Isolasi, Pemurnian, dan Karakterisasi Kolagen dari Kulit ...

Isolasi, Pemurnian, dan Karakterisasi Kolagen dari Kulit Babi serta Analisis Kandungan Glisin, Prolin, dan Hidroksiprolin secara

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi - Fluoresensi

Ayu Aditya Andayani, Harmita, dan Baitha Palanggatan Maggadani

Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia, Kampus UI, Depok, 16424, Indonesia

E-mail: [email protected]

Abstrak

Kolagen merupakan bahan baku tinggi protein, dimana hampir semua asam amino terkandung didalamnya dengan kandungan terbesarnya adalah glisin, prolin, dan hidroksiprolin. Pada penelitian ini, kolagen diisolasi, dimurnikan, dan dikarakterisasi dari kulit babi (Sus scrofa domesticus), kemudian dilakukan pencarian kondisi analisis optimum untuk mendapatkan metode penetapan kadar asam amino glisin, prolin, dan hidroksiprolin pada sampel kolagen kulit babi. Metode terbaik untuk mengisolasi kolagen dari kulit babi menggunakan perendaman dalam NaOH 0,1 M dan diekstraksi dengan asam asetat 0,5 N, dipresipitasi dengan NaCl 0,9M kemudian disentrifugasi, dialisis sebagai proses pemurnian, dan terakhir di freeze-drying untuk memperoleh bentuk padatnya. Karakterisasi yang dilakukan meliputi uji organoleptis, pH, analisis gugus fungsi, kadar air, kadar abu, viskositas, dan pewarnaan Casson’s trichrome pada jaringan kolagen. Selanjutnya kolagen dihidrolisis dengan HCl 6N selama 24 jam lalu diderivatisasi menggunakan pereaksi 9-Fluorenilmetoksikarbonil klorida (FMOC-Cl). Sampel selanjutnya dianalisis menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan kolom C-18® dan detektor fluoresensi pada panjang gelombang eksitasi 265 nm dan panjang gelombang emisi 320 nm. Fase gerak yang digunakan dapar asetat (pH 4,2)-asetonitril (55:45) dengan laju alir 0,8 mL/menit. Hasil menunjukkan kadar rata-rata glisin, prolin, hidroksiprolin berturut-turut adalah 33,663% ± 0,215%; 12,333% ± 0,128% ; dan 11,303% ± 0,354%.

Isolation, Purification, and Characterization of Porcine Skin Collagen and Analysis Component of Glycine, Proline, and Hydroxyproline by High Performance Liquid

Chromatography - Fluorescence

Abstract Collagen is a high protein feedstock with almost all amino acids are contained in it, but the greatest content of all

are glycine, proline, and hydroxyproline. In this study, collagen was isolated, purified, and characterized from porcine skin (Sus scrofa domesticus), then determination of the optimum conditions analysis on amino acid in

collagen were performed to obtain a method for determination of glycine, proline, and hydroxyproline content in porcine skin collagen samples. The best method to isolate collagen was using 0.1 M NaOH, extracted with 0.5 N Qacetic acid, precipitated with 0.9M NaCl, then collagen was centrifuged, dialysed to purification, and freeze-dryed to get the solid form. The characterization tests includes organoleptic, pH, Fourier Transform Infra Red

analysis, moisture content, ash content, viscosity, and Casson's trichrome staining on collagen tissue. After that, collagen was hydrolized using HCl 6N for 24 hours then derivatized using 9-Fluorenylmethylcarbonyl chloride.

Collagen was analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC) with C-18® column and fluorescence detector at excitation wavelength of 265 nm and emission wavelength of 320 nm. Mobile phase used was acetic buffer (pH 4.2)-acetonitrile (55:45) with flow rate 0.8 mL/min. The results showed average

contents of glycine, proline, and hydroxyproline were 33,663% ± 0,215%; 12,333% ± 0,128% ; and 11,303% ± 0,354%.

