MICROBIOLOGIA: CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST DEL … · MICROBIOLOGIA «TRADIZIONALE»… DL 31 MICROBIOLOGIA :CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST del DNA Decreto Legislativo 2

MICROBIOLOGIA: CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST DEL DNA E TOSSICITA’

dott.ssa de Lellis Laura

Bologna, 12/10/2017

� LABORATORI HERAtech

� SETTORE MICROBIOLOGIA

� TEST DNA - ANALISI SALMONELLA spp.

� TOSSICITA’ - VIBRIO FISHERI

3HERAtech

MICROBIOLOGIA

INNOVATIVA

MICROBIOLOGIA

INNOVATIVA

MICROBIOLOGIA

«TRADIZIONALE»…

MICROBIOLOGIA

«TRADIZIONALE»…

Metodiche classiche• Metodi qualitativi• Metodi quantitativi: conteggio UFC• Metodi semiquantitativi: MPN

Metodiche alternative• Metodiche biomolecolari quali

Real Time PCR (Salmonella spp, Legionella, enterovirus...)

� L’impiego di metodi d’analisi alternativi è accettabile quando talimetodi siano validati in base al metodo di riferimento.

MICROBIOLOGIA: CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST de l DNA E TOSSICITA’

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Settore Microbiologia

Parametri microbiologici o Enterococchio Escherichia coli

Parametri indicatorio Batteri coliformio Clostridium perfringenso Conte a 37 e 22°C

Parametri accessorio Algheo Batteriofagi anti E.coli -Nematodi a vita libera

o Salmonellao Funghi e Lievitio Pseudomonas aeruginosa e Stafilococchi o Protozoi e altri elementi figuratio Attinomicetio Spore di clostridi solfito-riduttori � Legionella� SBI (sludge biotic index)� Batteri filamentosi

Analisi acque

POTABILI

Analisi acque

REFLUE

Analisi fanghi

MICROBIOLOGIA

«TRADIZIONALE»…

MICROBIOLOGIA

«TRADIZIONALE»…

DL 31

MICROBIOLOGIA :CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST de l DNA

Decreto Legislativo 2 febbraio 2001, n. 31 : “Attuazione della direttiva 98/83/CErelativa alla qualità delle acque destinate al consumo umano»Decreto 14 giugno 2017 del Ministero della Salute, di recepimento della direttiva(UE) 2015/1787

5HERAtech

Perché utilizzare un metodo alternativo? � Più rapido � Ridotto impiego di personale � Ridotto uso di reagenti� Migliore performance � Multitarget� Patogeni emergenti � Intervento in situazioni di emergenza

Come procedere� Individuare il metodo più adatto� Valutare la possibilità di utilizzare kit

pronti presenti in commercio� Applicare in laboratorio � Validare il metodo � Accreditare la prova

EFFETTUARE la VERIFICADELLE PERFORMANCE INLABORATORIO

� SALMONELLA spp. nelle acque

Metodo M10R 793.1 Acque: Ricerca di Salmonella spp.

Tecnica: RT-PCR------Accreditato----

MICROBIOLOGIA: CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST de l DNA

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� SALMONELLA spp. nelle acque

Metodo M10R 793.1 Acque: Ricerca di Salmonella spp.

Tecnica: RT-PCR------Accreditato----

MICROBIOLOGIA: CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST de l DNA

� Protocollo interno di validazione ( verifica di sensibilità, deitempi di analisi, applicabilità in laboratorio per costi eformazione del personale coinvolto)

� Processo di accreditamento

Ricerca di salmonella in ambiente idrico – i vantaggi della PCR real time 2011 Energia e Ambiente oggi

IL METODO ACCREDITATO DAL LABORATORIO HERAtech sfrutta la PCR-RT :

�Tempi di risposta NOTEVOLMENTE DIMINUITI

�Procedura e lettura automatica (minor errore umano)

�Kit pronti all’uso (migliore gestione reagenti a magazzino)

�Sistema miniaturizzato che riduce i rifiuti speciali

Possibilità di effettuare l’analisi in

emergenza con tempi di

risposta di 24 ore

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MICROBIOLOGIA : CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST d el DNA

COSA E’ LA RT-PCR (REAL-TIME PCR)….

…Metodica sensibile, veloce e versatile che consente di otteneregrandi quantità di materiale genetico da piccole quantità di DNA.

Analizza specifiche sequenze che altrimenti costituirebbero bersaglirari in un genoma complesso.

