0 (Detail), mit im Längsschnitt erkennbarem reifen Embryo (Em). B: keimender Same der Woche 5 nach Aussaat (W5), unterirdisches Stadium mit auswachsender Radicula (Ra) und ergrünten Kotyledonen (Ko, Detail). C-D: Stadium der Wochen 6/7 (C) und 8 (D), Streckungswachstum des Hypokotyls (Hy) hebt Same und Kotyledonen an die Substratoberfläche (gestrichelte Linie). E-F: junger ca. 5 cm großer Keimling (F), 2-Blatt-Stadium, zum Ende der 8. Woche (W8); Entfaltung der Kotyledonen, Endosperm (En); Embryosack (Es); Hilum (Hi); Suspensor (Su); Testa (T); Wurzelhals (Wh), Primärwurzel (pW).

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ERGEBNISSE 57

Abb. 19: Keimungsreihe II: Schema & Lichtmikroskopische Aufnahmen (K4). A: Schematische Darstellung der ersten zehn Wochen (W1-10) der Samenkeimung. B & D: Längsschnitte (MIA) durch Same aus W1 (B) und W5 (D) nach Aussaat, Samenschale entfernt; reifer Embryo (Em) umgeben von Embryosack (Es) und Nährgewebe (primäres Endosperm, En), mit jungem Scheitelmeristem (SAM)/Vegetationskegel (Vk) an der Basis der jungen Kotyledonen (Ko), Hypokotyl (Hy), Radicula (Ra) und Suspensor (Su). C & E: Detail des Scheitelmeristems in W1(C) bzw. Vegetationskegels (E) in W5, um 180 °gedreht.

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ERGEBNISSE 58

Abb. 20 : Keimungsreihe III: Fotodokumentation ältere Keimlinge aus K2. A: sechs Monate alter, ca. 12 cm großer Keimling, 4-Blatt-Stadium; in Aufsicht (Detail) mit terminal sichtbarer Knospe umgeben von zwei Primärblättern (P/2) in den Lücken der zwei Kotyledonen (Ko/1). B-D: terminaler Bereich eines ca. zehn Monaten alten Keimlings, mit erstem achselständigen Kladodium (K) in der Achsel eines grünen schuppenförmigen Tragblattes (D; Knospenschuppe, Ks), Primärblattbasis (C: Detail) ohne Tragblatt. E: ca. 12 Monate alter Keimling nach Ausbildung der ersten beiden Kladodien (K/3); Aufsicht auf 4+2-Stadium mit 4 Blättern (2 Kotyledonen/1 & 2 Primärblätter/2) + 2 Kladodien/3. F: ca. 14 Monate alter Keimling mit drittem, achselständigen Kladodium, Kladodien zeigen deutlich ausgeprägte Doppelspitze (Pfeil) und Längsfurche. G: Aufsicht auf Unterseite des jüngsten Kladodiums mit Stomata und beginnender Längsfurche (Pfeil) mit papillösen Erhebungen der Cuticula.

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ERGEBNISSE 59

Abb. 21: Mikroskopische Aufnahmen zur Anlage der Primordien am Vegetationskegel. A-C: 4-Blattstadium (K2). A: Fluoreszenzaufnahme von lateral mit Aufsicht auf Knospenschuppen (Ks) im Bereich der terminalen Knospe; Primärblätter (P) und ein Kotyledon (Ko) entfernt (*). B: Frischmaterial aus A im medianen Längsschnitt (Hellfeld-Durchlicht/MIA) durch Vegetationskegel (Vk); Schnittebene parallel zu Kotyledonen; junge Primordien der ersten beiden Kladodien (Kp) erkennbar. C: Bereich der terminalen Knospe eines ca. einjährigen Keimlings im Querschnitt, Stadium zeigt junge, in Achseln der Knospenschuppen verborgene Kladodienprimordien. D: Schema eines Keimlings mit erstem ausgewachsenen Kladodium. E: W10-Keimling zeigt Vegetationskegel mit einem Primärblatt-Primordium; Schnittebene senkrecht zur Ansatzstelle der Kotyledonen geführt.

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ERGEBNISSE 60

3.2 Primerdesign

Die aufgeführten Gensequenzen für Knox Klasse 1-Gene stammen aus der

Sequenzrecherche in der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ausgewählt

wurden die kodierenden Sequenzen verschiedener Gymnospermen und Angiospermen,

von letzteren sowohl Dikotylen-, als auch Monokotylen-Vertreter. Das mit VectorNTI

(INVITROGEN) erstellte Alignment für Knox-Gene der Klasse 1 (Abb. 22) diente als Vorlage

für die Gestaltung verschiedener degenerierter Primer für eine Klasse 1-spezifische

Sequenz. Für eine bessere Eruierung der Klasse 1 wurden auch ausgewählte Klasse 2

Vertreter mit in das Alignment einbezogen (siehe Anhang A1). Ausschlaggebend für die

Wahl der betreffenden Sequenzabschnitte war neben einem hohen Konservierungsgrad

der Aminosäurensequenz eine möglichst niedrige Degeneration auf Nukleotidebene. Die

degenerierten Primer (Tab. 7) wurden für die Identifizierung gesuchter Knox-Sequenzen

bzw. für das Auffinden ihrer Sequenzmotive eingesetzt. Die spezifischen Primer (Tab. 7)

wurden aus der primären Nukleotidsequenz des jeweiligen Gens abgeleitet und zur

Überprüfung der Methodik herangezogen (z. B. über KNAT1, PhyN1). In Kombination mit

degenerierten Primern dienten sie der Erweiterung einer neu gefundenen Gensequenz

(z. B. SvKNOX).

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ERGEBNISSE 61

Tab. 7: Sequenzübersicht verwendeter Primer.

I Verwendete Primer für Arabidopsis thaliana, KNAT1.

Primer Basensequenz AS-Sequenz

Knat1 for, EcoRI

Knat1 rev, KpnI

5’– GGAATTCCATGGAAGAATACCAGC –3’

5’– GGGGTACCCCTTATGGACCGAGACG -3’

MEEYQH

RLGP *

II Verwendete Primer für Picea abies, HBK1.

Primer Basensequenz AS-Sequenz

PaHbk1 for XhoI/Kpn1

PaHbK1rev, NotI/SacI

5’- CCTCGAGGGTACCCATGGAGCACCTGAATGCAG -3’

5’- GCGGCCGCGAGCTCGTTAGCAATCCAAATGATAGCC –3’

MEHLNA(A)

GYHLDC *

III Verwendete Primer für Sciadopitys verticillata, SvKnox

Primer Basensequenz AS-Sequenz

PhyN1 for, EcoRI/KpnI

PhyN1 rev, SacI

dP-SvKnox for1

dP-SvKnox for2

dP-SvKnox rev1

dP-SvKnox rev2

SvSondeKnox for1 SacI

SvSondeKnox for2 HindIII

SvSondeKnox rev1 SacI

SvSondeKnox rev2 HindIII

SvGSTfor, EcoRI

SvGSTrev XhoI

5’–CGAATTGGGTACCGATGATCATGGGGAGGTGAT –3’

5’–GCTGGAGCTCGATGTTGGGCTTCTGAGTGA –3’

5’- CCRGARYTMGAYCARTTYATGGARGCWTAC –3’

5’- AAGAARAARAAGAAAGGDAARCTYCC –3’

5’- GGRAGYTTHCCTTTCTTYTTYTTCTT –3’

5’- ATRAACCAATTRTTKATTTGYTTYTGATCYARCCC–3’

5’–CCGAGCTCGAAGATTGCAGCACTGGTGAA –3’

5’–CTCAAGCTTAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTTC –3’

5’–CCGAGCTCAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTTC –3’

5’–CTAAGCTTGAAGATTGCAGCACTGGTGAA –3’

5’–CAGTGAATTCCCGGAGTTAGATCAATTTATGGA –3’

5’–GCCCTCGAGAAGTTTACCTTTCTTTTTCTTCTT –3’

DDHGEV(I)

(V)TQKPNI

PELDQFMEAY

KKKKKGKL(P)

KKKKKGKL(P)

GLDQKQINNWF

EDCSTGE(M)

KKKKKGKL

KKKKKGKL

EDCSTGE(M)

PELDQFM

KKKKKGKL

- unterstrichen sind Klonierungssequenzen (linker); Restirktionsenzyme

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ERGEBNISSE 62

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ERGEBNISSE 63

3.3 Vorwort zur Methodenetablierung

Alle molekularbiologischen Arbeiten wurden im Zuge einer Methodenetablierung

erstmalig am Lehrstuhl durchgeführt. Der Focus lag hierbei speziell auf der Suche nach

Knox-Sequenzen in der Gymnosperme S. verticillata und deren Einsatz (Antisense-

mRNA-Sonde, vergleiche 3.4.4) in einer in-situ-Hybridisierung, sowie der Etablierung

eines in-situ-Hybridisierungs-Protokolls für Gymnospermen (siehe 3.5.1). Für Teilarbeiten

(z. B. S1-Arbeiten) wurde in ein anderes Labor/eine andere Arbeitsgruppe ausgewichen.

In Hinblick auf die Tatsache, dass Informationen zu Klasse 1 Knox-Genen für Sciadopitys

gänzlich fehlen, wurden die molekularen Vorarbeiten relativ weit ausgedehnt. Zum

besseren Verständnis einzelner Durchführungsschritte werden die Ergebnisse der

molekularen (Vor-)Arbeiten eher untypisch detailliert beschrieben. Darüber hinaus wird

die Diskussion bestimmter Details vorgezogen und erfolgt innerhalb dieses Kapitels

direkt zusammen mit der Ergebnispräsentation. Eine abschließende, allgemeinere

Diskussion aller molekularen Arbeiten folgt im Kapitel Diskussion und ist dort

entsprechend kürzer.

3.3.1 Nukleinsäuregewinnung aus Gymnospermen

Zur Extraktion von Nukleinsäuren wurde der verwendete Mörser nach DOULIS

et al. (2000) mit einer 2 %igen SDS-Lösung gespült, mit Chloroform behandelt und

anschließend mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt. Frisch gesammeltes Pflanzenmaterial

wurde unter Zugabe von flüssigem Stickstoff fein gemörsert. Alternativ zum

Frischmaterial wurde tiefgekühltes (-80 °C schockgefrorenes) Material eingesetzt. Das

Verfahren zur Isolierung der Gesamt-RNA wurde, wie unter 2.3.3 beschrieben, in zwei

Ansätzen mit beiden Kit-eigenen Aufschlusspuffern (RLC & RLT von QIAGEN, Tab. 6)

durchgeführt. RLT besitzt laut Hersteller durch den Gehalt von Guanidinisothiocyanat

(GITC) bessere Zellzerstörungs- und Denaturierungseigenschaften. In Abhängigkeit vom

Gehalt an Sekundärmetaboliten (z. B. milchiges Endosperm) im Gewebe kann GITC

allerdings ausfallen und negativen Einfluss auf die Extraktion der RNA haben bzw. diese

mitunter unmöglich machen. Bei Einsatz von an Sekundärmetaboliten reichem Gewebe

wird daher der Einsatz von RLC-Puffer, mit Guanidinhydrochlorid, empfohlen. Für eine

verbesserte Homogenisierung des Gewebes wurde beim Aufschluss zusätzlich zum

Vortexen bei Bedarf mit einem Einweg-Minipistill gearbeitet (vergleiche DOULIS et al.,

2000).

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ERGEBNISSE 64

3.3.2 KNAT1 – Arabidopsis thaliana

Das KNAT1-Gen (knotted-like from Arabidopsis thaliana: U14175), auch

BREVIPEDICELLUS (BP1) genannt, kodiert für einen Transkriptionsfaktor, der eine

Homöodomäne besitzt, die denen der Klasse 1-kodierten Homöodomänen in Zea mays

sehr ähnlich ist. In der pflanzlichen Entwicklung ist das Vorkommen von KNAT1-

Transkripten, wie bei Kn1, hauptsächlich auf den Bereich des Sprossscheitels (SAM)

beschränkt und ist in der Anlageregion neuer Blattprimordien herunterreguliert. KNAT1

(wie auch KNAT2) übernimmt als Klasse 1 (Kn1–like Homöobox) Gen eine wichtige

Aufgabe in der Morphogenese. Die Zugehörigkeit zur Klasse 1 basiert auf Ähnlichkeiten

in der Sequenz und im Expressionsmuster von KNAT1 mit Klasse 1 Genen aus Z. mays

(LINCOLN et al., 1994).

Als Angiospermen-Vertreter mit komplett sequenziertem Genom diente A. thaliana in

dieser Arbeit als Modellorganismus für die ersten molekulargenetischen Ansätze.

Aufgrund fehlender, für die Isolierung von Nukleinsäuren störender Sekundärmetaboliten

wie z. B. Milchsaft, war von einem guten Aufschlussverhalten auszugehen. Arabidopsis

war für einen ersten Gewebsaufschluss, Isolierungsansatz und Primertest besonders

geeignet. Bei der Isolierung von Gesamt-RNA aus Grundblattrosetten von A. thaliana

lieferten die beiden Puffer, RLT und RLC, nahezu identische Extraktionsergebnisse und

zeigten keine gravierenden Unterschiede für das Extraktionsverhalten des eingesetzten

Gewebes. Die Reverse Transkription der Gesamt-RNA in cDNA erfolgte wie unter 2.3.5

beschrieben, mit Kit-eigenen Oligo(dT)18-Primern (FERMENTAS). Die gesuchte

KNAT1-Sequenz wurde über eine Zweitstrangsynthese mittels PCR (siehe 2.3.6) unter

Verwendung des KNAT1-spezifischen Sense-Primers Knat1 for und Antisense-Primers

Knat1 rev isoliert. Die Gen-spezifischen Primer wurden für den Bereich der 5’- und

3’-Enden des betreffenden KNAT1-Gens gewählt und mit dem Einbau einer EcoRI/KpnI-

Schnittstelle für die Restriktion versehen (Abb. 23 A). Die PCR wurde mit einem initialen

Denaturierungsschritt bei 94 °C, 2 min. gestartet, gefolgt von fünf weiteren Zyklen

bestehend aus einer Denaturierung bei 94 °C, 30 sec., Annealing bei 45 °C, 30 sec. und

einer 3 min. Elongation bei 72 °C. Daran schlossen sich 25 weitere Zyklen mit

Denaturierung bei 94 °C, 30 sec., einem Annealing bei 42 °C, 30 sec., sowie einer finalen

Elongation bei 72 °C für 3 min. und 72 °C für 10 min an. Verwendet wurde eine

Pwo-Polymerase (500 bp/min, PEQLAB).

Das amplifizierte, doppelsträngige cDNA Fragment (ds cDNA) entsprach mit einer Länge

von ca. 1200 bp (Abb. 23 B) den aus der Wahl der Primer abgeleiteten 1198 bp. Das

geleluierte (vergleiche 2.3.8) Produkt wurde EcoRI/KpnI-geschnitten (2.3.12), in einen

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ERGEBNISSE 65

Vektor pBlueskript SK+ (2.96 kb, STRATAGENE) ligiert (2.3.9) und in kompetente

TOP10 Zellen (INVITROGEN, Tab. 5) transformiert. Die Blau/Weiß-selektierten (2.3.9),

positiven Klone (insgesamt ca. 1/10 der Bakterienkolonien/Platte) wurden wie in 2.3.11

beschrieben präpariert und in einer Restriktionskontrolle mit EcoRI/KpnI geschnitten.

Anschließend wurden acht Klone über ein 1 %iges Agarosegel (vergleiche 2.3.7) auf den

richtigen Insert-Einbau hin überprüft (Abb. 23 C) und jeweils die Hälfte jedes

Restriktionsansatzes aufgetragen.

Das Ergebnis der Restriktion zeigte die erwarteten Fragmentgrößen von jeweils ca.

3000 bp für die 2960 bp großen Vektorfragmente und ca. 1200 bp für die

Insertfragmente. Von den vier erhaltenen Klonierungsfragmenten richtiger Größe (Nr. 3,

4, 6 & 8) wurde das aus Klon Nr. 3 verwendet, um die degenerierten Primer für die Knox-

Suche anhand von KNAT1 aus A. thaliana zu überprüfen.

Abb. 23: A. thaliana, cDNA-Synthese von KNAT1 & Klonierungskontrolle durch Restriktion. A: Schematische Darstellung des mit den spezifischen Primern Knat1 for/Knat1 rev zu erwartenden, 1198 bp großen KNAT1-Fragments; Primersequenz inkl. EcoRI bzw. KpnI Restriktionsschnittstelle. B: Reverser Ansatz; 1200 bp großes Fragment ds cDNA aus Zweitstrangsynthese mit Knat1 for/rev und Pwo-Polymerase im 1 %igen Agarosegel (5 µl PCR-Produkt+DNA-Probenpuffer+5 µl Marker (GeneRuler). C: Restriktionskontrolle für Insert. Überprüfung auf Einbau des Inserts aus B anhand von acht pBlueskript SK+ (2.96 kb) liegierten, Blau/Weiß-selektierten, positiven Klonen; vier (Nr. 3, 4, 6 & 8) der insgesamt acht untersuchten Klone zeigten eine 1200 bp große Bande als Insert. Weitergearbeitet wurde mit Klon Nr. 3.

B C

A

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ERGEBNISSE 66

Zur Überprüfung der aus dem Alignment für Knox (Abb. 22) abgeleiteten Primer wurden

0,5 µl der 1:20 verdünnten Plasmid-DNA (10 ng) von Klon 3 mit Taq-Polymerase in einer

PCR (94 °C, 2 min.; 30 Zyklen: 94 °C, 30 sec; 50 °C, 30 sec., 72 °C, 1 min. und 72 °C, 10

min.) eingesetzt. Durch unterschiedliche Kombinationen der verwendeten degenerierten

dP-SvKnox-Primer mit KNAT1-spezifischen Primer (Tab. 7, Abb. 24) wurde überprüft, ob

die Amplifikation verschiedener Teilfragmente der KNAT1-Sequenz möglich ist. Als

Sense-Primer wurden der KNAT1-spezifische Primer Knat1 for und die degenerierten

Primer dP-SvKnox for1 und for2 verwendet. Als Antisense-Primer kamen die

degenerierten Primer dP-SvKnox rev1 und rev2 sowie der spezifische Primer Knat1 rev2

zum Einsatz. Die im Gel sichtbaren Banden 1-8 (vgl. Abb. 23 A-B). entsprachen den

Erwartungen: Im Vergleich mit dem Markerbanden (bekannter Größe) ist Fragment 1 ca.

