Konstruktion und Charakterisierung einer isogenen · Pleuropneumonie der Schweine, die mit zunehmender Intensivierung der Schweinehaltung an Bedeutung gewonnen hat. Die Erkrankung

Aus dem Institut für Mikrobiologie

Zentrum für Infektionsmedizin

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

___________________________________________________________________________

Konstruktion und Charakterisierung einer isogenen

Actinobacillus pleuropneumoniae hlyX- Mutante

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Mohamed N’diaye

Kayes, Mali

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. G.-F. Gerlach

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. T. Leeb

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G.-F. Gerlach

Tag der mündlichen Prüfung: 26.05.2005

Gefördert durch ein Stipendium des Projekts “Programme d’Appui aux Services Agricoles

et aux Organisations Paysannes (PASAOP)" des Institut D’Economie Rurale, Mali

meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ................................................................................................. 11

2 Literaturübersicht................................................................................... 12

2.1 Actinobacillus pleuropneumoniae ........................................................................... 12

2.1.1 Bedeutung und Verbreitung .................................................................................... 12

2.1.2 Taxonomie .............................................................................................................. 13

2.1.3 Virulenzfaktoren ..................................................................................................... 14

2.1.4 Immunität und Vakzination .................................................................................... 19

2.2 Anaerobe Genregulation.......................................................................................... 20

3 Material und Methoden.......................................................................... 23

3.1 Bakterienkulturen .................................................................................................... 23

3.1.1 Bakterien und Plasmide ................................................................................... 23

3.1.2 Kultivierungsbedingungen ............................................................................... 23

3.2 Ermittlung der Zelldichte......................................................................................... 23

3.3 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von DNA ............................................ 24

3.3.1 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae ......................... 24

3.3.2 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA............................... 27

3.3.3 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract” (Macherey-NAGEL

GmbH&CO. Düren Deutschland) ................................................................... 27

3.3.4 Aufreinigung mit dem „ GENE Clean“-KIT ................................................... 28

3.3.5 Bestimmung der DNA-Konzentration ............................................................. 28

3.3.6 Anaerobe Anzucht zum Vergleich verschiedener Stämme und

Bestimmung des Trocknengewichts der Pellet ............................................... 28

3.4 Plasmidkonstruktion ................................................................................................ 29

3.4.1 PCR 2.1-TOPO-Cloning ................................................................................ 29

3.4.2 Restriktionsenzymverdau................................................................................. 30

3.4.3 Auffüllen von Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase........ 30

3.4.4 Agarosegelelektrophorese................................................................................ 30

3.4.5 Ligation ............................................................................................................ 31

3.5 Transformation ........................................................................................................ 31

3.5.1 Herstellen von chemisch kompetenten Zellen ................................................. 31

3.5.2 Transformation von chemisch kompetenten E. coli DH5α Zellen mit

Plasmiden ........................................................................................................ 32

3.5.3 Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae ........................ 33

3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) .......................................................................... 34

3.7 Konjugation von E. coli und A. pleuropneumoniae ................................................ 35

3.8 Saccharose-Gegenselektion ..................................................................................... 36

3.9 Southern Hybridisierung.......................................................................................... 36

3.9.1 Southern Blot ................................................................................................... 36

3.9.2 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode ................. 38

3.10 Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE) ...................................................................... 38

3.11 Sequenzierung.......................................................................................................... 40

3.12 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS) –Page .................... 40

3.13 Western Blot ............................................................................................................ 41

3.14 Aspartase Test.......................................................................................................... 42

3.15 Tierversuch .............................................................................................................. 42

3.15.1 Versuchstiere.................................................................................................... 42

3.15.2 Herstellen der Bakteriensuspension für die Aerosolbelastung ........................ 43

3.15.3 Aerosolkammer und Infektion ......................................................................... 43

3.15.4 Überwachung und Erhebung klinischer Parameter.......................................... 43

3.15.5 Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) .................................................. 44

3.15.6 Bakteriologischer Erregernachweis aus BALF................................................ 44

3.15.7 Sektion ............................................................................................................. 44

3.15.8 Bakteriologische Organuntersuchung .............................................................. 45

3.15.9 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay ) ........................................... 45

3.15.10 Statistik............................................................................................................. 46

4 Ergebnisse ................................................................................................ 47

4.1 Konstruktion und Charakterisierung der A. pleuropneumoniae hlyX

Deletionsmutante .................................................................................................... 47

4.1.1 Konstruktion des Plasmids pHLYX701 für die Konjugation .......................... 47

4.1.2 Konstruktion der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante..................... 49

4.1.3 Analyse der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante............................. 49

4.2 Überprüfung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX in der experimentellen

Aerosolinfektion...................................................................................................... 54

4.3 Humorale Immunantwort......................................................................................... 57

5 Diskussion ................................................................................................ 58

6 Zusammenfassung................................................................................... 62

7 Summary.................................................................................................. 63

8 Literaturverzeichnis................................................................................ 64

9 Anhang ..................................................................................................... 74

9.1 Material und Geräte ................................................................................................. 74

9.2 Zusammensetzung von Medien, Medienzusätzen und Puffer ................................. 75

9.3 Lösungen und Puffer................................................................................................ 77

9.3.1 Plasmidpräparation........................................................................................... 77

9.3.2 Präparation von chromosomaler DNA von Bakterien

(A. pleuropneumoniae).................................................................................... 78

9.4 Restriktionsverdau ................................................................................................... 79

9.5 Gel-Elektrophorese .................................................................................................. 79

9.6 Transformation ........................................................................................................ 80

9.7 Konjugation ............................................................................................................. 80

9.8 DNA-Transfer (Southern Blot)................................................................................ 80

9.9 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode......................... 81

9.10 Southern-Hybridisierung ......................................................................................... 81

9.11 SDS-Page ( Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel)............................................. 82

9.12 Western Blot ............................................................................................................ 82

9.13 Aspartase-Essay....................................................................................................... 83

9.14 Pulsfeldgelelektrophorese........................................................................................ 83

9.15 Enzyme .................................................................................................................... 84

9.16 Chemikalien............................................................................................................. 85

9.17 Nukleotid- und Aminosäuresequenz des hlyX Gens von A. pleuropneumoniae ..... 87

8.14. Rohdaten .................................................................................................................. 93

9.18 Index der Abbildungen ............................................................................................ 94

9.19 Index der Tabellen ................................................................................................... 95

Abkürzungsverzeichnis

A. dest. Aqua destillata

A. bidest. Aqua bidestillata (zweifach destilliertes Wasser)

A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae

ATCC “American Type Culture Collection”

BALF bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit

BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat p-Toluidin

BSA bovines Serumalbumin

Bp Basenpaare

DAPI Diaminopimelinsäure

CAMP Christie, Atkins, Munch-Petersen

cDNA Komplementäre DNA

dATP Deoxyadenosintriphosphat

dCTP Deoxycytidintriphosphat

dGTP Deoxyguanosintriphosphat

dTTP Desoxythymidintriphosphat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

E. coli Escherichia coli

et al. et alii

EDTA Ethylendiamin-Tetraessigsäure

EIVX Ersatz-IsoVitalex

ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay

(Enzymgekoppelter Immunabsorptionstest)

KBE Koloniebildende Einheiten

kbp Kilobasenpaare

IgG Immunglobulin G

LB Luria- Bertani

Lsg. Lösung

min Minute

M Molar

NaCl Natriumchlorid (Kochsalz)

NAD Nikotinamid-Adenindinukleotid

NBT Nitrotetrazoliumblauchlorid

NEB New England Biolabs

OD Optische Dichte

OLB Oligo Labeling Buffer

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase chain reaction

PFGE Pulsfeldgel-Elektrophorese

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PPLO “Pleuropneumoniae Like Organism”

RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)

RT-PCR Reverse-Transkriptase-PCR

SDS Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-

Elektrophorese

Sek Sekunde

Stammlsg. Stammlösung

SSC Sodium chloride Sodium citrate

TbpA Transferrin bindendes Protein A

TAE Tris Acetat EDTA

TBE Tris Borat EDTA

TE Tris EDTA

Tris Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan

U Unit

UV Ultraviolet

vol Volumen

v/v Volumen pro Volumen

w/v Gewicht pro Volumen

Einleitung

1 Einleitung

Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist der Erreger der wirtschaftlich bedeutsamen

Pleuropneumonie der Schweine, die mit zunehmender Intensivierung der Schweinehaltung an

Bedeutung gewonnen hat. Die Erkrankung verursacht infolge der hohen Mortalität und der

verminderten Gewichtzunahme chronisch kranker Tiere große wirtschaftliche Verluste. Die

Erkrankung verläuft perakut bis chronisch. Beim perakuten Verlauf stehen Apathie,

Erbrechen und plötzliche Todesfälle im Vordergrund. Hohes Fieber und ausgeprägte

respiratorische Störungen dominieren das klinische Bild in der akuten Phase. Die Ansteckung

erfolgt über Aerosole, wobei insbesondere chronisch infizierte Tiere Erregerreservoir und

Überträger sind.

Das Überstehen einer natürlichen Infektion hinterlässt einen serotypübergreifenden Schutz

vor Reinfektion, der Erreger persistiert jedoch über Monate hinweg in den

Lungenveränderungen, den Tonsillen und auf der Schleimhaut der Bronchien. Die

Anwendung der herkömmlichen serotypspezifischen Vakzinen reduziert die Morbidität und

die Mortalität, verhindert aber nicht die Kolonisierung der Lunge durch den Erreger. Der

Erreger überlebt trotz der verminderten Sauerstoffversorgung in nekrotischem

Lungengewebe. Diese Persistenz der Erreger in Geweben mit reduzierter Sauerstoffspannung

führte zu der Hypothese, dass die Fähigkeit des Erregers in anaeroben Sequestern zu

überleben, Virulenz und Erregerpersistenz beeinflusst.

Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass Enzyme des anaeroben Stoffwechsels, z.B. eine

anaerobe Dimethylsulfoxidreduktase sowie eine Aspartase nach Zugabe von

bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit zum Kulturmedium vom Erreger vermehrt exprimiert

werden. Beide Enzyme werden vermutlich unter anaeroben Bedingungen durch das HlyX-

Protein reguliert. Das HlyX-Protein ist A. pleuropneumoniae-Homolog zu FNR („fumarate

and nitrate reduction“), einem globaler anaeroben Regulator von Escherichia (E.) coli. Da

eine Deletion der Dimethylsulfoxidreduktase- und Aspartase-kodierenden Gene zu einer

deutlichen Attenuierung von A. pleuropneumoniae führte, soll in der vorliegenden Arbeit

untersucht werden, welchen Einfluss die HlyX-vermittelte Genregulation auf die

Überlebensfähigkeit des Erregers unter Bedingungen mit verminderter Sauerstoffspannung

und auf die Virulenz hat.

11

Literaturübersicht

2 Literaturübersicht

2.1 Actinobacillus pleuropneumoniae

2.1.1 Bedeutung und Verbreitung

Actinobacillus pleuropneumoniae ist ein obligat pathogener Erreger des Respirationstraktes

von Schweinen (TAYLOR 1999). Er wurde 1957 in Großbritannien als Verursacher der

kontagiösen Pleuropneumonie beim Schwein identifiziert (PATTISON et al. 1957). Der

Erreger ist streng wirtsspezifisch und kann aus Nasenhöhlen, Tonsillen und Lungen infizierter

Tiere isoliert werden (DOM et al. 1994). Der Erreger überlebt nicht lange in der Umwelt

(FENWICK u. HENRY 1994; TAYLOR 1999). Die Übertragung erfolgt per Aerosol oder

mittels Tröpfchen bei direktem Kontakt (JENSEN et al. 1999; LECHTENBERG et al. 1994).

Die indirekte Übertragung durch unbelebte oder belebte Vektoren spielt in der Verbreitung

der Erkrankung eine geringere Rolle (FENWICK u. HENRY 1994). Zwei Biotypen wurden

beschrieben, wobei der Biotyp I auf Nikotinamid-Adenindinukleotid (NAD; V-Faktor)

angewiesen ist (TAYLOR 1999). Fünfzehn Serotypen werden aufgrund der unterschiedlichen

Polysaccharidantigene dem Biotyp I zugeordnet (BLACKALL et al. 2002; MACLEAN et al.

2004). In Deutschland treten vor allem die Serotypen 2, 3, 7 und 9 auf (BUNKA et al. 1990).

Actinobacillus pleuropneumoniae-Erkrankungen wurden bisher in allen europäischen

Ländern, den USA, Kanada, Mexiko, Japan Taiwan und Australien registriert (NICOLET

1992).

Die Actinobacillus-Pleuropneumonie ist eine hämorrhagisch-nekrotisierende Pleuro-

pneumonie mit adhäsiver Pleuritis (SEBUNYA u. SAUNDERS 1983). Die Erkrankung

verläuft perakut bis chronisch; alle Altersgruppen können betroffen werden. Die Heftigkeit

des Verlaufs hängt vom infizierenden Serotyp, vom Immunstatus des Wirtstieres und von der

Erregerzahl ab (ROGERS et al. 1990). Beim perakuten Verlauf stehen Apathie, Erbrechen

und plötzliche Todesfälle im Vordergrund. Hohes Fieber und ausgeprägte respiratorische

Störungen dominieren das klinische Bild in der akuten Phase. Bei einem typischen

Actinobacillus.pleuropneumoniae-Ausbruch kann die Morbidität bei über 50% liegen, wobei

die Mortalität von 1 bis 10% schwankt (FENWICK u. HENRY 1994). Chronisch infizierte

Tiere zeigen ein vermindertes Wachstum und geringere Gewichtszunahmen. Bei adäquaten

Management- und Umweltfaktoren in Abwesenheit anderer Erkrankungen ist die

Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer A. pleuropneumoniae-Erkrankung reduziert

12

Literaturübersicht

(FENWICK u. HENRY 1994). Das Überstehen einer natürlichen Infektion hinterlässt einen

soliden Schutz wobei der Erreger jedoch in den Lungenveränderungen, den Tonsillen und auf

der Schleimhaut der Bronchien persistiert und weiterhin ausgeschieden wird (FENWICK u.

HENRY 1994). Diese rekonvaleszenten wie auch chronisch und latent infizierte Tiere spielen

epidemiologisch eine große Rolle bei der Verbreitung des Erregers in bisher

Actinobacillus. pleuropneumoniae-freie Bestände (FENWICK u. HENRY 1994).

2.1.2 Taxonomie

Actinobacillus pleuropneumoniae ist ein gram-negatives, fakultativ anaerobes Stäbchen aus

der Familie der Pasteurellaceae (MANNHEIM 1994). Zwei Biotypen werden beschrieben.

Isolate des Biotyps I sind auf NAD (V-Faktor) angewiesen (NIVEN u. LÉVESQUE 1988).

Isolate des Biotyps II können in Anwesenheit von spezifischen Pyridinnucleotiden NAD

synthetisieren (NIVEN u. LÉVESQUE 1988). Zwei Serotypen (2 und 9) sind bei Biotyp II

bekannt (NIELSEN 1988). Serotype 13 und 14 wurden später zu Biotyp II zugeordnet

(NIELSEN et al. 1997). Der Serotyp 15 wurde bei Biotyp I beschrieben (BLACKALL et al.

2002); Die Serotypenunterteilung beruht auf Kapselpolysacchariden und auf zellulären

Lipopolysacchariden (BLACKALL et al. 2002; MACLEAN et al. 2004; NICOLET 1992).

Die Serotypen 1 und 5 wurden jeweils aufgrund von Unterschieden in der

Polysaccharidstruktur in die Subtypen 1a, 1b, 5a und 5b unterteilt (JOLIE et al. 1994).

Weiterhin kommen zwischen verschiedenen Serotypen Kreuzreaktivitäten vor (EUZÉBY

1998; JOLIE et al. 1994). Alle Serotypen sind hämolytisch, zeigen ein positives Christie-

Atkins-Munch-Petersen (CAMP)-Phänomen mit Staphylococcus aureus (EUZÉBY 1998;

TAYLOR 1999) und sind in der Lage, eine Pleuropneumonie hervorzurufen; dabei

unterscheiden sich die einzelnen Serotypen in ihrer Virulenz (FREY 1995; ROSENDAL et al.

1981). Die Virulenzunterschiede der Serotypen sind unter anderem auf die Produktion von

verschiedenen Kombinationen von APX-Toxinen zurückzuführen (FREY 1995). Die

Oberflächen-Polysaccharide tragen ebenfalls hierzu bei (ROSENDAL u. MACINNES 1990).

Isolate der Spezies A. pleuropneumoniae können anhand biochemischer Eigenschaften von

anderen Actinobacillus-Spezies unterschieden werden (EUZÉBY 1998). So ist die Spezies

Actinobacillus.pleuropneumoniae durch eine starke Ureaseaktivität sowie durch das

Vermögen, Nitrat, Nitrit, Glucose, Saccharose, Mannit und Xylose abzubauen, charakterisiert.

Reaktionen mit Indol und Katalase sind negativ (EUZÉBY 1998). Isolate des Biotyps I sind

13

Literaturübersicht

H2S positiv, Isolate des Biotyps II sind H2S und Laktose negativ sowie Galaktose positiv

(EUZÉBY 1998).

2.1.3 Virulenzfaktoren

2.1.3.1 Kapsel

Die Kapsel von A. pleuropneumoniae besteht meist aus nur einem Polysaccharidbaustein und

bildet eine Hülle um die Bakterienzelle. Die meisten Kapselpolysaccharide sind stark

hydrophil und haben eine negative Oberflächenladung, die zur Verhinderung der Aufnahme

der Bakterien durch die ebenso geladenen Phagozyten führt (HACKER u. HEESEMANN

2000). Die Kapsel verhindert die Auflagerung des Komplementfaktors C3b auf die

Bakterienoberfläche somit wird einerseits die Komplement-vermittelte Lyse durch den

terminalen membranan-greifenden Komplex (MAC) verhindert, anderseits die Opsonierung

durch Komplement und Antikörper mit anschließender Phagocytose umgangen (HACKER u.

HEESEMANN 2000). Somit schützt die Kapsel A. pleuropneumoniae vor bakteriziden

Serumbestandteilen und verhindert die frühzeitige Eliminierung des Erregers (FENWICK u.

HENRY 1994; INZANA et al. 1988). Sie spielt weiterhin eine Rolle in der Virulenz

(JACQUES et al. 1988). So soll die Variation in der Virulenz der einzelnen Serotypen zum

Teil auf Unterschieden in der Kapselstruktur beruhen (JACQUES et al. 1988). Es wurde

gezeigt, dass A. pleuropneumoniae Stämme mit dickeren Kapseln virulenter sind als die mit

dünneren Kapseln (JENSEN u. BERTRAM 1986; ROSENDAL u. MACINNES 1990).

