La maggior parte dei trascritti del genoma sono RNA non ... · L’esone a monte attaa on la sua estremità 3’OH la giunzione di spli ing al 3’ reazione di esterificazione La

RNA non codificanti

large - rRNA 18+28S Xist

small - 5S rRNA traduzione tRNA traduzione snRNAs splicing snoRNAs modificaz./process. rRNA scRNAs controllo traduzionale gRNAs editing piRNAs stabilità del genoma miRNAs controllo traduzionale siRNAs stabilità dell’RNA rasiRNAs silenziamento trascriz. …?….

…?…

……

La maggior parte dei trascritti del genoma sono RNA non codificanti per proteine

……

Modificazioni dell’rRNA

• Metilazione (55 lievito, 110 vertebrati)

• Pseudouridilazione (45 in lievito, 100 vertebrati)

snoRNA e snoRNP

• Gli small nucleolar RNA (piccoli RNA nucleolari o snoRNA) sono piccoli RNA coinvolti in alcune reazioni di modificazione chimica a carico di rRNA e tRNA

• Queste modificazioni (metilazione e pseudouridilazione) sono in grado di aumentare l'attività dell'RNA maturo.

• Gli snoRNA sono RNA di 60-300 nucleotidi • Sono spesso codificati nelle sequenze introniche di proteine

ribosomiali oppure sono trascritti indipendentemente come unità policistriniche

snoRNA e snoRNP

• Box C/D metilazione

• Box H/ACA pseudouridilazione

• Assieme a proteine costituiscono le small nucleolar ribonucleoprotein (piccole ribonucleoproteine nucleolari o snoRNP)

• La funzione dei snoRNA è quella di guidare il complesso proteico snoRNP sul sito di modificazione dell'RNA bersaglio attraverso un appaiamento specifico mentre la componente proteica esegue la reazione chimica

La proteina Snu13p interagisce con entrambe le box C e D degli snoRNA e riconosce il motivo di struttura K-turn. Nop1p (la fibrillarina) interagisce con entrambe le box D e D’ (non mostrato) mentre le proteine Nop58p e Nop56p riconoscono la box D e la box D’, rispettivamente. A monte delle box D e D’ sono mostrate le sequenze guida antisenso e complementari alla molecola di RNA target.

Nei loop interni delle strutture a forcina sono presenti le sequenze guida bipartite complementari all’RNA target che fiancheggiano i due nucleotidi non appaiati, di cui uno è l’uridina che verrà pseudouridilata. Il sito di pseudouridilazione è posizionato a 13-16 nt a monte delle box H/ACA.

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright ©

2006

Maturazione di pre-rRNA nei batteri

Maturazione di pre-rRNA negli eucarioti

• Splicing tRNA

• Splicing di introni di tipo I

• Splicing di introni di tipo II

• Splicing nucleare

spliceosoma

nucleasi e ligasi

autosplicing trans-

esterificazioni

meccanismo simile

Tipi di splicing

Splicing di tRNA

Autosplicing

Introni di gruppo I e II

Confronto dei meccanismi di splicing

Tutti i tipi di spicing comportano due reazioni di trans-esterificazione irreversibili per degradazione dell’introne

Tutti gli introni di gruppo I e II sono caratterizzati da una complessa struttura tridimensionale, essenziale per il loro meccanismo di azione (autocatalisi)

Introni di gruppo I

Struttura dell’introne dell’rRNA di Tetrahymena

In vivo sono necessari fattori proteici per il corretto ripiegamento dell’RNA Proteine codificate dagli introni stessi

Lo splicing degli introni del gruppo I riguarda principalmente i geni che codificano rRNA, tRNA e mRNA degli organelli di funghi e piante

Lo splicing degli introni del gruppo I richiede l’intervento di una guanosina esterna (GTP) che si lega in una tasca dell’introne che deve essere rimosso

(sito di legame G)

Il GTP attacca con il gruppo 3’OH il fosfato del sito di splicing al 5’ (di solito U) Reazione di trans-esterificazione

Liberazione dell’esone al 5’ e legame del GTP all’estremità 5’ dell’introne

All’estremità 5’ dell’introne c’è un residuo di guanina che si lega al sito di legame G Reazione di esterificazione

L’estremità 3’-OH del primo esone attacca il legame estere al sito 3’ di splicing unendosi così al secondo esone e liberando l’introne

Introni di gruppo II

Introni di gruppo II

• sono meno comuni degli introni di gruppo I • si trovano nei genomi degli organelli di funghi e piante (la maggior parte

negli introni dei cloroplasti) • la reazione di self-splicing è molto più lenta di quella degli introni di

gruppo I Meccanismo di azione Il meccanismo è diverso da quello degli introni di gruppo I e somiglia a quello utilizzato dallo spliceosoma negli mRNA eucarioti • le giunzioni di splicing al 5’ (GUGYG) e al 3’ (AY) sono conservate • L’RNA si ripiega in una struttura conservata con la formazione di un sito

attivo che lega ioni Mg+2 • Sei domini a doppia elica attorno a un core centrale • Non utilizzano una guanosina esterna ma un residuo interno di

adenosina (presente nel VI dominio)

Struttura generale degli introni di gruppo II

Un residuo di Adenina nell’introne guida l’attacco nucleofilo (step 1).