1200 bp groß (erwartet waren 1198 bp), Bande 2 liegt zwischen 900 und 1031 bp

(erwartet waren 1026 bp), Bande 3 liegt bei ca. 1031 bp (1058 bp), Bande 4 liegt bei ca.

650 bp (624 bp), Bande 5 liegt bei 300 bp (297 bp), Bande 6 liegt bei ca. 350 bp

(347 bp), Bande 7 liegt bei 500 bp (485 bp) und Bande 8 liegt bei ca. 150 bp (157 bp).

Über die Vorversuche mit A. thaliana konnte daher die Funktionalität der degenerierten

Primer über den Einsatz der erfolgreich synthetisierten cDNA und eine gelungene

Amplifikation bestätigt werden.

Abb. 24: A. thaliana, Primertest mit KNAT1-Fragment. Kombinationen aus acht verschiedenen Paarungen KNAT1-spezifischer und degenerierter Primer dP-SvKnox für die Suche nach Knox-Genen (Tab. 7): 1) Knat1 for/Knat1 rev; 2) Knat1 for/dP-SvKnox rev1; 3) Knat for/dP-SvKnox rev2; 4) dP-SvKnox for1/Knat1 rev; 5) dP-SvKnox for2/Knat1 rev; 6) dP-SvKnox for1/rev1; 7) dP-SvKnox for1/rev2; 8) dP-SvKnox for2/rev2; die Fragmentgrößen 1-8 im Gel (links) entsprechen den je nach Primerkombination theoretisch zu erwartenden Größen (bp in rot) der zugehörigen KNAT1-Fragmentstücke. 1 %iges Agarosegel: aufgetragen sind PCR-Produkte (5 µl + DNA-Probenpuffer) und Marker (M: 5 µl GeneRuler); Amplifikation mit Taq-Polymerase.

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ERGEBNISSE 67

3.3.3 HBK1 – Picea abies

Das in P. abies gefundene HBK1-Gen homeobox of KNOX class) wurde von

SUNDÅS-LARSSON et al. (1998) anhand phylogenetischer Analysen als Mitglied der Knox

Klasse 1 beschrieben (AF063248/komplette mRNA). HBK1 stimmt, verglichen mit

Knox-Genen (Klasse 1) aus verschiedenen Angiospermen, in Aufbau und

Aminosäurensequenz des Proteins sowie in Expressionsmuster (vgl. Kn1 aus Z. mays)

und Funktion (Kontrolle der Zelldifferenzierung im Scheitelmeristem) überein. P. abies

steht im Folgenden als Referenz für Untersuchungen zum Vorkommen von Klasse 1

Knox-Genen in Gymnospermen. HBK1 ist das erste für P. abies beschriebene Gen der

Klasse 1 (SUNDÅS-LARSSON et al., 1998).

Im Folgenden wurde aus Nadeln oder vegetativen Knospen von P. abies Gesamt-RNA

isoliert. Das Gewebe wurde auch in diesem Fall mit RLC- und RLT-Puffer aufgeschlossen

(siehe 2.3.3). Aufgrund des für viele Gymnospermen typisch hohen Harzgehaltes, wurde

bei P. abies der RLC-Ansatz weiterverwendet. Die RNA-Ausbeute des RLC-Ansatzes war

besser, als die nach Aufschluss mit RLT, allerdings waren die Unterschiede wider

Erwarten nicht gravierend (Daten nicht gezeigt). Die Erststrangsynthese des Reversen

Ansatzes (2.3.5) erfolgte mit Oligo(dT)18-Primern des verwendeten FERMENTAS-Kits

(Tab. 6), die Zweitstrangsynthese mit den vier degenerierten Primern dP-SvKnox for1/2

und dP-SvKnox rev1/2 (Tab. 7). Die Basenfolge der beiden Sense-Primer dP-SvKnox for

und der beiden Antisense-Primer dP-SvKnox rev wurden aus dem Alignment für Klasse 1

Knox-Gene abgeleitet (Abb. 22). Dieser Ansatz diente zur Überprüfung der Funktionalität

der degenerierten Primer in Bezug auf ihre funktionelle Übertragbarkeit auf

Gymnospermen bzw. die Amplifikation ihrer Klasse 1-spezifischen Sequenzabschnitte.

Die Zweitstrangsynthese erfolgte mit Taq-Polymerase in 30 Zyklen. Denaturiert wurde bei

95 °C, 1 min. und 95 °C, 30 sec. Das Annealing fand bei 50 °C, 30 sec., die

anschließende Elongation bei 72 °C, 1 min. und 72 °C, 10 min. statt. Für die

Amplifizierungsversuche von Teilfragmenten des HBK1-Gens, aus P. abies, wurden in

drei PCR-Ansätzen jeweils einmal dP-SvKnox for1/rev1, dP-SvKnox for2/rev2, sowie

dP-SvKnox for1/ rev2 miteinander kombiniert (Abb. 25).

Nur Primerpaar dP-SvKnox for1/rev1 lieferte ein erwartungsgemäßes Ergebnis (359 bp)

mit einer im Original-Gel nur sehr schwach sichtbaren Bande zwischen 300 und 400 bp

(Ergebnis nicht gezeigt). Die aus den anderen beiden Primerpaarungen erwarteten

Fragmente (158 bp und 491 bp) konnten nicht amplifiziert werden. Die Funktionalität der

getesteten degenerierten Primer konnte über den kombinierten Einsatz mit dem

Gymnospermen-Knox-Gen HBK1 für dP-SvKnoxfor1/rev1 erfolgreich überprüft werden.

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ERGEBNISSE 68

Das ca. 360 bp große Teilfragment der erfolgreichen Kombination (Abb. 25) wurde

geleluiert (2.3.8), anschließend in einen 3,9 kb großen pCRII-TOPO Vektor (INVITROGEN)

ligiert und in kompetente E. coli-Zellen (TOP TEN, INVITROGEN) transformiert (2.3.9). Der

für die TA-Klonierung erforderliche A-Überhang („sticky end“) stammt aus der

Zweitstrangsynthese mit Taq-Polymerase (s. o.). Von den im Anschluss selektierten

(Blau/Weiß, vergleiche 2.3.9) Transformanten mit Insert (positiven Klonen) wurden sieben

ausgewählt. Die isolierten Plasmide der sieben Klone wurden in einem Restriktionsansatz

EcoRI-verdaut (vergleiche 2.3.12) und die Hälfte des Ansatzes durch Gelelektrophorese

(2.3.8) aufgetrennt. Das 1 %ige Agarosegel zur Prüfung des eingebauten Inserts

(Abb. 26), zeigte den Vektorbanden entsprechende Fragmente bei 4000 bp (Artefakt für

Klon 5 & 6) und ca. 400 bp große Inserts für Klone Nr. 1 und 3.

Abb. 26: P. abies, Restriktionskontrolle für 359 bp-Insert. Überprüfung auf Einbau des Inserts anhand der pCRII-TOPO (3,9 kb) liegierten, Blau/Weiß-selektierten, positiven Klonen. Aufgetragen wurden sieben EcoRI/KpnI-geschnittene Ansätze (je ½ Restriktionsansatz der Klone 1-7) auf 1 %iges Agarosegel mit 5 µl Marker und DNA-Probenpuffer; Gelausschnitt mit den zwei Insert-tragenden Klonen 1 und 3 (Klon Nr. 2 ohne Insert). Banden der Insertfragmente liegen im Bereich von ca. 400 bp; nicht gezeigte Klone waren ohne Insert.

Abb. 25: P. abies, Schema zum Primertest für dP-SvKnox und HBK1-Teilsequenz. Darstellung dertheoretisch zu erwartenden Größe von Teilfragmenten/dsDNA aus drei verschiedenen Paarungen von degenerierten dP-SvKnox-Primern für die HBK1-Sequenz (AF063248). dP-SvKnox for und dP-SvKnox rev sind aus Alignment abgeleitet.

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ERGEBNISSE 69

3.4 Molekulargenetische Ansätze im Sciadopitys-Modell

3.4.1 Funktionalitätstest mit PhyN1

Für S. verticillata wurde ein erster Ansatz mit einer bekannten, Sciadopitys-spezifischen

Sequenz durchgeführt. Verwendet wurde eine 579 bp lange Teilsequenz (genomische

DNA: AJ286657) des Phytochrom-Proteins PHYN1. Im Allgemeinen kommen bei

Gymnospermen zwei bis vier Phytochrom-Typen vor. Phytochrome sind kernkodierte

Proteine, die zu den pflanzlichen Photorezeptoren gezählt werden. Neben den sonst

üblichen Chloroplasten-, Mitochondrien- und rRNA-Genen werden auch Phytochrom–

Sequenzen für Stammbaumanalysen zur Phylogenie der Gymnospermen herangezogen

(SCHMIDT & SCHNEIDER-POETSCH, 2002). Anhand der bekannten PhyN1-Sequenz wurden

die spezifischen Primer PhyN1 for und PhyN1 rev (Tab. 7) erstellt.

Die Primer PhyN1 for/PhyN1 rev wurden auf ihre Funktion als Kontrollprimer überprüft.

Für diese Überprüfung wurde aus männlichen Zapfen isolierte, genomische DNA

verwendet. Die Isolierung (2.3.3) erfolgte mit dem DNeasy Mini Kit von QIAGEN (Tab. 6)

nach Herstellerangaben und zusätzlich optimiert nach DOULIS et al. (2000). Für den

PCR-Ansatz wurde Taq-Polymerase verwendet. Das PCR-Programm bestand aus einer

ersten Denaturierung bei 94 °C 2 min. gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung bei 94 °C

30 sec., Annealing bei 50 °C 30 sec. und einer Elongation bei 72 °C 1 min. und 72 °C

10 min..

Das im 1 % igen Agarosegel (Abb. 27 A) elektrophoretisch aufgetrennte (siehe 2.3.7),

ca. 600 bp große Fragment entsprach den aus der Primerwahl abgeleiteten 579 bp für

die PhyN1-Teilsequenz. Das Ergebnis zeigte, dass die gewählten Primer sich als

spezifische Referenz für Sciadopitys eignen.

Abb. 27: S. verticillata, Primertest mit PhyN1-Fragment(579 bp) & Kontrolle der cDNA-Synthese. A: ca. 600 bp großes PCR-Produkt aus Ansatz mit genomischer DNA als Template, PhyN1- spezifischen Primern PhyN1 for/rev und Taq- Polymerase im 1 %igen Agarose-Gel (5 µl PCR-Produkt + DNA-Probenpuffer + 5 µl Marker (GeneRuler, 2.3.2)); B: Reverser Ansatz, ca. 600 bp großes cDNA-Fragment aus Zweit-strangsynthese mit PhyN1 for/rev und Pwo-Polymerase im 1 % igen Agarosegel (5 µl PCR-Produkt + DNA-Proben-puffer+5 µl Marker (GeneRuler, 2.3.2)).

A

B

B

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ERGEBNISSE 70

3.4.2 Test zur Synthese von cDNA

In einem zweiten Ansatz wurde Gesamt-RNA aus einem einjährigen Sciadopitys-Keimling

isoliert (vergleiche 2.3.3) und in einem Reversen Ansatz für die Synthese der

entsprechenden cDNA (2.3.5) eingesetzt. Bei der RNA-Isolierung aus verschiedenen

Gewebetypen lieferte vorwiegend der RLT-Ansatz die besseren RNA-Ausbeuten. Daher

wurde entgegen der Herstellerempfehlung (zu RLC für Sekundärmetaboliten-reiches

Gewebe) bei Sciadopitys der RLT-Aufschlusspuffer verwendet. Die beiden Synthese-

schritte des Reversen Ansatzes erfolgten wie für P. abies (siehe 3.3.3: HBK1 mit dP-

SvKnox) beschrieben. Für die Zweitstrangsynthese wurden die getesteten PhyN1-

spezifischen Primer aus 3.4.1 erneut eingesetzt. Dieser Ansatz hatte zum Ziel den

Reversen Ansatz und damit die Qualität der resultierenden cDNA bzw. des Templates zu

überprüfen. Das im Gel sichtbare Fragment war ca. 600 bp groß (Abb. 27 B). Das

Resultat des Template-Tests zeigte, dass die eingesetzte RNA und der Reverse Ansatz

auch auf Sciadopitys mit Erfolg anwendbar waren.

3.4.3 SvKnox - Suche nach Knox-Genen mit degenerierten Primern

Im Folgenden wurde der anhand einer bekannten Gensequenz auf Funktionalität

getestete Verfahrensansatz auch für das Auffinden einer unbekannten Sequenz unter

Verwendung degenerierter Primer angewendet. Für die Suche nach Klasse 1

Knox-Genen in Sciadopitys, wurde der bei P. abies getestete Ansatz (siehe 3.4.1) mit

den degenerierten Primer dP-SvKnox wiederholt. Die HBK1-getesteten degenerierten

Primer wurden im Folgenden auf die noch unbekannte Gensequenz von Sciadopitys

angewendet. Die jeweils aus den Sequenzvergleichen für Klasse 1 Knox-Gene

konstruierten Primer dP-SvKnox for1/for2, sowie dP-SvKnox rev1/rev2 wurden für die

Suche nach der Existenz eines Knox Klasse 1-ähnlichen Motivs in Sciadopitys

eingesetzt. Kombiniert wurden dP-SvKnox for1/rev1 bzw. rev2, sowie dP-

SvKnox for2/rev2. Die Primer dP-SvKnox for2/rev1 kodieren für dieselbe Aminosäuren-

sequenz, sind jedoch einmal für die Basensequenz in 5’/3’-Richtung (for2) und einmal in

die Gegenrichtung (rev1) konstruiert (Tab. 7).

Die Isolierung von Gesamt-RNA aus jungen Zapfen erfolgte mit RLT-Puffer (vgl. PhyN1-

Ansatz). Der Reverse Ansatz war identisch mit dem Picea-Ansatz, daher stimmt auch die

Zweitstrangsynthese mit der in Kapitel 3.4.1 überein: PCR mit Taq-Polymerase und

Denaturierung bei 95 °C, 1 min, gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung bei 95 °C, 30 sec.;

Annealing bei 50 °C, 30 sec.; Elongation bei 72 °C, 1 min. und 72 °C, 10 min.. Im Gel

sind die Fragmente, entsprechend der aufgetragenen Kombinationen aus den

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ERGEBNISSE 71

dP-SvKnox-Primern, bei ca. 359 bp (for1/rev1), 158 bp (for2/rev2) und 491 bp (for1/rev2)

zu erwarten (vergleiche 3.3.3: Abb. 25). Das 1 %ige Agarosegel zeigt eine erfolgreiche

Amplifikation für dP-SvKnox for1/rev1 mit einer Bande zwischen 300 und 400 bp, die mit

den erwarteten 359 bp übereinstimmte (Abb. 28 A: for1/rev1). Die Gelelution des 359 bp

großen Fragments, die Ligation in den pCRII-TOPO Vektor (INVITROGEN), die

Transformation und die Kontrollrestriktion mit EcoRI erfolgten wie für P. abies (3.4.1).

Insgesamt wurden auch hier die eingebauten Fragmente sieben verschiedener Klone im

1 %igen Agarosegel auf Richtigkeit überprüft (Abb. 28 B). Aufgetragen wurden die Klone

in Reihenfolge 1 bis 7 von links nach rechts. Für alle aufgetragenen sieben positiven

Klone war jeweils ein eingebautes Fragmente im Größenbereich von ca. 400 bp

erkennbar.

Für die weitere Betrachtung wurden nur die Klone Nr. 5 und 7 mit besonders intensiver

Bande herangezogen. Es wurden Aliquots der jeweiligen Plasmidisolierungen

sequenziert. Die Sequenzierung (MWG) lieferte eine M13 Reverse- und

M13(-40)Forward-flankierte (vgl. pCRII-TOPO Vektor, INVITROGEN), 350 bp lange

Basensequenz für Klon Nr. 7 (Sequenzierung 1). Beim Umschreiben der Basensequenz

in die entsprechende Aminosäurensequenz, dienten die für die cDNA-Synthese

(Zweitstrang) eingesetzten Primer als Orientierung. Die in Abb. 29 A gezeigte

Teilsequenz von Sciadopitys umfasst den mit dP-SvKnox for1/rev1 ermittelten Bereich

Abb. 28: S. verticillata, cDNA-Synthese mit dP-SvKnox & Klonierungskontrolle. A: Reverser Ansatz mit degenerierten Primern dP-SvKnox. Von den aufgetragenen Primerkombinationen (vgl. Abb. 25) lieferte nur der erste Ansatz mit dP-SvKnox for1/rev1 ein ds cDNA-Fragment von ca. 300 bis 400 bp Länge; das entsprechend erwartete Teilfragment für PaHBK1 ist 359 bp groß. Im 1 %igen Agarose-Gel wurden 5 µl PCR-Produkt + DNA-Probenpuffer + 5 µl Marker (GeneRuler, 2.3.2) aufgetragen; PCR-Ansatz mit Taq-Polymerase. B: Restriktionskontrolle für Insert aus A. Überprüfung auf Einbau des Inserts anhand der pCRII-TOPO (4 kb) ligierten, Blau/Weiß-selektierten, positiven Klonen. Aufgetragen wurden sieben EcoRI/KpnI-geschnittene Ansätze (je ½ Restriktionsansatz der Klone 1-7) auf 1 %iges Agarosegel mit 5 µl Marker und DNA-Probenpuffer. Alle Klone zeigen ein Fragment von ca. 400 bp, Banden sind von unterschiedlicher Intensität.

A B

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ERGEBNISSE 72

PELDQFMEAY bis KKKKKGKL(P). In einem zweiten Ansatz wurde die Sequenz mit der

Primerpaarung SvSondeKnox for1/dP-SvKnox rev2 um 36 Aminosäuren (EDCSTGE(M)

bis GLDQKQINNW) erweitert (Sequenzierung 2, Abb. 29 A).