2.1.3.2 RTX-Toxine

RTX-Toxine sind porenformende, zytolytische Proteine, die bei vielen pathogenen gram-

negativen Bakterien vorkommen (FREY 1995). Sie besitzen die Fähigkeit, Erythrozyten und

kernhaltige Zellen zu lysieren (JANSEN et al. 1995; THOMPSON et al. 1993). Die von

Actinobacillus.pleuropneumoniae gebildeten RTX- Toxine werden als Apx-Toxine

bezeichnet.

Das ApxI-Toxin wird von den Serotypen 1, 5a, 5b, 9, 10 und 11 produziert. Das ApxII-Toxin

wird von allen Serotypen außer Serotyp 10 produziert. Das ApxIII-Toxin wird von den

Serotypen 2, 3, 4, 6 und 8 produziert (FREY et al. 1993b; SCHALLER et al. 1999). Das

ApxIV-Toxin wird von allen Serotypen produziert (BOSSE et al. 2002; SCHALLER et al.

1999).

14

Literaturübersicht

Tabelle 1.: Apx-Toxin Produktion der verschiedenen A. pleuropneumoniae Serotypen (BOSSE et

al. 2002)

Operon Aktivität Aktivator Struktur Export hämolytisch zytotoxisch

MW (kDa)

Serotypen

ApxI ApxI C ApxI A ApxIBD stark stark 105-110 1, 5a,5b, 9, 10, 11

ApxII ApxII C ApxII A Nein schwach mild 103-105 alle außer 10

ApxIII ApxII C ApxIII ApxIIIBD kein stark 120 2, 3, 4, 6, 8ApxIV ORF 1?C ApxIVa Kein schwach unbestimmt 200 alle

Das ApxI-Toxin ist stark hämolytisch, das ApxII-Toxin zeigt eine langsamere hämolytische

Aktivität. Beide Toxine sind auch zytotoxisch (FREY et al. 1993a; PRIDEAUX et al. 1999).

Das ApxIII-Toxin ist nicht hämolytisch aber stark zytotoxisch (KAMP et al. 1991; MAIER et

al. 1996; RYCROFT et al. 1991a). Das ApxI-Toxin zeigt die höchste porenbildende Aktivität,

gefolgt von dem nicht hämolytisch aber stark zytotoxisch wirkenden ApxIII- und dem ApxII-

Toxin (MAIER et al. 1996). Das ApxIV-Toxin ist schwach hämolytisch (BOSSE et al. 2002;

SCHALLER et al. 1999). Die Apx -Toxine sind verantwortlich für die charakteristischen

hämorrhagischen Läsionen der A. pleuropneumoniae-Erkrankung (FREY et al. 1993b). Sie

sind für die Virulenz von A. pleuropneumoniae sowie für die Pathogenese von großer

Bedeutung (FREY 1995; FREY u. NICOLET 1988). Unterschiede in der Virulenz der Actino-

bacillus. pleuropneumoniae Serotypen sind zum Teil auf die verschiedenen Kombinationen

von Apx-Toxinen zurückzuführen, wobei die virulentesten Serotypen ApxI und ApxII

produzieren (FREY 1995). Serotypen, die zusätzlich zum ApxIV-Toxin noch zwei andere

Apx-Toxine bilden, sind stärker virulent als jene, welche nur ein zusätzliches Apx-Toxin

sezernieren (FREY u. NICOLET 1988; KAMP et al. 1991). Die ApxI- und ApxII-Toxine

induzieren einen oxidativen “burst“ der neutrophilen Granulozyten (JANSEN et al. 1995).

Eine spontan aufgetretene Serotyp 7 Mutante von A. pleuropneumoniae ohne die Fähigkeit

ApxII zu sezernieren, ist apathogen für Schweine (ANDERSON et al. 1991). Eine chemisch

induzierte A. pleuropneumoniae Serotyp 2 Mutante, die nur ApxIII sezeniert, ist weniger

virulent als der Wildtyp (RYCROFT et al. 1991b; TONPITAK et al. 2002).

Für die Produktion und Sekretion von Apx-Toxinen im Allgemeinen wird die Aktivität von

vier Genen (apxC, apxA, apxB und apxD) benötigt (ISSARTEL et al. 1991). Die für die

Synthese von ApxI- und ApxII-Toxin verantwortlichen Gene sind in Operons kodiert, die aus

vier durchgängigen Genen (apxCABD) bestehen und von einem am 5’-Ende vor dem apxC-

15

Literaturübersicht

Gen gelegenen Promotor kontrolliert werden. Das ApxII-Operon enthält nur die apxA- und

apxC-Gene; für den Membrantransport sind die apxBD Gene des apxI- oder apxIII-Operons

erforderlich.

Die Apx-Toxine sind für die Induktion einer protektiven Immunität von Bedeutung

(DEVENISH et al. 1990). Rekonvaleszente Schweine sind nach einer Infektion mit

Actinobacillus. pleuropneumoniae gegen die Infektion mit einem homologen Serotyp

geschützt, ebenso, jedoch weniger effektiv, gegen Infektionen mit heterologen

Actinobacillus. pleuropneumoniae-Serotypen (CRUIJSEN et al. 1995). Nicht hämolysierende

Mutanten können diese kreuzprotektive Immunität nicht induzieren (INZANA et al. 1988).

2.1.3.3 Äußere Membranproteine (OMP)

Zahlreiche äußere Membranproteine wurden identifiziert und einige davon sind stamm- oder

serotypspezifisch (FENWICK u. HENRY 1994). Manche dieser Proteine sind nur unter

bestimmten spezifischen Wachstumsbedingungen exprimiert, so dass sie nicht in den

gebräuchlichen Vakzinen enthalten sind (FENWICK u. HENRY 1994). Zwei eisenregulierte

Membranproteine (TbpA und TbpB) wurden identifiziert (NIVEN u. LÉVESQUE 1988), die

eine wesentliche Rolle bei der Verwertung von Transferrin-gebundenem Eisen und beim

Vermitteln einer protektiven Immunität spielen (GERLACH et al. 1992; GONZALEZ et al.

1990; RAPP u. ROSS 1986; WILKE et al. 1997) haben verschiedene äußere

Membranproteine (OMPs) zwischen 45 und 67 kDa, und über 94 kDa nachgewiesen. Diese

Proteine wurden im Western Blot von Rekonvaleszentenseren erkannt. Ein weiteres OMP von

40 kDa, OmlA („outer membrane lipoprotein A“) genannt, wurde von GERLACH et al.

(GERLACH et al. 1993) für Serotyp 1, später für Serotyp 5 beschrieben (BUNKA et al.

1995).

Die OMPs können auch zur Typisierung benutzt werden (RAPP u. ROSS 1986). So lassen

sich innerhalb der Referenzstämme für die Serotypen 1 bis 9 sieben verschiedene

Proteinmuster der äußeren Membran unterscheiden (RAPP u. ROSS 1986). Dabei weisen die

Stämme eines Serotyps ähnliche oder identische OMP-Muster auf. Diese OMPs erwiesen sich

weiterhin als immunogen (RAPP u. ROSS 1986). Bei den Serotypen 1 bis 8 wurden drei

immunologisch dominierende äußere Membranproteine von 17, 32, und 42 kDa

nachgewiesen (MACINNES u. ROSENDAL 1987). Ein OMP von 42 kDa wurde bei einigen

Serotypen nachgewiesen und wird auch in vivo exprimiert (DENEER u. POTTER 1989).

16

Literaturübersicht

2.1.3.4 Adhäsine

Infektiöse Prozesse beginnen in der Regel mit der Kolonisierung von Wirtsgeweben und

Zellverbänden durch pathogene Mikroorganismen. Bei dieser Kolonisierung kommt es zu

einer Haftung der Erreger an spezifische Wirtsrezeptoren, die durch Adhäsine vermittelt

werden (HACKER u. HEESEMANN 2000). Bei dieser Besiedlung sind Gewebespezifität und

Wirtsspezifität sehr entscheidend (MADIGAN et al. 2003). Adhäsine werden von allen

pathogenen Erregern produziert und stellen Proteine dar, die spezifisch mit

Kohlenhydratrezeptoren von Wirtszellen interagieren (HACKER u. HEESEMANN 2000;

SAUER et al. 2000).

Nach HACKER 2000 sind folgende Adhärenzfaktoren zu unterscheiden:

- Fimbrienadhäsine (Pili) sind ungefähr 2 µm lange und 2-8 nm dicke filamentöse

Strukture aus ca. 1000 Proteinuntereinheiten. Fimbrienadhäsine werden oft von

großen Genclustern kodiert, die auf Plasmiden oder auf dem Chromosom lokalisiert

sein können.

- Fibrillen. Es sind Zellwandanhänge mit dünnerer und feinerer Struktur als bei den

Fimbrien.

- Nicht-Fimbrienadhäsine (NFA) oder „A-Fimbrienadhäsine“ (AFA). Es sind adhäsive

Proteine, die als integrale Membranproteine oder Proteine, die der bakteriellen

Membran aufgelagert sind, vorkommen.

- Mikrobielle Saccharide: Lipopolysaccharide (LPSs) oder Lipooligosaccharide

(LOSs) können mit Rezeptoren interagieren.

- Lipoteichonsäure (LTAs); Sie spielen eine Rolle bei der Adhärenz von Streptokokken

an Wirtszellen.

Fimbrien exprimierende Stämme von E. coli sind viel häufiger Ursache von

Harnwegsinfektionen als Stämme ohne Fimbrien. Enteropathogene E. coli Stämme besitzen

spezifische Oberflächenstrukturen (Kolonisierungsfaktorantigene [CFA]), die die

Kolonisierung des Dünndarmes ermöglichen und zu Diarrhoe führen (MADIGAN et al.

2003).

Versuche haben gezeigt, dass A. pleuropneumoniae besser den unteren Teil des

Respirationstrakts (Bronchen und Alveolen) als den oberen Teil besiedeln kann (DOM et al.

1994). Die Ausbildung von Fimbrien durch Isolate von A. pleuropneumoniae zeigte keine

lokalisationsbedingten Unterschiede zwischen der Lunge, den Nasenhöhlen und den

17

Literaturübersicht

Tonsillen. Die Fimbrien scheinen die gleiche Bedeutung an diesen verschiedenen Stellen zu

haben (BOSSE u. MACINNES 2000).

2.1.3.5 Lipopolysaccharide

Lipopolysaccharide (LPS) sind Bestandteile der äußeren Membran gramnegativer Bakterien

und bestehen aus dem O-Antigen, dem „core“-Zucker (HACKER u. HEESEMANN 2000)

und dem Lipid A (BAARSCH et al. 1995) und besitzen immunogene Eigenschaften

(HACKER u. HEESEMANN 2000). Die als O-Antigen-Einheiten bezeichneten Module aus

drei bis sechs Zuckern können ein- bis 40-fach wiederholt vorkommen und bestimmen damit

die Länge des LPS-Moleküls. (HACKER u. HEESEMANN 2000). Der starke

Polymorphismus des O-Antigens innerhalb einer bakteriellen Spezies führt zur Bildung

verschiedener Serotypen; Bakterienmutanten mit verkürztem O-Antigen besitzen eine

verminderte Virulenz im Infektionsmodell (HACKER u. HEESEMANN 2000). So haben

virulente A. pleuropneumoniae Serotyp 5 Isolate 10 mg LPS mehr pro g Erregertrockenmasse

als die avirulenten Isolate vom gleichen Serotyp (JENSEN u. BERTRAM 1986).

Untersuchungen an Teilen von LPS haben gezeigt, dass die Lipidfraktion für die Toxizität

verantwortlich ist, während der Polysaccharidanteil die Wasserlöslichkeit und die

Immunogenität des Komplexes bedingt (MADIGAN et al. 2003). Lipid A ist auch an der

Bindung von Hämoglobin an die LPS-Oberfläche beteiligt und trägt damit zur

Eisenversorgung von Actinobacillus. pleuropneumoniae bei (BELANGER et al. 1995). Die

Freisetzung von LPS aus lysierten Bakterien bei Infektionen mit gramnegativen Erregern

stimuliert eine übermäßige Auschüttung von Zytokinen, die zum septischen Schock führen

kann (HACKER u. HEESEMANN 2000).

LPS spielt auch eine Rolle bei der Adhärenz von A. pleuropneumoniae an

Schweinetrachealringen (BELANGER et al. 1990). Dabei hängt die Stärke der Adhärenz von

der Struktur der Lipopolysaccharide ab. Die A. pleuropneumoniae-Serotypen 2, 4 und 7 mit

glatter LPS heften stärker an Wirtszellen an als Serotyp 1 mit LPS mit semi-rauhen Kulturen

oder die Serotypen 3 und 6 mit mit rauhen Kulturen (EUZÉBY 1998). Actinobacillus

pleuropneumoniae-Stämme mit glatter Koloniemorphologie zeigten auch eine stärke

Anheftung an Trachealringe (BELANGER et al. 1990). Zwei Mutanten von

Actinobacillus. pleuropneumoniae-Serotyp 1 mit strukturellen LPS-Anomalien zeigten eine

verminderte Adhärenz und abgeschwächte Virulenz (EUZÉBY 1998).

18

Literaturübersicht

2.1.3.6 Urease

Die Urease wird von mehreren pathogenen und apathogenen Bakterien gebildet. Sie spaltet

durch Hydrolysierung Harnstoff, was zu einer Alkalisierung des Milieus und damit zu einer

Verbesserung der Wachstumbedingungen für die Mikroorganismen in Habitaten wie

Harnwegen (Staphylococcus saprophyticus) oder Magen (Helicobacter pylori) führt

(HACKER u. HEESEMANN 2000).

Actinobacillus pleuropneumoniae-Feldisolate sind in der Regel stark ureasepositiv

(BLANCHARD et al. 1993). Urease ist nicht notwendig für die Entstehung einer

Actinobacluus.pleuropneumoniae-Infektion (TASCON CABRERO et al. 1997). Dieses wurde

durch die Isolierung eines ureasenegativen A. pleuropneumoniae Wildtypstamms bei einem

akuten Infektionsgeschehen mit A. pleuropneumoniae bewiesen (BLANCHARD et al. 1993).

Die genaue Rolle der Urease in chronischen A. pleuropneumoniae Infektionen ist nicht

vollständig geklärt. Allerdings konnte die ureasenegative isogene Mutante

Actinobacillus. pleuropneumoniae ∆ureC 21 Tage nach der Belastung in intaktem

Lungengeweben nicht mehr nachgewiesen werden, was auf eine Bedeutung bei der

Besiedlung intakten Epithels hinweist (BALTES et al. 2001). Ureasenegative

Actinobacillus. pleuropneumoniae konnte keine Infektion bei einer geringeren

Belastungsdosis hervorrufen (BOSSE u. MACINNES 2000). GATERMANN et al.

(GATERMANN et al. 1989) zeigten, dass ureasepositive Organismen im experimentellen

Tiermodell besser als die isogene ureasenegative Mutante kolonisieren und überleben.

2.1.4 Immunität und Vakzination

Natürliche Infektionen mit A. pleuropneumoniae führen zur Bildung von Antikörpern, die als

maternale Antikörper auch saugende Ferkel mehrere Wochen über das Kolostrum weitgehend

schützen (BOSSE et al. 1992; HAESEBROUCK et al. 1997). Es handelt sich in erster Linie

um gegen Apx-Toxine gerichtete, neutralisierende Antikörper (CRUIJSEN et al. 1995). Die

durch die Infektion erworbene Immunität schützt zuverlässig vor einer erneuten Infektion

durch einen homologen Serotyp, aber nicht unbedingt gegen eine Infektion mit einem

heterologen Serotyp (CRUIJSEN et al. 1995; FENWICK u. HENRY 1994). Tiere, die eine

Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion überstanden haben, beherbergen weiterhin

Actinobacillus. pleuropneumoniae im nekrotischen Gewebe (Sequester) in den Lungen und

19

Literaturübersicht

sind ernstzunehmende Infektionsquellen für einen erneuten Ausbruch der Krankheit

(EUZÉBY 1998; FENWICK u. HENRY 1994; RIOUX et al. 1997).

Durch die herkömmlichen Serotyp-spezifischen Vakzinen können die Morbidität, die

Mortalität und das Ausmaß der Lungenveränderungen reduziert werden, aber die Besiedlung

der Lungengewebe durch den Erreger wird nicht verhindert (FENWICK u. HENRY 1994).

Weiterhin führt die Immunisierung mit einem Inaktivatimpfstoff aus einem Serotyp nicht zu

einer protektiven Immunität gegen heterologe Serotypen (JOLIE et al. 1992). Eine orale

Immunisierung mit inaktiviertem und lebendem bzw. attenuiertem A. pleuropneumoniae

Serotyp 9 führte zu einer Reduzierung der Morbidität nach Belastung mit dem homologen

Serotyp (HENSEL et al. 1995). Eine Immunisierung per Aerosol mit einer Actinobacillus

pleuropneumoniae Serotyp 2 Inaktivatvakzine führt zu einer starken, IgA-geprägten

Immunantwort in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF), in Nasalflüssigkeit und im

Serum, die geimpfte Tiere nach Belastung mit homologen Serotypen gegen eine

schwerwiegende Pleuropneumonie schützt (LOFTAGER et al. 1993).Tiere, die mit einer

lebenden bzw. attenuierten A. pleuropneumoniae Vakzine immunisiert wurden, zeigten

höhere Antikörpertiter (IgA, IgM und IgG) als Tiere, die mit Inaktivatvakzinen immunisiert

wurden (HENSEL et al. 1995). Mit lebendem, nicht bekapselten A. pleuropneumoniae

Serotyp 1 oder Serotyp 5 Impfung waren die Tiere vor klinischer Erkrankung nach Belastung

mit homologen oder heterologen Serotypen geschützt, während Tiere in den Kontrollgruppen

starben (INZANA et al. 1993). Eine aerosole Immunisierung mit A. pleuropneumoniae ureC

und apxIIA Doppelmutante schützt vor Lungenkolonisierung.und die Doppelmutante war

attenuiert (TONPITAK et al. 2002). Immunisierte Schweine mit rekombinantem OmlA-

Protein von A. pleuropneumoniae Serotyp 1 immunisierte Schweine zeigten nach Belastung

mit dem homologen Serotyp signifikant niedrigere Mortalität, mildere klinische Symptome

sowie geringer ausgeprägte Lungenläsionen als Tiere der Kontrollgruppe. Allerdings konnte

Actinobacillus. pleuropneumoniae aus der Lunge aller immunisierten Schweinen isoliert

werden (GERLACH et al. 1993).