Keywords:porcine skin collagen, amino acid, glycine, proline, hydroxyproline, derivatization, HPLC, fluorescence, optimization, component

Isolasi, Pemurnian ..., Ayu Aditya Andayani, FFAR UI, 2017

Pendahuluan

Selama ribuan tahun, sebelum polimer sintetis berbasis minyak ditemukan, kolagen

merupakan material organik yang dominan digunakan untuk membuat sepatu, pakaian, lem,

pengikat, filamen, benang bedah, dan aplikasi lainnya secara universal. Hingga saat ini,

permintaan terhadap kolagen dan bentuk terdenaturasinya, yaitu gelatin semakin meningkat.

Produksi kolagen kini dianggap sebagai salah satu biomaterial yang sangat bermanfaat karena

berperan pada berbagai aplikasi industrial yang digunakan secara luas pada industri makanan,

pakaian, kosmetik, farmasi, kesehatan, dan biomedik (Meyer, M., Schröpfer, M., 2013).

Kolagen adalah satu-satunya protein yang paling berlimpah jumlahnya yang dapat

ditemukan pada hewan dan meliputi hampir 30% dari total protein pada jaringan dan organ.

Tingginya peminatan dan permintaan terhadap kolagen terutama pada industri makanan

dikarenakan tingginya kadar protein yang terkandung dan karakteristik fungsional kolagen

mulai dari kapasitas absorbsinya terhadap air, kemampuannya dalam membentuk gel, dan

kemampuannya dalam membentuk dan menstabilisasi emulsi. Pada industri farmasi dan

biomedik, kolagen memiliki beberapa pengaplikasian yaitu sebagai transpor suatu obat,

protein, gen, dan sebagai pengganti pada kulit manusia, pembuluh darah, dan ligamen

(Gómez-Guillén et al., 2011).

Pada prinsipnya penggunaan bahan mentah dalam produksi kolagen dapat diperoleh

dari beberapa sumber hewani seperti dari tulang, kulit, tendon, jaringan ikat mamalia, ikan,

dan unggas. Kolagen dari sapi dan babi merupakan sumber kolagen yang paling banyak

digunakan karena harganya yang murah, lebih mudah didapat, dan jumlah kandungannya

yang sangat besar.

Sejak tahun 2010, peminatan dan permintaan terhadap kolagen babi semakin

meningkat di industri kosmetik dan kecantikan sebagai sediaan krim wajah dan sleeping

packs yang memiliki khasiat tinggi dalam menghidrasi kulit, menjaga kelembapan kulit, dan

menghilangkan garis-garis halus yang disebabkan oleh penuaan dan kekeringan (Yang, H. &

Shu, Z., 2014).

Hal ini menjadi dasar peneliti untuk melakukan produksi terhadap kolagen babi

melalui ekstraksi dan isolasi dari kulit babi. Pada penelitian ini, isolasi dan pemurnian

kolagen mengacu pada metode yang dilakukan Lestari tahun 2007 dengan modifikasi. Mula-

mula dilakukan tahap pre-treatment bahan baku dengan perendaman pada NaOH 0,1N,

kemudian diekstraksi dengan asam asetat 0,5M dan dilanjutkan salting out dengan NaCl 0,9N

dan sentrifugasi. Tahap pemurnian dilakukan melalui dialisis dan diikuti freeze-dry untuk

memperoleh bentuk padat kolagen. Kolagen yang telah diisolasi dikarakterisasi melalui uji


organoleptis, kadar air, kadar abu, pH, viskositas, analisis gugus fungsi, dan pewarnaan

casson’s trichrome.

Selanjutnya dilakukan analisis terhadap kadar asam amino utama glisin, prolin, dan

hidroksiprolin yang terkandung dalam kolagen babi. Prolin dan hidroksiprolin yang

terkandung pada kolagen merupakan jenis asam amino sekunder yang tidak memiliki gugus

kromofor, sehingga perlu diderivatisasi dengan pereaksi fluorogenik agar dapat membentuk

senyawa berfluoresensi pada daerah sinar ultraviolet/tampak (UV/Vis). Pada penelitian ini

dipilih pereaksi 9-Fluorenilmetoksikarbonil klorida (FMOC-Cl) yang mampu menderivatisasi

asam amino primer dan sekunder sekaligus. Selanjutnya dilakukan penelitian lebih lanjut

menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang lebih efektif dan selektif dalam

pemurnian dan kuantifikasi asam amino yang dilengkapi dengan detektor fluoresensi.