Sequenzerweiterung:

Die Ansätze für Sequenzierung 2 entsprachen der von Sequenzierung 1. Die

Erststrangsynthese erfolgte mit Oligo(dT)18-Primern unter Einsatz von RNA aus

vegetativen Knospen. Die Synthese der doppelsträngigen cDNA erfolgte mittels

SvSondeKnox for1, einem SvKnox-spezifischen Primer, und dP-SvKnox rev2, einem

degenerierten Primer mit Antisense-Orientierung. Die ds cDNA wurde über ein 2 %iges

Agarosegel aufgetrennt und das Fragment (ca. 110 bp), nach erfolgreicher

Restriktionskontrolle, sequenziert (MWG). Die 36 Aminosäuren umfassende Erweiterung

des Homöodomänenmotivs ist in Abb. 29 B abzulesen. Weitere Versuche zur

Verlängerung der Sequenz mit degenerierten Primern für den N- bzw. C-Terminus waren

nicht erfolgreich. Die terminalen Bereiche sind nur schwach konserviert (Abb. 22), so

dass jede Sciadopitys-spezifische Sequenzabweichung die Funktionalität, der aus dem

Sequenzvergleich hergeleiteten degenerierten Primer, in Frage stellt bzw. verhindert.

Ein direkter Vergleich der Aminosäurensequenzen von HBK1 und SvKNOX (Abb. 29), in

Kombination mit dem Alignment weiterer Homöodomänen-Proteinen verschiedener

Organismen (Abb. 22) unter gleichzeitiger Berücksichtigung der Basensequenz, zeigte,

dass die in Sciadopitys gefundene Teilsequenz für ein PaHBK1 ähnliches

(Homöodomänen-)Protein kodiert. Das betreffende Protein weist Bereiche auf, deren

Motive denen von KN1-Homöodomänen-Proteinen in Z. mays ähnlich sind. Der

N-terminale Bereich der Aminosäuren-Sequenz des Sciadopitys-Proteins von MKKKKK

bis QINNW ist eindeutig als hochkonservierter Bereich eines Homöodomänen-Proteins

deutbar (siehe Anhang, A2). Aus dem Sequenzvergleich mit dem Homöodomänen-

Bereich von HBK1 wird deutlich, dass die für alle KNOX-Proteine hochkonservierte

atypische, TALE-Homöodomäne, auch im N-terminalen Bereich der Sciadopitys-

Aminosäurensequenz zu finden ist. Die für die atypisch Homöodomänen-Gruppe

namensgebenden drei Aminosäuren PYP sind auch in der Sciadopitys-Sequenz zu

finden. PYP ist ein in allen KNOX-Proteinen hochkonservierter Bereich zwischen zwei von

drei α-Helix-Motiven (Helix I ca. 17 AS, N-terminal von PYP & Helix II ca. 12 AS C-terminal

von PYP). Der für die dritte Helix beschriebene Bereich von ca. 17 AS, nach dem so

genannten turn-Motiv (GLD), ist für Sciadopitys nicht vollständig. Insgesamt fehlt ca. 1/3

des C-Terminus der Homöodomäne. Die Aminosäurenfolge PEL bis NSL ist, mit

Ausnahme einzelner Aminosäuren, klar als C-terminales Motiv der KNOX-Domäne

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ERGEBNISSE 73

erkennbar. Die N-terminale Hälfte der KNOX-Domäne fehlt. Die für HBK1 beschriebene

Zuordnung zu den Klasse 1 Genen (SUNDÅS-LARSSON et al., 1998) kann auch für

Sciadopitys über zwei fehlende Aminosäuren (Valin-Arginin: eine für Klasse 2 Gene wie

KNAT3 & 4 typische Insertion) getroffen werden. Auch der konservierte Bereich der ELK-

Domäne ist charakteristischer Bestandteil der identifzierten Sequenz. Der zwischen

KNOX- und ELK-Domäne liegende Bereich der neuen Sequenz wird der GSE-Domäne

zugeordnet und ist in ca. der Hälfte der kodierenden Sequenz mit HBK1 identisch.

Das Sequenzierungsergebnis (Abb. 29 A) zeigte, dass sich die Kombination der

degenerierten Primer dP-SvKnox for1/rev1 und eine Kombination aus degenerierten und

spezifischen Primern (SvSondeKnox for1/dP-SvKnox rev2) eignen, um unbekannte

Sequenzen mit Knox-Charakter zu isolieren (Abb. 29 B). Eine Komplettierung der neu

gefundenen Knox-Sequenz um den 3’- und 5’-Bereich bzw. die im Vergleich mit HBK1

fehlenden Aminosäuren (Abb. 29 B), steht noch aus. Die mit insgesamt fünf weiteren

degenerierten Primern (Daten nicht gezeigt) durchgeführten Ansätze waren bisher ohne

Erfolg. Der Sequenzbereich aus Sequenzierung 1 diente als Vorlage zur Synthese

spezifischer Primer für die nachfolgende Herstellung des Sondentemplates. Die weitere

Vorgehensweise erfolgt daher unter dem Aspekt der Herstellung einer Antisense-

mRNA-Sonde (vergleiche 3.4.4) für die in-situ-Hybridsierung (siehe 3.5.2)

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ERGEBNISSE 74

Abb. 29: Schema der ermittelten Sciadopitys-Sequenz im Vergleich zur KNOX-Proteinsequenz von P. abies (HBK1). A: Darstellung der ermittelten Nukleotidsequenz und der daraus abgeleiteten Aminosäurenabfolge. B: Die aus P. abies hergeleitete Aminosäurensequenz (AF063248) wurde der in Sciadopitys gefundenen Teilsequenz, SvKNOX, gegenübergestellt; übereinstimmende Aminosäuren wurden gelb hinterlegt, abweichende, Sciadopitys-spezifische hellblau, die für HBK1 sind grau hinterlegt, charakteristische KNOX-Domänen sind durch farbige Rahmen gekennzeichnet; gezeigte Teilsequenz aus Kombination von zwei verschiedenen Sequenzierungsansätzen: 1) PELDQFMEAY…KKKKKGKL mit dP-SvKnox for/rev1; 2) EDCSTGE(M)… GLDQKQINNW) mit SvSondeKnox for1/dP-SvKnox rev2.

Pa HBK1 Sv KNOX identische AS

A

B

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ERGEBNISSE 75

3.4.4 Sondenherstellung für SvKnox

Für die Herstellung des Sondentemplates wurde eine Teilsequenz mit einem

hochkonservierten Abschnitt der ELK- und der Homöodomäne ausgewählt. Der Bereich

um die fehlende Klasse 2-typische Aminosäureninsertion (vgl. HBK1, SUNDÅS-LARSSON et

al., 1998) ist ebenfalls enthalten. Im Transkriptionsansatz mit T7-RNA-Polymerase

(vergleiche 2.3.14) wurden die Sciadopitys-spezifischen Sondenprimer

SvSondeKnox for1/rev2 (für EDCSTGE(M)) und SvSondeKnox for2/rev1 (für KKKKKGKL)

zur Herstellung eines ca. 150 bp langen DNA-Fragments verwendet. Für die

Sondenherstellung kann ein linearisierter Plasmidvektor inklusive des Inserts oder ein

PCR-generiertes Template (200 ng/µl) als Matritze dienen. Für die Herstellung der Sense-

und Antisense-mRNA-Sonden wurde jeweils ein linearisierter Plasmidvektor als Matritze

eingesetzt. Dafür wurde vorab in einer PCR (siehe 2.3.6 mit Annealing bei 50 °C, 30 sec.)

mit Pwo-Polymerase und den SvKnox-spezifischen Sondenprimern (Sense-Sonde:

SvSondeKnox for1/for2; Antisense-Sonde: SvSondeKnox rev1/rev2) der ausgewählte

cDNA-Bereich amplifiziert (Abb. 30, Spur1). Als Template dienten 0,5 µl einer 1:20-

Verdünnung der Plasmidisolierung von Klon Nr. 7 aus 3.4.3. Die Sondenprimer waren so

konstruiert (Tab. 7), dass das resultierende DNA-Fragment über den zusätzlich zur

150 bp Sondensequenz vorhanden Restriktionslinker/SacI/HindIII-geschnitten (Abb. 30,

Spur 2) in den pGEM-Vektor, hinter eine T7-Promotorsequenz, kloniert werden konnte.

Der leere pGEM-Vektor (PROMEGA) wurde vor der Klonierung des Inserts ebenfalls

SacI/HindIII-geschnitten (Abb. 30, Spur3). Die Matritze (Abb. 30, Spur 4) wurde über ein

2 %iges Agarosegel überprüft. Die Bande bei ~150 bp entspricht dem eingebauten

Insert bestehend aus der sondenspezifische cDNA-Sequenz (150 bp), die 3221 bp

große Bande entspricht dem Vektoranteil. Im Testgel wurde parallel zum Antisense-

Ansatz (Spur1*-4*) auch ein Ansatz für die Sense-mRNA-Sonde (Spur1-4) getestet.

Abb. 30: S. verticillata, Testgel zur Sonden-herstellung. 2%iges Agarosegel aufgetragen 5 µl Ansatz + DNA-Probenpuffer (OrangeG) + 5 µl DNA-Marker (GeneRuler). Spuren 1*-4*= Ansätze für Antisense-Sonde, 1-4= Ansätze für Sense-Sonde. 1/1*= Amplifikationsprodukt aus PCR mit Pwo-Polymerase, Sondenprimern SvSondeKnox for1/2 bzw. rev1/2 und 1:20 Verdünnung aus Plasmid-isolierung von Klon Nr. 7. 2/2*= SacI/HindIII-geschnittenes PCR-Produkt. 3/3*= SacI/HindIII-geschnittener pGEM-Vektor (3221 bp). 4/4*= pGEM (PROMEGA) + 150 bp Insert bzw. Sondentemplate (SacI/HindIII-geschnitten).

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ERGEBNISSE 76

Die hergestellte Antisense-mRNA-Sonde umfasst einen Bereich von 50 Aminosäuren und

ist entsprechend 150 bp lang. Aufgrund der gewählten Länge, die nach ZACHGO (2002)

im optimalen Bereich von 150-200 bp liegt, ist keine zusätzliche Sonden-Hydrolyse zur

Herstellung kleinerer Fragmente nötig. Die hergestellte Sonde sollte aufgrund ihrer Größe

gut in das Gewebe penetrieren können und keine unspezifisch starke

Hintergrundfärbung verursachen, wie z. B. zu lange Sonden. Die Sonde wurde mit dem

10x DIG Labeling Mix der Firma ROCHE nach Herstellerangaben mit DIG-UTPs markiert.

Durch ein Mischungsverhältnis von drei unmarkierten zu einem DIG-markierten Uracil

war jedes vierte Uracil (U) DIG-markiert. Die ausgewählte Sequenz enthält einen UTP-

Anteil von ca. 41 %. Die indirekte Markierung der DIG-UTPs erfolgte im Gewebe über

DIG-Antikörper (Alkalische Phosphatase-gebunden). Die nicht radioaktive

Markierungsvariante wurde aufgrund der unkomplizierteren Handhabung, besseren

Aufbewahrung bzw. längeren Lagerfähigkeit und möglichen Wiederverwendung gewählt.

Die Wahl fiel auf Digoxigenin, weil es als sensibler in Bezug auf die Detektion

beschrieben wird als z.B. Biotin (ZACHGO, 2002). Es wurden zwei parallele

in-vitro-Transkriptionen durchgeführt. In einem Ansatz mit DIG-UTPs wurden die

eigentliche Antisense-mRNA-Sonde und eine zusätzliche markierte Sense-mRNA-Sonde

hergestellt. Über den zweiten Transkriptionsansatz ohne DIG-UTPs wurden unmarkierte

Sense- und Antisense-mRNA-Sonden erstellt. Die zusätzlich zur DIG-Antisense-mRNA-

Sonde erstellten Sonden fungierten als Kontrollen.

Dot Blot

Da die richtige Sondenmenge für ein gutes Hybridisierungsergebnis essentiell ist, wurde

sie über das Dot Blot-Verfahren (siehe 2.3.14) quantifiziert und die unverdünnte

Antisense-mRNA-Sonde aufgrund des besten Detektionsergebnisses (Abb. 31 B) für die

Hybridisierung (siehe 3.5.2) ausgewählt.

Die Detektion (vergleiche 2.3.15.5) wurde mittels Substrat BCIP/NBT, in Tablettenform

(SIGMAFAST™ von SIGMA-ALDRICH), durchgeführt. Das Detektionsergebnis/Signal war

nach ca. 2 h sichtbar. Das Signal der Antisense-Sonde (300 µg/µl) war im Vergleich zu

einer unmarkierten Sense-mRNA-Sonde (Kontrolle 1: 1404 µg/µl) bzw. unmarkierten

Antisense-mRNA-Sonde (Kontrolle 2: 288 µg/µl) deutlich sichtbar. Im Vergleich mit einer

parallel getesteten markierten Sense-mRNA-Sonde (Kontrolle 3: 1008 µg/µl) war das

Signal, entsprechend des Konzentrationsunterschiedes, insgesamt schwächer

(verbesserte sich auch bei längerer Inkubation nicht deutlich). Die unverdünnten Sonden

lieferten die besten Signale. Die 1:10 Verdünnungen beider Ansätze waren sichtbar,

lieferten aber nur schwache Signale und wurden daher nicht weiterverwendet.

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ERGEBNISSE 77

Entsprechendes gilt für den 1:100 verdünnten Ansatz der markierten Sense-Sonde. Die

entsprechende Verdünnung der markierten Antisense-Sonde lieferte kein Signal. Die

Signale der 1:1000 Verdünnung blieben in beiden Fällen aus.

3.5 Expressionsnachweis für SvKnox

3.5.1 in-situ-Hybridisierung – methodisch

Als Vorlage für die Durchführung der in-situ-Hybrdisierung wurde das unter 2.3.15

aufgeführte „GLEISSBERG-Protokoll“ als Vorschrift verwendet. Die Hybridisierungs-

Vorschrift ist speziell an dikotyle Angiospermen (z. B. Papaveraceae, Fumariaceae)

angepasst. In dieser Arbeit wurden Samen (mit angeschnittener/entfernter

Samenschale), vegetative Knospen (mit verholzten Knospenschuppen) und Keimlinge

(Kotyledonen mit Wachsschicht) von Sciadopitys fixiert. Eigenschaften der hier

eingesetzten Gewebe, wie z. B. starke Wachsauflagerungen etc. machten Anpassungen

erforderlich. Das Ursprungs-Protokoll wurde daher abgewandelt, um die Methode

optimal auf Sciadopitys anzupassen. Die methodischen Abwandlungen und

Ablaufvarianten werden hier beschrieben und anhand des Methodenprotokolls für

in-situ-Hybridisierung nach ZACHGO (2002) diskutiert. Die Abwandlungen der unter 2.3.15

Abb. 31: S. verticillata, in-vitro-Transkription & Dot Blot. A: Schema zur eingesetzten DNA-Matritze; linearisierter Vektor inklusive des einklonierten DNA-Fragments mit Promotor für T7-RNA-Polymerase. B: Dot Blot; Quantifizierungsergebnis für DIG(UTP)-markierte Sense- und Antisense-mRNA-Sonde; Aufgetragen: je 1 µl unverdünnte Sonde (Sense: ca. 1000 µg/µl, Antisense ca. 300 µg/µl) und Verdünnungen im Verhältnis 1:10, 1:100 und 1:1000 (erkennbare Signale eingekreist), Detektion über AP-gekoppelte Anti-DIG-Antikörper und BCIP/NBT.

A

B

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ERGEBNISSE 78

beschriebenen Hybridisierung betrafen hauptsächlich die Fixierung (2.3.15.1), die

Proteinase K-Behandlung (Prähybridisierung, 2.3.15.2), die eingesetzte Sondenmenge

bzw. den Sondenmix (Hybridisierung, 2.3.15.3), die Färbelösung und die

Detektionsdauer (2.3.15.5).

3.5.1.1 Fixieren & Schneiden des Gewebes

Voraussetzung für eine erfolgreiche in-situ-Hybridisierung ist die Fixierung der RNA im zu

untersuchenden Gewebe. Wichtige Parameter sind hierbei die Wahl und die

Konzentration des Fixativs (Komponenten & Fixativ-spezifische Wechselwirkungen mit

dem Gewebe und der RNA), die Dauer der Fixierung und die Fixativmenge im Verhältnis

zur Probengröße. Bei der Objektpräparation des eingesetzten Pflanzenmaterials

(siehe 2.1.) wurde zwischen wichtigen Objektanteilen und der Fixierung/Infiltration

abgewogen, außerdem wurde die Präparation auf ein Minimum reduziert, um möglichen

RNase-Kontaminationen vorzubeugen. Die Dauer für eine komplette Infiltration war

entsprechend der Penetrationseigenschaften des Formaldhyd-Anteils (4%ige Lösung:

2 mm/h), maßgeblich von der Objektgröße abhängig. In dieser Arbeit wurde mit den

Standard-Fixierungstechniken FAA (Formalin-Alkohol-Eisessig-Gemisch) und PFA

(Formaldehyd, PBS-gepuffert) fixiert, da mit beiden gute Penetrationseigenschaften bei

gleichzeitig ausreichender Erhaltung der Morphologie zu erwarten waren.

Variante I:

Die PFA-Fixierung nach ZACHGO (2002) wurde wie im Methoden-Kapitel 2.3.15.1

beschrieben durchgeführt und entspricht der Fixierung im GLEISSBERG-Protokoll. Die

Fixierdauer hat Einfluss auf die Signalstärke (fehlende Signale bei der Detektion). Um

eine zu geringe Infiltration des Gewebes gegenüber einer Überfixierung abzuwägen,

wurden unterschiedliche Fixierzeiten genutzt. Fixiert wurde, wie im Protokoll angegeben,

für mind. 8 h bzw. 16 h. Dem Fixativ wurde ein Detergenz (ca. 0,1 %) zugegeben, um die

Infiltrationsdauer im Vakuum zusätzlich zu verkürzen. Die Dauer der Vakuumbehandlung

plus Detergenz für die Gewebeinfiltration zu Beginn der Fixierung wurde gewebebedingt

auf 30 bis 60 min. verlängert. Als Detergenz wurde nicht TritonX, sondern Tween20

zugegeben. Die 40 ml Fixativ wurden anschließend durch frische Lösung ersetzt.