2.2 Anaerobe Genregulation

Eine Möglichkeit der Energieerzeugung in Abwesenheit von Sauerstoff ist eine Variation der

Atmung, bei der andere Elektronenakzeptoren als Sauerstoff verwendet werden. Zu diesen

Elektronenakzeptoren gehören Nitrat (NO3-), dreiwertiges Eisen (Fe3+), Sulfat (SO4

2-),

Carbonat (CO32-) und bestimmte organische Verbindungen (MADIGAN et al. 2003).

20

Literaturübersicht

Bakterien, die zu anaerober Atmung befähigt sind, besitzen im allgemeinen

Elektronentransportsysteme, die Cytochrome, Chinone, Eisenschwefelproteine und andere

typische Elektronentransportproteine enthalten (MADIGAN et al. 2003).

In E. coli werden viele unter anaeroben Bedingungen exprimierte Gene vom globalen

Regulator FNR reguliert (SHAW u. GUEST 1982). Das FNR (fumarate and nitrate

reduction)-Protein von E. coli ist ein ca. 30 kDa großes Protein; es enthält vier Eisen-

Schwefel-Gruppen und induziert die Regulation vieler Gene, wie z. B. der DMSO-Reduktase

(SPIRO u. GUEST 1990; UNDEN u. DUCHENE 1987; WEINER et al. 1992), die am

anaeroben Stoffwechsel beteiligt sind; gleichzeitig wird die Expression von Genen, die am

aeroben Metabolismus beteiligt sind unterdrückt. Escherichia coli besitzt Enzyme zur

Nutzung von DMSO und anderen Substraten als Elektronenakzeptoren und wächst unter

anaeroben Bedingungen auf Minimalmedium mit Glyzerol als Kohlenstoff- und Energiequelle

sowie DMSO als terminalem Elektronenakzeptor (BILOUS u. WEINER 1985). Die DMSO-

Reduktaseaktivität kann durch die Anwesenheit von Nitrat oder Sauerstoff unterdrückt

werden. Andererseits induziert anaerobes Wachstum auf DMSO als terminalem

Elektronenakzeptor die Aktivität von Nitrat, Fumarat und Trimethylamin-N-Oxid Reduktase

(BILOUS u. WEINER 1985). Ein Abfall des Sauerstoffspiegels, aber auch andere Faktoren

wie Wachstumsphase und Kohlenstoffquelle spielen eine wichtige Rolle bei der FNR-

Expression von E. coli (SOLTES u. MACINNES 1994).

Das HlyX Protein von A. pleuropneumoniae ist homolog zum FNR-Protein von E. coli

(JERLSTROEM et al. 1987; MACINNES et al. 1990; WOODS u. GUEST 1987). Wie FNR

enthält auch HlyX vier Eisen-Schwefel-Gruppen, die für das DNA-Bindungsvermögen des

Proteins verantwortlich sind (GREEN u. BALDWIN 1997). MACINNES et al. (1990) haben

die Nukleotidensequenz des hlyX-Gens analysiert und dabei einen offenen Leserahmen mit

einer Länge von 720 bp identifiziert, der von Länge und Sequenz her dem des fnr-Gens

entspricht. Der offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit einer molekularen Masse von

27,1 kDa. Die Nukleotidsequenz liegt unter der Zugangsnummer M34443 bei GenBank vor.

Der Vergleich der Nukleotidsequenz von hlyX mit der von fnr zeigt, dass beide zu 65%

identisch sind. Im hlyX-Gen sind Glycin, Isoleucin und Leucin vorwiegend durch CAA, ATT

und TTA kodiert, während bei fnr GAG, ATG und CTG die häufigsten Kodierungstripletts

sind. Die abgeleiteten Proteinsequenzen von FNR und HlyX sind sehr ähnlich, 71% von 239

Aminosäuren sind identisch. Vier Cysteinreste (Positionen 14, 18, 21 und 27) sind am

aminoterminalen Ende von sowohl HlyX als auch FNR vorhanden. Weiterhin ist auch die

Erkennungssequenz von HlyX der von FNR sehr ähnlich (15 von 18 Basen sind identisch).

21

Literaturübersicht

Die Konsensussequenz für HlyX-Bindungsstellen ist TTGAT----ATCAA und die

Erkennungssequenz von FNR ist TTGAT----ATCAG (GREEN u. BALDWIN 1997). Die

vergleichbare Aktivität von HlyX und FNR wurde auch dadurch bestätigt, dass eine FNR-

Mutante mit HlyX komplementiert werden konnte (GREEN u. BALDWIN 1997;

MACINNES et al. 1990). Anders als das FNR-Protein war das HlyX-Protein aber in der

Lage, die Synthese einer hämolytischen Aktivität bei E. coli unter anaeroben Bedingungen zu

induzieren (SOLTES u. MACINNES 1994); dieses Ergebnis weist auf Unterschiede der

beiden Proteine in ihrem DNA-Bindungsvermögen hin. Die Anwesenheit von HlyX oder

FNR sind für das Wachstum von E. coli (∆fnr) auf einem Glycerol-Nitrat Minimalmedium

unter anaeroben Bedingungen essentiell. Im Gegensatz dazu werden weder HlyX noch FNR

beim Wachstum auf demselben Medium mit Fumarat gebraucht (SOLTES u. MACINNES

1994).

Es wird vermutet, dass A. pleuropneumoniae ein ähnliches hierarchisches System für die

Expression der Gene im sauerstoffarmen Milieu wie E. coli hat (MACINNES et al. 1990).

Bisher wurde gezeigt, dass die DMSO-Reduktase und die Aspartase bei A. pleuropneumoniae

im ex vivo Modell (Zusatz von BALF zum Kulturmedium) hochreguliert sind und dass die

kodierenden Gene über potentielle HlyX-Bindungsstellen verfügen (BALTES et al. 2003;

JACOBSEN et al. 2005). Die Deletion des dmsA-Genes führt zur Attenuierung von

Actinobacillus. pleuropneumoniae in der akuten Phase der Infektion (BALTES et al. 2003).

Eine A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA Doppelmutante zeigte in Kultur reduziertes

Wachstum unter anaeroben Bedingungen sowie einen milderen klinischen Verlauf nach

Aerosol-Infektion als der Wildtypstamm und konnte nur selten in intakten Lungengeweben

nachgewiesen werden (JACOBSEN et al. 2005). Der A. pleuropneumoniae Wildtypstamm

konnte jedoch in großer Anzahl aus unverändertem Lungengeweben isoliert werden. Diese

Ergebnisse zeigen, dass mit der DMSO-Reduktase und der Aspartase zwei mögliche Vertreter

des HlyX-Regulons an Pathogenese und Persistenz beteiligt sind. Daraus lässt sich die

Hypothese ableiten, dass HlyX-regulierte Gene allgemein von grosser Bedeutung für die

Pathogenese und Persistenz von A. pleuropneumoniae im Respirationstrakt sind. In der

vorliegenden Arbeit sollte diese Hypothese überprüft werden. Dazu sollte eine hlyX-negative

Mutante von A. pleuropneumoniae erstellt und im Aerosolinfektionsmodell am Schwein auf

ihre Virulenz hin überprüft werden.

22

Material und Methoden

3 Material und Methoden

Die Zusammensetzung von Medien, Medienzusätzen und Puffern ist im Anhang aufgeführt

(Kapitel 9.2). Die benutzten Geräte, Enzyme und Chemikalien sind ebenfalls im Anhang

aufgeführt (Kapitel 9.1, 9.15 und 9.16)

3.1 Bakterienkulturen

3.1.1 Bakterien und Plasmide

Die in der Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in der Tabelle 2

aufgeführt.

3.1.2 Kultivierungsbedingungen

E. coli wurde in Luria-Bertani (LB) Medium im Schüttelinkubator (Incubator Shaker Series

25, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) oder auf LB-Agar im Brutschrank

(Memmert GmbH + Co. KG, Schwalbach) kultiviert. Je nach Kultivierungsziel wurden

Zusätze hinzugefügt.

Actinobacillus. pleuropneumoniae wurde in PPLO-Medium bzw auf PPLO-Agar mit

bestimmten Zusätzen kultiviert.

Für anaerobe Kulturen wurden 36 ml Medium mit 4 ml einer Übernachtkultur beimpft und im

Schüttler bis zu einer optischen Dichte bei 660 nm (OD660) von 0,3 inkubiert. Anschließend

wurde die Kultur in zwei Aliquots von 20 ml aufgeteilt. Ein Aliquot wurde normal im

Schüttler als aerobe Kontrolle weiter bebrütet und das zweite Aliquot wurde als anaerobe

Anzucht im Anaerobiertopf (OXOID, Wesel, Deutschland) für 3 Stunden inkubiert. Für die

Trockengewichtegewinnung wurden die Kulturen 16 Stunden in der Anaerobierkammer

inkubiert.

3.2 Ermittlung der Zelldichte

Die Zelldichte wurde durch die Messung der optischen Dichte der Flüssigkulturen bei 660 nm

(OD660) bestimmt.

23


3.3 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von DNA

Puffer und Lösungen zur Reinigung und Quantifizierung der DNA sind im Anhang aufgeführt

(Kapitel 9.3)

3.3.1 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae

1. Bakterien von einer gut bewachsenen Platte wurden in 2,5 ml TE-Puffer resuspendiert.

2. EDTA (10 mM, 25 µl), SDS (1%, 125 µl) und Proteinase K (500 µg/ml, 32 µl)

wurden zugegeben, gemischt und bei 55°C im Wasserbad inkubiert.

3. RNAse (100 µg/ml, 19 µl) wurde zugegeben und 30 min im Wasserbad 37°C

inkubiert.

4. Phenol (250 µl) in TE-Puffer wurde hinzugefügt, gemischt und bei -70°C über Nacht

eingefroren.

5. Das Gemisch wurde vorsichtig bei 55°C aufgetaut und Chloroform:Isoamylalkahol

(24:1)–Gemisch (500 µl) wurde anschließend zur Trennung der Phasen dazugegeben.

6. Der Ansatz wurde bei 10.000 rpm (SA600-Rotor), bei 4°C für 5 min zentrifugiert, der

Überstand wurde mit einer Plastik-Pasteurpipette entnommen und in ein neues

Polypropylen-Röhrchen pipettiert.

7. Die Phenol/Chloroform Extraktion mit 500 µl (ca. 1/5 des Volumens)

Chloroform:Isoamyl (24/1)-Gemisch wurde wiederholt und bei 10.000 rpm, 4°C 10

min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Plastikröhrchen überführt.

8. Die DNA wurde mit 3M Na-Acetat pH 5,2 (250 µl, ca. 1/10 des Volumens) und

Isopropanol (2,5 ml, ca. 1 Volumen) ausgefällt.

9. DNA-Fasern wurden mittels einer Pipettenspitze aufgewickelt, in 70% Ethanol für 5

min gewaschen und luftgetrocknet.

10. Die DNA wurde in 200 µl A. bidest. resuspendiert.

11. Die DNA wurde anschließend im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt.

12. Die DNA wurde durch Elektrophorese von 1 µl der Präparation auf einem Agarosegel

quantifiziert.

24


25

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26


3.3.2 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA

Drei ml Übernachtkultur (Schüttler) wurden abzentrifugiert.

1. Das Pellet wurde in 300 µl Tris-EDTA ( 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]; 10 mM EDTA,

1 mg/ml RNAse) resuspendiert.

2. Dreihundert µl NaOH-SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1% [w/v] SDS) wurden

hinzugegeben und bis zur Lyse der Bakterien bei Raumtemperatur (längstens 3 min)

inkubiert.

3. Dreihundert µl 3,2 M K-Acetat-Puffer (pH 5,5) wurden zugegeben, die Suspension

wurde gründlich gemischt und für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.

4. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

5. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 µl eiskaltem Isopropanol bei

Raumtemperatur.

6. Nach 10 min Zentrifugation bei 13.000 rpm wurde das Pellet getrocknet.

7. Das Pellet wurde in 25 µl A. dest. resuspendiert.

3.3.3 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract” (Macherey-NAGEL GmbH&CO.

Düren Deutschland)

1. Das DNA Fragment wurde unter UV-Licht (280 nm) aus einem TAE-Agarosegel

ausgeschnitten und gewogen.

2. Dreihundert µl NT1-Puffer/100 mg Gel wurden zugegeben und im Wasserbad bei

50°C bis zum vollständigen Lösen des Gels inkubiert.

3. Das aufgelöste Gel wurde auf ein Nucleospin-Säulchen geladen bei 10.000 rpm für

1 min zentrifugiert und die Flüssigkeit verworfen.

4. Fünfhundert µl NT2-Puffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 1 min

zentrifugiert und das Eluat verworfen.

5. Sechshundert µl NT3-Puffer wurden zugegeben, bei 13.000 rpm für 1 min


6. Zweihundert µl NT3-Puffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 5 min


7. Das Säulchen wurde in neues Reagenzgefäss überführt, 25-50 µl A. bidest. wurden

hinzugegeben und 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die aufgereinigte DNA

wurde durch Zentrifugieren bei 11.000 rpm für 1 min eluiert.

27


3.3.4 Aufreinigung mit dem „ GENE Clean“-KIT

1. Mit steriler Skalpellklinge wurden die Blöckchen möglichst „knapp“ aus dem

Agarosegel ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt.

2. Das Reaktionsgefäß mit Blöckchen wurde gewogen, das Gewicht des Blöckchens

wurde als Differenz zum Leergewicht ermittelt.

3. Die dreifache Menge des Blöckchengewichtes an Natriumjodidlösung wurden

zugegeben und ca 3 min bei 55°C inkubiert (bis zum Auslösen der Blöckchen).

4. Drei µl vollständig in Suspension gebrachte Glassmilch wurden zugegeben und

30 min bei Raumtemperatur stehengelassen.

5. Es wurde 20 sek. mit voller Geschwindigkeit (13000 rpm) zentrifugiert.

6. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen, 500 µl „New Wash“ wurden

zugegeben und die Glassmilk wurde durch gründliches Pipettieren resuspendiert.

7. Es wurde wieder 20 sek. zentrifugiert und der Überstand verworfen.

8. Das Waschen mit „New Wash“ wurde noch 2 mal wiederholt.

9. Nach dem letzten Abpipettieren des Überstands wurde 3 min mit voller

Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand mit einer gelben Pipettenspitze

restlos abgenommen.

10. Die Glassmilch wurde in 27 µl A. dest. resuspendiert und 3 min bei 55°C inkubiert.

11. Es wurde 3 min mit voller Geschwindigkeit zentrifugiert und 25 µl Überstand

wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

3.3.5 Bestimmung der DNA-Konzentration

Die DNA–Konzentration wurde im Spektrophotometer Ultrospec III bei 260 nm gemessen.

Der Leerwert wurde mit A. dest. eingestellt.

3.3.6 Anaerobe Anzucht zum Vergleich verschiedener Stämme und Bestimmung des

Trocknengewichts der Pellet

Tag 1:

1. PPLO-Medium wurde mit der adäquaten Menge EIVX und Tween 80 versetzt,

100 ml wurden mit einem Messzylinder abgemessen und in 200 ml Kolben

gefüllt.

28


2. Das Medium wurde in die Anaerobenkammer eingeschleust, die Deckel wurden

etwas gelockert und das Medium wurde dort für mindestens 2 Tage stehen

gelassen.

Tag 2:

PPLO-Platten wurden mit den zu untersuchenden A. pleuropneumoniae wt und

Actinobacillus pleuropneumoniae ∆hlyX-Stämmen beimpft.

Tag 3:

Beimpfte Platten und sterile Ösen wurden in die Kammer eingeschleust und das

Medium wurde beimpft.

Tag 4:

1. Nach 16 Stunden Inkubation wurden die Kulturen ausgeschleust.

2. Zur Reinheitskontrolle wurde eine Öse des Kulturmaterials auf Blutagar

ausgestrichen.

3. Kulturen wurden in Zentrifugenbecher überführt und bei 4°C, 8.000 rpm für

10 min abzentrifugiert. Kulturmaterial, dass am Kolbenboden klebte, wurde

mittels abgeflammter Glaspipette gründlich abgeschwemmt

4. Die gummiartigen Pellets wurden nach dem Zentrifugieren mit 5 ml steriler

physiologischer NaCl-Lösung in zuvor gewogene Polypropylenröhrchen

überführt.

5. Röhrchen wurden bei 4°C, 8,000 rpm, 10 min zentrifugiert.

6. Der Überstand wurde verworfen und die Röhrchen wurden 24 Stunden bei 80°C

inkubiert.

Tag 5:

1. Die Reinheitskontrolle wurde überprüft.

2. Die Röhrchen mit den getrockneten Pellets wurden gewogen und die Trockengewichte der

Pellets wurden anschließend berechnet.

3.4 Plasmidkonstruktion

3.4.1 PCR 2.1-TOPO-Cloning

1. Zu 2 µl des PCR 2.1-TOPO -Produkts wurden 1 µl Salzlösung, 1 µl steriles A. dest und

1 µl Vektor 2.1- TOPO hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert.

29


2. Fünfzig µl kompetenter E. coli wurden in ein Reaktionsgefäß pipettiert, die oben

inkubierte Lösung wurde hinzugegeben und auf Eis für 10 min stehen gelassen.

3. Das Gemisch wurde anschließend im Thermoblock bei 42°C für 20 sek. Inkubiert und

anschlissend auf Eis gestellt.

4. Zweihundertfünfzig µl SOC-Medium (Zusammensetzung im Anhang, Chapitel 8.2)

wurden nach dem Hitzeschock dazu pipettiert und dann wurden die Zellen für 1 Stunde

bei 37°C geschüttelt.

5. Auf LB-Platten mit Ampicillinzusatz wurden 25 µl X-Gal Lösung (25 mg/l,Verdünnung:

25 µl X-Gal Stammlösung + 125 µl A. dest) ausplattiert.

6. Die Bakterien wurden auf Platten (Platte 1: 200 µl, Platte 2: 100 µl) ausplattiert und im

Brutschrank bei 37°C über Nacht inkubiert.

7. Am nächsten Tag wurden die Platten überprüft und an weiβen Kolonien wurde eine PCR

zum Nachweis des Inserts durchgeführt.

3.4.2 Restriktionsenzymverdau

Die Zusammensetzung der angewendeten Puffer sind im Anhang aufgeführt (Chapitel 8.4).

Die Restriktionsenzymverdaus wurden in 25 µl Ansätzen (0,5 bis 1 µg DNA) durchgeführt.

Die DNA wurde mit A. dest., den jeweiligen Restriktionsendonukleasen, 10 × Carlos Puffer

und DTT-Puffer (10 mM) und BSA (1 mg/ml) gemischt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert.

Der Verdau wurde anschließend auf ein Agarosegel geladen und bewertet.