Tinjauan Teoritis

Kolagen

Kolagen merupakan suatu jenis protein fibrosa struktural yang terdapat pada matriks

ekstraseluler dan jaringan ikat hewan (Ramshaw, et al., 2009). Pada mamalia, burung, dan

ikan, kolagen merupakan protein utama penyusun jaringan kulit, tendon, ligamen, tulang

rawan, dan jaringan ikat pada umumnya. Molekul dasar pembentuk kolagen disebut

tropokolagen dimana unit strukturalnya terdiri dari tiga rantai polipeptida yang tersusun dalam

bentuk triple helix. Urutan triple helix sering digambarkan sebagai pola berulang Gly-X-Y,

dimana X adalah prolin dan Y adalah hidroksiprolin.

Kolagen pada Babi

Pada babi, kolagen banyak bersumber dari kulit, tulang, dan tendonnya, dimana

ketiga sumber tersebut kerap digunakan sebagai sumber kolagen tipe I dan tipe III, sementara

kolagen tipe IV dapat diperoleh dari villi plasenta babi dan kolagen tipe II dapat diperoleh

dari kartilago artikulernya (Silvipriya et al., 2015). Kolagen pada kulit babi terkandung di

lapisan dermis bersamaan dengan serat elastin didalam sebuah matriks amorf di

mukopolisakarida (Summerfield, Meurens, Ricklin, 2015).

Kolagen pada babi sering digunakan untuk keperluan industri kosmetik dan makanan,

karena kolagen dari babi memiliki komponen yang hampir sama dengan kolagen yang berasal

dari manusia sehingga kolagen babi tidak menimbulkan reaksi alergi maupun iritasi ketika

digunakan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Chang, P., Chang, S., Chen, H., & Ho, Y.

(2003), menunjukkan bahwa terdapat perbedaan komposisi kandungan kolagen yang


bersumber dari babi dengan kolagen dari hewan lainnya seperti sapi dan ayam, dimana pada

babi memiliki kandungan kolagen yang lebih tinggi dari yang terkandung pada sapi dan ayam.

Asam Amino pada Kolagen

Komposisi kolagen yang diisolasi dari sumber hewani seperti dari tulang dan kulit

babi didominasi oleh asam amino glisin, prolin,dan hidroksiprolin (McCullaugh, et al., 2010).

Ketiga asam amino tersebut memiliki kadar masing-masing glisin 33%, prolin 12%, dan

hidroksiprolin 10% (Szpak&Paul, 2011).

Pada kolagen, glisin dan prolin berfugsi menjaga integritas struktural kolagen.

Sementara gugus OH pada hidroksipolin akan berpartisipasi dalam pembentukan ikatan

hidrogen antar rantai pada triple helix kolagen yang memperkuat stabilitas struktur kolagen.

Tingginya kandungan glisin, prolin, dan hidroksiprolin akan mencegah konformasi α-helix

dan β-sheet, sehingga kandungan ketiganya sangat penting dan sangat berperan dalam

meningkatkan stabilitas kolagen. Kolagen dengan kandungan asam amino tinggi sangat baik

digunakan sebagai bahan baku dalam industri karena memiliki kestabilan suhu yang tinggi

(Jamilah et al., 2013).

Proses Ektraksi dan Isolasi

Ekstraksi untuk kolagen dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu ekstraksi

konvensional menggunakan solvent dan ekstraksi enzimatis. Ekstraksi konvensional biasanya

dilakukan dengan cara maserasi, yaitu proses perendaman suatu bahan baku selama beberapa

waktu, umumnya 24 jam dengan menggunakan satu atau campuran pelarut (Hartati, 2010).

Sementara, isolasi merupakan proses pemisahan dan pemurnian suatu substansi menjadi

komponen-komponen secara kimiawi serta menghilangkan pengotornya. Proses isolasi

kolagen dari bahan baku meliputi tiga tahapan utama, yaitu tahap pre-treatment pada bahan

baku, tahap ekstraksi, dan tahap pemurnian kolagen (Lestari, 2007).