Reazione enzimatica di amplificazione diun segmento di DNA a partire da una coppiadi primers necessari per l’innesco direazione.

Una zona specifica di DNA viene amplificata,copiandola un enorme numero di volte e resavisibile e manipolabile per l’analisi .

8HERAtech

MICROBIOLOGIA CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST DNA

IL DNA amplificato viene rilevato in tempo reale dallostrumento: non è prevista nessuna manipolazionepost-amplificazione.

Il sistema real-time permette di.• rilevare fino a 1 copia di DNA per campione• prevede un controllo interno per monitorare in modo

sicuro il processo di amplificazione• evidenzia eventuali falsi negativi (inibitori di

reazione)

�Termociclatore Stratagene Mx3005P

�kit Rapid-Pathogen Detection system

AOAC Certificate of Performance TestedSM Status No. 070402 –ADIAFOOD Rapid Pathogen Detection System for Salmonella

LABORATORIO HERAtech

9HERAtech

MICROBIOLOGIA : CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST D NA

Sistema automatizzato:rilevazione dei frammenti amplificati perregistrazione di emissione difluorescenza (ibridazione di sondespecifiche marcate con molecolefluorescenti).

Nel momento in cui si appaiano allasequenza complementare, emettono ilsegnale di fluorescenza

SI SEGUE ISTANTE PER ISTANTEL’INDIVIDUAZIONE di SALMONELLA

METODO TRADIZIONALE - APAT IRSA 7080/

- RAPPORTI ISTISAN 07/5 ISSA 011A

- FILTRAZIONE IN ACQUA PEPTONATA

- CRESCITA A 37°C (24h)- PASSAGGIO IN RV (24h)

- SEMINA SU PIASTRA DI HEKTOEN (24h+24h)

- IDENTIFICAZIONE E CONFERMA di COLONIE SOSPETTE

Test di conferma

test biochimici e/o sierologiciESITO

4 GIORNI PER NEGATIVI6 GIORNI PER POSITIVI

METODO ALTERNATIVOPCR - RT

- FILTRAZIONEIN ACQUA PEPTONATA

- CRESCITA A 37°C (24h)- REAZIONE DI PCR

(3h tot)

CONFERME NON NECESSARIE

ESITO

2 GIORNI PER NEGATIVI E POSITIVI

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• ACCURATEZZA: ELEVATA SPECIFICITÀ E SENSIBILITÀ, LIVELLI DI RILEVAZIONE MIGLIORI DI QUELLI DEL

METODO DI RIFERIMENTO

• RAPIDITÀ DEL RISULTATO: ELIMINAZIONE DELLA PREPARAZIONE DI TERRENI DI COLTURA E DI PROVE DI

CONFERMA; ESITO IN 24-48 ORE

• FACILITÀ D ’USO: KIT DI ANALISI COMPLETI, SOFTWARE SEMPLICE, FASI DI ESTRAZIONE E CICLI

VISUALIZZABILI A VIDEO, RISULTATI CHE NON NECESSITANO DI INTERPRETAZIONI SOGGETTIVE

• MIGLIORE TRACCIABILITÀ DEI DATI: ARCHIVIO INFORMATICO DI TUTTE LE FASI ANALITICHE

MICROBIOLOGIA : CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST d el DNA

Come procedere nel prossimo futuro….

Sistema unico di applicazione RT-PCR per:o screening Legionellao ricerca di enteroviruso Salmonella spp ….

PUNTO DI FORZA: METODO ALTERNATIVO CHE PERMETTE SUPPORTO / CONSULENZA AL CLIENTE IN TEMPI RAPIDI

� LABORATORI HERAtech

� SETTORE MICROBIOLOGIA

� TEST DNA - ANALISI SALMONELLA spp.

� TOSSICITA’ - VIBRIO FISHERI

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MICROBIOLOGIA : CONTROLLI BATTERIOLOGICI TEST del D NA E TOSSICITA’

Per stabilire la tossicità di prodotti e sottoprodottidelle attività umane - sostanza note, miscele(rifiuti- fanghi) o acque di scarico - per undeterminato ECOSISTEMA si utilizzano:

Test su bioindicatori allevati in laboratorio

Daphnia magnacrostaceo cladocero

� Buon indicatore : breve ciclo vitale � Diverse tipologie di matrici,

sostanze chimiche (mg/L), acque di scarico e superficiali (%),

rifiuti (% o mg/L) e fanghi (mg/L)� Esposizione a diverse

concentrazioni del campione in esame: 24/48 ore

� Endpoint: morte/immobilizzazione

Perché utilizzare il metodo alternativo di analisi convibrio?