3.4.3 Auffüllen von Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase

Nach dem Restriktionsverdau mit den Enzymen BglII und XcmI wurden 0,5 µl einer dNTP-

Stammlösung (je 10 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP) und 0,4 µl T4 – Polymerase/Klenow

Fragment (Biolabs, Schwalbach Taunus, England) in den Ansatz (25 µl) gegeben und im

Wasserbad (12°C) für 20 min inkubiert.

3.4.4 Agarosegelelektrophorese

Die Puffer, die Lösungen und der Marker sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.5)

1. Je nach Größe wurden die DNA-Fragmente im 0,8-1,5 %igen Gel aufgetrennt.

2. Für das Gießen eines Gels wurde die erforderliche Menge der Agarose in entsprechendem

Puffer (1 x TAE/0,5 x TBE) unter Kochen gelöst, in einem 55°C Wasserbad abgekühlt

und mit Ethidiumbromid (1 µl Stammlösung [10 mg/ml] pro 50 ml) versetzt.

30


3. Das Gel wurde in eine Gelkammer gegossen

4. Nach dem Erstarren wurde das Gel in eine Elektrophoresekammer mit Laufpuffer

eingelegt.

5. Die Proben wurden mit entsprechenden Ladepuffer versetzt und, genauso wie HindIII-

verdaute λ-DNA als Größenstandard, in die Geltaschen geladen.

6. Die Stromspannung und die Zeit der Auftrennung wurden entsprechend Größe und

Konzentration des Gels und der Größe der DNA-Fragmente eingestellt (180V für große

und 80V für kleine Gele und 1 Stunde).

7. Nach Auftrennung wurden die DNA-Fragmente unter UV-Licht beurteilt oder mit einer

Polaroid-Kamera bzw. mit dem Biorad MultiAnalyst-System fotografiert.

3.4.5 Ligation

Zur Ligation wurden Vektor (0,1 µg DNA), Insert (im Überschuss), A. dest., 2 x Ligasepuffer

und T4-DNA-Ligase in einem 20 µl Ansatz gemischt und bei 16°C für über Nacht inkubiert.

Ein Ansatz ohne Insert mit Ligase diente als negative Kontrolle.

Tabelle 3: Zusammensetzung des Ligationsgemisches

Ansätze 1 2 3 4 Vektor 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl Insert 7,5 µl 2,5 µl - -

A. dest - 5 µl 7,5 µl 7,5 µl 2 x Ligasepuffer 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl

Ligase + + + -

3.5 Transformation

Die Puffer und die Medien zur Transformationsdurchführung sind im Anhang aufgeführt

(Kapitel 9.2 und 9.6).

3.5.1 Herstellen von chemisch kompetenten Zellen

1. Escherichia coli DH5α wurde auf LB-Agar ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C über

Nacht bebrütet.

31


2. Eine Einzelkolonie wurde in 3 ml LB-Medium mit 20 mM MgCl2 angeimpft und als

Standkultur bei 37°C über Nacht inkubiert.

3. 150 ml LB-Medium mit 20 mM MgCl2 (über Nacht vorgewärmt) wurden mit der

Standkultur beimpft und bei starkem Schütteln bebrütet.

4. Bei OD660 von 0,3-0,4 wurde die Kultur auf Eis gestellt und in vorgekühlter Zentrifuge

(4°C) 4000 x G, 10 min pellettiert.

5. Der Überstand wurde verworfen; das nach dem Abgießen verbleibende Restmedium

wurde vorsichtig mit einer Pipette entfernt.

6. Das Pellet wurde in 30 ml TFB1 (eiskalt, pH 5,8) resuspendiert und mindestens 90 min

auf Eis gestellt.

7. Die Bakterien wurde bei 4°C 4000 x G, 10 min pelletiert, der Überstand verworfen und

das Restmedium mit einer Pipette abgenommen.

8. Das Pellet wurde in 5 ml TFB2 Lösung (pH 6,5) resuspendiert und für maximal 30 min

auf Eis gehalten.

9. Das Abfüllen erfolgte in vorgekühlte Eppendorfreaktionsgefäße (Aliquots ca.250 µl/-

Reaktionsgefäß) und die Aliquots wurden bei – 70°C eingefroren.

3.5.2 Transformation von chemisch kompetenten E. coli DH5α Zellen mit Plasmiden

1. Kompetente Zellen (DH5αF’) wurden aus – 70°C entnommen und auf Eis aufgetaut.

2. Zu 100 µl kompetenten Zellen wurden 10 µl Ligationsansatz gegeben.

3. Das Gemisch wurde für 1 Stunde auf Eis gestellt und anschließend im Thermoblock bei

42°C für 3 min inkubiert.

4. Nach dem Hitzeschock wurden die Ansätze für 2 min auf Eis gestellt.

5. Zweihundert µl LB-Medium wurden zugegeben und die Suspension wurde im

Brutschrank bei 37°C für eine Stunde inkubiert.

6. Die Bakterien wurden auf ½ vorgetrocknete Agarplatte mit entsprechendem Antibiotikum

ausplattiert und mit der Öse fraktioniert.

7. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert und Kolonien nach 12 – 16 Stunden beurteilt.

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3.5.3 Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae

3.5.3.1 Herstellen elektrokompetenter Zellen

1. Fünfzig ml supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1% Tween80 wurden mit einer

Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 37°C mit 5% CO2 inkubiert; 250 ml

supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1 % Tween80 wurden über Nacht bei 37% mit

5% CO2 vorgewärmt.

2. Die 250 ml Medium wurden mit 25 ml der Übernachtkultur beimpft und bei 37°C im

Schüttler bis zu einer OD600 von 0,3 – 0,4 inkubiert.

3. GYTT-Medium wurde für 20-30 min zum Vorkühlen auf Eis gestellt.

4. Die Bakterien wurden bei 4°C in der vorgekühlten Zentrifuge bei 5.000 rpm für 10 min

abzentrifugiert, der Überstand wurde verworfen.

5. Das Bakterienpellet wurde dreimal vorsichtig mit eiskaltem GYTT-Medium (50 ml,

30 ml, 20 ml) gewaschen und der Überstand wurde nach dem Zentrifugieren (5.000 rpm,

4°C, 10 min) jeweils mit einer Pipette abgenommen.

6. Die Bakterien wurden in einem Endvolumen von 1,5-2 ml eiskaltem GYTT aufgenommen

und am selben Tag transformiert.

7. Die Reinheit der transformierten Bakterien wurde auf supplementiertem PPLO-Agar und

auf Blutagar überprüft.

3.5.3.2 Durchführung der Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae

1. Die Elektroporationsküvetten wurden auf Eis gestellt, supplementiertes PPLO-Medium

wurde in 5% CO2 bei 37°C vorgewärmt (1 ml je Ansatz).

2. 2-5 µg (10 µl) dialysierte DNA und 200-300 µl kompetente Zellen wurden in die

vorgekühlten Küvetten gegeben und 20-30 min auf Eis gestellt.

3. Der Genpulser wurde auf 2,5 KV, 25 µFD und 1000 Ω eingestellt.

4. Wassertropfen an der Außenseite der Küvette wurden vor dem Einstellen in den Gen-

Pulser getrocknet und die Elektroporation wurde durchgeführt.

5. Sofort nach der Elektroporation wurde 1 ml vorgewärmtes PPLO-Medium in die Küvetten

gegeben und gemischt. Der Gesamtinhalt wurde in Polypropylen-Röhrchen überführt und

für 2 – 3 Stunden bei 37°C bebrütet.

6. Transformierte Zellen wurden anschließend auf Agar mit den entsprechenden Antibiotika

ausplattiert und über Nacht bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.

33


7. Platten wurden am nächsten Tag beurteilt.

3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Verwendete Primer sind in der Tabelle 2 aufgeführt.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde wie folgende durchgeführt:

1. Fünf µl Template (DNA oder Kolonie [in 100 µl 0,1% TE]) wurden in PCR-Gefäße

pipettiert.

2. Der Mastermix wurde erstellt (Tabelle 4); 0,1 µl Taq-Polymerase pro Ansatz wurde zum

auf Eis gekühlten Mastermix gegeben.

3. Zwanzig µl Mastermix mit Taq-Polymerase wurden in die PCR-Gefäße pipettiert.

4. Die PCR-Reaktionen (mit Positiv- und Negativkontrollen) wurden in den Thermocycler

gestellt und das HLYX5 Programm (94°C 3 min; [94°C 30 sek., 55°C 1 min, 72°C 2 min

30 sek.] x 32 Zyklen; 72°C 10 min) wurde anschließend gestartet.

5. Nach Beendigung der PCR wurden die Proben entnommen und auf Agarose Gele (1,5 %)

geladen oder bei – 20°C eingefroren.

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Tabelle 4: Mastermix-Zusammensetzung

Datum: Template: [ ] Plasmid [ ] chrom.

DNA [ ] Kolonie

Primer:

Volumen und benötigte Mengen/ Ansatz:

Mastermix [ ] 25

µl [ ] 50

µl [ ] anderes: _____ µl

benötigte Ansätze:

____ PCR- Puffer 10

x 2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl

MgCl 0, 75 µl 1,5 µl ___ µl ___ µl

dNTPs 10 mM/each 0,5 µl 1 µl ___ µl ___ µl

Primer 1 5 pM/each

2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl

Primer 2 5 pM/each

2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl

Bemerkungen:

H2O 11,15 µl 27,3 µl ___ µl ___ µl Cycler:

Taq 0,1 µl 0, 2 µl ___ µl ___ µl Programm:

Template 5 µl 5 µl ___ µl ___ µl Start: ___:___ Uhr

3.7 Konjugation von E. coli und A. pleuropneumoniae

Die verwendeten Puffer sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.7).

1. Donorstamm (E. coli ß2155 mit pEMOC2-Derivat) und Rezipientenstamm

(A. pleuropneumoniae wt) wurden auf festem Nährboden über Nacht (max. 14 Stunden)

kultiviert.

2. Die Kulturen wurden mit einem Wattetupfer von der Platte abgenommen, in 3 ml

vorgewärmtem TNM-Puffer resuspendiert und auf eine OD600 von 2 eingestellt.

3. Nitrozellulosefilter (Durchmesser 2,5 cm; Porenweite 0,45 µm) wurden auf Whatman

3MM Filterpapier gelegt (erwärmt auf 37°C); 50 µl Donorzellen und 400 µl

Rezipientenzellen wurden vorsichtig gemischt, auf die Nitrozellulosemembran

aufgebracht, über die gesamte Membran verteilt, und inkubiert, bis die auf der Membran

stehende Flüssigkeit in das darunterliegende Filterpapier gesaugt worden war.

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4. Die noch leicht feuchten Membranen wurden auf vorgewärmtem PPLO Agar,

supplementiert mit 1% EIVX, 1 mM DAPI, 10 mM MgSO4 gelegt und ca. 7 Stunden bei

37°C und 5% CO2 inkubiert; für jede Membran wurde eine PPLO-EIVX-

Chloramphenicol (Cm, 5 µg/ml) Platte zum Vortrocknen in Inkubator gelegt.

5. Die Filter wurden abgenommen, in ERG verbracht und mit ca. 650 µl PPLO Medium

(supplementiert mit EIVX) durch vortexen abgewaschen.

6. Der Inhalt wurde auf eine vorgetrocknete supplementierte PPLO-EIVX-Cm-Platte

aufgebracht und bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.

7. Die Trankonjuganten wurden durch PCR überprüft

3.8 Saccharose-Gegenselektion

Die verwendete Medien sind im Anhang aufgeführt (Chapitel 9.2).

1. Eine chloramphenicolresistente Kolonie wurde morgens in 1 ml vorgewärmtem

supplementiertem PPLO-Medium inokuliert und im Schüttler (37°C) für 2 Stunden (bis

zum Auftreten einer leichten Trübung) inkubiert.

2. Vierhundert µl 2,5-fach konzentriertes PPLO Medium 500 µl 40% Saccharose, 100 µl

steriles Pferdeserum und 10 µl EIVX wurden zugegeben.

3. Die Kultur wurde für 5-6 Stunden weiter geschüttelt. Im Anschluss wurden 50 µl von der

Kultur auf einer halben supplementierten PPLO-Platte ausplattiert, über die restliche

Hälfte der Platte fraktioniert und über Nacht bei 37°C im CO2-Inkubator (5 % CO2)

bebrütet.

3.9 Southern Hybridisierung

Puffer und Lösungen zum DNA-Transfer, zur Herstellung einer Gensonde und zur Southern-

Hybridisierung sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.8, 9.9 und 9.10).

3.9.1 Southern Blot

1. Die Depurinierung wurde in Depurinierungslösung für 15 min durchgeführt

2. Die Denaturierung der DNA erfolgte in Denaturierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min)

3. Die Neutralisation wurde in Neutralisierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min)

vorgenommen.

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4. Der Unterbau in einer Plastikschale wurde mit 2 Lagen 3MM Filterpapier bedeckt und

unter Puffer gesetzt (10 × SSC) ; das Filterpapier wurde mit Puffer bedeckt.

5. Das Gel wurde mit Unterseite nach oben auf das Filterpapier gelegt.

6. Ein genügend großes Stück Tropilon–45 Membran (rundum ca. 2 mm größer als das Gel)

wurde mit A. dest. angefeuchtet und unter Vermeidung von Luftblasen aufgelegt.

7. Zwei Lagen Filterpapier (2 mm < Membran) wurden trocken aufgelegt.

8. Mehrere Lagen Papierhandtücher wurden als Saugkissen aufgelegt.

9. Ca. 500 g Gewicht wurde aufgelegt (je nach Gelgrösse; das Gewicht wurde so bemessen,

dass Papierhandtücher gerade eben zusammengedrückt sind).

10. Nach einer Blottingdauer von 0,5-15 Stunden wurden die Auflagen entfernt.

11. Das Gel wurde mit der Membran zusammen umgedreht, die Geltaschen (mit Bleistift) und

Seiten (Ecke abgeschnitten) wurden markiert.

12. Das Gel wurde abgezogen und entsorgt.

13. Die Membran wurde 5 min in 5 x SSC geschwenkt.

14. Die Membran wurde in Papierhandtüchern getrocknet und 2 Stunden bei 90°C gebacken.

15. Die gebackene Membran wurde in A. dest. angefeuchtet und in 6 x SSC Lösung für 2 min

geschwenkt.

16. Die Membran wurde eingerollt und mit ausreichend Hybrisierungspuffer (50 ml) in einer

Glasröhre für ca. 2 Stunden im Hybrisierungsofen inkubiert (Prähybridisierung).

17. Die Flüssigkeit wurde abgegossen, Hybrisierungspuffer (50 ml) und 5 min gekochte

Gensonde (ca. 50 µl) wurden dazugegeben, und die Membran wurde über Nacht (bei ca.

60 °C) hybridisiert.

Nach Abgießen des Hybridisierungspuffers und der Sonde wurde die Membran mit 1 x SSC +

0,5 % SDS ca. 1 Stunde (Waschpuffer 3 x gewechselt) gewaschen.

Zur Exposition der Membran auf Röntgenfilm wurde folgendermaßen vorgegangen:

1. Ein alter Film wurde als Unterlage mit Frischhaltefolie überzogen; die Blots wurden

darauf aufgelegt und mit Folie bedeckt.

2. Auf diese zweite Lage Frischhaltefolie wurden drei Stückchen Klebeband geklebt und mit

radioaktiver Tinte Kreuze als Markierung gemacht.

3. Die Blots wurden in eine Röntgenkassette eingelegt; der Film (Kodak X-OMAT AR,

SIGMA, Deisenhofen) wurde direkt auf Blots gelegt; eine Verstärkerfolie wurde darauf

gelegt, und der Film bei -70°C exponiert (Dauer je nach Aktivität des Blots).

37


3.9.2 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode

Es wurden zusammenpipettiert:

5 µl OLB

1 µl acetyliertes BSA (10 mg / ml)

5 µl DNA (20 -30 ng ) vorher 5 min bei 100 °C, kurz auf Eis

10.5 µl A. dest.

1 µl T4-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment)

2.5 µl dCTP-32*

25 µl Gesamtansatz

Das Gemisch wurde 4 -5 Stunden bei RT inkubiert, dann werden 100 µl STOP-Puffer

hinzugefügt.

3.10 Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE)

Puffer, Lösungen und Marker sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.14)

1. Eine Platte supplementierte PPLO-Agar wurde am ersten Tag mit A. pleuropneumoniae

beimpft und im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO2 bebrütet.

2. Das Koloniematerial wurde am zweiten Tag von der Platte abgeschwemmt und in 3 ml

Pett IV resuspendiert.

3. Die Suspension wurde auf eine OD600von 0,3 eingestellt.

4. Fünf ml Bakteriensuspension in Pett IV wurden bei 4°C und 4.000 rpm für 10 min

abzentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen und das Pellet in 0,5 ml Pett IV

resuspendiert und gut durch Vortexen gemischt.

5. Das Röhrchen mit Bakteriensuspension wurde auf Eis gestellt.

6. Für je 10 Blöckchen wurde 1 ml einer 1,2% igen Agarose ( Biorad # 162-0135; Agarose

Chromosomal Grade Biorad, 25 g) angefertig und in einem 55°C Wasserbad aufbewahrt.

7. 0,5 ml warme Agarose wurde schnell in das Röhrchen mit der vorher vorgewärmten

Bakteriensuspension überführt und vorsichtig gemischt.

8. Mit einer 1 ml-Pipette wurden je 100 µl der agarosehaltigen Suspension in gereinigte

Gießförmchen pipettiert.

9. Die Förmchen wurden für 10 min in den Kühlschrank gestellt.

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10. Nach Entfernung von überstehender Agarose von den Gießförmchen wurden je 5

Blöckchen mit umgebogenem Glas-„Pasteurhäkchen“ aus dem Gießstand gestoßen in ein

Röhrchen mit 3 ml Lysepuffer überführt

11. Die Blöckchen wurden in der Lysepufferlösung für 2 Stunden bei 37°C im Brutschrank in

Schräglage ohne schütteln inkubiert.

12. Die Lyselösung wurde abgegossen, jedem Röhrchen wurden 3 ml ESP-Puffer zugegeben

und über Nacht bei 55°C im Wasserbad ohne Schütteln inkubiert.

13. Der ESP-Puffer wurde abgegossen, die Blöckchen wurden mit 3 ml A. dest. gewaschen

und bei Raumtemperatur 15 min waagerecht sanft geschwenkt.

14. Das A. dest. wurde abgegossen und in jedes Röhrchen wurden 2 ml TE-PMSF-Gemisch

gegeben und 30 min bei Raumtemperatur sanft geschwenkt.

15. Der TE-PMSF-Puffer wurde abgegossen, 3 ml A. dest. wurden zugegeben und die

Röhrchen für 15 min bei Raumtemperatur sanft geschwenkt.