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan komponen-komponen campuran

diantara dua fase yang didasarkan pada perbedaan distribusi, yaitu fase diam dan fase gerak.

Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar

yaitu kromatografi gas dan kromatografi cair (McNair dan Miller, 1998; Braithwaite dan

Smith, 1999).

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan tipe kromatografi cair yang dapat

memisahkan dan menganalisis suatu senyawa secara kualitatif dan kuantitatif dalam suatu

senyawa yang terlarut. KCKT merupakan metode yang tidak desktruktif dan memiliki

kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi (T.Kupiec, 2004). Secara umum instrumentasi


dalam KCKT meliputi pompa, injektor, kolom, detektor, integrator dan sistem pengumpul

data.

Detektor memiliki fungsi mendeteksi atau mengidentifikasi komponen yang ada

dalam eluat dan mengukur jumlahnya. Jenis detektor yang biasa digunakan dalam KCKT

adalah detektor fluoresensi, detektor UV, detektor indeks bias (RID), detektor ionisasi nyala

(FID), detektor elektrokimia (ECD), detektor evaporation light scattering (ELSD) dan

detektor radioaktif (Harmita, 2006). Detektor fluoresensi merupakan detektor yang paling

sensitif dan selektif, dimana ia 100 kali lebih sensitif daripada detektor UV. Namun detektor

fluoresensi hanya dapat digunakan pada senyawa yang dapat berfluoresensi pada daerah sinar

ultraviolet/tampak.

Metode Penelitian

Alat

Kromatografi cair kinerja tinggi LC 20AT (Shimadzu, Japan) yang dilengkapi dengan

pompa, kolom YMC-Triart®C18, detektor fluoresensi RF 20A (Shimadzu, Japan), injektor

manual, dan pemroses data (LC-Solution), syringe KCKT (SGE, Australia), Spektrofotometer

UV-Vis (Shimadzu, UV-1601), FTIR (Shimadzu 8400S yang dilengkapi dengan DRS-

8000),Ultrasonic (LC 20 H), Oven (Heraeus), Tanur (Cole-Parmer, Chemoscience),

Sentrifugator (NF 400R), pH meter (Eutech Instruments pH 510), Freeze-dryer (Eyela FDU

1200), Vortex (WiseMix VM-10), pipet mikro (Propete), Viskometer Ostwald (Schott

Gerate), Milipore 45 µm (Whatman), timbangan analitik, ultrasonic (LC 20 H), labu ukur,

dialisis tubing (cellulose membrane) 12 kDa (Sigma), dan alat-alat gelas kimia yang umum

digunakan dalam analisis kuantitatif.

Bahan

Kulit Babi yang diperoleh dari Pasar tradisional, Pasar Agung, Depok, Undenaturated

Collagen-II (Inter Health, Nutraceuticals Incorporated), Standar Asam Amino Glisin, Prolin,

dan Hidroksiprolin (Sigma-Aldrich), 9-Fluorenilmetoksikarbonil klorida (FMOC-Cl)

(Hangzhou Dingyan Chem Co. Ltd), pewarna Casson’s trichrome (Laboratorium Patologi,

PSSP IPB), Reagen pro HPLC: asetonitril, metanol, NaOH, asam borat, asam asetat glasial,

natrium asetat anhidrat, HCl, NaCl (Merck), Aqua Pro Injection (Ikapharmindo Putramas),

Aquadest (Brataco).


Pembuatan Larutan Standar Kolagen

Ditimbang 50 mg standar kolagen kemudian dilarutkan dalam 5 ml HCl 6N dan

dihidrolisis dalam oven pada suhu 110°C selama 22, 23, 24, dan 25 jam. Selanjutnya

dilarutkan dalam dapar asetat (pH 4,2) dan diencerkan hingga konsentrasi 10 µg/mL.

Pembuatan Larutan Stok Asam Amino

Ditimbang standar asam amino glisin, prolin, dan hidroksiprolin masing-masing 50

mg kemudian dilarutkan dalam 100 mL HCl 0,1 M. Selanjutnya masing-masing larutan

diencerkan hingga diperoleh konsentrasi 10 µg/mL.