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MICROBIOLOGIA : TOSSICITA’

TOSSICITA’ CON DAFNIA

MAGNA ALLEVAMENTO

TOSSICITA’ CON DAFNIA

MAGNA

EFIPPI COMMERCIALI

TOSSICITA’ CON VIBRIO FISHERI-

METODO AUTOMATICO

TOSSICITA’ CON VIBRIO

FISHERI-METODO

MANUALE

� ANALISI TOSSICITA’Metodo UNI EN ISO 11348-3 : 2009 - Effetto inibitori o sull’emissione di luce di Vibrio fisheri - Parte 3: metodo con batteri liofil izzati-----in attesa di formale accreditamento visita isp ettiva 2017-----

METODI UTILIZZABILI nel LABORATORIO HERAtech

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MICROBIOLOGIA : TOSSICITA’

NORMATIVADLgs 152/06 allegato 5 : «il saggio effettuato utilizzando batteri bioluminescentiè previsto tra i possibili saggi, oltre a quello con Daphnia magna, per l’analisi dellatossicità»Il Saggio di Tossicità non è prescrittivo ai termini di legge, ma è un parametroindicatore per segnalare la necessità di eventuali ed ulteriori indagini analitiche.

PARAMETRO VALUTAZIONE TOSSICITA’

Daphnia magna Immobilizzazione >50% (scarico in acque superficiali)Immobilizzazione >80% (scarico in rete fognaria)

Vibrio fisheri Concentrazione di effetto EC50<100%

LABORATORIO HERAtech

� Protocollo interno di validazione� Processo di accreditamento

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MICROBIOLOGIA : TOSSICITA’

LABORATORIO HERAtech

�Easychem tox: analizzatore a lettura diretta per analisi tossicità in automatico

�Batteri selezionati e liofilizzati in modo da garantirne un utilizzo continuativo (mantengono per sei giorni un segnale di

bioluminescenza misurabile e un’inalterata sensibilità ai composti tossici definiti nella norma).

Le cinetiche di luminescenza sono visualizzabili in forma graficaaggiornate in tempo reale, integrate da una tabella dei risultati

Sono calcolati i valori di inibizione medi, la deviazione percentualedalla luminescenza media finale dei singoli bianchi e la stabilità deisegnali

Cicli analitici, frequenza, parametri e limiti del controllo qualitàsono programmabili e gestiti in forma automatizzata

Lo strumento conserva memoria di tutte le singole letture diluminescenza eseguite

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MICROBIOLOGIA : TOSSICITA’

La bioluminescenza emessa dai batteri marini Vibrio fisheriviene utilizzata per il saggio a 5,15 e 30 minuti, sfruttando laproporzionalità tra diminuzione di luminescenza e tossicitàdel campione.

Secondo la UNI EN ISO 11348-3:2009 il risultato dell’analisiè una concentrazione di effetto (EC 50 - EC 20):

� NON TOSSICO - bioluminescenza invariata o diminuzioneminore del 10%

� TOSSICO misurabile –diminuzione di bioluminescenzacontenuta tra 10 e 90 % nelle diverse diluizioni

� estremamente TOSSICO - bioluminescenza assente

VIBRIO FISHERI

INIBIZIONE <10%: EC50 non calcolabile, Campione non tossico

INIBIZIONE compresa tra 10 e 90%

EC50 calcolabileCampione tossico

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MICROBIOLOGIA : TOSSICITA’EC 50 CALCOLATA

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MICROBIOLOGIA : TOSSICITA’

PUNTO DI FORZA: METODO ALTERNATIVO AUTOMATIZZATO CHE FACIL ITA EVELOCIZZA L’ATTIVITA’ LAVORATIVA

RAPIDITÀ DEL RISULTATO

FINO A 60 CAMPIONIANALIZZABILI

CONTEMPORANEAMENTE

ANALISI DEL

SINGOLO CAMPIONE

IN 30 MINUTI

MIGLIORE GESTIONEDEL LAVORO

POSSIBILITÀ DICONSERVARE I

CAMPIONI CONGELATI

FACILITÀ D ’USO

SISTEMA AUTOMATICO(DILUIZIONI, ANALISI DELLA

BIOLUMINESCENZA, CALCOLO DEL RISULTATO E

DELL’INTERVALLO DIINCERTEZZA…)

TRACCIABILITÀ DEI DATI

ARCHIVIO INFORMATICODI TUTTE LE FASI

ANALITICHE

Grazie per l’attenzione….

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