Variante II:

FAA wurde in der am Lehrstuhl etablierten Zusammensetzung verwendet (siehe 2.2.1),

die für die morphologischen Studien an Sciadopitys, in Kombination mit einer Fixierdauer

von 72 h, gute Ergebnisse zeigte. Angepasst an die RNase-sensitive Arbeit wurde für

72 h bei 4° C gekühlt fixiert. Zu Beginn der Fixierung erfolgte eine Vakuumbehandlung, in

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ERGEBNISSE 79

Anlehnung an die PFA-Fixierung, zum Zweck einer zusätzlichen Optimierung. Die

Vakuumbehandlung war allerdings aufgrund der besseren Infiltrationseigenschaften

(durch Eisessig und Alkohol) beschleunigt und vergleichsweise kurz (10 min.) und

bedurfte keiner Zugabe von Detergenz.

Für kleinere Objekte eigneten sich beide Fixierungsvarianten. Für größere Proben mit

verholzten Strukturen und/oder solche mit hohem Stärke- oder Milchsaftanteil, wie z.B.

präparierte Samen (Embryonen in Endosperm) und vegetative Knospen, lieferte die

Fixierung mit FAA die besseren Resultate. Eine unzureichende Fixierung hatte u. a.

negativen Einfluss auf die Infiltration mit Paraffin. Die Gewebeschnitte betreffender

Proben hafteten nicht optimal auf den Objektträgern und gingen während der

Durchführung (Prähybridisierung etc.) verloren.

Die Vorbereitung auf die Paraffinbehandlung erfolgte wie in 2.3.15.1 beschrieben, nach

GLEISSBERG-Protokoll, mit Roti-Histol als Intermedium. Im Zuge der ersten vier Tage

wurde ein Teil des verflüssigten Paraffins abgeschüttet und durch neues

ungeschmolzenes ersetzt. An den folgenden Tagen wurde entsprechend des Vorlagen-

Protokolls gegen frisches, geschmolzenes Paraffin ausgetauscht. Nachfolgend wurde

aufgrund von Schrumpfungsartefakten bei Verwendung von Paraffin mit Plastikpolymer-

Anteil (Paraplast Plus, „nach GLEISSBERG“), ausschließlich in reines Paraffin (HISTOWAX,

Abwandlung) eingebettet. Ob allein die Plastikpolymer-Komponente ausschlaggebend

war oder die Schrumpfung auf Temperaturschwankungen (Wärmeschrank) während der

Lagerung beim Hochführen der Proben zurückzuführen ist (Vergleich Schmelzpunkte

von Paraplast, 2.3.15.1), bleibt abzuwägen. Es wurden Gewebeschnitte in einer Stärke

von 10 µm hergestellt. Die Gewebeschnitte wurden in Anlehnung an Punkt 2.2.2 wie

beschrieben auf Polylysin-beschichteten Objektträgern gestreckt (DEPC-H2O) und

getrocknet (2.3.15.1). Bei den eingesetzten Gewebeschnitten handelte es sich meist um

Teilbänder einer Schnittreihe, bestehend aus ca. vier zusammenhängenden

Einzelschnitten. Objektabhängig (Zerreissen der Schnitte aufgrund von Verholzungen/

methodische Artefakte etc.) konnten allerdings teilweise nur viele Einzelschnitte erstellt

werden. Das Strecken der Schnitte erfolgte wie aus rein anatomisch-morphologischen

Arbeiten gewohnt, anstelle der mit Eiweißglycerin vorbehandelten Objektträger

(siehe 2.2.2) wurden allerdings fertige, Polylysin-beschichtete Objektträger verwendet.

Die Methodik des Streckens im Wasserbad (nicht auf dem Objektträger) wurde nicht vom

Vorlagenprotokoll übernommen, da sich der Transfer, Wasseroberfläche-Objektträger,

nicht für die vielfach entstandenen Einzelschnitte eignete. Für eine Kombination aus

Schnittbändern und Einzelschnitten erwies sich das gewohnte Strecken auf Wasser,

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ERGEBNISSE 80

Abb. 32: Sciadopitys-Gewebe nach Proteinase K-Behandlung. Proteinase K-Konzentration von 10 µg/ml: Verlust der Gewebemorphologie über Auflösen der Zell-ververbände bei zu starkem Verdau.

direkt auf den Objektträgern als gut geeignet. Durch die im Material & Methoden-Teil

aufgeführten POLYSINE™ Microscope Slides (Tab. 2 II) war ein gutes Anhaften der

Schnitte und eine gute Verteilung des Wasserfilms (Strecken der Schnitte) gewährleistet.

Polylysin-beschichtete Objektträger eines anderen Herstellers erwiesen sich als nicht

ausreichend mit Wasser benetzbar, so dass die Schnitte beim Strecken mitsamt dem

Wasser abperlten und größtenteils verloren gingen.

3.5.1.2 Prähybridisierung

Die Prähybridisierungsschritte erfolgten wie in 2.3.15.2 beschrieben in jeweils 200 ml

Lösung (in Glasküvette). Die Durchführung ist der im anatomisch-morphologischen

Methodenteil beschriebenen Vorgehensweise sehr ähnlich und bedurfte daher keiner

weiteren Anpassung. Die Behandlung mit Roti-Histol- und Ethanol-Lösung diente der

Entfernung des Paraffins und der anschließenden Hydrierung über die mit

Natriumchlorid-Lösung (0,85 %) verdünnte, absteigende Ethanol-Reihe. Den

Waschschritten mit Salzsäure (HCl), DEPC-H2O und 2x SSPE-Puffer folgte der besonders

kritische Schritt der Proteinase K-Behandlung. Die Vorbehandlung mit Proteinase K

diente zur Verbesserung der Durchlässigkeit des Gewebes und machte daher immer

eine Anpassung an die jeweilige Gewebeart erforderlich. Eine Erhöhung der Proteinase-

Konzentration führt allgemein zu einer Verbesserung des Signals bei zunehmendem

Verlust der Gewebemorphologie der Schnitte durch Auflösen des Gewebeverbandes.

Die im Ausgangsprotokoll verwendete Proteinase K-Konzentration von 10 µg/ml, erwies

sich für alle verwendeten Objekte als zu stark (Abb. 32).

Der zu intensive Verdau führte zu

einer starken Auflösung des

Gewebeverbandes bis hin zum

Totalverlust der Gewebeschnitte.

Durch Reduktion der verwendeten

Enzym-Konzentration auf 5 µg/ml

blieb das Gewebe besser erhalten.

Über eine daran anschließende

Säurehydrolyse wurden Nukleotid-

gebundene Proteine teilweise

abgelöst und die Durchlässigkeit

des Gewebes für eine zusätzliche

Signaloptimierung weiter erhöht.

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ERGEBNISSE 81

Die Bedingungen für Säurehydrolyse und Acetylierung (Triethanolamin/Essigsäure-

anhydride) und die weitere Prähybridisierung (SSPE & aufsteigende Ethanolreihe)

wurden hier nicht variiert und direkt vom Vorlagenprotokoll übernommen. Die Möglichkeit

der Zwischenlagerung in Ethanol (100 %) wurde i. R. nicht genutzt, stattdessen wurde

direkt mit der Hybridisierung fortgefahren.

3.5.1.3 Hybridisierung

Ein gutes Detektionsergebnis/die Signalstärke ist abhängig von der Bildung spezifischer

Hybride aus Antisense-mRNA-Sonde und Ziel-RNA/Sense-mRNA (ZACHGO, 2002). Die

Bildung spezifischer Hybridmoleküle wird allgemein über die Komponenten der

Hybridisierungslösung beeinflusst. Außerdem wird ein starkes Hintergrundsignal über die

Entstehung unspezifischer Bindungen positiv beeinflusst. Die Formamide ermöglichen

allgemein eine Senkung der Temperatur, die für eine RNA-RNA-Bindung nötig ist. Die

Spezifität der Hybridbindung ist zusätzlich über Na+-Ionen beeinflussbar: Je höher die

Konzentration der monovalenten Ionen ist, desto mehr stabile Duplexe entstehen, weil

ausschließlich Sequenzen mit hohem Homologiegrad binden. Eine zu niedrige

Konzentration erzeugt unspezifischere Hybriden, durch Bindung weniger homologer

Sequenzbereiche aneinander (ZACHGO, 2002). Der Anteil nicht spezifischer Bindungen

ist zusätzlich über die in der Hybridisierungslösung enthaltene tRNA und Denhardt’s

Lösung abblockbar. In dieser Arbeit wurde die vorgegebene Hybridisierung, bei 55 °C

ü. N. übernommen.

Probenvorbereitung:

Die Hybridisierung fand, wie in 2.3.15.3 beschrieben (nach GLEISSBERG-Protokoll), unter

Verwendung von Deckgläsern in einer verschlossenen Box (chloroformgereinigt) und vor

Verdunstung geschützt statt. Die Kontrollen wurden parallel mitgeführt, aber immer

separat behandelt (Handschuhwechsel, separate Kammern), um einen Kontakt mit den

markierten Proben auszuschließen.

Sondenmix:

In der eigentlichen Hybridisierungsreaktion (vergleiche 2.3.15.3) wurde hier aus-

schließlich die Menge der eingesetzten Sonde im Sondenmix (in Abhängigkeit von der

Sondenkonzentration) bzw. pro Objektträger variiert. Es wurden Sondenmengen von 180

bis 900 ng pro Objektträger verwendet. Vom Sondenmix (Hybridisierungslösung plus

Sonde) wurde anstelle von 200 µl ein Endvolumen von 400 µl pro Objektträger

eingesetzt, um eine homogene Verteilung (über alle Schnitte) zu gewährleisten. In

Kontrollansätzen wurden die entsprechenden Objektträger entweder mit 400 µl reiner

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ERGEBNISSE 82

Hybridisierungslösung (ohne Sonde), 400 µl Sondenmix mit unmarkierter Sense-

/Antisense-Sonde oder markierter Sense-Sonde (anstelle der Antisense-Sonde)

behandelt. Es gilt generell einen Sondenüberschuss (im Vergleich zur Zielsequenz) zu

vermeiden, da es zu Überlagerung des eigentlichen Signals durch verstärkte

Hintergrundfärbung führen kann. Daher wurde die eingesetzte Menge per Dot Blot

abgeschätzt (vergleiche 2.3.14). Der Anteil an Dextransulfat in der Hybridisierungslösung

sorgt dabei für ein weiteres Ankonzentrieren der Sonde, weil es in wässrigen Lösungen

so stark hydratisiert, dass die Makromoleküle durch ausbleibende Hydratisierung (hier

RNA) stärker ankonzentriert werden (ZACHGO, 2002).

3.5.1.4 Waschschritte

Die Waschschritte im Anschluss an die Hybridisierung wurden wie in Punkt 2.3.15.4

beschrieben, nach GLEISSBERG-Protokoll, unter leichter Bewegung für einen

gleichmäßigen Lösungskontakt der Schnitte durchgeführt und dienten der Beseitigung

aller Komponenten, die zu einer verstärkten Hintergrundfärbung bei der Signaldetektion

beitragen würden. Die Deckgläser wurden vor der Inkubation in den jeweiligen

Waschlösungen (je 200 ml) entfernt (3x SSPE). Die Inkubation in Puffern mit steigenden

Salzkonzentrationen diente dazu ungebundene, markierte Sonden zu entfernen. Die

fehlgepaarten Hybride und/oder nicht spezifisch gebundenen Komponenten wurden

über die ansteigende Temperatur der Pufferlösungen unter gleichzeitiger Absenkung

deren Salzkonzentration beseitigt (ZACHGO, 2002). Die einzelsträngigen RNA-Moleküle

(z. B. nicht gebundene markierte RNA-Sonden) wurden mit RNase A (20 µg/µl in NTE)

verdaut.

3.5.1.5 Detektion des Signals

Die Antikörperbehandlung wird hier zusammen mit der Detektion besprochen. Um ein

mögliches Trockenfallen etc. der Gewebeschnitte zu verhindern und den

Versuchsablaufs gleichzeitig zeitlich zu straffen wurden beide Schritte lückenlos

aneinandergereiht. Die Schnitte wurden daher abweichend vom Ausgangsprotokoll,

ohne eine Zwischenlagerung (4 °C, ü. N.), nach insgesamt 80 min. Inkubation in

Puffer 1 mit Tween20 direkt weiter in Puffer 2 mit Tween überführt bzw. equilibriert.

Antikörperinkubation:

Als Vorbereitung auf die Inkubation mit Anti-DIG-Antikörpern, wurden die Schnitte über

Inkubation mit Puffer 1 wie beschrieben (2.3.14.6), unter Zugabe von 0,5 % Blocking-

Reagenz und 0,1 % BSA in Puffer 1, geblockt. Die 1 h Antikörperinkubation, mit 300 µl

verdünnter (1:3000) Antikörperlösung pro Objektträger, wurde unverändert übernommen

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ERGEBNISSE 83

und wie im Methodenkapitel (s. o.) beschrieben durchgeführt. Auf jeden Objektträger

wurden anschließend 300 µl der verdünnten Antikörperlösung aufgetragen und die

Objektträger entsprechend der Anweisung inkubiert und als Vorbereitung auf die

Detektion gewaschen (siehe 2.3.14.5).

Detektion:

Für die Detektion der Anti-DIG-gekoppelten Alkalischen Phosphatase wurde das ent-

sprechende Substrat BCIP/NBT in Tablettenform (SIGMAFAST™, SIGMA ALDRICH)

verwendet. Die Tabletten wurden in dieser Arbeit mit Polyvinylalkohol (10 %) oder

alternativ in DEPC-H2O bzw. Puffer 2 gelöst (vergleiche 2.3.14.5). Es wurden 200 µl der

Detektionslösung pro Objektträger aufgetragen. Die Verwendung von Polyvinylalkohol

entspricht dabei der Version nach GLEISSBERG-Protokoll. Der Einsatz von Polyvinylalkohol

dient generell der Beschleunigung der Reaktion und einer genaueren Lokalisierung des

Signals, indem es z. B. die Diffusion des gebildeten Reaktionsproduktes

Formazan/Violettfärbung unterdrückt (ZACHGO, 2002). Aufgrund der stark viskosen

Beschaffenheit der Polyvinyl-Färbelösung erschienen die Schnitte innerhalb eines

Objektträgers durch die inhomogene Verteilung der Lösung unterschiedlich gut benetzt

bzw. angefärbt (Abb. 33).

Bei Verwendung der über DEPC-H2O

gelösten Färbelösung (bevorzugte

Variante) blieben derartige Artefakte aus

und lieferten durch vollständiges Lösen der

Tablette (homogene Lösung) die besten

Ergebnisse. Bei Verwendung von Puffer 2,

in direkter Anlehnung an den

durchgeführten Dot Blot aus 2.3.14, war

das Ergebnis vergleichbar mit den

Resultaten mit DEPC-H2O. Die einmalige

Verwendung einer Detektions Kit-eigenen

NBT/BCIP-Stocklösung, nach Hersteller-

angaben (ROCHE, Tab. 6), führte zu keinem

Erfolg.

Die Detektionsreaktion wurde unter Verwendung von Deckgläsern und vor Licht und

Verdunstung geschützt durchgeführt. Die Färberesultate variierten nicht nur je nach

eingesetztem Medium zum Lösen der Färbetablette, sondern auch je nach eingesetzter

Abb. 33: Detektionslösung: Gewebe mit Rück-ständen des Färbesubstrats. Färbelösung mit Polyvinylalkohol: viskose Färbelösung mit inhomoger Verteilung über Objekträger bzw. Gewebe.

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ERGEBNISSE 84

Sondenmenge für die Hybridisierung und Einwirkzeit der Färbelösung (Detektionszeit).

Die Kombinationen aus Sondenmenge und Einwirkzeit wurden in verschiedenen

Ansätzen variiert. Die Detektionsdauer der durchgeführten in-situ-Hybridisierungen lag

dabei zwischen 16 h und 24 h, max. bei 4 Tagen. Außerdem kam es bei Einsatz

markierter Sense-mRNA-Sonde, wie auch bei ZACHGO (2002) beschrieben, zur

Signalentwicklung.

3.5.1.6 Reaktionsstop

Der Zeitpunkt des Abstoppens mit Aqua dest. (vergleiche 2.3.15.6), wurde festgelegt,

indem die Intensität der Hintergrundfärbung im Vergleich zum eigentlichen Signal

abgewogen wurde. Für Ergebnisse mit nur schwachem Detektionsignal war beim

Dehydrieren der Schnitte zu beachten, dass sich das Signal über die aufsteigende

Alkoholreihe auswäscht.

Die gesamte Hybridisierung ist durch die Veränderung einzelner Parameter in der

Durchführung auf vielfältige Weise adaptierbar. Die Erfolge sind daher stark

Parameterahängig bzw. über deren Veränderungen beeinflusst. Insgesamt wurden, mit

Ausnahme der Detektionszeit (s. o), innerhalb eines kompletten Versuchsdurchlaufes

ausgehend von der gewählten Fixierung nur maximal zwei parallele Parameter-

veränderungen (Proteinase K & Sondenmenge/Objektträger) durchgeführt. Die Variation

der Sondenkonzentration kann durch Erhöhung der eingesetzten Menge, bis zum

Sättigungspunkt der Ziel-RNA-Sequenz, verbesserte Signale bewirken.

3.5.2 in-situ-Hybridisierung – inhaltlich

Im Folgenden werden lichtmikroskopische Aufnahmen von mit mRNA-Sonde

hybridisierten Gewebeschnitten gezeigt. Bei den dargestellten Ergebnissen handelt es

sich um vier Tage mit Färbelösung inkubierte Proben. Die gewählte Konzentration lag für

alle Sondenvarianten dieses Ansatzes mit 450 ng Sonde pro Objektträger im mittleren

Bereich. Die Einwirkzeit der Färbelösung entsprach der maximalen Dauer. Die

Ergebnisse zeigen erkennbare Detektionssignale bei gleichzeitig sehr starker

Hintergrundfärbung. Gezeigt sind Längsschnitte bzw. kleinere Serien aufeinander

folgender Schnitte, die median oder nahe der Medianen durch den Vegetationskegel

verlaufen. Parallel wurden auch Querschnitte von Keim- und Primärblättern betrachtet.