16. Das A. dest. wurde abgegossen, 3 ml TE-Puffer wurden hinzugefügt und die Röhrchen

wurden für 30 min bei Raumtemperatur waagerecht geschwenkt.

17. Der TE-Puffer wurde abgegossen und frischer TE-Puffer zugegeben und 30 min bei

Raumtemperatur geschwenkt.

18. Der TE-Puffer wurde abgegossen.

19. Fünf ml TE-Puffer wurden hinzugefügt und die Blöckchen über Nacht (oder länger) im

Kühlschrank aufbewahrt und anschließend verdaut (Tabelle 5).

20. Die Auftrennung der Makrorestriktionsfragmente erfolgte in einem 1%-igen TBE-

Agarose-Gel.

21. Zur Herstellung des Geles wurde die erforderliche Menge Agarose in 0,5 x TBE durch

Aufkochen gelöst und nach Abkühlen bei 55°C in eine Flachbettapparatur mit

eingesetztem PVC-Kamm zur Erzeugung der Probentaschen gegossen.

22. Der Kamm wurde nach Erstarren des Gels entfernt und die verdauten Blöckchen wurden

vorsichtig in die Slots eingesetzt.

23. Eine dünne Scheibe von Lambda Ladder PFG-Marker ( 50 µg/ml von NEB, Schwalbach,

Taunus, England) wurde als Größenstandard genutzt.

24. Befüllte Slots wurden mit erwärmter Agarose versiegelt und 15 min stehen gelassen.

25. Nach Befestigung der Umrandung in der PFGE-Kammer wurde das Gel in die Kammer

gelegt.

26. Der Laufpuffer wurde vorsichtig in die Kammer gegossen.

39


27. Das Programm wurde anschließend bei einer Temperatur von 12°C, einem

Spannungsgradienten von 6 V/cm bei eingeschlossenem Winkel von 120° auf Pulszeiten

von 10 bis 20 sek. (Block I, 14 Stunden) sowie von 35 bis 70 sek. (Block II, 12 Stunden)

eingestellt.

28. Nach der Beendigung der Auftrennung wurde das Gel in Ethidiumbromidlösung

(1:20.000; 25 µl Ethidiumbromidstocklösung [10 mg/ml] auf 500 ml A. dest.) für 15 min

gefärbt.

29. Das Entfärben erfolgte danach in A. dest. für 15 min.

Tabelle 5: Verdau der Blöckchen

ApaI Verdau AscI Verdau NotI Verdau Puffer (NEB) 25 µl 25 µl 25 µl BSA (NEB) 2,5 µl - 2,5 µl

ApaI 10 UI - - AscI - 10 UI _ NotI - - 10 UI

A. dest ad. 250 µl 250 µl 250 µl Ansätze mit ApaI wurden jeweils bei 25°C und Ansätze mit AscI und NotI bei 37°C über

Nacht inkubiert.

3.11 Sequenzierung

Die Nukleotidsequenzierung wurde von der Firma Seqlab (Göttingen, Deutschland) an einem

ABI-PRISM-Sequenziergerät (Modell 3700) mit der Kettenabbruchmethode nach SANGER

(SANGER et al. 1992) durchgeführt. Die Sequenzanalyse wurde mit dem HUSAR Programm

des deutschen Krebsforschungszentrums Heidelberg, Deutschland, durchgeführt.

3.12 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS) –Page

Die Puffer und die Lösungen zur SDS-Page Durchführung sind im Anhang aufgeführt

(Kapitel 9.11)

1. Supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1% Tween80 (10 ml) wurde mit Actinobacillus.

pleuropneumonie AP76 und A. pleuropneumonie ∆hlyX beimpft und über Nacht inkubiert.

2. 40 ml vorgewärmtes Medium wurden mit 10 ml einer Übernachtkultur beimpft und im

Schüttler bis zu einer OD660 von 0,3 geschwenkt.

40


3. Bei Erreichen einer OD660 von 0,3 wurde eine Reinheitskontrolle durch Ausstreichen auf

Blutagar durchgeführt.

4. Zwanzig ml aerobe Kultur wurden abzentrifugiert und das Pellet wurde bei – 20°C

aufbewahrt; die verbleibenden 20 ml wurden für 3 Stunden in einen Anaerobiertopf

(OXOID, Wesel, Deutschland) verbracht.

5. Nach Messung der OD660 der anaeroben Kulturen wurde der Koeffizient berechnet, um

die OD an die der homologen aeroben Kulturen anzupassen.

6. Pellets der aeroben und anaeroben Kulturen wurden je in 200 µl A. dest resuspendiert;

7. Die Glasplatten wurden in einem Gießstand zusammengebaut.

8. Die Anfertigung der Gele erfolgte wie in Tabelle 6 beschrieben.

9. Die Gele wurden gegossen.

10. Zehn µl von jeder Bakteriensuspension und 10 µl Spaltpuffer wurden vermischt und bei

100°C für 5 min gekocht und anschliessend auf Eis gestellt.

11. Die Proben wurden geladen und die Elektrophorese im Mini-Protean II von BioRad bei

150 V für 1 Stunde durchgeführt.

Tabelle 6: Zusammensetzung des Polyacrylamidgeles

Trenngel Sammelgel A. dest.

1,5 Tris (pH 8,8) 0,5 Tris (pH 6,8)

SDS (10%) TEMED

Acrylamidlösung 10% APS

3,9 ml 2,5 mi

- 100 µl 10 µl 3,8 ml 100 µl

3,05 ml -

1,25 ml 50 µl 10 µl

0,65 ml 50 µl

3.13 Western Blot

Die Puffer, Lösungen und die Molekularmassenstandards sind im Anhang aufgeführt (Kapitel

9.12)

1. Die Gele wurden mittels Elektrotransfer in einer Biorad Transblot Apparatur auf

Nitrozellulosemembranen geblottet; die Membranen wurden in Blockpuffer gelegt und im

Kühlschrank über Nacht gelagert.

2. Der Blockpuffer wurde abgegossen und die Membran (ca. 100 cm2) wurde in 10 ml

Blockpuffer und 50 µl Kaninchen-anti-DmsA-Antiserum (Endkonzentration: 1:2000,

41


BALTES et al. 2003) eingelegt und auf dem Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur

geschwenkt.

3. Der Blockpuffer wurde abgegossen.

4. Die Membran wurde 3 x 5 min mit Waschpuffer gewaschen.

5. Zehn ml Waschpuffer und 20 µl 1 : 10 vorverdünntes alkalische Phosphatase-gekoppeltes

Ziege-anti-Kaninchen-Konjugat (Dianova, Hamburg) wurden auf die Membran gegeben

und auf dem Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur geschwenkt.

6. Die Membran wurde 2 x mit Waschpuffer gewaschen und anschließend 5 min mit

Substratpuffer gewaschen.

7. 10 ml Substratpuffer + 100 µl 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat [(BCIP), 5 mg/ml] +

100 µl Nitroblau Tetrazolium [(NBT), 10 mg/ml) wurden auf die Membran gegeben und

bis zum Erscheinen der Banden inkubiert.

3.14 Aspartase Test

Die Zusammensetzung des Aspartase-Puffers ist im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.13).

1. Der Test-Puffer wurde im Wasserbad auf 37°C vorgewärmt.

2. Das Photometer wurde auf 240 nm einstellt.

3. Ein ml Aspartase-Puffer wurde in Quarzküvetten eingefüllt und die Absorption gemessen

und notiert.

4. Es erfolgte die Zugabe von 50 µl Ganzzelllysat mit 1 mg /ml Proteingehalt.

5. Nach Messen des Nullwertes (Puffer) wurden die Werte alle 60 sek. gemessen.

3.15 Tierversuch

3.15.1 Versuchstiere

Die Untersuchungen wurden an 18 Schweinen der Rasse „Deutsche Landrasse“ im Alter von

7 bis 9 Wochen durchgeführt (Genehmigungsnummer für den Tierversuch: 009i-[neu]42502-

98/45). Die Tiere wurden durch Randomisierung in zwei Gruppen von je 9 Tieren eingeteilt

und in Isolierställen mit separatem Lüftungssystem gehalten. Die Luftfeuchtigkeit und

Temperatur wurden täglich kontrolliert. Die Tiere waren klinisch gesund und frei von

Actinobacillus. pleuropneumoniae. Die serologische Untersuchung der Versuchstiere auf eine

Actinobacillus. pleuropneumoniae Infektion erfolgte durch einen Enzyme-linked

42


Immunosorbent Assay (ELISA; (LEINER et al. 1999)). Sie wurden einmal täglich gefüttert

und erhielten Wasser ad libitum.

3.15.2 Herstellen der Bakteriensuspension für die Aerosolbelastung

Supplementiertes PPLO-Medium (je 10 ml) mit 0,1 % Tween 80 wurde jeweils mit

Actinobacillus. pleuropneumoniae wt und der A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante beimpft

und im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 über Nacht inkubiert. Diese Standkulturen von

Actinobacillus. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae∆hlyX wurden am nächsten

Tag zur Inokulation von 90 ml supplementiertem PPLO-Medium mit 0,1 % Tween 80

verwendet; die Kulturen wurden im Schüttler bei 37°C bis zum Erreichen einer OD660 von 0,4

angezüchtet. Die Kulturen wurden auf Eis gestellt, mit eiskaltem NaCl (150 mM) 1:300

verdünnt und bis zur Belastung auf Eis aufbewahrt. Kurz vor der Belastung wurde eine

weitere Verdünnung 1:100 mit eiskaltem NaCl (150 mM) angefertigt; dann wurden 13 ml

dieser Bakteriensuspension pro 4 Schweine vernebelt (das enspricht etwa 1 x 105 Erreger/ml).

Bei dieser Vorgehensweise wird eine Erregerdichte von etwa 1 x 103 A. pleuropneumoniae

pro Liter Aerosol in der Kammer (siehe unten) erreicht.

3.15.3 Aerosolkammer und Infektion

Die Infektion erfolgte in einer Aerosolkammer, die vom Impfstoffwerk Dessau nach

Beschreibungen von JACOBSEN et al. (1996) gebaut wurde. Die Tiere wurden jeweils in

Gruppen von 4 oder 5 Tiere belastet, wobei 13 ml Bakteriensuspension (ca. 1 x 105 /ml) mit

einem Druck von 2 bar in ca. 2 min vernebelt wurden. Für das Vernebeln wurde die Düse

Modell Nr. 97058 (Schlick Duesen, Untersiemau, Deutschland) auf Position „5“ und das

Ventil auf Position „75“ eingestellt. Nach weiteren 10 min wurde das Aerosol mittels eines

Kompressors 20 min lang aus der Kammer abgepumpt. Anschließend wurden die Tiere in die

Ställe zurückgetrieben.

3.15.4 Überwachung und Erhebung klinischer Parameter

Einen Tag vor der Belastung wurde mit der Erhebung der klinischen Parameter begonnen;

dies wurde täglich bis Tag 7 nach der Belastung weitergeführt. Die klinischen Parameter

Körpertemperatur, Husten, Dyspnoe, Lethargie und Grad der Inappetenz wurden erhoben.

43


3.15.5 Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF)

Zur Gewinnung der BALF wurden die Tiere mit einem Gemisch von Azaperon (Stresnil,

Janssen GmbH, Neuss, Deutschland; 2mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (Ursotamin,

Serumwerk Bernburg Ag, Bernburg; 15 mg/kg Körpergewicht) intramuskulär anästhesiert.

Nach Fixierung der Tiere wurde die BALF mit Hilfe eines flexiblen Bronchoskops (Typ

XP20, Fa. Olympus, Hamburg, Deutscland) nach Einführung bis zum Bronchus des rechten

Kraniallappens gewonnen. Einhundert ml lauwarme (30°C) NaCl-Lösung wurden in

Portionen von 20 ml eingegeben und wieder abgesaugt. Eine spezielle Saugpumpe

(Endoaspirator, Fa Georg Paudrach, Hannover, Deutschland) erzeugte ein Vakum von 0,2 bis

0,5 bar und gewährleistete somit die Rückgewinnung der Spülflüssigkeit (ca. 90 ml BALF

wurden pro Spülung und Tier gewonnen und bis zum Erregernachweis auf Eis gestellt).

3.15.6 Bakteriologischer Erregernachweis aus BALF

Ein ml BALF wurde bei 5.000 rpm für 2 Minuten zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in

60 µl NaCl (150 mM) resuspendiert. Zwanzig µl dieser Suspension wurden auf Gassner-

Platte, Columbia Schafblut (CSB)-Agar und auf supplementiertem PPLO-Agar ausplattiert.

Die Platten wurden am nächsten Tag ausgewertet. A. pleuropneumoniae zeigt ein minimales

Wachstum mit Hämolyse auf der CSB-Platte und ein gutes Wachstum auf der

supplementierten PPLO-Agar-Platte. Erhaltene A. pleuropneumoniae-Kolonien wurden

gezählt, auf supplementiertem PPLO-Agar subkultiviert und mittels PCR-Analyse unter

Verwendung der Primer oHLYX6 und oHLYX7 bestätigt.

3.15.7 Sektion

Die Versuchtiere wurden nach BALF Gewinnung am Tag 21 mit einer intravenöse Injektion

von 10 ml Eutha 77 (Pentobarbital, Essex Pharma, München, Deutschland) euthanasiert.

Nach Eröffnung des Brustkorbes wurden die Organe entnommen und die Veränderungen

makroskopisch durch Adspektion und Palpation bewertet. Von jedem Lungenlappen wurde

eine Probe für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Die Lungenveränderungen

wurden nach der Methode von HANNAN et al. (HANNAN et al. 1982) beurteilt. Die

Methode beruht auf einem “scoring“-System, wobei “scores“ von maximal 5 (komplett

verändert) für jeden Lappen und somit 35 (maximal) pro Lunge zu erreichen sind. Zur

Ermittlung des Lungen-„score“ sind die einzelnen Lungenlappen in Dreiecksfelder unterteilt

44


und einzelne Lungenläsionen werden auf den korrespondierenden Dreiecksfeldern markiert.

Die Zählung der veränderten Dreiecken ergibt den Grad der Läsion, der dann als „score“

ausgedrückt wird. Die Summe aller Lappen- „scores“ ergibt den “lung lesion score“

(HANNAN et al. 1982). Die Europäische Pharmakopoe schreibt diese Methode für Impfstoff-

Versuche mit A. pleuropneumoniae vor.

3.15.8 Bakteriologische Organuntersuchung

Proben von verändertem und intaktem Lungegewebe, von Tonsillen und von

Tracheobronchallymphknoten wurden zum bakteriologischen Erregernachweis verwendet.

Die Gewebeproben wurden nach dem Abflammen angeschnitten und auf CBS und

Selektivagar (Zusammensetzung im Anhang, Kapitel 9.2) fraktioniert ausgestrichen. Die

Platten wurden im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 über Nacht bebrütet. Die Platten wurden

folgendermaßen ausgewertet: (-) keine A. pleuropneumoniae -verdächtigen Kolonien, (+)

Actinobacillus. pleuropneumoniae-Kolonien nur im direkt beimpfen Bereich, (+ +)

Actinobacillus. pleuropneumoniae-Kolonien auch im Bereich der 1 Fraktionierung und (+ +

+) A. pleuropneumoniae-Kolonien auch im Bereich der 2. Fraktionierung).

Für die semiquantitative Bestimmung von A. pleuropneumoniae aus Lungenläsionen wurden

2 g Sequesternmaterial pro Tier aus 2 Läsionen entnommen und auf Eis gestellt. Hundert mg

des Materials wurden in Schraubdeckeleppendorfreaktionsgefäße abgefüllt und 5-6 große

Glaskugeln und 1 ml physiologische Kochsalzlösung wurden hinzugegeben. Das Gewebe

wurde mit dem FastPrep Gerät aufgeschlossen (Stufe 3, 40 sec). Von der Suspension wurden

20 µl entnommen und eine logarithmische Verdünnungsreihe (Doppelansatz) wurde angelegt.

Von den Verdünnungsstufen (unverdünnt bis 10-7) wurden je 25 µl auf supplementierten

PPLO-Agar aufgetropft und über Nacht inkubiert. Erhaltene A. pleuropneumoniae-Kolonien

wurden gezählt, auf supplementiertem PPLO-Agar subkultiviert und mittels PCR-Analyse

unter Verwendung der Primer oHLYX6 und oHLYX7 bestätigt.

3.15.9 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay )

Die Immunantwort der Versuchtiere wurde mittels eines ELISA ermittelt. Die Methode zur

Bestimmung des ApxIIA-Toxin-Antikörpertiters beruht auf einem standardisierten ELISA mit

einem rekombinanten A. pleuropneumoniae ApxIIA-Protein als Antigen (LEINER et al.

1999). Der ELISA wurde von der IVD (Innovative Veterinärdiagnostik, GmbH, Aninstitut,

Tierärztliche Hochschule Hannover) duchgeführt.

45


3.15.10 Statistik

Für die statistische Auswertung wurde das WinStat Plug-in Modul (R. Fitch Software,

Staufen, Deutschland) für Excel benutzt. Werte von p < 0,05 im Wilcoxon-Test wurden als

signifikant bewertet.

46

Ergebnisse

4 Ergebnisse

4.1 Konstruktion und Charakterisierung der A. pleuropneumoniae hlyX

Deletionsmutante

4.1.1 Konstruktion des Plasmids pHLYX701 für die Konjugation

Das hlyX-Gen wurde mit den Primern oHLYX5 und oHLYX6 innerhalb eines 2338 bp

großen Fragment amplifiziert (Abb. 1) und über eine Zwischenklonierung in einen pCR-2.1

TOPO Vektor in pBluescript Sk+ zur Konstruktion von pHLYX110 eingebaut. Dann wurden

883 bp des hlyX-Genes in pHLYX110 mit den Enzymen BglII und XcmI ausgeschnitten

(Abb. 1). Die Überhänge wurden mit Klenow-Fragment aufgefüllt und zu pHLYX111 ligiert

(Abb.2). Das deletierte hlyX-Gen wurde anschließend mit ApaI und NotI aus pHLYX111

herausgeschnitten und in den ebenso geschnittenen Konjugationsvektor pEMOC2 ligiert.

Hierbei entstand das Plasmid pHLYX701(Abb. 2).

Abbildung 1: hlyX Gen mit Primern und Restriktionssenzymschnittstellen

47

Ergebnisse

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Konstruktion von pHLYX701

48

Ergebnisse

4.1.2 Konstruktion der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante

Das Plasmid pHLYX701 wurde in E. coli β2155 transformiert und anschließend in

Actinobacillus. pleuropneumoniae wt konjugiert. Transkonjuganden

(chloramphenicolresistente A. pleuropneumoniae Kolonien mit dem in das Chromosom

integrierten Plasmid) wurden mittels PCR mit den Primern oHLYX7 und oHLYX8 bestätigt;

diese Transkonjuganden wurden dann für die Saccharose Gegenselektion verwendet.