Pembuatan Larutan 9-Fluorenilmetoksikarbonil klorida (FMOC-Cl)

Larutan 15 mM FMOC-Cl dibuat dengan menimbang 39 mg FMOC-Cl (BM 258,7

g/mol), kemudian dilarutkan dengan 10 ml asetonitril, encerkan hingga diperoleh konsentrasi

1,5 mM.

Pembuatan Dapar Borat pH 9

Dapar borat 100 mM disiapkan dengan menimbang 0,0618 gram asam borat lalu

ditambahkan 100 mL aquabidest. Selanjutnya dilakukan pengenceran hingga diperoleh

konsentrasi 10 µg/mL, kemudian cek pH hingga mencapai pH 9 dengan menambahkan NaOH

6N tetes demi tetes.

Pembuatan Dapar Asetat

Larutan dapar asetat 15 mM dibuat dengan menimbang 1,6 gram natrium asetat

anhidrat kemudian dilarutkan dalam 400 ml aquadest. Selanjutnya dilakukan adjust pH

dengan asam asetat glasial P hingga diperoleh pH 4,2. Dapar asetat yang telah jadi disaring

dengan kertas saring Whatman No. 45.

Langkah Kerja

Pre-treatment Bahan Baku

Bahan baku kulit babi dicuci dalam air dan dibersihkan lemaknya dengan pisau secara

manual kemudian dipotong kecil-kecil dengan ukuran ± 1x1 cm2. Selanjutnya direndam

dalam NaOH 0,1 N dengan perbandingan 1:5 selama tiga hari dengan dilakukan penggantian

pelarut setiap harinya.

Ekstraksi Kolagen dari Kulit Babi

Ekstraksi sampel dilakukan dengan merendam kulit babi yang telah dipotong kecil-

kecil ke dalam asam asetat 0,5 M selama 3 hari, selanjutnya filtrat diambil (filtrat 1). Residu

kulit babi direndam kembali dalam larutan asam asetat 0,5M baru selama 3 hari dan filtrat

diambil kembali (filtrat 2). Filtrat 1 dan Filtrat 2 disimpan dalam lemari pendingin selama 1


hari kemudian dicampur dan dilakukan salting out dengan NaCl 0,9 M selama semalam.

Selanjutnya larutan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit pada suhu

4°C. Endapan yang terbentuk diambil kemudian dilarutkan pada asam asetat 0,5 M.

Pemurnian Kolagen

Proses pemurnian dilakukan dengan mendialisis kolagen dalam membran selofan

dengan asam asetat 0,1 M pada perbandingan 1:10 dari volume larutan kolagen selama 1 hari,

kemudian dilanjutkan penggantian pelarut setiap hari selama dua hari dengan aquadest.

Kolagen hasil dialisis kemudian diliofilisasi (freeze-dry) untuk memperoleh bentuk padatnya.

Karakterisasi Kolagen Kulit Babi

Organoleptis

Uji organoleptis dilakukan dengan memeriksa penampilan, warna dan bau dari

kolagen yang diisolasi dari kulit babi.

Analisis Gugus Fungsi dengan FTIR

Ditimbang 200 mg KBr dan 2 mg kolagen, campur keduanya dan digerus hingga

homogen. Campuran diletakkan pada disk. Disk diletakkan pada DRS-8000 alat FTIR dan

diukur pada bilangan gelombang 4000-400 cm-1, selanjutnya spektrum IR akan muncul.

Uji pH (AOAC 2005)

Sampel dan standar kolagen masing-masing ditimbang 1 gram dan dilarutkan dalam

aquadest 70 ml. Nyalakan alat pH meter, elektroda dicelupkan ke dalam masing-masing

larutan hingga diperoleh nilai pH yang stabil.

Pewarnaan Casson’s trichrome

Kolagen hasil isolasi diletakkan pada gelas obyek kemudian direndam dalam larutan

Cassons trichrome selama 5 menit, dicuci dengan air selama 3-5 detik dan air diserap dengan

kertas saring hingga kering. Selanjutnya dilakukan dehidrasi cepat dalam alkohol 100%,

dijernihkan dalam silol, kemudian dilekatkan dengan kaca penutup. Pengamatan dilakukan

dengan mikroskop cahaya perbesaran obyektif 10x.