Le frecce indicano le giunzioni esone-introne L’esone è tratteggiato

splicing degli introni del gruppo II in mRNA mitocondriali, di cloroplasti, funghi, piante In vivo sono necessarie proteine per il corretto ripiegamento dell’RNA

Il 2’OH del residuo di adenosina attacca il fosfato della giunzione al 5’ formando un legame 2’-5’ con la prima base dell’introne (G)

reazione di trans-esterificazione L’esone a monte viene liberato mentre l’introne assume una struttura a cappio (lariat) L’esone a monte attacca con la sua estremità 3’OH la giunzione di splicing al 3’

reazione di esterificazione La reazione porta alla giunzione dei due esoni e la liberazione dell’introne a cappio

Processo a due step

Splicing nucleare

Il DNA non codificante è quindi quella parte di genoma che maggiormente varia al variare della complessità

INTRONI UTRs

REGIONI INTERGENICHE

• DNA -> RNA eterogeneo (hnRNA) -> mRNA

• Il passaggio hnRNA -> mRNA consiste in:

– Incappucciamento: alterazioni chimiche all’estremità 5’

– Splicing : rimozione degli “introni”

– Poliadenilazione: sostituzione dell’estremità 3’ con un’estensione di circa 250 basi A non presenti nella sequenza del gene

• Introni/Esoni

• Esistono almeno 8 tipi diversi di introni

• Quello associato in modo predominante ai geni che codificano proteine segue la “regola GU-AG” (cioè: introne = GU*…*AG)

• Esistono delle regole ben precise che determinano la rimozione precisa degli introni

• Splicing alternativo

mRNA – Modifiche al 5’ e al 3’

mRNA – Modifiche durante la trascrizione

SCAF: splicing complex associated factors

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright ©

2006

Esoni e domini funzionali delle proteine

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright ©

2006

Le giunzioni di splicing sono conservate

Sequenze minime di consenso di spicing, numero minimo di complementarietà Mutazioni in questa regione alterano lo splicing

Lo splicing degli mRNA richiede lo “spliceosome” un complesso RNA-proteine

pre-mRNA spliced mRNA

spliceosome (~100 proteins + 5 small RNAs)

snRNA (smal nuclear RNA) U1 snRNA

U2 snRNA U4 snRNA

U5 snRNA U6 snRNA

I 5 snRNA sono associati a proteine formando complessi ribonucleoproteici chiamati snRNP

5 RNA e più di 200 proteine (7 comuni) (snurp snRNP) formano lo spiceosoma

Lo spliceosoma

The spliceosome is a ribonucleoprotein complex

composed of multiple snRNPs

Lo spliceosomea

Il complesso snRNP U1

Interazioni tra sequenze introniche

e snRNA

U1 = sito di splicing 5’ U2 = sito di ramificazione U6 = sito di splicing 5’

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright ©

2006

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright ©

2006

(5 appaiamenti) con U1 Py:polipirimidina SC35, ASF/SF2 auxiliary splicing factor

fattori di splicing ricchi di ser/arg

Formazione del complesso di pre-splicing (complesso early)

Due vie per la definizione delle giunzioni Riconoscimento del sito donatore più stringente

Tappe iniziali dello splicing del pre-mRNA Complesso A: assembling U2 sul sito di ramificazione richiede ATP Complesso B: binding

Tappa finale dello splicing Complesso C: catting reazioni di transesterificazione U6 si lega a U2 con una struttura a forcina

The spliceosomal splicing cycle

La composizione dello spliceosoma cambia

nel corso dello splicing

Regolazione dello splicing

Difetti nello splicing implicati in numerose malattie

Splicing alternativo fonte di variazione genetica e meccanismo di regolazione di attività cellulari

Conseguenze di mutazioni delle sequenze consenso di splicing

Fattori che modulano lo splicing

Proteine con motivi DEXH/D box: RNA-elicasi ATP-dipendenti

Svolgimento di brevi tratti a doppia elica presenti nel pre-mRNA

Proteine SR (ricche in Ser e Arg fosforilabili): proteine modulari con dominio di legame per l’RNA (RRM) e dominio RS