Saccharoseresistente Kolonien wurden auf Chloramphenicolsensitivität hin untersucht.

Saccharoseresistente, chloramphenicolsensitive Kolonien wurden mittels PCR auf die

Anwesenheit des deletierten hlyX-Gens hin überprüft.

4.1.3 Analyse der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante

4.1.3.1 Genetische Überprüfung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX

Saccharoseresistente chloramphenicolsensitive A. pleuropneumoniae ∆hlyX wurden mittels

PCR mit den Primern oHLYX6 und oHLYX7 mit dem Elternstamm A. pleuropneumoniae wt

Abbildung 3: A, PCR mit Primer oHLYX5 und oHLYX6; B, PFGE Analyse von

A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX ; C, Southern Blot nach

Verdau mit DraI; 1, A. pleuropneumoniae AP76; 2, A. pleuropneumoniae ∆hlyX.

49

Ergebnisse

verglichen. Die korrekte Lokalisation der Deletion wurde am PCR-Produkt mittels

Nukleotidsequenzierung überprüft. Das deletierte hlyX-Gen weist eine Größe von 578 bp

gegenüber 1461 bp beim Wildtyp auf (Abb. 3A). Zusätzlich wurde eine

Pulsfeldgelelektrophorese nach Restriktionsverdau mit ApaI, AscI und NotI durchgeführt. Es

zeigte sich eine Übereinstimmung des Bandenmusters der A. pleuropneumoniae ∆hlyX-

Mutante mit dem von A. pleuropneumoniae wt (Abb. 3B). Weiterhin wurde genomische DNA

von A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX mit DraI verdaut und im

Southern Blot durch Hybridisierung einer mit den Primern oHLYX5 und oHLYX6

konstruierten Gensonde überprüft. Die DraI-Schnittstelle liegt innerhalb der Deletion, was

dazu führt, dass im Blot beim A. pleuropneumoniae wt zwei (979 bp und 1368 bp) und bei

Actinobacillus pleuropneumoniae ∆hlyX nur eine Bande (1455 bp) zu sehen sind (Fig. 3C).

Eine anschließende Southern Blot Analyse erlaubte, die Lage des hlyX-Gen im Bereich der

Überlappung der Fragmente Asc3, ApaI und Not8 auf der physikalischen Genkarte zu

lokalisieren (Abb. 4).

Abbildung 4: Position des hlyX-Gen auf der physikalischen Karte von A. pleuropneumoniae AP76

50

Ergebnisse

4.1.3.2 Funktionelle Überprüfung der A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante

Da A. pleuropneumoniae unter anaeroben Bedingungen zur Verklumpung neigt, wurden die

Trockengewichte der Pellets für den Wachstumsvergleich herangezogen. Unter anaeroben

Verhältnissen zeigte A. pleuropneumoniae ∆hlyX ein signifikant reduziertes Wachstum nach

16 h Inkubationszeit zum Vergleich zu A pleuropneumoniae wt (p< 0,01). Das

Trockengewicht des Pellets der Mutante war im Vergleich zum Wildtyp um 37,3 % reduziert

(A. pleuropneumoniae wt 21,7 mg ± 1,15; A. pleuropneumoniae ∆hlyX 13,6 mg ± 0,5; p <

0,01; Abb. 5).

0

5

10

15

20

25

mg

Mittelwert

Pelletgewicht

A. pphlyX

Abbildung 5: Vergleich der Trockengewichte von A. pleuropneumoniae wt (A.pp) und

A. pleuropneumoniae ∆hlyX (hlyX) nach Kultivierung unter anaeroben Bedingungen;

dargestellt ist der Mittelwert aus 5 Untersuchungen.

Um die Spezifität der hlyX-Mutation zu überprüfen und um eventuelle polare Effekte

auszuschließen, wurde eine Komplementierung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX mit dem

ganzen hlyX-Gen vorgenommen. Dazu wurde das hlyX-Gen mittels PCR mit den Primern

oHLYX9 und oHLYX10 auf einem 747 bp großen Fragment amplifiziert und in den

Plasmidvektor pLS88 transformiert; dieser Vektor hat ein breites Wirtsspektrum und kann in

E. coli und in A. pleuropneumoniae replizieren. Die beiden aus der Ligation resultierenden

Plasmide, pHLYX1300 (Orientierung in Richtung des vor der Ligationsstelle liegenden

51

Ergebnisse

Promotors) und pHLYX1301 (umgekehrte Orientierung) mit dem intakten hlyX-Gen, dienten

zur Komplementierung von A pleuropneumoniae ∆hlyX (Abb. 6).

Abbildung 6: Konstruktion der Plasmide für die Komplementierung der A. pleuropneumoniae lyX-

Mutante

52

Ergebnisse

Zur Überprüfung der Wiederherstellung der HlyX-Aktivität wurde zum einen die

Anwesenheit der DMSO-Reduktase durch Western Blot Analyse nach Anzucht unter

anaeroben Bedingungen geprüft; dabei wurde festgestellt, dass beide Plasmide eine

Transkription des dmsA Gens vermittelten (Abb. 7).

Abbildung 7: Western Blot Analyse der anaeroben DmsaA-Expression. A: Coomassie Blau

gefärbtes Gel; B: Western Blot Analyse; 1 A; pleuropneumoniae wt; 2

A. pleuropneumonie ∆hlyX, 3 A. pleuropneumonie ∆hlyX + pHLYX1300;

A. pleuropneumonie ∆hlyX + pHLYX1301 (links unter Standardbedingungen und

rechts unter anaeroben Bedingungen gewachsen).

Zum anderen wurde die Aktivität der Aspartase nach Anzucht unter anaeroben Bedingungen

untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Aspartase-Aktivität nur durch die

Komplementierung mit dem Plasmid pHLYX1300 (Orientierung in Richtung des vor der

Ligationsstelle liegenden Promotors) rekonstituiert werden konnte (Tabelle 7).

53

Ergebnisse

Tabelle 7: Überprüfung der Aspartaseaktivität in A. pleuropneumoniae wt, A. pleuropneumoniae

∆hlyX und A. pleuropneumoniae ∆hlyX komplementiert „in trans“ unter Verwendung

der Plasmide pHLYX1300 und pHLYX1301

Stämme Aspartaseaktivität anaerob

(relative Aktivität) A. pleuropneumoniae wt A. pleuropneumoniae ∆hlyX A. pleuropneumoniae ∆hlyX + pHLYX1300 A. pleuropneumoniae ∆hlyX + pHLYX1301

191a

106a

213 118

a Arithmetischer Mittelschnittwert von 3 unabhängigen Messungen von A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX

4.2 Überprüfung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX in der experimentellen

Aerosolinfektion

Die A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante wurde durch Aerosolinfektion im Tierversuch mit Actinobacillus. pleuropneumoniae wt verglichen. Die Belastungsdosis betrug 6,76 x 104

Bakterien für 4 Schweine in der Aerosolkammer in der A. pleuropneumoniae Wt-Gruppe und

5,98 x 104 in der A. pleuropneumoniae ∆hlyX-Gruppe. Die Infektion führte zu einer Erhöhung der Körpertemperatur auf 40°C oder höher am Tag 1 nach der Infektion bei 4 von 9 Tieren in

der A. pleuropneumoniae ∆hlyX-Gruppe gegenüber 6 von 8 Schweinen in der Actinobacillus. pleuropneumoniae wt-Gruppe. An den Tagen 2, 3 und 4 nach der Infektion

waren die Körpertemperaturen in der A. pleuropneumoniae ∆hlyX –Gruppe signifikant

niedriger ( p< 0,05) als in der A. pleuropneumoniae wt-Gruppe (Abb. 8). In der an Tag 21

post infectionem entnommenen BALF von Tieren in der A. pleuropneumoniae ∆hlyX–Gruppe

konnte A. pleuropneumoniae ∆hlyX nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde Actinobacillus. pleuropneumoniae wt aus der BALF von 5 Tieren in der A. pleuropneumoniae wt-Gruppe reisoliert. In der Wildtypgruppe starb ein Tier an infektionsbedingtem Kreislaufversagen 2 Tage nach der Belastung. Alle überlebenden Tiere wurden 21 Tage nach der Belastung euthanasiert. Bei

der Obduktion wiesen 6 von 9 Tieren aus der A. pleuropneumoniae ∆hlyX -Gruppe keinerlei makroskopisch erkennbaren Lungenläsionen auf; dagegen hatten nur 2 von 8 Tiere in der Actinobacillus. pleuropneumoniae wt-Gruppe keine sichtbaren Lungenveränderungen. Die vorhandenen Läsionen bei den verbleibenden Schweinen waren weniger ausgeprägt nach der

Infektion mit A. pleuropneumoniae ∆hlyX. Die histologische Untersuchungen zeigte keine

54

Ergebnisse

signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen. Die Unterschiede in den „lung lesion

scores“ waren statistisch signifikant (p< 0,05; Abb. 8).

Abbildung 8: Vergleich der Körpertemperaturen und „lung-scores“ bei Schweinen mit

A. pleuropneumoniae wt (AP76) und A. pleuropneumoniae ∆hlyX (hlyX) Infektionen;

A : Körpertemperatur der Tiere der A. pleuropneumoniae ∆hlyX und

A. pleuropneumoniae wt Gruppen nach der Infektion. Tag 0 ist der Tag der Infektion;

B: „lung-scores“ der Schweine der A. pleuropneumoniae ∆hlyX und

A. pleuropneumoniae wt Gruppen 21 Tage nach der Infektion; Sternchen zeigen

signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an (p < 0,05).

Die A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante konnte nach der Infektion nur in verändertem Lungengeweben von 2 der 3 Tiere mit Lungenläsionen in Anzahlen von 2,6 x 105 und 3,4 x 105 KBE pro Gramm Gewebe reisoliert werden. Aus Tonsille und makroskopisch intakter

Lunge konnte A. pleuropneumoniae ∆hlyX nicht nachgewiesen werden. In der

Actinobacillus. pleuropneumoniae Wildtypgruppe wurde A. pleuropneumoniae in allen veränderten Lungengeweben von den 6 Tieren mit Lungenläsionen reisoliert. Die Anzahl der Erreger im veränderten Gewewebe war deutlich geringer bei Tieren aus der Actinobacillus. pleuropneumoniae hlyX-Gruppe als bei Tieren aus der A. pleuropneumoniae Wt-Gruppe. Die Bestimmung der Reisolierungskeimzahl war aufgrund des Vorliegens von Mischkulturen nur bei 4 Tieren erfolgreich und lag zwischen 4,6 x 106 und 4,0 x 107

koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Gramm Gewebe. Zusätzlich konnten von den 8 Tieren in der Wildtypgruppe A. pleuropneumoniae in makroskopisch unveränderten Lungen bei 7 Tieren, in tracheobronchalen Lymphknoten bei 4 Tiere und in den Tonsillen bei 6 Tiere nachgewiesen werden (von 6,2 x 104 KBE/g bis 3,0 x 107 KBE/g).

55

Ergebnisse

56

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lyX

Ergebnisse

4.3 Humorale Immunantwort

Eine Woche vor und 3 Wochen nach der Infektion wurden Serumproben gewonnen. In der

App∆hlyX-Gruppe waren nur die 3 Tiere mit Lungenläsionen serologisch positiv im ApxIIA-

ELISA-Test; dagegen waren alle überlebenden Tiere aus der Appwt-Gruppe serologisch

positiv.

57

Diskussion

5 Diskussion

Der Erreger A. pleuropneumoniae verursacht eine Pleuropneumonie, die infolge der hohen

Mortalität und der verminderten Gewichtzuhname chronisch kranker Tiere eine wirtschaftlich

bedeutsame Erkrankung in der Schweinehaltung darstellt. Die Persistenz von A. pleuro-

pneumoniae auch bei geimpften Tieren (FENWICK u. HENRY 1994) und die mangelnde

Kreuzprotektivität der Impfstoffe sind zwei Faktoren, die zunehmend an Bedeutung

gewonnen haben. Auch Tiere, die eine A. pleuropneumoniae-Erkrankung überlebt haben,

beherbergen trotz einer belastbaren Immunität weiterhin den Erreger und spielen als „Carrier“

eine entscheidende Rolle in der Verbreitung der Schweinepleuropneumonie (EUZÉBY 1998;

FENWICK u. HENRY 1994; RIOUX et al. 1997).

Im Rahmen der Entwicklung von Lebend-Markerimpfstoffen wurden bisher unter anderem

Deletionen in folgenden Genen erstellt und überprüft: eine nicht hämolysierende Mutante

(INZANA et al. 1991), eine ureasenegative Mutante (BALTES 2002; TASCON CABRERO

et al. 1997), eine ApxII-Toxin Mutante (PRIDEAUX et al. 1999), eine Urease und ApxII

Doppelmutante (TONPITAK et al. 2002), eine Urease- und ExbB-negative Doppelmutante

(BALTES 2002); eine dmsA Mutante (BALTES et al. 2003), eine hybB Mutante (BALTES u.

GERLACH 2004), eine TbpA und TbpB Doppelmutante (BALTES 2002), eine dmsA aspA

Doppelmutante (JACOBSEN et al. 2005).

Wie von BALTES et al. (2003) und von JACOBSEN et al. (2005) gezeigt wurde, werden die

Actinobacillus. pleuropneumoniae DMSO Reduktase und die Aspartase unter dem Einfluss

von BALF hochreguliert. Beide Enzymen sind an der anaerober Atmung beteiligt. Putative

HlyX-Bindungsstellen wurden bei dmsA und aspA gefunden. Die Deletion des dmsA und des

aspA Gens führen zur Attenuierung von A. pleuropneumoniae im Organismus (BALTES et al.

2003; JACOBSEN et al. 2005). Bei E. coli werden diese beiden Enzyme durch den globalen

Regulator FNR reguliert (COTTER u. GUNSALUS 1989; JERLSTROEM et al. 1987;

WOODS u. GUEST 1987). Das FNR-Protein enthält bei E. coli vier Eisen-Schwefel-Gruppen

und induziert die Expression vieler Gene, deren Produkte am anaeroben Stoffwechsel beteiligt

sind, bei gleichzeitiger Senkung der Expression von Genen, deren Produkte am aeroben

Stoffwechsel beteiligt sind (BAUER et al. 1999).

Bei A. pleuropneumoniae wurde HlyX als das Homolog von FNR identifiziert (MACINNES

et al. 1990). Die Analyse der Aminosäuresequenz von HlyX zeigt eine Region, die praktisch

identisch mit der DNA-Bindungsregion von FNR ist, und sich nur in einem einfachen

konservativen Aminosäureaustausch unterscheidet (MACINNES et al. 1990). Die

58

Diskussion

Hochregulierung von DMSO-Reduktase und Aspartase im ex vivo Modell (BALTES et al.

2003; JACOBSEN et al. 2005) führte zu der Hypothese, dass eine hlyX-Deletion eine

Attenuierung und Verhinderung der Persistenz herbeiführen könnte.Das Ziel der Arbeit war

es somit, die Rolle des hlyX-Genes in der Virulenz von A. pleuropneumoniae und bei der

Kolonisierung zu ermitteln.

Die Arbeit beruht auf der Konstruktion einer isogenen hlyX Mutante mit einer Deletion von

883 bp, die mittels Rekombination und anschließender Saccharose-Gegenselektion

(OSWALD et al. 1999) durchgeführt wurde. Die Deletion wurde durch PCR-Analyse und

nachfolgende Nukleotidsequenzierung des PCR-Produktes von A. pleuropneumoniae ∆hlyX

überprüft. Das deletierte hlyX-Gen hatte die vorhergesagte Grösse von 578 bp gegenüber

1461 bp beim Wildtyp. Der Verdau der genomischen DNA von A. pleuropneumoniae ∆hlyX

und von A. pleuropneumoniae wt mit DraI zeigte im Southern Blot wie erwartet zwei Banden

von 979 bp und 1368 bp bei dem Elternstamm und eine Bande von 1455 bp bei der Mutante.

Gleichzeitig zeigte die Übereinstimmung des Bandenmusters von A. pleuropneumoniae ∆hlyX

und A. pleuropneumoniae wt in der Pulsfeldgelelektrophorese, dass keine starken

genomischen Umlagerungen stattgefunden haben. Diese Ergebnisse belegen auf DNA-Ebene,

dass die gewünschte Mutante vorliegt.

Die isogene A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante zeigte ein reduziertes Wachstum in vitro

unter anaeroben Bedingungen, was zur Schlussfolgerung führt, dass der HlyX-Regulator

wichtig aber nicht unentbehrlich für die Anpassung von A. pleuropleuropneumoniae an

anaerobe Kulturbedingungen ist. Das Fehlen der DmsA-Expression, wie sie mittels Western

Blot-Analyse gezeigt wurde, sowie das Fehlen der Aspartase-Induktion bei der

Actinobacillus. pleuropneumoniae hlyX-Mutante wiesen darauf hin, dass beide Gene vom

globalen anaeroben Regulator HlyX reguliert werden. Um dieses Ergebnis zu belegen und

andere genomische Mutationen oder polare Effekte als Ursache auszuschließen, wurde das

hlyX-Gen in beiden Orientierungen mit Bezug auf den vektorständigen sulAB-Promotor auf

den Plasmiden pHLYX1300 und pHLYX 1301 in die A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante

transformiert und somit „in trans“ komplementiert. Die Expression der DMSO-Reduktase

konnte mit beiden Plasmiden wiederhergestellt werden. Die Induktion der Aspartase-Aktivität

gelang nur mit dem Plasmid, das das hlyX Gen in der richtigen Orientierung mit Bezug zum

vektorständigen Promotor enthält (pHLYX1300). Die Beobachtung, dass auch pHLYX1301

(vektorständiger Promotor ohne Einfluss) zu einer DmsA-Expression führt, könnte mit der

zufälligen Bildung eines schwachen Fusionspromotors im Plasmid pHLYX1301

59

Diskussion

zusammenhängen. Der Fusionspromotor könnte dann zu einer geringfügigen Expression von

HlyX führen, die ausreicht, um die dmsA-Transkription zu initiieren. Weiterhin könnte die

unterschiedliche Sequenz der vorhergesagten HlyX-Bindungsstellen vor dem aspA und dem

dmsA Gen insofern eine Rolle spielen, als das HlyX Protein möglicherweise eine höhere

Affinität zu der dmsA-assoziierten Sequenz besitzt. Zusätzlich könnte das Ergebnis auch

dadurch verursacht worden sein, dass die Western Blot-Analyse eine empfindlichere Analyse

der Genexpression als der Aspartase Assay erlaubt.