Uji kadar air (AOAC 2005)

Botol timbang kaca ditimbang kemudian dikeringkan dalam oven 105°C selama 1

jam. Botol dimasukkan dalam desikator 5 menit dan ditimbang kembali hingga bobot tetap

(A). Masukkan 1 gram sampel ke dalam botol, lalu timbang (B). Botol timbang berisi sampel

dioven pada suhu 105°C selama 5-6 jam, kemudian masukkan desikator, dan ditimbang

kembali (C). Kadar air (%) dihitung berdasarkan rumus : !!!!!!

x 100%


Uji kadar abu (AOAC 2005)

Cawan ditimbang lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 105°C selama 30 menit.

Cawan dimasukkan dalam desikator 5 menit dan ditimbang kembali hingga bobot tetap.

Masukkan 1 gram sampel ke cawan lalu dibakar diatas kompor listrik sampai tidak berasap.

Selanjutnya masukkan tanur pengabuan dengan suhu 600°C selama 7 jam. Setelah itu cawan

dan sampel dimasukkan ke dalam desikator lalu ditimbang dan dihitung kadar abunya.

Uji viskositas

Larutan sampel kolagen dibuat pada konsentrasi 0,5% dalam aquadest lalu dilarutkan

dalam air panas. Lakukan pengukuran menggunakan Viskometer Ostwald. Pengujian

dilakukan tiga kali pada sampel yang sama.

Proses Derivatisasi Asam Amino

Proses derivatisasi asam amino dilakukan pada suhu ruang menggunakan prosedur

pre-kolom. Diambil 300 µL larutan kolagen lalu ditambahkan 300 µL dapar borat 10 mM pH

9 dan 300 µL FMOC-Cl 1,5 mM. Larutan uji disuntikkan sebanyak 20 µL ke alat KCKT.

Penentuan Kondisi Analisis Optimum

Penetapan panjang gelombang optimum analisis

Larutan standar kolagen yang sudah diderivatisasi dilakukan percobaan untuk

menentukan panjang gelombang emisi pada 320, 325, dan 330 nm. Sedangkan penentuan

panjang gelombang eksitasi dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada larutan

standar asam amino hidroksiprolin, glisin, dan prolin.

Pemilihan komposisi fase gerak

Komposisi fase gerak yang diuji coba adalah dengan dapar asetat (pH 4,2)-asetonitril

pada perbandingan (55:45); (60:40); dan (65:35).

Pemilihan laju alir fase gerak untuk analisis

Variasi laju alir fase gerak (pada komposisi fase gerak terpilih) yang akan diuji coba

adalah pada 0,8 mL/menit, 1,0 mL/menit dan 1,2 mL/menit.

Uji Kesesuaian Sistem

Larutan standar kolagen yang telah diderivatisasi disuntikkan sebanyak 20 µL ke alat KCKT

dengan komposisi fase gerak dan laju alir terpilih. Kemudian dilihat parameter waktu retensi,

faktor ikutan, resolusi,efisiensi kolom, dan koefisien variasi pada enam kali penyuntikkan.

Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas

Larutan uji kurva kalibrasi dibuat dari campuran larutan standar asam amino prolin,

glisin, dan hidroksiprolin pada rentang konsentrasi 1, 2, 4, 5, 10, dan 20 µg/ml. Masing-

masing larutan tersebut disuntikkan 20,0 µL ke alat KCKT pada kondisi analisis terpilih. Dari


hasil yang diperoleh, dianalisis regresi luas puncak (y) terhadap konsentrasi analit (x) dan

dibuat kurva kalibrasinya. Koefisien korelasi (r) dari persamaan garis regresi linear dihitung.

Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Dari kurva kalibrasi yang diperoleh, dihitung konsentrasi terkecil yang masih dapat

dideteksi (LOD) dan terdeteksi secara kuantitatif (LOQ) menggunakan perhitungan statistik

dari regresi linear kurva kalibrasi.