Legame a elementi di enhancer di splicing per stimolare il legame di U2AF Legame ai siti di ramificazione per stimolare il legame di U1 al sito 5’

Sequenze enhancer e silenziatori di splicing esoniche (ESE e ESS) Sequenze enhancer e silenziatori di splicing introniche (ISE e ISS) Richiamano rispettivamente le proteine SR (attivatori che richiamano U2AF) o le proteine hnRNP (inibitori che impediscono il legame dello spliceosoma)

regolazione positiva dello splicing

controllo negativo del sito di splicing

Splicing alternativo

Splicing alternativo

• Scoperto inizialmente nel 1980

• Meccanismo sottoposto a regolazione cellularte anche se può essere casuale

• Il gene Dscam di Drosophila può avere sino a 38000 differenti variani di splicing

Il gene DSCAM è lungo 61.2 kb e dopo la trascrizione e lo splicing produce un mRNA di circa 7.8 kb composto da 24 esoni. Gli esoni 4, 6, 9, e 17 sono mutualmente esclusivi e alternativi. Ogni mRNA finale prodotto contiene una delle12 possibile alternative dell’esone 4, una delle 48 possibili per l’esone 6, una delle 333 possibili per l’esone 9 e una delle 2 possibili per l’esone 17. Tutte le possibili combinazioni dei singoli esoni 4, 6, 9, e 17 permettono di ottenere 38016 diverse varienti dell’mRNA per il gene DSCAM e quindi altrettante proteine diverse.

Gene DSCAM (codifica per una proteiba della superficie cellulare coinvolta nella connettività tra neuroni)

Implicazioni nell’evoluzione

• Lo splicing alternativo modifica l’espressione del genoma aumentandone la complessità

• Quante proteina sono prodotte dai genomi eucariotici? • Quanti geni sono necessari per un organismo pluricellulare

complesso? • Come le varianti di splice contribuiscono all’evoluzione? • Quanto sono stabili i siti di splicing durante l’evoluzione?

Possibili effetti dello splicing alternativo

• Inclusione/esclusione di domini funzionali che possono

modificare la funzione o la localizzazione

• Variazioni nella struttura proteica

• Variazioni nella regione 5’ non tradotta che modificano

l’efficienza di traduzione

• Variazioni nella sequenza di poliadenilazione che

alterano la stabilità dell’mRNA

Diverse tipologie di splicing alternativo proteoma più vario e complesso del trascrittoma

Many cellular factors may affect

which splice variant is produced

Pre-mRNA

mRNA

RNA binding proteins

Pre-RNA secondary structure

Other mRNAs?

Small ncRNAs?

Protein:protein complexes

1. The phenotype is determined by the proteome & transcriptome.

2. Selection acts on the phenotype, and is blind to the genotype.

Therefore: two species/individuals that have different forms of a protein will be selected

differently - even if the genes DNA sequence is identical.

CAMKII (chinasi II

calmodulina dipendente

Caspasi 2 -13-15-16-17- -13-14- -13-17-

Gene fru

P = promotori alternativi

S = esone a splicing specifico

Segnali pro e anti apoptotici

Attività simile ma diversa localizzazione

sarcolemma nucleo citosol

Fattore di trascrizione Zn-finger Espresso in alcuni neuroni sensori Controllo del comportamento

multiple introns may be spliced differently in different circumstances, for example in different

tissues.

3 5 4 1 2

1 2 3 5 Heart muscle

1 4 3 5 Uterine muscle

Thus one gene can encode more than one protein. The proteins are similar but not identical and may have distinct properties. This is

important in complex organisms

Splicing alternativo della tropomiosina

scelta di un diverso promotore

Trans-splicing

Trans-splicing Trans-splicing di gruppo II discontinuo

mitocondri vegetali Scambio di tratti di DNA tra regioni geniche differenti

Trans-splicing di leader attaccato tripanosomi fornisce una presequenza al 5’ Cappuccio a RNA trascritti dalla RNApol I o III Utile per trascritti policistronici Efficienza di traduzione (5’ non tradotto dell’RNA coinvolto nel legame con i ribosomi)

Trans-splicing del t-RNA Alcuni organismi Ricongiungere le due metà del tRNA presenti in due regioni geniche differenti

RNA-editing

Inserzione di U (Tripanosomi) Conversione A>I e C>U (mammiferi)

RNA guida

Terminal-Uridil-Trasferasi

Ribonucleasi 3’->5’ U-specifica

ADAR

Editing nei mammiferi

Editing differente nei due tessuti ApoB-100 -> trasporto lipidi (LDL) ApoB48 -> assorbimento lipidi

L’editing richiede APOBEC1 = attività catalitica ACF = fornisce la specificità del sito

AA

AA

AA

Stop Stop Stop