Ein Teil dieser Schnitte wurde zur Kontrolle mit unmarkierter Antisense-mRNA-Sonde

(Kontrolle 1) oder markierter Sense-mRNA-Sonde (Kontrolle 2) und der übrige Teil, im

eigentlichen Ansatz, mit DIG-markierter Antisense-mRNA-Sonde behandelt. Der

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ERGEBNISSE 85

gewählte Ansatz zeigt die für die hergestellte Sonde bestmöglichen Detektions-

ergebnisse. Die hybridisierten Schnitte anderer Ansätze waren überwiegend nicht

auswertbar, weil sich die (Kontroll-)Schnitte im Versuchsverlauf von den Objektträgern

lösten, die Schnitte entsprechend des jeweils verwendeten Mediums zum Lösen der

Färbetabletten nicht anfärbten und/oder aufgrund der Kombination aus Detektionslänge

und Sondenkonzentration keine zufrieden stellenden Resultate lieferten. Ein Ansatz, der

im Vergleich zum hier präsentierten, mit der maximalen Sondenkonzentration und

entsprechend kürzer 24 h Detektionszeit durchgeführt wurde und viel versprechend war,

ist daher nicht präsentierbar. Für den hier gezeigten Ansatz wurden zwei terminale

Knospen sechs Monate alter Keimlinge aus K2 (4-Blatt-Stadium), sowie deren Keim- und

Primärblätter FAA-fixiert. Zusätzlich wurden zwei Proben des terminal zwischen den

Kotyledonen liegenden Abschnittes zehn Wochen (W10) alter Keimlinge aus K4

gesammelt, von denen eine mit FAA und die andere mit PFA fixiert wurde. Alle fixierten

Proben wurden in HISTOWAX, als Paraffin, eingebettet.

3.5.2.1 Expression in vegetativen Knospen

Ein Vergleich der Übersichtsaufnahmen (MIA, Abb. 34) von Knospen und terminalen

Sprossabschnitten von Keimlingen zeigt, dass die unmarkierte Kontrolle 1 nur sehr

schwach violett, die Färbung der markierten Kontrolle 2 und der Antisense-Probe sehr

viel intensiver ist. Die intensivsten Signale liegen in Bereichen mit größerer Zelldichte

bzw. erhöhter Zellteilungsaktivität. Bei der leichten Anfärbung der unmarkierten

Kontrolle 1 handelt es sich um das Hintergrundsignal, dass auf die sehr lange

Detektionszeit zurückgeht und nach zwei Tagen noch nicht sichtbar war. Punktuell sind

ungleichmäßig über die Gewebeschnitte verteilte fleckige, violette Bereiche erkennbar

(Abb. 34 B-D) bei denen es sich um ungelöste Reste des Färbesubstrats handelt. Ein

intensives, jedoch unspezifisches Färberesultat für Primärblätter (vergleiche 3.5.2.2) ist

z. B. in den in den Übersichtsaufnahmen A-C der Abb. 34 von Knospen-Längsschnitten

erkennbar.

An Knospen-Stadien sechs Monate alter Keimlinge im 4-Blatt-Stadium

(vergleiche Abb. 20 A) sind neben den (hier teilweise entfernten) Keim- und

Primärblättern am Vegetationskegel bereits die Primordien der ersten jungen Kladodien

in den Achseln von Knospenschuppen sichtbar (Abb. 34). Bei detaillierter Betrachtung

der hybridisierten Gewebeschnitten junger Kladodienprimordien und ihren

dazugehörigen Knospenschuppen bzw. Tragblättern (Abb. 35 A-C) zeigen die Zellen der

mit unmarkierter Kontrolle behandelten Gewebe abgesehen vom Hintergrundsignal keine

weitere Violettfärbung (Abb. 35 A). Eine zusätzlich zum Hintergrundsignal erkennbare

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ERGEBNISSE 86

Anfärbung ist nur für die markierte Kontrolle 2 und die Antisense-Probe erkennbar. In

beiden Fällen erscheinen die Zellkerne der kleinlumigen Zellen der Kladodien (Abb. 35

B-C), im Gegensatz zu blasseren Zellwänden und Cytoplasma und im Vergleich zum

gesamten Gewebe/großlumigeren Zellen der Knospenschuppen (leicht) violett angefärbt.

Das Signal der Antisense-Probe (Abb. 35 C) erscheint im Vergleich zur markierten

Kontrolle 2 (Abb. 35 B) insgesamt etwas intensiver gefärbt. Außerdem ist in den für die

Antisense-Probe gezeigten Details (Abb. 35) in Abb. 35 D eine Violettfärbung im basalen

Abschnitt einer Knospenschuppe dargestellt. In Abb. 35 E-F sind abhängig von der

Schnittebene auch angefärbte Knospenschuppenachseln (Pfeil) sichtbar.

Abb. 34: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten vegetativer Knospen 6 Monate alter Keimlinge (I). Lichtmikroskopische Übersichts-Aufnahmen (MIA) der mit unterschiedlichen Sonden behandelten Gewebeschnitte. A: Kontrolle 1, unmarkierte Antisense-mRNA-Sonde. B: Kontrolle 2, DIG-markierte Sense-mRNA-Sonde. C-D: Antisense-Probe, DIG-markierte Antisense-mRNA-Sonde. D mit Artefakt (diagonal verlaufender Bereich durch Auffaltung des Gewebeschnittes stärker angefärbt erscheinend). Kotyledonen (Ko); Kladodien(primordium) (Kp); Knospenschuppe (Ks), Primärblatt(primordium) (P); Vegetationskegel (Vk).

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ERGEBNISSE 87

Die Farbreaktion im Bereich des Leitgewebes der Sprossachse ist mit der für die

jüngeren Keimlinge identisch und dort in Abb. 37 abgebildet. Auf die zusätzliche

Darstellung der vergleichbaren Aufnahmen (s. o.) der markierten Kontrolle 2 wird hier

verzichtet. Die zusätzlich erkennbare Rot-Braun-Färbung einzelner Strukturen steht in

keinem Zusammenhang mit den Hybridisierungsversuchen, sondern geht auf

eingelagerte Sekundärmetaboliten zurück und ist auch in unbehandelten Schnitten

erkennbar.

Abb. 35: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten vegetativer Knospen 6 Monate alter Keimlinge (II). Lichtmikroskopische Detail-Aufnahmen der mit unterschiedlichen Sonden behandelten Gewebeschnitte; Bereich des Vegetationskegels (Vk, E-F) mit jungen Kladodien (Kp, A-C) und Knospenschuppen (Ks, D). A: Kontrolle 1, unmarkierte Antisense-mRNA-Sonde. B: Kontrolle 2, DIG-markierte Sense-mRNA-Sonde. C-F: Antisense-Probe, DIG-markierte Antisense-mRNA-Sonde.

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ERGEBNISSE 88

Betrachtet man die Längsschnitte durch den terminalen Bereich zehn Wochen alter

Keimlinge im 2-Blatt-Stadium (siehe auch Abb. 18 E-F) sind im Gegensatz zu den älteren

Knospen weder Knospenschuppen noch Primordien von Kladodien erkennbar (Abb. 36).

Zu diesem Zeitpunkt sind ausschließlich die Primordien der beiden Primärblätter am

Vegetationskegel sichtbar (Abb. 36 A-D). Bei den durch eingelagerte Sekundär-

metaboliten braun erscheinenden Strukturen im Bereich des Vegetationskegels

(z. B. Abb. 36 C-D) handelt es sich um mehrzellige Haare (siehe auch Abb. 10). Bei den

Gewebeschnitten aus Abb. 36 A und C verläuft der Längsschnitt im 90 ° Winkel versetzt

zu den Kotyledonen, entsprechend sind beide Primärblätter gleichzeitig getroffen. In den

Schnitten aus Abb. 36 B und D ist der Schnitt parallel zu den Kotyledonen geführt, daher

ist zusätzlich zum Vegetationskegel nur ein Primärblatt-Primordium erkennbar. Vergleicht

man die Zellen der Primärblatt-Primordien mit dem Bereich des Vegetationskegels, so

zeigt letzterer die intensiveren Signale. Im Ursprungsbereich der ersten Knospen-

schuppe erscheint die Anfärbung des Vegetationskegels reduziert (Abb. 36 C). Die sehr

junge Anlage der Knospenschuppe (*) zeigt ein schwaches Farbsignal, vergleichbar mit

dem der Primärblätter. Für die Primärblätter ist nur ein schwaches Farbsignal an der

Basis lokalisierbar (Abb. 36 D). Darüber hinaus zeigt sich eine Anfärbung in den die

Leitelemente des Sprosses flankierenden Zellen (Abb. 36 D, Pfeil). Die Anfärbung des

Blattgewebes der Kotyledonen (Abb. 36 E) ist, sofern vorhanden, nur unspezifisch zu

deuten (siehe auch 3.5.2.2). Auf die zusätzliche Darstellung der vergleichbaren

Aufnahmen (s. o.) der markierten Kontrolle 2 wird hier verzichtet.

3.5.2.2 Expression in Blättern

Zusammen mit den gezeigten Untersuchungen an Knospen wurden gleichzeitig auch

Keim- und Primärblätter in die Untersuchung mit einbezogen, weil für diese im

Unterschied zu undifferenziertem meristematischem Gewebe keine spezifischen Signale

zu erwarten sind. Die vorhandenen Anfärbungen der Keimblatt-Querschnitte (Abb. 37 A-

C) werden daher auch als nicht spezifisch gewertet, da generell in Färbetechniken eine

Affinität der Farbstoffe zu Chloroplasten und Sekundärmetaboliten zu bestehen scheint,

wie ähnliche Farbablagerungen auch mit anderen histologischen Färbetechniken (z. B.

Astrablau-Safranin-Färbung nach Gerlach (siehe Anhang, A 3) belegen. In

Detailaufnahmen (Abb. 37 D-F) ist die Violettfärbung unterschiedlichster Zellstrukturen im

Bereich des Palisaden- und Schwammparenchyms gut erkennbar. Die für die

Keimblätter gezeigten Ergebnisse gelten auch für die untersuchten Primärblättern (siehe

Anhang, A 4).

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ERGEBNISSE 89

Abb. 36: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Längsschnitten des terminalen Spross-abschnittes 10 Wochen alter Keimlinge (III). Lichtmikroskopische Aufnahmen der DIG-markierten Antisense-mRNA-Sonde. A & C: Übersicht (A, MIA) und Detail (B) mit Schnittebene parallel zu Kotyledonen. B & D: Übersicht (C, MIA) und Detail (D) mit Schnittebene senkrecht zu Kotyledonen. E: Detail der Sprossachse mit intensiv gefärbten Leitbündel-Flanken (Pfeil). F: Kotyledonengewebe im Detail. Haare (Ha); Kotyledonen (Ko); Knospenschuppe (Ks), Leitbündel (LB), Primärblatt(primordium) (P); Vegetationskegel (Vk, gestrichelte Linie).

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ERGEBNISSE 90

Abb. 37: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Querschnitten von Keimblättern. Licht-mikroskopische Aufnahmen, von Übersichts- (A-C, MIA) und Detailaufnahmen (E-F) der mit unterschiedlichen Sonden behandelten Gewebeschnitte. A & E: Kontrolle 1, unmarkierte Antisense-mRNA-Sonde. B & D: Kontrolle 2, DIG-markierte Sense-mRNA-Sonde. C & F: Antisense-Probe, DIG-markierte Antisense-mRNA-Sonde. Cuticula (C); Epidermis (E); Harzkanal (Hk); Interzellulare (I); Leitbündel (LB); Leitbündelscheide (LS); Palisadenparenchym (Pp); Stomata (S); Schwammparenchym (Sp).

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ERGEBNISSE 91

3.5.3 Heterologe Expression von SvKnox

Um neben der Lokalisierung SvKnox-spezifischer mRNA (im direkten Vergleich durch

doppelte Markierung) auch die Ko-Lokalisation des entsprechenden Proteins zu

ermöglichen wurden erste Schritte für die Herstellung SvKNOX-spezifischer Antikörper

unternommen. Für die heterologe Expression wurde die aus S. verticillata isolierte

Sequenz in einen E. coli Expressionsvektor kloniert. Hierzu wurde das Fragment mittels

PCR mit den Primern SvGST for/rev und Plasmid-DNA von Klon Nr. 7 (aus 3.4.3) als

Template amplifiziert (Abb. 38 A, Spur 1). Das 350 pb große Produkt, sowie der pGEX-

4T1 Zielvektor (GE HEALTHCARE) wurden EcoRI/XhoI geschnitten (Abb. 38 A, Spur 2/3)

und miteinander ligiert (Abb. 38 A, Spur 4). Das erhaltene Plasmidkonstrukt wurde zur

Expression in E. coli Stamm BL21DE3 (Tab. 5) transformiert und unter selektiven

Bedingungen angezogen. Eine Induktion des Fusionsproteins erfolgte während der

exponentiellen Wachstumsphase durch Zugabe von 0,4 M IPTG. Nach 4 h Inkubation bei

30 °C wurden die E. coli-Zellen sedimentiert, in Aufschlusspuffer unter Zugabe von

Protease-Inhibitoren aufgenommen und durch French Press-Behandlung mechanisch

aufgeschlossen. Die nicht aufgeschlossenen Zellen wurden zusammen mit den

Membranen und den unlöslichen Proteinen durch Zentrifugation (30 min./ 16.000 rpm)

sedimentiert. Der lösliche Überstand, der das exprimierte GST-Fusionsprotein enthielt,

wurde über eine Glutathion Sepharose-Matrix gegeben. Zur Reduktion unspezifischer

Bindungen wurde die Säule mit dem 10 fachen Säulenvolumen gewaschen. Die Elution

erfolgte durch wiederholte Zugabe von 10 mM reduziertem Glutathion. Die Analyse des

Reinigungsverlaufs mittels SDS-PAGE und anschließender Coomassie-Färbung (2.3.16)

der Proteine (Abb. 38 B) zeigte eine erfolgreiche Expression und Aufreinigung der

isolierten SvKNOX-Sequenz als GST-Fusion in E. coli. Das mit 38,7 kDa kalkulierte

Fusionsprotein konnte in einer Konzentration von 2,4 mg/ml aufgereinigt werden und

steht nun für eine Immunisierung zur Antikörpergewinnung zur Verfügung.

Abb. 38: Heterologe Expression von SvKnox. A: Klonierung in pGEX-4T1. 1 %iges Agarosegel: aufgetragen 5 µl Marker (GeneRuler), 1= PCR mit SvGST for/rev, 2= EcoRI/XhoI-geschnittenes Fragment, 3= pGEX-4T1, EcoRI/XhoI-geschnitten, 4= positiver Klon, EcoRI/XhoI-geschnitten. B: GST-SvKNOX überexprimiert in E. coli (BL21DE3); 12,5 %igen SDS-Polyacrylamidgel, Protein-Detektion durch Coomassie-Färbung. 1= SDS-Marker (SIGMA-ALDRICH), 2= E. coli vor Induktion mit IPTG, 3= E. coli nach Induktion mit IPTG, Spur 4= Zelllysat der induzierten E. coli-Zellen nach Zellaufschluß, 5= Sediment nach Zentrifugation (16.000 rpm, 30 min), 6= Überstand nach Zentrifugation (16.000 rpm, 30 min), 7= Durchlauf der nicht gebundene Proteine, 8= Waschfraktion, 9= Eluat 1 (10 mMGlutathion), 10= Eluat 2 (10 mM Glutathion).

B A

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ERGEBNISSE 92

3.6 Knox-Suche in Phyllocladus trichomanoides

Die erfolgreich auf Funktionalität getestete Kombination der degenerierten Primer

dP-SvKnox for1/rev1 wurde auch für die Suche nach einer KNOX-Sequenz in

Phyllocladus eingesetzt. Ziel ist es, bei etablierter Methodik der in situ-Hybridisierung,

Phyllocladus als Vergleich in einem Ansatz mit vegetativen Knospen heranzuziehen.

Darin sollen die Expressionsmuster im Anlagebereich junger Phyllokladien am

Sprossscheitel mit denen junger Kladodien von Sciadopitys überprüft werden. Ein

späterer Abgleich möglicher übereinstimmender Expressionsmuster beider Flachspross-

Typen wäre dann als zusätzliche Kontrolle bzw. mögliche Bestätigung der Sciadopitys-

Resultate verwendbar.

Die RNA-Isolierung erfolgte unter Verwendung des RLC-Puffers inklusive aller

Optionalschritte (2.3.3). Isoliert wurde aus einem jungen ca. 1 cm großen Phyllokladium

oder drei vegetative Knospen. Der Reverse Ansatz entspricht dem von Sciadopitys bzw.

Picea mit dP-SvKnox (siehe 3.3.3 & 3.4.3). Über ein 1,5 %iges Agarosegel wurden 5 µl

Fragment (versetzt mit DNA-Probenpuffer Orange G von APPLICHEM) zusammen mit 5 µl

GeneRuler (FERMENTAS) aufgetrennt. Das in Anlehnung an HBK1 (Abb. 25) bei 359 bp zu

erwartende Fragment wird durch die im Gel zwischen 300 und 400 bp liegende Bande,

auch hier, bestätigt (Abb. 39 A). Die entsprechende Bande wurde geleluiert und bis

einschließlich der Kontrollrestriktion entsprechend der Anleitung für Picea (siehe 3.3.3)

behandelt. Von den selektierten positiven Klonen (vergleiche 2.3.9) wurden sechs auf

den Einbau des richtigen Inserts hin kontrolliert.

Abb. 39: P. trichomanoides, cDNA-Synthese mit dP-SvKnox & Klonierungskontrolle. A: Reverser Ansatz, dP-SvKnox for1/rev1(vgl. Abb. 25) lieferten ein DNA-Fragment von ca. 300 bis 400 bp Länge; 1 %iges Agarose-Gel mit 5 µl PCR-Produkt + 1,25 µl 5x DNA-Probenpuffer & 5 µl Marker (GeneRuler, FERMENTAS). B: Restriktionskontrolle, Überprüfung von Einbau des Inserts aus A in pCRII-TOPO (4 kb) ligierte, Blau/Weiß-selektierte, positive Klone. Aufgetragen wurden sechs EcoRI/KpnI-geschnittene Ansätze (je ½ Restriktionsansatz der Klone 1-7) auf 1 %iges Agarosegel mit 5 µl Marker und DNA-Probenpuffer; Klone 1-5 mit eingebaute Fragmente von ca. 350-400 bp, Banden sind von unterschiedlicher Intensität.