Nach Erstellung der Mutante wurde ihre Virulenz im Aerosolinfektions-Modell (JACOBSEN

et al. 1996) überprüft. Die Virulenz von A. pleuropneumoniae ∆hlyX war deutlich reduziert,

was sich an der geringeren Erhöhung der Körpertemperatur und an den weniger ausgeprägten

Lungenschädigungen in der entsprechenden Tiergrupppe zeigte. Dass 6 von 9 Tiere in der

Actinobacillus. pleuropneumoniae ∆hlyX-Gruppe keine makroskopischen Lungenläsionen

und keine messbaren Antikörpertiter aufwiesen, spricht für eine Verminderung des

Kolonisierungsvermögens von A. pleuropneumoniae ∆hlyX im Vergleich zum Wildtyp. Diese

Schlussfolgerung wird unterstützt durch die Ergebnisse der Resisolierung. So konnte

Actinobacillus. pleuropneumoniae ∆hlyX nach 21 Tagen weder in Tonsillen noch in

makroskopisch intaktem Lungengewebe nachgewiesen werden. Auch innerhalb von

Sequestern wurde der Erreger nur bei zwei von drei Tieren nachgewiesen und die Zahl der

Erreger im veränderten Gewebe war deutlich geringer als bei Tieren aus der Actinobacillus.

pleuropneumoniae wt-Gruppe. Diese Unterschiede sind vermutlich auf eine ineffektive

Anpassung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX an die anaeroben Bedingungen in Sequestern und

in Tonsillen zurückzuführen, was eine zentrale Rolle des HlyX-Proteins bei der Regulation

anaerober Stoffwechselvorgänge auch bei A. pleuropneumoniae belegt. Die fehlende HlyX-

gesteuerte Repression der am aeroben Stoffwecksel beteiligten Gene zusammen mit der

gestörten Expression von Genen, deren Produkte an der anaeroben Atmung beteiligt sind,

führen vermutlich zu erheblichen Energieverlusten bei der A. pleuropneumoniae hlyX

Mutante. Diese Ergebnisse bestätigen die Schlussfolgerungen von BALTES et al. (2003) und

Jacobsen et al. (2005), dass Gene unter hlyX-Regulierung virulenzassozierte Proteine

induzieren, die vermutlich für das Überleben im anaeroberen Milieu erforderlich sind.

Eine mögliche Erklärung des Nicht-Persistierens der A. pleuropneumoniae Mutante in

Tonsillen und in intaktem Lungegewebe könnte der erhöhte Glutathionspiegel in der

„epithelial lining fluid“ (ELF) sein. Dieses Antioxidant wurde bei Menschen und bei

Säugetieren, unter anderem auch bei Schweinen, als eine Schutzmaßnahme gegen oxidative

60

Diskussion

Schäden bei entzündlichen Reizen im Respirationstrakt nachwiesen (CANTIN et al. 1987;

DAY et al. 2004; YAM u. ROBERTS 1980). Die ausreichende Menge von Glutathion in der

ELF der Schweinelunge, die zur Reduzierung des Sauerstoffs führt, sowie die

Beeinträchtigung der Expression von virulenzassoziierten Faktoren durch die hlyX-Deletion

könnten die Ursache für die beobachtete Verhinderung der Persistenz von Actinobacillus.

pleuropneumoniae∆ hlyX in Tonsillen und auf intaktem Lungenepithel sein. Diese Hypothese

ist besonders interessant, da ein erhöhter Glutathionspiegel in der ELF der Mäuselunge

während einer Pseudomonas aeruginosa-Infektion nachgewiesen wurde (CANTIN et al.

1987; DAY et al. 2004; YAM u. ROBERTS 1980). Allerdings scheint HlyX nicht allein

entscheidend für die Kolonisierung und die Persistenz verantwortlich zu sein, da die HlyX-

negative A. pleuropneumoniae Mutante eine deutliche Restvirulenz aufwies. Somit muss

Actinobacillus. pleuropneumoniae über zusätzliche Faktoren verfügen, die eine Kolonisierung

und Peristenz ermöglichen. Als Kandidat kommt beispielsweise der globale Regulator ArcAB

infrage, der bei dem verwandten Erreger Haemophilus influenzae wie auch bei Vibrio

cholerae mit der Virulenz unter anaeroben Bedingungen assoziiert wurde (SENGUPTA et al.

2003; SOUZA-HART et al. 2003). Um die Bedeutung dieser und anderer Faktoren für die

anaerobe Atmung sowie die Virulenz und Persistenz von A. pleuropneumoniae aufzuklären,

sind somit zukünftig weitere Untersuchungen erforderlich.

61

Zusammenfassung

6 Zusammenfassung

Konstruktion und Charakterisierung einer

Actinobacillus pleuropneumoniae hlyX- Mutante

(Mohamed N’diaye)

Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist der Erreger einer wirtschaftlich bedeutsamen

Pleuropneumonie der Schweine, die mit zunehmender Intensivierung der Schweinehaltung an

Bedeutung gewinnt. Sie verursacht infolge der hohen Mortalität und der verminderten

Gewichtzunahme chronisch kranker Tiere große wirtschaftliche Verluste. Das Persistieren des

Erregers trotz Impfung ist ein Faktor der zunehmend an Bedeutung gewonnen hat. Die

mangelnde Fähigkeit der bisherigen Impfstoffen, die Kolonisierung mit dem Erreger zu

verhindern und die entscheidende Rolle dieser „carrier“ bei der Verbreitung der

Schweinepleuropneumonie, führen zu einer verstärkten Untersuchung der Pathogenese in der

Hoffnung, über die Aufklärung der Mechanismen der Kolonisierung und Persistenz besser

wirksame Vakzinen herstellen zu können.

Basierend auf der Hypothese, dass die Fähigkeit des Erregers in sequestriertem

Lungengewebe zu überleben, die Virulenz und die Persistenz beeinflusst, wurde das hlyX-Gen

im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Dazu wurde eine A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante

konstruiert und charakterisiert. Die Mutante zeigte ein verringertes Wachstum unter

anaeroben Kulturbedingungen und war im Tierversuch deutlich attenuiert. So war der

klinische Verlauf der Erkrankung wie auch die Schwere der Lungenveränderungen deutlich

herabgesetzt. Unerwarteterweise zeigte die A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante nicht nur eine

reduzierte Kolonisierungsfähigkeit im anaeroben Milieu von Lungensequestern und Tonsillen

sondern auch im aeroben Milieu des unveränderten Lungenepithels.

62

Summary

7 Summary

Construction and characterization of an Actinobacillus pleuropneumoniae hlyX mutant

(Mohamed N'diaye)

Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae is the etiologic agent of an economically important

pleuropneumonia of pigs which has gained importance due to the increase of intensive pig

farming. The disease causes significant economic losses, resulting from high mortality as well

as reduced weight gain in chronically infected animals. The ability of the organism to persist

even in vaccinated animals has steadily gained significance. Presently available vaccines are

unable to prevent colonization, and carrier animals play a crucial role in the spreading of

porcine pleuropneumonia. This has led to intensive research on the pathogenesis, aiming at

the elucidation of the mechanisms of colonization and persistence, which in turn will

hopefully facilitate the development of more efficacious vaccines.

Based on the hypothesis that the ability of the organism to persist in sequestered lung tissue

influences virulence and persistence, the hlyX gene was the subject of this thesis. An

Actinobacillus. pleuropneumoniae hlyX mutant was constructed and characterized. The

mutant showed reduced growth under anaerobic culture conditions, and it was attenuated in

an infection experiment. Clinical disease as well as lung lesions were reduced in severity.

Unexpectedly, the A. pleuropneumoniae mutant exhibited not only reduced ability to colonize

in the anaerobic environment of lung sequesters and tonsils, but also in the aerobic

environment of the pulmonary epithelium.

63

Literaturverzeichnis

8 Literaturverzeichnis

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Anhang

9 Anhang

9.1 Material und Geräte

Geräte Firmen Thermocycler BioRad MultiAnalyst-System Elektrophoresekammer Easy CastTM Elektro- phoresis System Sorvall-Kuhlzentrifuge Mini Hybridisation Oven Multi-Block Heater UV-Transilluminator GEX-TFX-20M Vortex Genie2 Orbital-Schüttler 3011 Wasserbäder 37°C, 55°C, 16°C Spektralphotometer Ultrospec III PFGE-Gerät Chef DRIII Filterpapier Gel-Blotting-Papier Nylonmembran Positive Membran Polaroidkamera Gene Clean II Kit Bio 101 Nucleospin Extrakt Kit Film Kodak X-OMAT AR Gefrierschränke –20°C Gefrierschränke -70°C Incubator Shaker Series 25 Mircocentrifuge MC 13

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland BioRad, München, Deutschland MWG, München, Deutschland Bad Homburg, Pharmacia, Freiburg Appligene, Illkirch, Frankreich Lab-line Instr., inc., Illinois, USA GmbH, Heidelberg, Deutschland Bender und Hobein, Schweiz GFL, Burgwedel, Deutschland GFL, Burgwedel, Deutschland Pharmacia, Freiburg, Deutschland BioRad, München, Deutschland Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland Appligene, Illkirch, Frankreich GmbH, Heiderberg, Deutschland Dianova, Hamburg, Deutschland Macherey-NAGEL GmbH&CO.,Deutschland Amicon, Heraeus Instr.Osterode, DeutschlandLiebherr, Ochsenhausen, Deutschland Heraeus, Osterode, Deutschland New Brunswick, Scientific Co, USA Heraeus, Osterode, Deutschland

74

Anhang

9.2 Zusammensetzung von Medien, Medienzusätzen und Puffer

Medien

LB-Medium

Bacto-Trypton (Roth, Karlsruhe, Deutschland) 10,0 g

Hefeextrakt (Roth, Karlsruhe, Deutschland) 5,0 g

NaCl 5,0 g

Aqua dest. ad 1000 ml

PPLO-Medium 21 g

A. dest. ad 1000 ml

PPLO-Agar

PPLO-Agar (Difco, le Pont de Claix, Frankreich) 35 g / l Agar

Agar-Agar (Roth, Karlsruhe, Deutschland) 2-3 g

Blut-Agar, Columbia Sheep Blood Agar, OXOID (Wesel, Deutschland)

PPLO ohne NaCl-Zusatz

Sechsundvierzig g BactoBeef Heart in 1 Liter A. dest gelöst und bei 50°C für 1 h inkubiert;

Die Lösung wird in der Mikrowelle für 3 min aufgekocht und bei Raumtemperatur abgekühlt.

Nach dem Filtrieren der Suspension werden 7,4 g Bacto Peptone zugegeben. Ein pH-Wert

von 7,4 wird mit 1 M NaOH eingestellt. Die Lösung wird anschliessend sterilfiltriert.

SOC-Medium

Bacto-Trypton 2 %

Hefe-Extrakt 0,5 %

NaCl 10 mM

KCl 2,5 mM

Nach Lösen und Autoklavieren, Zugabe von:

MgCl2 10 mM

MgSO4 10 mM

Glucose 20 mM

75

Anhang

GYTT-Medium

Glycerin 100,0 ml

Hefe-Extrakt 1,25 g

Tryptone 2,5 g

Tween 80 0,2 ml

A. dest ad 1000 ml

Selektivblut-Agar

In Blut-Agar zugegeben: Kristalviolett, 1 µg/ml

Lincomycin, 1 µg/ml

Nystatin, 50 µg/ml

Bacitracin, 100 µg/ml

Antibiotika-Stammlösungen und andere Zusätze

Ampicillin-Stammlösung:

Einhundert mg/ml in 30% des Endvolumens A. dest. lösen, dann mit Ethanol auf 100%

auffüllen (Gebrauchskonzentration: 100 µg/ml, d.h. 1 µl/ml Medium)

Kanamycin: 50 mg/ml in 50% des Endvolumens von A. dest. lösen, dann mit 50% Glycerin

auf 100% auffüllen und sterilfiltrieren (Gebrauchskonzentration: 50 µg/ml für E. coli, 25 µg/-

ml für A. pleuropneumoniae)

Chloramphenicol: 100 mg/ ml in Ethanol lösen (100 µg/ ml für die Plasmidamplifikation,

25 µg/ ml für Wachstum von E. coli mit Plasmid, 5 µg/ ml für die Kultivierung von

Actinobacillus pleuropneumoniae-„single-crossing-overs“)

Diaminopimelinsäure (DAPI): Stammlösung 100 mM (100fach konzentriert);

Gebrauchskonzentration ist 1 mM. Sie wird durch Lösen der Stammlösung in A. dest

hergestellt. Unter Rühren wird 1 M HCl tropfenweise bis die Mischung klar wird hinzugefügt.

Anschliessend wird die Lösung sterifiltriert und in 10 ml portioniert und –70°C gelagert.

Die DAPI-Lösung wird als Zusatz für die Anzucht DAPI-auxotropher E. coli Stämme

( z. B. β2155) benötigt.

76

Anhang

Ersatz-IsovitaleX (Stammlösung; 100fach konzentriert) besteht aus

Glutamin: 10 g

NAD: 1 g

L-Cystein-HCl: 26 g

L-Cystin-dihydrochlorid: 1 g

100 g Glukose ad 1000 ml

X – Gal (5 – Bromo-4-chloro-3-indolyl-galactosid): 25 mg / l

Tween 80: 0,1%

MgSO4: 10 mM

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG): 1 mM

9.3 Lösungen und Puffer

EDTA-Lösung 0,5 M (pH 8,0)

CaCl2- Lösung 1 M

TrisHCl,- Lösung 1 M (pH 7,5)

TrisHCl,- Lösung 1 M (pH 8,0)

SDS- Lösung 20%

NaCl- Lösung 3 M

Na-Acetat- Lösung 3 M (pH 6,0)

Ethanol- Lösung 96%

Glyzerin- Lösung (50%)

9.3.1 Plasmidpräparation

Lösung 1:

TrisHCl 50 mM (pH 8,0);

EDTA 10 mM;

RNAse 1 mg/ml

Lösung 2:

NaOH 0,2 M;

SDS 1%

Lösung 3:

K-Acetat-Puffer 3,2 M (pH 5,5)

77

Anhang

9.3.2 Präparation von chromosomaler DNA von Bakterien (A. pleuropneumoniae)

EDTA- Lösung 0,5 M (pH 8,0) (Endkonzentration 10 mM)

SDS- Lösung 10 % (Endkonzentration 1%)

Proteinase K- Lösung 20 g/ml (Endkonzentration 500 µg/ml)

RNAse- Lösung 10 mg/ml (Endkonzentration 100 µg/ml)

Phenol in TE-Puffer- Lösung pH 7,8 (Roti-Phenol)

Chloroform:Isoamyl- Lösung (24:1)

Na-acetat- Lösung, 3 M (pH 5,2)

78

Anhang

9.4 Restriktionsverdau

Carlos-Puffer (10 x)

TrisHCl, pH 8,0 330 mM

Kaliumacetat 660 mM

Magnesiumacetat 100 mM

Spermidin 30 mM

BSA 1 mg/ml

DTT 10 mM

BSA 1 mg/ml

9.5 Gel-Elektrophorese

Blau-Marker: Bromphenolblau, 0,25%

Xylene Cyanol, 0,25%

Glycerin, 30,0% in A. bidest

10 × TBE: Tris Base, 1 M

Borsäure, 1 M

EDTA, 20 mM (pH 8,0)

50× TAE: Tris Base, 2 M

Essigsäure, 1 M

EDTA, 50 mM (pH 8,0)

DNA-Längenstandards: Lambda DNA, HindIII-verdaut (NEB)

Lambda Ladder PFG-Marker: 50 µg/ml von Biolabs

79

Anhang

9.6 Transformation

TFB1: K-Acetat, 30 mM

RbCl, 100 mM

CaCl2, 10 mM

MnCl2, 50 mM

50 % Glycerin, 30,0 ml

A. dest, ad 100,0 ml

TFB2 Mops, 10 mM

RbCl, 10 mM

CaCl2, 75 mM

50 Glycerin, 30,0 ml

9.7 Konjugation

TNM-Puffer TrisHcl, pH 7,2, 1 mM

NaCl, 100 mM

MgSO4, 10 mM

9.8 DNA-Transfer (Southern Blot)

Depurinierungslösung: HCl, 0,25 M

Denaturierungslösung: NaCl, 1,5 M

NaOH, 0,5 M

Neutralisierungslösung: Tris-HCl, 1 M (pH 8,0)

NaCl, 1,5 M

20 x SSC: NaCl, 3 M

Tri-Natriumcitrat, 0,3 M

80

Anhang

9.9 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode

OLB-Puffer: 100 Teile Puffer A,

250 Teile Puffer B,

150 Teile Puffer C

Puffer A: 1 ml Lösung O‚

625 µl 2 M Tris-HCl (pH 8,0)

125 µl 1 M MgCl2,

250 µl A. bidest

18 µl 2-Mercaptoethanol

je 5 µl 0,1 M dCTP, dGTP, dTTP

Puffer B: 2 M Hepes (pH 6.6)

Puffer C: Hexadeoxyribonucleotides (90 OD units/ml = 4,5 mg/ml in TE)

Stop-Puffer: 20mM NaCl,

20mM Tris-HCl (pH 7,5)

2 mM EDTA,

0,25% SDS,

1µM dCTP

9.10 Southern-Hybridisierung

Hybridisierungspuffer: 6 x SSC (6 ml 20 x SSC)

0,01 M EDTA (0,4 ml 0,5 M EDTA)

5 x Denhardt’s (2 ml D’S Stamm 50 x)

0,5% SDS (0,5 ml 20% SDS)

A. dest ad. 20 ml 11 ml

50 x Denhardt’s-Lösung: 5 g Ficoll,

Polyvinylpyrrolidon 5 g

BSA (Fraktion V) 5 g

81

Anhang

9.11 SDS-Page ( Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel)

Anfertigung der Gele

Trenngel Sammelgel A dest

1,5 Tris pH 8,8 0,5 Tris pH 6,8

SDS (10%) TEMED

Acrylamid 10% APS

3,9 ml 2,5 mi

- 100 µl 10 µl 3,8 ml 100 µl

3,05 ml -

1,25 ml 50 µl 10 µl

0,65 ml 50 µl

Lauf-Puffer II für SDS-Gele nach Lämmli: 30,0 g Tris,

144 g Glycin,

10 g SDS,

A. dest ad 1000 ml.

Acrylamid-Bisacrylamid-Stammlösung Acrylamid (Serva 10675), 60 g

NN’-Methylen-Bisacrylamid

(Serva 29195), 0,8 %, 1,6 g

A. dest, ad 200 ml

Die Lösung wurde filtriert und bei 4°C aufbewahrt.