B A

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ERGEBNISSE 93

Das Gel zur Restriktionskontrolle (Abb. 39 B) zeigte für alle sechs Klone, mit Ausnahme

von Klon Nr. 6, Insertfragmente passender Größe. Zur Sequenzierung wurden Aliquots

der isolierten Plasmide von den zwei Klonen Nr. 4 und 5, mit der intensivsten

Bandenausprägung, sequenziert (MWG). Die Sequenzierungsergebnisse deuten darauf

hin, dass es sich bei dem in Klon 5 eingebauten Fragment um eine Teilsequenz eines

Knox Klasse 1-Gens, ähnlich PaHBK1 und SvKNOX (vergleiche Abb. 29), handelt. Die

Phyllocladus-Sequenz (Abb. 40) steht als Template zur Sondenherstellung für eine

spätere in-situ-Hybridisierung zur Verfügung.

Abb. 40: Schema der ermittelten Phyllocladus-Sequenz. Darstellung der ermittelten Basensequenz für PtKnox-Teilsequenz und der daraus abgeleiteten Aminosäurenabfolge für das kodierte Protein-Fragment von PtKNOX; die sequenzierte cDNA wurde mit dP-SvKnox for1/rev1 synthetisiert.

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DISKUSSION 94

4 DISKUSSION

4.1 Morphologische Ausgangssituation

Betrachtet man die gesammelten morphologischen Daten für Sciadopitys, bilden deren

durch funktionelle Überlagerung blattähnlich erscheinenden, achselständigen Kurztriebe

den allgemeinen Ausgangspunkt. Zu klären ist, ob die innerhalb der Gymnospermen

vorkommenden einfachen Nadelblätter auf unterschiedlichem Wege entstanden sein

können. In Hinblick auf die Methodenetablierung zum Expressionsnachweis von Knox-

Genen in Sciadopitys, ist ein morphologisches Verständnis nötig, um die Resultate mit

Organidentitäts-Genen in Relation setzen zu können. Eine Kombination aus den anhand

der morphologischen Ausgangsbasis zu erwartenden Hybridisierungsergebnissen mit

den tatsächlichen Signalen erscheint essentiell für eine Beantwortung weiterführender

Fragen zur Makroevolution der Blätter rezenter Gymnospermen, bzw. rezenter Strukturen

im Allgemeinen.

Betrachtet man Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen vegetativer Knospen von

Sciadopitys (Abb. 10) zeigt sich, dass die ersten jungen Kladodien gegen Ende

Juli/Anfang August als Primordien sichtbar werden (Abb. 10 A-D). Die charakteristische

Doppelspitze wird innerhalb der ersten vier Wochen nach Erscheinen der Primordien

deutlich sichtbar (Abb. 10 E). Für jedes Kladodienprimordium ist zu diesem Zeitpunkt

bereits eine eigene Knospenschuppe (als Tragblatt) sichtbar, wodurch die Sprossnatur

schon von Beginn an deutlich ist (z. B. 10 E-F). Bei der Betrachtung von Querschnitten

ausdifferenzierter Kladodien (Abb. 16) zeigen diese einen Aufbau, der mit denen

normaler Nadelblätter, von Koniferen wie z. B. Abies oder Pinus, deutliche

Übereinstimmungen zeigt. In allen drei Fällen sind blatttypische Gewebe wie z. B.

Palisaden- und Schwammparenchym ausgebildet (Abb. 41). Die blattähnlichen

Kladodien sind daher optimal an ihre Photosyntheseaktivität angepasst. Die

abweichende Orientierung der Leitbündel resultiert aus der Sprossnatur der Sciadopitys-

Kladodien und hat keinerlei Einfluss auf die Vergleichbarkeit des Kladodiums mit Nadeln.

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DISKUSSION 95

Würden die als Tragblätter der Kladodien fungierenden, schuppenartig ausgebildeten

Langtriebblätter als Bezugssysteme fehlen (z. B. Abb. 4; Abb. 11) wäre die Sprossnatur

schon rein vom äußeren Erscheinungsbild her nicht belegbar und die Sciadopitys-

Kladodien nicht von normalen Nadelblättern zu unterscheiden (Abb. 4 B; Abb. 5).

Bezieht man die lichtmikroskopischen Aufnahmen zum Leitbündelanschluss an den

Zentralzylinder der Langtriebachse (Abb. 13-15) mit ein, so wir deutlich, dass der

Anschluss der Sciadopitys-Kladodien über das Einziehen einer aus Xylem und Phloem

bestehenden keilförmigen Struktur erfolgt (Abb. 13). Diese Art des Anschlusses kommt

dem normaler Blätter, mit Ausbildung einer Blattlücke im Bereich der ringförmig

angeordneten Leitelemente der Hauptachse (Abb. 14), sehr viel näher als dem anderer

Kurztriebe unter Ausbildung einer ringförmigen Struktur (Abb. 15). In Querschnitten

durch den terminalen Bereich der Langtriebachse von Sciadopitys (Abb. 13 B) sind

zusätzlich zu den Kladodienspuren keine weiteren einziehenden Blattspuren erkennbar

die eindeutig den Tragblättern zuzuordnen sind. Die in den Knospenschuppen

erkennbaren Leitbündel bzw. Xylem-Elemente sind rudimentär und zeigen keine

Verbindung zum Zentralzylinder des Langtriebes. Anders als in älterer Literatur

angegeben (z. B. STRASBURGER, 1872) ist das Vorhandensein von Leitelementen nicht

zwangsläufig auch mit deren Anschluss an die Hauptachse korreliert. Die Differenzierung

neuer Leitelemente erfolgt dort wo sie gebraucht werden und ist immer vom Blatt in

Richtung des Zentralzylinders gerichtet und nicht umgekehrt. Leitbündel sind daher als

variable Strukturen zu betrachten, deren Anordnung im großen Maße über

physiologische Gegebenheiten beeinflussbar ist. Der blattähnliche Aufbau der Kladodien

und der entsprechend blattartige Leitbündelanschluss dieser Kurztriebe lassen sich gut

mit einer morphologischen Anpassung an eine funktionelle Überlagerung in Bezug

setzen.

Abb. 41: Sciadopitys-Kladodium und Nadelblätter im schematischen Querschnitt. Vergleichende Darstellung der am Aufbau beteiligten (blattcharakteristischen) Gewebetypen. *Abweichende Orientierung der Kladodien-Leitbündel resultiert aus der Sprossnatur und ist zu vernachlässigen.

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DISKUSSION 96

Betrachtet man die Verteilung der Kurztriebe entlang der Langtriebachse (Abb. 4 B) wird

deutlich, dass die Kladodien im Bereich der gestauchten Internodien der Langtriebachse

gefördert sind. In den Schuppenblattachseln der nicht gestauchten Langtriebinternodien

(Abb. 11) ist die Ausbildung der Kladodien dagegen unterdrückt. Hier sind lediglich

Kladodienrudimente erkennbar (Abb. 11 D-E). Die Knospenschuppen bzw.

Langtriebblätter sind zum Zeitpunkt des Austriebes noch grün (Abb. 11 A), verholzen

aber mit der Zeit zunehmend und sind an älteren Trieben braun und verholzt (Abb. B).

Die Kombination einer zunehmenden Verholzung und die nur rudimentäre Ausbildung

der Leitbündel lassen die Vorstellung einer weiteren Reduktion der

Langtriebblätter/Tragblätter bis hin zum Ausbleiben ihrer Anlage durchaus vorstellbar

erscheinen. Die Hinweise auf eine Reduktion der Langtriebblätter, die gleichzeitig die

Bezugssysteme für die Achsennatur sind (Abb. 42), stützen die Vorstellung für eine

Transformationsreihe hin zum sekundär entstandenen Nadelblatt zusätzlich.

Überlegungen zur Entstehungsweise photosynthetisch aktiver Flachsprosse legen die

Vermutung nahe, dass die Ausgangsgruppen der heute nicht laubwerfenden

Gymnospermen laubwerfend gewesen sein müssen. Auszugehen ist dabei von einem

undifferenzierten Triebsystem wie dem bei Abies oder Picea mit spiralig stehenden,

allseitswendigen einfachen Blättern. Eine für viele rezente Gehölze wie z.B. Ginkgo, Larix

oder Taxodium typische Langtrieb-Kurztrieb-Differenzierung (Abb. 42) steht im

Zusammenhang mit Laubabwurf. Derartig umgebaute Systeme stellen Adaptionen an

Klimaveränderungen dar und ziehen eine Verlagerung der Blätter an die Kurztriebe nach

sich. Der Vorteil derartiger Veränderungen im Bauplan liegt in einem vergleichsweise

geringeren energetischen Aufwand. Die Belaubung kann jährlich in ausreichender

Menge neu gebildet werden, ohne dass in nennenswertem Umfang in Gerüstsubstanz

wie Zweige investiert werden muss. In einigen Pinus-Vertretern ist die Ausbildung von

Langtriebnadeln bereits auf die Jugendphase der Entwicklung beschränkt.

Langtriebblätter adulter Formen sind, z.B. bei P. sylvestris, nur als spiralig angeordnete

braune Schuppenblätter ausgebildet, während die photosynthetisch aktiven Nadeln auf

die Kurztriebe beschränkt sind. Die Anzahl der Nadeln pro Kurztrieb variiert. In der

Gattung Pinus können die Kurztriebnadeln arttypisch bis auf eine einzelne reduziert sein

(P. monophylla). Bei Phyllocladus finden sich Kurztriebe, die blattartig ausgebildet sind

und noch zahlreiche randständige Schuppenblätter tragen (vgl. RIEGER, 2002), bei

denen also noch beide Kurztriebkomponenten (Achse und Blätter) erkennbar sind

(Abb. 42). Betrachtet man die Kurztriebe von Sciadopitys als nadellos, so wäre dies das

zweite Extrem nach Pinus mit Kurztrieben bestehend aus reduzierter Kurztriebachse und

deutlich entwickelten Kurztriebnadeln.

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DISKUSSION 97

Abb. 42: Schema zur Transformationsreihe & Variabilität triebdifferenzierter Systeme. Triebdifferen-zierung (Ausschnitte) in ausgewählten Gymnospermen-Vertretern mit unterschiedlicher Betonung der beteiligten Sprosskomponenten (oben). „Momentaufnahme“ mit nadelartigem, achselständigem Kladodium von Sciadopitys (links) als Ausgangspunkt für Entstehung der Nadelblätter (vgl. A. homolepis) aus umgewandelten Kurztrieben über Verlust der Kurztrieb-Tragblätter (Kasten); Nicht colorierte Bereiche dienen der Vollständigkeit.

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DISKUSSION 98

Machen erneute klimatische bzw. standortbedingte Änderungen eine Rückkehr zur

immergrünen Lebensweise möglich so erscheint es plausibel, dass nach

abgeschlossener Reduktion aller Kurztriebblätter, die Sprossachsen blatthomolog

umgewandelt werden, um die Funktion der fehlenden Blätter zu übernehmen. Einmal

reduzierte Strukturen bzw. Blätter können nach der DOLLO´schen Regel nicht auf

demselben Wege zurück gewonnen werden.

Blattlose Kurztriebe machen funktionelle Anpassungen im Achsengewebe erforderlich,

um die Verluste der photosynthetisch aktiven Blätter zu kompensieren. Palisaden-

parenchym kann je nach Lichtexposition, wie für Thuja gezeigt (Abb. 6), an untypischen

Stellen im Blatt und im Spross lokalisiert sein. Bei Sciadopitys übernehmen Kladodien die

assimilatorischen Aufgaben (von Blättern) und sind funktionell bzw. morphologisch

optimal an diese Aufgabe angepasst (Abb. 16). Abgesehen von der achselständigen

Stellung sind die Sciadopitys-Kladodien daher sehr blattähnlich.

Unter der Voraussetzung, dass die Zuordnung fossiler Sciadopitys-Funde (z. B.

CHRISTOPHEL, 1973) korrekt ist, liegt es nahe aus dem Fund isolierter Kladodien auf einen

ehemals Laub abwerfenden Vorfahren zu schließen. KRAMER (1974) nimmt über

Ausführungen zu „Flüchtlinge vor der heranrückenden Eiszeit“ Bezug auf die

Zusammenhänge der tertiären und rezenten Florenverteilung unter Berücksichtigung der

klimatischen Bedingungen. Schilderungen wie diese lassen die eingangs erwähnte

Transformationsreihe (Abb. 42) hin zum blattartigen Kurztrieb durchaus vorstellbar

erscheinen.

Genetische Untersuchungen geben Einblicke auf einer neuen Ebene. Sie können

zusätzliche Erkenntnisse zu Ereignissen vor Sichtbarwerden von Anlagen liefern.

Aussagen zum Aufbau aus verschiedenen Organen und zu deren Anteil an den rezenten

Kladodien können so überprüft und möglicherweise konkretisiert werden. Aus

genetischer Sicht entspricht der Zustand Blatt bzw. laterales Organ vereinfacht „nur“

einer veränderten Gen-Expression. Das Ein- und Ausschalten bestimmter Gene nimmt

Einfluss auf den morphologischen Bauplan indem z. B. der Befehl für Zelldifferenzierung,

„Blatt-AN bzw. Sprossmeristem-AUS“, gegeben oder unterdrückt wird

(„Sprossmeristem-AN bzw. Blatt-AUS“). Diversität entsteht auf molekularer Ebene durch

Mutationen in regulatorisch wirksamen Sequenzen. Morphologische Veränderungen

können als Folge einer Expressionsänderung entstehen, indem Transkriptionsfaktoren

mit neuen Ziel-Genen interagieren. Darüber hinaus stehen Knox-Gene und von ihnen

kodierte Transkriptionsfaktoren eng mit der Biosynthese von Phytohormonen in

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DISKUSSION 99

Verbindung (HAY et al., 2002; HAKE et al., 2004; HAY et al, 2004 & Abb. 43). Knox-Gene

und (veränderte) Umweltfaktoren sind über eine entsprechende Antwort/Anpassung auf

genetischem und morphologischem Niveau (TESTONE, 2008) miteinander korreliert. Der

Promotor von KNAT3, einem Klasse 2 Gen, wird beispielsweise von SERIKAWA et al.

(1997) als lichtinduzierbar beschrieben. Der Expressionslevel eines Gens kann auch

Einfluss auf die morphologische Gestalt haben. Bei Überexpressionsmutanten von kn1

(knotted1) resultiert der Phänotyp aus Sprossmeristemen, die im ausdifferenzierten

Blattgewebe der Blattlamina als knotenförmige Strukturen erscheinen und im Fall von

Zea mays Blattader-assoziiert entstehen (z. B. VOLLBRECHT et al., 1991).

4.2 Keimlingsentwicklung

Bisher fehlten vergleichbare detaillierte Studien zur Keimlingsentwicklung bzw.

Kladodienentwicklung an Keimpflanzen von Sciadopitys. Die hier neu gewonnenen

Erkenntnisse zur Anlage der ersten Kladodien(primordien) an Sciadopitys-Keimlingen

(siehe 3.1.2) erwiesen sich wie erwartet als sehr hilfreich für den Einsatz in

Hybridisierungen. Die ersten Terminalknospen sind zum Zeitpunkt der Anlage von

Primärblättern bis zur Entwicklung der ersten Kladodienanlagen sehr viel übersichtlicher

als vegetative Knospen zweijähriger Triebe. Die Anzucht von Keimlingen, hat,

abgesehen von der zeitlichen Komponente, den Vorteil die optimalen Keimlingsstadien

für die Hybridisierung zu ermitteln. Besonders bedeutsam ist, dass diese Stadien auf

diese Weise auch in möglichst großen Mengen über gezielte Anzucht, „termingerecht“

produzierbar sind. Die richtigen Knospenstadien zu sammeln war nur dann

problematisch, wenn jahreszeitlich untypische, starke Witterungsschwankungen

auftraten und die Entwicklung der Knospen entsprechend stark mitschwankte. Die

Entnahme geeigneter Knospenstadien von Freilandpflanzen war nur in begrenzter

Abb. 43: Schema zu genetischen Interaktionen am Scheitelmeristem (nach Hay et al., 2004, verändert). Knox-Gene (weiß); Hormone (gelb); andere Transkriptionfaktoren (schwarz). STM-Expression im gesamten Meristem, fehlt aber im Bereich einer Blattanlage; STM unterdrückt Gibberillin-Oxidase-Expression (Expression auf Blatt beschränkt). ASYMMETRIC LEAVES 1&2 beschränkt auf Blätter, fehlen im Scheitelmeristem, werden über STM negativ reguliert; AS 1/AS 2-Aktivität, wenn STM herunter-reguliert; AS1-AS2-Heterodimere regulieren Knox-Genexpression im Meristem negativ. Abaxiale im Blatt exprimierte YABBY-Gene unterdrücken BP (und STM). Heterodimer-Bildung aus KNOX und BELL zum Transkriptionskomplex im Scheitelmeristem möglich.

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DISKUSSION 100

Anzahl möglich, wenn man deren verfügbare Menge mit der Anzahl der in relativ großer

Stückzahl produzierbaren Keimpflanzen vergleicht. Im Zuge der anfänglichen

Parameteranpassung bei der Hybridisierung waren die im Freiland entnommen Proben

entsprechend schneller aufgebraucht, ohne dass die gewünschten Ergebnisse zu

erzielen waren. Die hier gewählten Bedingungen für die Anzucht der Sciadopitys-Samen

führten verglichen mit anderen Angaben zur Aussaat (z. B. BÄRTELS, 1996 und

http://www.schirmtanne.de/sciadopitys_verticillata.php), zu einem zeitlich deutlich

optimierten Keimungs-Ergebnis. Das beschleunigte Auflaufen der Samen bleibt dennoch

um ein Vielfaches langsamer als jenes von Angiospermen wie z. B. Arabidopsis. Eine

nähere Betrachtung der gesammelten Stadien zeigte, dass die ersten beiden Kladodien

an ca. sechs Monate alten Keimlingen erkennbar werden, wenn Kotyledonen und

Primärblätter bereits ausgebildet sind (Abb. 20; Abb. 21). Vergleicht man die Abfolge der

Kotyledonen, Primärblätter und Kladodien der hier gesammelten Keimlings-Proben mit

den bei STRASBURGER (1872) beschriebenen Beobachtungen, so sind beide

Beobachtungen abgesehen von der Deutung, rein morphologisch gut vereinbar.

4.3 Methodenetablierung

Über erste Vorversuche an bekannten Gensequenzen von Arabidopsis (siehe 3.3.2:

KNAT1) konnte der Umgang mit den neuen molekulargenetischen Techniken erfolgreich

getestet werden. Auch der Test der für die Suche nach Knox in Sciadopitys konstruierten

degenerierten Primer dP-SvKnox for1/rev1 in Kombination mit einer bekannten Picea-

Sequenz (siehe 3.3.3: HBK1) war erfolgreich. Mit den getesteten degenerierten Primern

dP-SvKnox for1/rev1 war es möglich aus der noch unbekannten Sciadopitys-

Gensequenz ein 350 bp langes DNA-Fragment (Abb. 28 A) zu isolieren (siehe 3.4.3:

SvKnox). Nach erfolgreicher Sequenzierung (Abb. 29, Sequenzierung1: PEL bis

KKKKKGKL) dienten die für EDC bis GKL (Abb. 29) kodierenden Bereiche der

Basensequenz als Template für die Sondenherstellung und die Expressionsstudien

(vergleiche 3.4.4 & 3.5). Die Sciadopitys-Sequenz konnte zum 3’-Ende hin über eine

Sequenzerweiterung (siehe 3.4.3) um weitere 108 bp verlängert werden (Abb. 29,

Sequenzierung 2: EDC bis QINNW). Die Komplettierung der bisher identifizierten

Teilsequenz von SvKnox ist Voraussetzung für eine funktionelle Charakterisierung. Zur

Vervollständigung der Basensequenz wurden daher unterschiedliche Ansätze wie z. B.

3’- bzw. 5’-RACE verfolgt. Die Komplettierungsansätze blieben allerdings, abgesehen

von der 108 bp-Erweiterung, bisher ohne Erfolg. Gründe sind vermutlich im allgemein

schwachen Konservierungsgrad der Primärsequenz(en) zu suchen (vergleiche

Alignment/Abb. 22), durch die die Konstruktion geeigneter Primer für die noch

unbekannten terminalen Sequenzabschnitte entsprechend komplizierter ist. Für

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DISKUSSION 101

Sciadopitys kommt erschwerend hinzu, dass man aufgrund ihrer basalen Stellung im

Stammbaum, davon ausgehen muss, dass ihre Sequenz sehr ursprünglich ist und man

im Vergleich zu den bekannten, insgesamt recht variablen terminalen Sequenzen mit

einem zusätzlich gesteigerten Degenerationsgrad zu rechnen hat. Zusätzlich zur in

Teilen erfolgreichen Sequenzermittlung konnte für Sciadopitys auch die in-situ-

Hybridisierung inklusive der Fixierung etc. unter rein methodischen Gesichtpunkten

(siehe 3.5.1 & 3.5.2/Signal) erfolgreich angepasst werden.

Erste Vorarbeiten für einen Expressionsnachweis von Knox in P. trichomanoides

(dP-SvKnox for1/rev1, Vgl. 3.6) lieferten auch für Phyllocladus eine ca. 360 bp große

Teilsequenz (Abb. 39 A), die entsprechend der abgeleiteten Proteinsequenz (Abb. 40),

Knox-Charakter hat. Entsprechende Arbeiten für A. homolepis lieferten trotz Einsatz der

für Sciadopitys und Phyllocladus erfolgreichen Primerpaarung bisher keine Erfolge. Für

Abies war bereits der Gewebeaufschluss bzw. die Isolierung der Gesamt-RNA und DNA

(vergleiche 2.3.3) aus verschiedensten Geweben, möglicherweise aufgrund des hohen

Harzgehaltes, bislang nicht erfolgreich.

4.4 Knox & Sciadopitys

In neueren Arbeiten zum Thema Knox wird die Suche nach Knox-homologen Genen oder

von ihnen kodierten Proteinen auch in Nicht-Blütenpflanzen immer mehr thematisiert (vgl.

SINGER & ASHTON, 2007). Für Gymnospermen, genauer gesagt für Koniferen, sind hier im

Speziellen die Arbeiten von SUNDÅS-LARSSON et al. (1998), HJORTSWANG et al. (2002) und

GUILLET-CLAUDE et al. (2004) zu nennen, die sich speziell mit Picea befassen. Eine sehr

detaillierte Ausführung zu den Ursprüngen von Knox findet sich bei SINGER & ASHTON

(2007). Hier werden Arbeiten von Gymnospermen und Farnen, als Nicht-Blütenpflanzen,

mit Arbeiten zu Arabidopsis, als klassischer Angiosperme (Blütenpflanze), vergleichend

betrachtet. Über die allgemeinen Expressionsmuster und Phänotypen heterolog in

Arabidopsis eprimierter Knox-Gene aus Gynospermen oder Farnen wird aufgezeigt,

dass Klasse 1 Gene von Arabidopsis, Ceratopteris, und Picea als homolog zu betrachten

sind auch wenn der Verwandtschaftsgrad der drei Taxa vergleichsweise niedrig ist

(SINGER & ASHTON, 2007). Die Autoren leiten aus den bis dato existierenden Arbeiten zu

Knox-Genen in Algen (Chlamydomonas und Acetabularia) ab, dass in Algen Merkmale

für Klasse 1 und Klasse 2 Knox-Gene nebeneinander vorkommen. Aus Studien zur

Evolution der KNOX-Homöodomänenproteine ziehen BARATHAN et al (1999) den Schluss,

dass der Vorfahr der Knox-Gene in allen Teilen der Pflanze exprimiert war und erst

später, mit Klasse 1, der Schritt zum Herunterregulieren in Wurzel und Blatt auftrat.

Außerdem besitzt der Vorfahr aller Angiospermen bereits beide Klassen von Knox-

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DISKUSSION 102

Genen. SUNDÅS-LARSSON et al. (1998) datieren das gemeinsame Vorkommen beider Gen

Klassen sogar noch weiter zurück. Über Studien zu HBK1 zeigte sich, dass sowohl die

Knox-Gene allgemein und beide Klassen im Speziellen schon älter als 300 Millionen

Jahre sein müssen und schon der letzte gemeinsame Vorfahre der Gymno- und

Angiospermen Knox-Gene besessen haben muss. Bei SINGER & ASHTON (2007) werden

Genduplikationsereignisse (bzw. Anpassungen) hin zu den zwei Klassen auf einen

Zeitpunkt vor Abspaltung der Moose von der Linie zu den Gefäßpflanzen datiert.

Gleichzeitig werden die ursprünglichen Knox-Funktionen als notwendige Adaption in

Verbindung mit dem Schritt an Land gedeutet.

Leitet man aus der 458 bp langen Sciadopitys-Teilsequenz die entsprechend kodierte

Aminosäurensequenz, SvKNOX, ab und vergleicht man diese mit HBK1 aus P. abies,

wird deutlich, dass die ermittelte Gensequenz Teil eines Knox Klasse 1-Gens ist

(Abb. 29). Zwei für Klasse 2 typische Aminosäuren im Bereich der ELK-Domäne

(SUNDÅS-LARSSON et al. 1998) fehlen beispielsweise. Besonders die Übereinstimmungen

beider Sequenzen im Bereich ihrer ELK-Domäne und TALE-Homöodomäne legen die

Eigenschaft als Transkriptionsfaktor für SvKNOX nahe. Das auch in SvKNOX gut

konservierte, ca. 60 Aminosäuren lange Motiv der Homöodomäne, gilt allgemein als

DNA-Bindemotiv für die sequenzspezifische Erkennung anderer Gene (z. B. CHAN et al,

1998). Die Bindedomäne besteht aus den drei α-Helices, von denen besonders Helix III

der Sequenzerkennung dient. Über die Bindung der Zielgene kann so Einfluss auf deren

Expression genommen werden. Knox-Gene interagieren beispielsweise mit Genen der

Gibberillin-Biosynthese (GA-Oxidase, z. B. SAKAMOTO et al., 2001; HAY et al., 2002).

Darüber hinaus verfügt die gefundene Sciadopitys-Sequenz mit den Domänen ELK und

KNOX über Bereiche durch die die Interaktion mit anderen Proteinen möglich wird.

KNOX-Proteine bilden beispielsweise Transkriptionskomplexe mit BELL-Proteinen

(BELLAOUI et al., 2001; Abb. 43). Sowohl Helix III als auch die KNOX-Domäne konnten

bisher nur ansequenziert werden.

Mit den aus der in situ-Hybridisierung gewonnen Expressionsmustern (siehe 3.5.2) ist

keine zusätzliche Bestätigung der Zugehörigkeit von SvKnox zur Knox-Klasse 1 zu

erhalten. Konkrete Aussagen zum Organcharakter, wie man sie aus Studien an z. B.

KNAT1 (LINCOLN et al., 1994) oder HBK1 (SUNDÅS-LARSSON et al., 1998) gewohnt ist, sind

hier aus mehreren Gründen nicht sicher möglich: Durch die Kombination einer langen

Detektionszeit mit einer relativ niedrigen Sondenkonzentration ist ein im Vergleich zu

Ergebnissen anderer Arbeiten (s.o) nur schwaches Signal vor intensivem Hintergrund

erkennbar. Aus diesem Grund sind erwartete Signale, sofern sichtbar (Abb. 34 bis 36),

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DISKUSSION 103

nur schwer zu eruieren. Sense- und Antisense-Ansatz zeigen vergleichbare Signale.

Diese Signale liegen in beiden Fällen in Bereichen erhöhter meristematischer Aktivität.

Die Lokalisierung der Signalhäufung erinnert an die für KNAT1 beschriebenen

Expressionsmuster (vergleiche. LINCOLN et al., 1994). Die Sense-Kontrolle sollte im

Normalfall kein Signal liefern. Es lässt sich nur vermuten, dass die hier dennoch

sichtbaren Signale über unspezifische Bindungen der Sense-Sonde entstanden sind.

Unspezifische Bindungen sind bei näherer Betrachtung der zur Sondenherstellung

gewählten Template-Sequenz (s.o.) auf das 3’-Ende mit hohem A/T-Anteil (vergleiche

Abb. 29: KKKKK) zurückzuführen und sind daher auch für die Antisense-Sonde nicht

auszuschließen. Ein hoher A/T-Anteil kann zu erhöhter Fehlpaarung bzw. unspezifischen

Bindungen führen. Fehlerhafte Signale durch cDNA-Reste aus der Sondenherstellung

können ausgeschlossen werden, weil am Ende der Reaktion ein DNA-Verdau

durchgeführt wurde. Die Signalentwicklung für Sense-Kontrollen mit Ähnlichkeit zum

eigentlichen Signal ist leider keine Seltenheit und wird auch bei ZACHGO (2002)

entsprechend diskutiert. Die Tatsache, dass die Färbung der Antisense-Proben

intensiver ist als die der Kontrollen lässt einen erhöhten Anteil spezifischer Bindung bzw.

„richtiger Signale“ zwar vermuten, bleibt aber spekulativ. Zur Sondenherstellung bietet

sich als Template der aus einer nachträglichen Sequenzerweiterung stammende,

erweiterte 5’-Bereich bzw. das INNW-Proteinmotiv sehr viel mehr an (Abb. 29). Hier ist

die Wahrscheinlichkeit von unspezifischen Bindungen durch den höheren GC-Anteil

deutlich herabgesetzt. Dieser Ansatz mit spezifischerer Sonde kann allerdings erst

verfolgt werden, wenn die bis dato noch fehlenden sechs Aminosäuren (Abb. 29) auch

identifiziert sind. Verlässliche Aussagen zu Expressionsmustern sind daher erst möglich,

wenn unspezifische Bindungen der Sense-Sonde so gut wie möglich auszuschließen

sind. Für zukünftige Hybridisierungen erscheint der Ansatz mit der spezifischeren Sonde

sehr Erfolg versprechend. Außerdem erscheint der Einsatz einer höheren

Sondenkonzentration kombiniert mit einer kürzeren Detektionszeit (und ohne Deckgläser)

lohnenswert, weil so zu intensive Hintergrundsignale zu vermindern sind. Natürlich ist es

dann auch möglich, dass sich die in 3.5.3 sichtbare Signalverteilung (KNAT1-ähnliches

Expressionsmuster, vergleiche Abb. 44) bestätigen lässt.

Man muss allerdings auch damit rechnen, dass die funktionelle Überlagerung der

Kladodien auf morphologischer Ebene auch Einfluss auf die genetische Expression

haben kann. Die mögliche Folge wäre ein sehr spezifisches und neues

Expressionsmuster wie es beispielsweise auch schon für Knox Klasse 1-Gene in der

Blattentstehung von Lycopersicon esculentum (Tomate), mit Signalen in Meristem und

Blattprimordien, gezeigt wurde (CHEN et al., 1997). Für die Kladodien von Sciadopitys ist

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DISKUSSION 104

auch nicht abwegig, dass die Klasse 1 ähnliche Sequenz dennoch ein unspezifisches,

Klasse 2-ähnliches Muster mit Expression in allen Organen hervorbringt.

Die klassische Trennung beider Knox-Klassen könnte aus zwei Gründen fehlen. Erstens

kann Sciadopitys so ursprünglich sein, dass das Duplikationsereignis, das zu Trennung

der beiden Klassen führte hier nicht oder nur unvollständig stattgefunden hat. Eine

zweite Ursache könnte auch in der funktionellen Überformung bzw. der Anpassung auch

auf genetischer Ebene, durch Sciadopitys-spezifische Duplikationsereignisse, zu suchen

sein. Zeigen sich Unterschiede auf genetischer Ebene ist fraglich, wie groß das

Zeitfenster ist in dem dies noch erkennbar ist/bleibt (vergleiche BARATHAN et al., 2002).

Ein Nachweis ist dann entsprechend schwieriger.

Interessant und hilfreich erscheinen in diesem Zusammenhang auch Knox-

Expressionsmuster von den bei HIRAYAMA et al. (2007) als intermediäre Organe

(„doppelte Organidentität“) beschriebenen Ruscus-Phyllokladien, die im genannten

Artikel bereits angekündigt werden, bis dato aber noch nicht publiziert sind. Die anhand

von Expressionsstudien zu Knox- und Yabby-Genen beschriebene „Doppelte Identität“

der Phyllokladien (HIRAYAMA et al., 2007) hilft wenig, wenn wie bei Ruscus die Ableitung

von Vorläufern mit eindeutigen Identitäten sicher ist. Über Ruscus wird eher deutlich,

dass die „doppelte Identität“ sich mehr als Hinweis dafür eignet, dass genetische

Identität noch schneller verloren geht oder verwischt wird als morphologische Identität.

Abb. 44: Schematische Darstellung ausgewählter Typen von Expressionsmustern im Scheitelmeristem (nach HAKE & ORI, 2002 & REISER et al., 2000, jeweils verändert). Zwei Grundmuster der Expression (violett) von STM & KNAT/BP in Zea (Mais), Oryza (Reis), Nicotiana (Tabak) und A. thaliana (HAKE & ORI, 2002). STM-Expression im gesamten Scheitelmeristem, Ausnahme sind Ausgangszellen für neue Blattanlage (P0). Expression von KNAT/BP (ähnlich STM) in bestimmten Meristemregionen (z.B. Internodien-bereichen/Blattbasen, Leitbündelflanken/sehr junge Achse). LeT6-Expression (REISER et al., 2000) in gesamtem Meristem inklusive P0, in jungen Blattprimordien (P) und adaxialen Regionen älterer Primordien exprimiert (vgl. CHEN et al., 1997). Hypothetische Zuordnung (?) von Sciadopitys zu gezeigten Grundmustern wurde ergänzt.

Arabidopsis Lycopersicon

STM KNAT/BP LeT6

? Sciadopitys ? ? Sciadopitys ?

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DISKUSSION 105

4.5 Ursprung des Gymnospermenblattes

Die Übertragungen der aus Sciadopitys gewonnen Ergebnisse auf die Nadelblätter

anderer Gymnospermen bzw. deren mögliche polyphyletische Entstehungsweise stehen

weiterhin aus. Um die eingangs erwähnten, möglichen Zusammenhänge zwischen Abies

und Sciadopitys aufzudecken, könnten die Knox-Expressionsmuster bei der

Nadelentstehung von Abies möglicherweise schon aussagekräftig genug sein. Die

Phyllokladienentstehung bei Phyllocladus könnte zusätzliche Hilfestellung bei der

Auswertung der Expressionsmuster von Sciadopitys geben. Geht man von der allgemein

gültigen morphologischen Sprossnatur für die Phyllokladien von Phyllocladus und der

normalen Blattnatur von Abies-Nadeln aus, müssten sich die zu erwartenden

Expressionsmuster eigentlich von selbst ergeben (Abb. 45).

An dieser Stelle kann die Lokalisierung der zu erwartenden Expressionsmuster nur rein

hypothetisch behandelt werden, weil diesbezügliche Ergebnisse nicht existieren

(Veröffentlichungen fehlen). Müssten Vermutungen angestellt werden, dann sollten

Expressionsmuster bei der Nadelentstehung (als normale Blätter) bei Abies mit denen

bei Picea (HBK1) übereinstimmen. Die Expression für Knox-Gene (Klasse 1) sollte auf

das Meristem beschränkt und vom (Anlage-) Bereich der Nadelprimordien

ausgeschlossen sein (Abb. 45 B). Auch Phyllocladus sollte die spezifischen

Expressionsunterschiede der Klasse 1-Gene in Meristem und Blatt (Vgl. z.B. KNAT1 oder

STM) wiedergeben. Eine Expression wäre hier nur für die Meristeme bzw. jungen

Abb. 45: Demonstration hypothetischer Expressionsmuster an REM-Aufnahmen von A. homolepis &P. trichomanoides. A: junges Phyllokladium von P. trichomanoides zu Beginn der Differenzierung der Teilabschnitte des Phyllokladiums (Schuppenblätter der linken Seite entfernt), nach RIEGER, 2002: mit Schuppenblatt (Sb) und Phyllokladien-Teilabschnitt (T); entsprechende Schemazeichnung des REM-Objektes nach Austrieb & Expressionsmuster (lila) wurden ergänzt. B: junge, vegetative Knospe von A. homolepis (vgl. Abb. 12). mit jungen Nadel(blatt)primordien (Nb) am Vegetationskegel (Vk), hypothetisches Expressionsmuster wurde ergänzt.