9.12 Western Blot

Transfer-Puffer: 3,0g Tris,

8,5g Glycin,

200 ml Methanol,

ad 1000 ml A. dest

PBST, pH 7,2 (Waschpuffer): 8,0 g NaCl,

0,2 g KH2PO4,

1,44 g Na2HPO4,

0,2 g KCl,

0,5 ml Tween 20,

A. dest ad 1000 ml

82

Anhang

PBST-Gelatine (Blockpuffer): 500 ml PBST (1 × ),

2,5 g Gelatine (0,5%)

Substrat-Puffer für Alkalische Phosphatase: 100,0 ml 1 M Tris (pH 9,5)

100,0 ml 1 M NaCl,

5,0 ml 1 M MgCl2,

A. dest ad 1000 ml.

9.13 Aspartase-Essay

Aspartase-Puffer MgCl2, 3 mM

L-Aspartat, 0,1 M

TrisHCl, pH 9, 0,1 M

9.14 Pulsfeldgelelektrophorese

Pett IV-Puffer: NaCl-Lösung, 1 M

Tris Lösung , 10 mM (pH 8,0)

EDTA (Dinatriumsalz, Titriplex III

von Merck)-Lösung, 10 mM

Lysepuffer: NaCl, 1 M

Tris, 10 mM (pH 8,0)

EDTA, 200 mM

N-lauroyl-sarcosin Sigma, L 5125,

0,5 %

Sodium deoxycholate- Lösung

(Sigma, D 5670), 0,2 %

RNAse-Stocklösung: 10 mg/ml in Aq. bidest.

Lysozym-Stocklösung: 50 mg/ml in Aq. bidest.

ESP-Lösung: EDTA, 0,5 M

N-lauroyl-sarcosin Sigma, L 5125,

1 %

Proteinase K (Endkonz. 0,65

mg/ml)

Proteinase K-Stocklösung: 20 mg/ml in A. bidest.

83

Anhang

TE-Puffer: Tris- Lösung, 10 mM (pH 8,0)

Na2-EDTA-Lösung, 1 mM (pH

8,0)

PMSF: Phenyl-methyl-sulfonyl-fluorid,

7 mg in 1 ml Isopropanol gelöst

9.15 Enzyme

Enzyme

Restriktionsendonukleasen Firmen ApaI AscI BamHI BglII BsrI DraI EcoRI EcoRV HindIII MfeI NotI PspomI PstI SacI TaqI XcmI XhoI Lysozym DNase, RNase frei RNase T4 DNase-ligase Klenow Enzym Taq-DNA-Polymerase

NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus NEB, Schwalbach, Taunus SIGMA, Deisen Boehringer, Mannheim Boehringer, Mannheim Boehringer, Mannheim Boehringer, Mannheim Stratagene, Heidelberg

84

Anhang

9.16 Chemikalien

Chemikalien Firmen Acrylamid Agar-Agar Agarose Ampicillin Bacto Tryptone BCIP (5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate) Bovine Serum Bovine Serum albumin (BSA) Bromphenol Blau Chloramphenicol Chloroform α32 P-dCTP L-Cysteine hydrochloride monohydrate DAPI Diethanolaminiethanolamin ACS Reagenz Diethylamin Dimethylsulfoxide (DMSO) EDTA Ethidium bromid Ethanol Glycerin Gelatine Hefeextrakt HCl IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactosid) Isoamyl alkohol Isopropanol Kanamycin Magnesiumsulfat Methanol Mineral oil NaCl NaOH Phenol Phenyl-methyl-sulfonyl-fluoride (PMSF) Phosphorsäure (reinst)

Serva, Heidelberg Roth, Karlsruhe Appligene,Illkirch, Frankreich SIGMA, Deisen Difco, Augsburg SIGMA, Deisen WDT, Hoyerhagen New England Biolabs, Schwalbach SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen Roth, Karlsruhe NEN, Boston, MA, U.S.A SIGMA, Deisen Merck, Darmstadt Sigma, Deisen Sigma, Deisen Sigma, Deisen Roth, Karlsruhe SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen Elch-Apotheke, Hannover Roth, Karlsruhe SIGMA, Deisen Roth, Karlsruhe Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe SIGMA, Deisen Merck, Darmstadt SIGMA, Deisen Roth, Karsruhe Roth, Karsruhe SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen Roth, Karlsruhe Serva, Heidelberg

85

Anhang

PPLO-Agar Saccharose Sarcosyl (N-lauryl-sarcosine) SDS (Laurylsulfat) Sodium acetat Sodium Chlorid Tirs (hydroxymethylaminomethane) Tris-acetat Tris-HCl TCA (flüssig) TCA (fest) Tween 20 X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactosid)

Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Difco, Augsburg Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen SIGMA, Deisen Roth, Karlsruhe Serva, Heidelberg Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe SIGMA, Deisen

86

Anhang

9.17 Nukleotid- und Aminosäuresequenz des hlyX Gens von A. pleuropneumoniae

-

taaagtttaaatgccacttcgcccgaaagcgtattgttttcaacttttgtcagagcatct

1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60

tctaataatgccaaaccacgctcaagcgtgcgcgcaaattgttcttcttccgcttttaat

61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120

gttttttgaatatgcgcttgtttttgcgttaaaacttcgccggcatgacccattacggtt

121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180

gcaagtgtcggtactaatttatagaagaacgcttcttttgcacctaaaaggttaccgtga

181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240

cgaaccgcacgacggataatacgacgtaacacatagccacgaccttcatttgacggaact

241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

acgccatccgcaattaagtacgaacacgcacgaatatggtctgccactacacgtaacgat

301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360

ttattatctaaatcgcttacattcaataaaccggcaacttccttgatgagcgtttggaaa

361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420

atatccgtttcatagtttgagttcacgtgttgcattacagcggtcatacgctctaaaccc

421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480

atccccgtatctacggacggtttcggtaatttttccatcgtaccgtctgccaaacggtta

481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540

aattgcataaatacgatattccacacttcgatataacgatcgccgtcttcttccggacta

541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600

cccggtaaaccgccccagaaagtttcgccgtgatcatagaagatttccgtacaaggaccg

601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660

cacggaccggtgtcacccattgcccagaagttatccgaagcatacggtgcacctttgtta

661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720

tcaccgatacgaataatatgatcggtcggaacacctacgattttattccaaatgtcatag

721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780

87

Anhang

gcttcatcatccgtttcataaacggttacatataatttttctttcggcagaccaagccat

781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840

tgcggagaagttaaatattcccaaccgaattgaatcgcatcatgtttgaagtaatcaccg

841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900

aaactgaagttacccatcatttcaaaaaatgtatggtggcgcgcggtatagcctacgttt

901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960

tctaaatcattatgtttaccgccggcacgcacgcaacgttgtgcggtggtcgcacgagta

961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020

taaggacgtttttctaagccgagaaaaacatctttaaattgattcatcccggcattagtg

1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080

aataataaggtagggtcattttcaggtaccaatgagctactcggtacaacggtatgtcct

1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140

ttactgtggaagaaatccaagaaagattgtctgatttctgaagttgttttcatttaataa

1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200

cactctaaataatgtataagtaaataactagtgataaatgcctttattctacacgttttt

1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260

cattcctttgataattgactacggcttttttaatgaaaaacttcttatatttactataat

1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320

ttattaaaaaacaaccgcttgaaaagctaaagaacttttaagcggttgagtttaaggtta

1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380

tttatctgcttttatatcaatgttttttagcattagcgttattcgtcggctaacggcacc

1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440

acaagcatatctacggtaacgttgttcattacttggcgagtggacgacataaacttactc

1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500

cagaaatcctgatgatgaccggtaattaataagtcaattttgtgttttgccacggcgtct

1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1560

tccaatacctgactgaaatcgcccgtgccgttaagacgttccgaaaccggataattcact

1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1620

88

Anhang

ttagccgataattcggctaacgctttagtggtttcttccagtacgctatcttgtactgaa

1621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1680

gacatattaatatcaattaatcccgtataaagatcggagaaattaacgtccacatgaatc

1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740

aaagaaagttttgcgccgcatttttccgctaaatccgcgcctttacgaagtaaaacaaga

1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800

ctttcttcagagagatcaaccgcaactaaaatatgtttatacataaatagactccttctt

1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860

gtatgcctaatcattttttgtttgaagatactagcatattctttttagagaaaacttgag

1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920

ctagatctcatttttgaaaaaacatttcaatgtctgaaatattttttaattcggagcata

1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980

taagcataagattgaaaataactttttaagggtaaataaaccgattaccgactttattat

1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040

cctaataaataatgttaaaatttgcttgaaatcaaacttttacctattttaaaagacggt

2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

agcccttatgaaaattgtatctgacgctaaacatacaggccgaacggcttgcactattca

2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160

M K I V S D A K H T G R T A C T I H

ttgccagaattgcagtattagccaactttgcttaccttttacgttgagcgaacacgaatt

2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220

C Q N C S I S Q L C L P F T L S E H E L

aactcagcttgacaatattatcgaacgcaaaaaaccggttcaaaaatctcaaatcatttt

2221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2280

T Q L D N I I E R K K P V Q K S Q I I F

89

Anhang

ccaatccggcgatgaacttcgttccatctatgcgattcgttcaggtacaattaaaagcta

2281 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2340

Q S G D E L R S I Y A I R S G T I K S Y

tacgattagcgaaagcggcgaagaacaaattacggcgttccatttacccggtgatctggt

2341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400

T I S E S G E E Q I T A F H L P G D L V

cggatttgatgcgattatgaatatgaaacatgtcggtttcgcacaagcgctcgaaacgtc

2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2460

G F D A I M N M K H V G F A Q A L E T S

gatgatttgcgagattccatttgatattttagacgatctcgccggcaagatgcctaaaat

2461 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2520

M I C E I P F D I L D D L A G K M P K I

ccgtcatcaaattatgcgtttgatgagtaatgaaattaaaagcgatcaagaaatgatttt

2521 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2580

R H Q I M R L M S N E I K S D Q E M I L

attactttcaaaaatgagtgcggaagaaaagttagcggcgtttttacataatttatctca

2581 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2640

L L S K M S A E E K L A A F L H N L S Q

EcoRI

acgttatgcggcacgcggtttttccgctcgtgaattccgtctgactatgactcgcggcga

2641 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700

R Y A A R G F S A R E F R L T M T R G D

tatcggcaactatctcggtttaaccattgaaactatcagtcgtttattaggacgtttcca

2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2760

I G N Y L G L T I E T I S R L L G R F Q

90

Anhang

gaaaagcggtatgattacggtacaaggtaaatatattaccatcaatcgtatggacgaact

2761 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2820

K S G M I T V Q G K Y I T I N R M D E L

gaccgatatggcgggtgtaacacgttcacaaattccggtaatacaaacggcataagcctt

2821 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2880

T D M A G V T R S Q I P V I Q T A *

ataaaaacaaaaataccactattttctaatagtggtatttttttgttcggaacatatttg

2881 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2940

caaataacttaagaaatttaaccgcttatttatctatttgactaatttcaaatgtgtcgg

2941 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000

ttttttcttagctttaggcttactttcttctctgtcggcttgctgattaaccctttcgct

3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3060

atatgcttgttcactataataagcctcgtcttggaacataattccgtcgccggtttcttg

3061 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3120

cgcataaatggcttccgttgcaccaaaaggaatataaatatcacgcaacatcccttggaa

3121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3180

acgagcattaaagctgattgactcgtcattaatcacatattgtccgatggaacgcggtgc

3181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3240

gatattcaaaataattttgccgtcccgaacaaattcgaccggcacatccacatccggata

3241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300

ttccgcatttactaataaataaggcgtattatcgttatctaaaatccagttgtagtacgc

3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3360

gtggtaaagataagggcgcaaaggtttcattagtctttatcatccattaagtgtttcgga

3361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3420

gccgcaccgccgatagactgaacgaagctctcacgttggaatacgcgagtcatataggtt

3421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3480

91

Anhang

ttaattgccttactgcccgcaccggtaaattcaatacctaaactgtgcattttccataat

3481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3540

EcoRI

|

aacggcgcaacgtaacaatcgaccaaactgaattcttcgctcataaaatacggtgttgcg

3541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600

gcaaagacaggacctaatgccaacatttcgtcacgaagttccatcaacgcttttttcgct

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3660

tctttagattcaggatctttgtttgcaatatcaattaatgagtaccaatcttgttcgata

3661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3720

cggtgcatggttaaacgacatttaccgcgtaataccggatagaccggcattaacggcgga

3721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3780

tgaggaaaacgctcgtctaagtattccataatgatacgtgaattaaataatactaaatcg

3781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3840

cgatcaactaatgtcggtacattaccgtatgggtttacttccaccaaatcttcagaaatc

3841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900

gtatcaggactaatattttcaatttcataaggaacgcccttctctgccaatacgatacgt

3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3960

acttgatgactgaaaatatcgtttttatctgaaaaaaggg

3961 ---------+---------+---------+---------+ 4000

Primerpositionen

Primer Position

OHLYX5

oHLYX6

oHLYX7

oHLYX8

oHLYX9

oHLYX1O

1121 – 1141

3458 - 3438

1600 - 1619

3060 - 3041

2087 - 2110

2833 - 2814

92

Anhang

9.18 Rohdaten

Tabelle: Tierversuches mit A. pleuropneumoniae AP76 und A. pleuropneumoniae ∆hlyX

Reisolation

Gruppe Tier- Nummer

LungenScores

ELISA

ApxII

(EU) Veränd. Lunge

Unver.Lunge

Lymph-knoten Tonsillen

A pleuropneu-moniae AP76

63126368 6433 6441 6442 6443 6448 6774 6474 6435

5,3 5,0 0,52

0 10,26 3,37

0 7,13

0

25 54 57 21 1 28 10 43

+ + + + + +

+ *

+ + + + + *

+ + + *

+ + + - -

** ** + **

+ + +

+ + + - - + - - +

+ +

- ++ +

- + +

- *** + + + +

+ + +

A pleuropneu-moniae ∆hlyX

5071 6428 6429 6432 6439 6449 6465 6471 6472

2,74 0 0

1,25 3,63

0 0 0 0

34 1 1 1 1 2 28 17 53

+ * * + - * * * *

- - - -

** - - - -

- - - - - - - - -

- - - - - - - - -

(-) keine App-verdächtigen Kolonien, (+) App nur im direkt beimpfen Bereich; (+ +) auch im

Bereich der 1. und (+ + +) auch im Bereich der 2. Fraktionierung, (*) keine Lungen-

veränderungen bei diesen Tieren, (**) Lungen beiderseitig verändert, (***) nicht auswertbar

(Mischkulturen).

93

Anhang

9.19 Index der Abbildungen

Abbildung 1: hlyX Gen mit Primern und Restriktionssenzymschnittstellen.......................... 47

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Konstruktion von pHLYX701......................... 48

Abbildung 3: A, PCR mit Primer oHLYX5 und oHLYX6; B, PFGE Analyse von

A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX ; C, Southern Blot nach

Verdau mit DraI; 1, A. pleuropneumoniae AP76; 2, A. pleuropneumoniae ∆hlyX. ........ 49

Abbildung 4: Position des hlyX-Gen auf der physikalischen Karte von A.

pleuropneumoniae AP76.................................................................................................. 50

Abbildung 5: Vergleich der Trockengewichte von A. pleuropneumoniae wt und A.

pleuropneumoniae ∆hlyX nach Kultivierung unter anaeroben Bedingungen;

dargestellt ist der Mittelwert aus 5 Untersuchungen........................................................ 51

Abbildung 6: Konstruktion der Plasmide für die Komplementierung der A.

pleuropneumoniae lyX-Mutante....................................................................................... 52

Abbildung 7: Western Blot Analyse der anaeroben DmsaA-Expression. A: Coomassie

Blau gefärbtes Gel; B: Werstern Blot Analyse; 1 A; pleuropneumoniae wt; 2 A.

pleuropneumonie ∆hlyX, 3 A. pleuropneumonie ∆hlyX + pHLYX1300; A.

pleuropneumonie ∆hlyX + pHLYX1301 (links unter Standardbedingungen und

rechts unter anaeroben Bedingungen gewachsen). .......................................................... 53

Abbildung 8: Vergleich der Körpertemperaturen und „lung-scores“ bei Schweinen mit

A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX Infektionen; A :

Körpertemperatur der Tiere der A. pleuropneumoniae ∆hlyX und

A. pleuropneumoniae wt Gruppen nach der Infektion. Tag 0 ist der Tag der

Infektion; B: „lung-scores“ der Schweine der A. pleuropneumoniae ∆hlyX und

A. pleuropneumoniae wt Gruppen 21 Tage nach der Infektion; Asterisks zeigen

signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an (p < 0,05)...................................... 55

94

Anhang

9.20 Index der Tabellen

Tabelle 1.: Apx-Toxin Produktion von den verschiedenen A. pleuropneumoniae

Serotypen (BOSSE et al. 2002)........................................................................................ 15

Tabelle 2: Verwendete Bakterienstämme und Plasmide................................................... 25

Tabelle 3: Zusammensetzung des Ligationsgemisches.................................................... 31

Tabelle 4: Mastermix-Zusammensetzung ......................................................................... 35

Tabelle 5: Verdau der Blöckchen...................................................................................... 40

Tabelle 6: Zusammensetzung des Polyacrylamidgeles ..................................................... 41

Tabelle 7: Überprüfung der Aspartaseaktivität in A. pleuropneumoniae wt, A.

pleuropneumoniae ∆hlyX und A. pleuropneumoniae ∆hlyX komplementiert „in

trans“ unter Verwendung der Plasmide pHLYX1300 und pHLYX1301 ........................ 54

Tabelle 8: Virulenzvergleich zwischen A. pleuropmeumoniae wt und A.

pleuropmeumoniae ∆hlyX ................................................................................................ 56

95

Danksagung

An der Stelle möchte ich mich herzlich bedanken bei:

Prof. Dr. Gerald-F. Gerlach für die Überlassung des Themas, die Bereitstellung des

Arbeitsplatzes, die zeitaufwendige Betreuung und für den engagierten Einsatz für das

Erhalten meines Ausreisevisum,

Dr. Nina Baltes für die wissenschaftliche Betreuung und für die Unterstützung und die

fachliche Beratung bei der Durchführung der Tierversuche,

Jörg Merkel für die Hilfe bei der Edition

Allen Mitarbeiter und Mitdoktoranden für die Zusammenarbeit,

Frau Ledwoch für ihre allgegenwärtige und freundliche Hilfsbereitschaft,

Meinem Institut für die Bereitstellung des Stipendiums,

Meiner Familie für ihr Verständnis und ihre Unterstützung.

Konstruktion und Charakterisierung einer isogenen · Pleuropneumonie der Schweine, die mit zunehmender Intensivierung der Schweinehaltung an Bedeutung gewonnen hat. Die Erkrankung

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