A B

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DISKUSSION 106

Bereiche der Phyllokladien, nicht für (Schuppen-)Blätter zu erwarten (Abb. 45 A). Es

besteht natürlich auch die Möglichkeit, dass Expressionsmuster zusammengesetzter

Phyllokladien denen von zusammengesetzten Blättern der Tomate (s. o.) nahe kommen.

Die Schuppenblätter bzw. Tragblätter der Seitenverzweigungen müssten dann

entsprechend innerhalb des gesamten Phyllokladiums Signale zeigen. Allerdings kann

erst in Kombination mit Sciadopitys abgewogen werden, ob die oben hypothetisch

beschriebenen Abies-Resultate auf eine normale Blattnatur zurück zu führen wären oder

dies aus einer auf genetischem Level wirksamen gewordenen funktionellen

Überlagerung von umgewandelten Sprossen resultiert.

4.6 Ausblick

Die Homologie bzw. Orthologie von Genen verschiedener Organismen gemeinsamen

Ursprungs, ist teilweise kompliziert festzustellen. Die unabhängige Entstehung von

paralogen Genen innerhalb eines Organismus, durch Genduplikation, kann den

homologen Ursprung zu Genen anderer Organismen sehr verwischen. Die in Sciadopitys

gefundene Sequenz spricht dafür, dass es sich bei SvKnox um ein PaHBK-orthologes

Klasse1 Knox-Gen handelt. Um definitive Aussagen treffen zu können sind, zusätzlich

zur Komplettierung der Sequenz, mindestens noch die entsprechenden Ergebnisse der

Expressionsstudien (mit optimierter Sonde) abzuwarten. Zukünftige Versuche beinhalten

daher zu allererst die Herstellung einer spezifischeren Sonde über die Verwendung der

erweiterten Sequenz als Template. Außerdem erscheint der Einsatz höherer

Sondenkonzentrationen kombiniert mit einer kürzeren Detektionszeit (und ohne

Deckgläser) lohnenswert, weil so zu intensive Hintergrundsignale zu verhindern sind. Bei

intermediär erscheinenden Organen, wie z. B. Sciadopitys-Kladodien, empfiehlt es sich,

wie bereits bei HIRAYAMA et al. (2007) gezeigt, zusätzlich zu Knox-Genen auch

Hybridisierungen mit Blatt-typischen Genen, z. B. Yabby, durchzuführen und beide

Ergebnisse miteinander zu vergleichen. Außerdem sollte zusätzlich zum reinen Nachweis

der mRNA auch der Verbleib des kodierten Transkriptionsfaktors erfolgen. Eine ähnliche

Expression von Genen deutet nicht zwangsläufig auf eine gleiche Funktion hin. Zuerst

muss geklärt werden, wo das dazugehörige Protein, als eigentlich wirksame

Komponente, vorkommt. Geplant ist eine Hybridisierung durchzuführen, in der über

doppelte Markierung (JACKSON, 2002) gleichzeitig die mRNA und das dazugehörige

Protein parallel im Gewebe nachgewiesen werden können. Erste Vorbereitungen für die

Proteinmarkierung sind über die heterologe Expression des SvKNOX-Proteins in E.coli

bereits getroffen (siehe 3.5.3) und stehen für eine erforderliche Antikörperherstellung

bereit. Zu den weiteren Arbeiten zählt außerdem der Expressionsnachweis von Knox in

Phyllocladus. Die ermittelte Sequenz zur Herstellung einer Antisense-mRNA-Sonde für

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DISKUSSION 107

die Hybridisierungsreaktion konnte bereits ermittelt werden (vergleiche 3.6). Ein

entsprechender Ansatz ist darüber hinaus auch für A. homolepis geplant. Die

Vorarbeiten zur Sequenzsuche müssen allerdings im Vorfeld weiter optimiert werden.

Außerdem sollten Interaktionsstudien mit bekannten Knox-Bindepartnern folgen. Ein

Two Hybrid-Ansatz mit KNOX- und BELL-Proteinen als Interaktionspartner kann weitere

Klarheit bringen, ob die nahe liegende Orthologie von SvKNOX zu HBK1 bzw. zu Knox

im Allgemeinen zu stützen ist. Besonders interessant für die Orthologie-Frage ist welche

phänotypischen Ausprägungen aus einer SvKnox-Expression in Arabidopsis resultieren

würden und welche neuen Erkenntnisse aus einem anschließenden Vergleich mit bereits

bestehenden HBK1-Phänotypen gezogen werden können.

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ZUSAMMENFASSUNG

108

5 ZUSAMMENFASSUNG Anhand der durchgeführten morphologischen Studien kann eine hypothetische

Transformationsreihe zur Umwandlung von Kurztrieben in normale Blätter formuliert

werden. Der Schritt der vollständigen Tragblatt-Reduktion innerhalb der Reihe erscheint

durch die reduzierte Gestalt der Tragblätter von Sciadopitys-Kladodien sehr nahe

liegend. Die morphologische Ähnlichkeit der Kladodien mit normalen Nadeln kann als

Folge der funktionellen Überlagerung gesehen werden. Die Anpassungen der Kladodien

an ihre photosynthetische Aktivität (Funktion als Blattersatz) bestätigen, dass sie bei

Wegfall ihres Tragblattes als Bezugssystem nicht mehr von normalen Blättern, wie z. B.

den Nadeln von A. homolepis, zu unterscheiden sind.

Die Etablierung der Methoden, um diese Transformation auch entwicklungsgenetisch zu

erfassen, war in vielerlei Hinsicht erfolgreich: Im Zuge der entwicklungsgenetischen

Etablierungsversuche konnten für S. verticillata degenerierte Primer konstruiert werden

mit denen aus einer bis dato unbekannten Sequenz erstmalig ein Sciadopitys-

spezifisches Knox-Gen amplifiziert werden konnte. Die neu ermittelte Teilsequenz diente

nicht nur als Template für die Herstellung DIG-markieter mRNA-Sonden für den

Expressionsnachweis, sondern diente auch über heterologe Expression in E.coli der

erfolgreichen Gewinnung eines dazugehörigen KNOX-Proteinfragments, des kodierten

Transkriptionsfaktors. Die Methodik der in-situ-Hybridisierung konnte über Abwandlung

eines für Angiospermen etablierten Protokolls erfolgreich an Sciadopitys angepasst

werden.

Die Sciadopitys-Keimlinge aus eigener Anzucht erwiesen sich als eine sehr gut Quelle

zur gezielten Gewinnung gewünschter Entwicklungsstadien für die in-situ-

Hybridisierungen. Die terminalen Knospen der Keimlinge stellen sehr viel

übersichtlichere Objekte dar als die im Freiland gesammelten Knospen. Ein weiterer

Vorteil liegt in der durch konstante Warmhausbedingungen berechenbareren

Entwicklung im Vergleich zu den z. T. starken Witterungsschwankungen unterworfenen

Freilandproben. Gleichzeitig konnte anhand der durchgeführten verschiedenen Ansätze

zu Untersuchungen an Sciadopitys-Keimlingen über optimierte Anzuchtbedingungen

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ZUSAMMENFASSUNG

109

außerdem die herkömmliche Dauer bis zum Auflaufen der Samen und der Entwicklung

erster Kladodien verkürzt werden.

Mit den erfolgreich zur Knox-Suche in Sciadopitys eingesetzten Primern war auch aus

der unbekannten Sequenz von P. trichomanoides die erfolgreiche Ermittlung einer ersten

Teilsequenz mit Knox-Charakter möglich. Die hier konstruierten Primer erscheinen daher

auch für die Suche nach Knox in Abies geeignet.

Zusammenfassend ist zu sagen, dass die erste Isolierung eines Knox-Gens aus der noch

unbekannten Sciadopitys-Sequenz gelungen ist und die Anpassung des verwendeten

in-situ-Hybridisierungs-Protokolls (für Angiospermen) an Gymnospermen-Verhältnisse

erfolgreich war. Für eine komplette Charakterisierung des gefundenen Knox-Gens sind

mit einer Sequenzerweiterung zur Komplettierung des neuen Knox-Gens bereits erste

Teilerfolge erzielt. Mit der ersten Sequenzverlängerung und erfolgreichen

Proteinisolierung sind bereits die Vorbereitungen für eine zukünftige in-situ-

Hybridisierung mit optimierter Sonde inklusive eines doppelten Nachweises von mRNA

und ihrem entsprechenden Proteins (kodierten Transkriptionsfaktors) im Gewebe

getroffen. Außerdem können zukünftige Expressionsnachweise der gefundenen

Phyllocladus-Sequenz für ein Knox-Gen als Referenz für Ergebnisse in Sciadopitys

genutzt werden.

Inwiefern die Ergebnisse der noch anstehenden Versuche helfen die Frage nach der

Entstehung von Nadelblättern aus umgewandelten Kurztrieben zu beantworten bleibt

abzuwarten. Mit der Kombination aus Morphologie und Molekulargenetik im Rahmen der

Methodenetablierung neu gewonnenen Erkenntnisse wurden in dieser Arbeit bereits

erste grundlegende Schritte unternommen die Annahme der polyphyletischen

Entstehung des Gymnospermenblattes zu überprüfen. Die Qualität der erzielten in-situ-

Hybridisierungen muss und kann zweifellos weiter verbessert werden. Dies beinhaltet

allerdings nicht zwingend, dass die Auflösung im Hinblick auf die untersuchte

Fragestellung besser wird und zu einem eindeutigen Ergebnis führt.

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NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

NCBI-BLAST Search: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast

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ANHANG 116

7 ANHANG

Aminosäuren/Code: Aminosäure Abkürzung Ein-Buchstaben-Code Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Aspartat Asp D Cystein Cys C Glutamin Gln Q Glutamat Glu E Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp W Tyrosin Tyr Y Valin Val V

Basen/degenerierter Code:

degenerierte Basen

Basen

A T G C M + + R + + K + + S + + Y + + W + + D + + + H + + + V + + + B + + + N + + + +

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ANHANG 117

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ANHANG 118

A2: Verifizierung der aus SvKnox abgeleiteten Aminosäurensequenz eines Homöodomänen-Proteins der KNOX-Familie & der dazugehörigen Nukleotidsequenz. A: Ausschnitt eines erfolgreichen Sequenz-vergleichs auf Aminosäurenebene in der NCBI-Datenbank („BLAST“-Suche) mit insgesamt 100 Suchergebnissen. Die höchste erzielte Übereinstimmung der eingesetzten Teilsequenz (PELDQFM bis QINNW, vergleiche Abb. 29) zeigte sich für KNOX-Proteinen anderer Gymnospermen (grüner Rahmen) mit max. 70 %. Übereinstimmung mit KNAT1 aus A. thaliana lag bei 61 %. B: Ausschnitt eines erfolgreichen Sequenzvergleichs auf Nukleotidebene. Gezeigt sind die ersten vier von insgesamt 100 Treffern, die Übereinstimmung mit den gezeigten Gymnospermen-Sequenzen liegt bei 76 %.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast

……

……

A

B

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ANHANG 119

A3: S. verticillata, Astrablau-Safranin gefärbte Blattquerschnitte. Lichtmikroskopische Übersichtsaufnahmen (MIA). A: Keimblatt. B: Primärblatt. Cuticula (C); Epidermis (E); Hypodermis (H); Harzkanal (HK); Interzellulare (I); Leitbündel (LB); Leitbündelscheide (LS); Palisardenparenchym; Schwammparenchym (Sp).

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ANHANG 120

A4: S. verticillata, in-situ-Hybridisierung an Querschnitten von Primärblättern. Lichtmikroskopische Aufnahmen von Übersichts- (A-C, MIA) und Detailufnahmen (E-F) der mit unterschiedlichen Sonden behandelten Gewebeschnitte. A & B: Kontrolle 1, unmarkierte Antisense-mRNA-Sonde. C & D: Kontrolle 2, DIG-markierte Sense-mRNA-Sonde. E-F: Antisense-Probe, DIG-markierte Antisense-mRNA-Sonde. Cuticula (C); Epidermis (E); Harzkanal (Hk); Interzellulare (I); Leitbündel (LB); Leitbündelscheide (LS); Palisadenparenchym (Pp); Schwammparenchym (Sp).

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DANKSAGUNG

Ich danke Herrn Prof. Stützel für seine hilfreichen Anregungen und das in mich gesetzte Vertrauen

bei der Überlassung dieses Themas.

Herrn Prof. Tollrian danke ich für die freundliche Übernahme des Korreferates.

Vielen Dank an Herrn Dr. Stefan Gleissberg und seine Arbeitsgruppe am Institut für Spezielle

Botanik der Universität Mainz, für die Überlassung des laboreigenen Versuchsprotokolls zur in-situ-Hybridisierung sowie für die freundliche Einladung nach Mainz und die damit verbundene

Demonstration eines kompletten Hybridisierungsablaufes vor Ort.

Im Zuge der Methodenetablierung danke ich …

… der Abteilung Systembiochemie (Prof. Erdmann) am Institut für Physiologische Chemie, der

Fakultät für Medizin an der Ruhr-Universität Bochum, für die Mitbenutzung ihrer Labore und

Geräte sowie den Genuss eines etablierten Labors und die damit verbundene Möglichkeit zur

Realisierung meiner genetischen Versuche. Ein besonderer Dank geht an Dr. Markus Deckers für

ein Stück seiner Laborbank, seine fachliche Unterstützung und Beratung sowie seine ständige

Diskussionsbereitschaft, die mir eine große Hilfe waren und im großen Maße zum Gelingen dieser

Arbeit beigetragen haben.

…dem Lehrstuhl Biologie der Mikroorganismen (Prof. Naberhaus) für das Autoklavieren der

Lösungen und die freundliche Leihgabe einzelner Geräte sowie der AG Parasitologie (Prof.

Schaub) für einen zusätzlichen, kühlen „Sonden-Stellplatz“.

Für das Pflanzenmaterial danke ich den Botanischen Gärten Bochum und Marburg. Herrn M.

Goerigk danke ich für die gastfreundliche Aufnahme meiner Sicadopitys-Anzuchten, die tägliche

Wässerung und eine sehr freundliche „Aufzucht-Atmosphäre“. Gärtnermeister U. Katz danke ich

für den Tipp und die schnelle Hilfe mit Confidor im Kampf gegen den Nematodenbefall.

Ich bedanke mich bei allen „SpezBots“ - den Mitgliedern des Lehrstuhls für Evolution und

Biodiversität der Pflanzen und meinen Mitstreitern.

Ein Dankeschön an Petra Lerch für die unübertroffene Voraussicht in allen organisatorischen

Belangen.

Ein Dankeschön an Ilse Wessel für ihre stetige Hilfsbereitschaft, die nur durch ihre

unvergleichliche Freundlichkeit übertroffen wurde.

Ein Dankeschön an Sabine Adler, die Hüterin der Material-Schatzkiste. Sabine, Danke für deinen

„heißen Draht“ zur Werkstatt und den „Bestell-Firmen“ UND die Quelle der Nervennahrung (nicht

wahr Julia!?).

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Danke an Hanno, den Administrator mit dem „südländischen Charme“, für den es eigentlich keine

Computerprobleme gibt, die er nicht durch Handauflegen lösen kann.

Patrick, dem Unverbesserlichen, möchte ich für die schon legendären Sammlungsreisen danken,

die nicht nur fachlich eine Bereicherung waren, sondern allen Beteiligten wohl in vielerlei Hinsicht

in Erinnerung bleiben werden (CODE: Blondes (Meer-)Schwein123).

Ein herzlicher Dank geht an Veit(i), den nervösen „Adoptiv-Vater“ aller (!) Scia-Keimlinge, dessen

enorme Begeisterungsfähigkeit und Tatendrang nicht nur den Lehrstuhl immens bereichern,

sondern auch mir immer wieder neuen Schwung brachten.

Eine besonders große MADS-Box (Mein Ausserordentliches DankeSchön) geht an Julia als ein

kollegiales und freundschaftliches Dankeschön für die beste Reisebegleitung in die „Molli-Welt (für Anfänger)“ und die gemeinsame Zeit in 773 & 772.

Meinen Freunden danke ich für den verständnisvollen und gnädigen ;) Umgang mit dem

„Akademischen Way of life“.

Ein ganz liebes Dankeschön an meine Eltern, für ihren unerschütterlichen Glauben an mich und in

meine Arbeit – DANKE!

Und ein riesigengroßes doppeltes Dankeschön an meinen Freund, fachlich & privat. DANKE, dass

du so bist, wie du bist – ein ganz besonderer Mensch.

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LEBENSLAUF

Nicole Hille

geboren am 29.09.1976 in Dortmund

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Schulische Ausbildung:

1983 bis 1987 Lutherschule, Waltrop

1987 bis 1996 Theodor-Heuss-Gymnasium, Waltrop

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Studium:

1996 bis 2002 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

2001 bis 2002 Diplomarbeit

am Lehrstuhl Spezielle Botanik

Fakultät für Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

bei Prof. Dr. Th. Stützel

Abschluss: Diplom

seit 2002 Wissenschaftliche Hilfskraft/Mitarbeiterin am Lehrstuhl Spezielle

Botanik, Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum

11/2002-03/2004 Mitarbeit im Drittmittelprojekt am Lehrstuhl Spezielle Botanik:

Wurzeleinwuchs in Abwasserleitungen und –kanäle - Ursachen,

Prüfung & Vermeidung (Ministerium für Umwelt & Naturschutz

des Landes NRW)

seit 2004 Wissenschaftliche Mitarbeit & Promotion am Lehrstuhl Spezielle

Botanik (seit 2007: LS Evolution und Biodiversität der Pflanzen),

Fakultät für Biologie (seit 2007: Fakultät für Biologie und

Biotechnologie) der Ruhr-Universität Bochum

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ERKLÄRUNG

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen

Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel

verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um

fünf in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 14.04.2008

(Nicole Hille)