Penetapan Kadar Asam Amino dari Kolagen yang diisolasi dari Kulit Babi

Ditimbang ±50 mg kolagen padat hasil isolasi lalu dilarutkan dalam 5 ml HCl 6N.

Campuran dihidrolisis dalam oven pada suhu 110°C selama 22 jam, 23 jam, 24 jam, dan 25

jam. Setelah itu dilarutkan dalam dapar asetat pH 4,2 dan diencerkan hingga diperoleh

konsentrasi 10 µg/mL. Larutan kolagen diderivatisasi dengan FMOC-Cl dan dapar borat lalu

dianalisis pada alat KCKT pada kondisi analisis terpilih. Catat luas puncak yang diperoleh,

ulangi percobaan 3 kali. Kadar dihitung dengan menggunakan persamaan kurva kalibrasi.

Hasil dan Pembahasan

Ekstraksi dan Isolasi Kolagen dari Kulit Babi

Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi dan isolasi kolagen dari kulit babi segar yang

memiliki bobot rata-rata 1000 gram secara tiga tahap. Pada tahap pre-treatment, kulit babi

dicuci dalam air, dibersihkan dari pengotor dan lemak, dan dipotong kecil-kecil dengan

ukuran ± 1x1 cm2 untuk memperoleh luas permukaan yang besar. Selanjutnya direndam

dalam NaOH 0,1 N untuk menghilangkan protein nonkolagen dan kontaminan mineral dan

pigmen yang terkandung dalam sampel. Penampakan kulit babi setelah perendaman NaOH

adalah kulit babi menjadi lebih putih dan kesat dibandingkan dengan sebelum direndam

NaOH, hal ini disebabkan NaOH mengikat kotoran dan protein nonkolagen sehingga warna

kulit babi yang tadinya merah muda akan menjadi putih. Selain itu, kulit babi juga

mengabsorbsi larutan NaOH tersebut sehingga beratnya pun akan bertambah dari berat

awalnya (Rahadini, 2007).

Ekstraksi dilanjutkan dengan proses perendaman kulit babi ke dalam asam asetat 0,5

M selama 3 hari. Filtrat gabungan selanjutnya di salting out dengan NaCl 0,9M selama

semalam. Hasil salting out akan terlihat endapan-endapan putih di bagian bawah larutan.

Salting-out bertujuan agar protein kolagen yang terlarut pada asam asetat dapat dikeluarkan

menjadi protein yang tak larut (Rahadini, 2007). Selanjutnya kandungan kolagen yang tak

larut dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 20 menit pada suhu

4°C. Temperatur saat sentrifugasi harus dipertahankan pada suhu rendah agar protein kolagen


tidak terdenaturasi akibat kecepatan putaran yang dapat menimbulkan panas. Endapan putih

akan terbentuk di bawah tube sentrifugasi, endapan diambil kemudian dilarutkan pada asam

asetat 0,5 M.

Tahap pemurnian dilakukan dengan mendialisis endapan putih kolagen hasil

sentrifugasi melewati asam asetat 0,1 M dan aquadest dalam cellophane membrane 12 kDa.

Prinsip kerja dialisis adalah difusi dimana pelarut dan NaCl dalam kolagen dapat berdifusi

keluar membran, sedangkan kolagen yang bermolekul besar akan tertahan di dalam membran.

Berikutnya, kolagen hasil dialisis diliofilisasi (freeze-dry) untuk memperoleh bentuk

padat atau keringnya.

Karakterisasi Kolagen Kulit Babi

Organoleptis

Hasil akhir kolagen yang diperoleh adalah berupa kolagen kering berserat seperti

kapas, berwarna putih, dan berbau amis.

Gambar 1. Kolagen setelah di freeze-drying

Analisis gugus fungsi

Hasil analisis spektra FTIR pada sampel dan standar kolagen menunjukkan puncak-

puncak serapan pada wilayah serapan amida A pada 3200-3400 cm -1, amida B pada 2935-

2915 cm -1, amida I pada 1600-1690 cm -1, amida II pada 1480-1575 cm -1, dan amida III pada

1229-1301 cm -1 yang masing-masing merupakan serapan khas pada kolagen. Amida A

sendiri merupakan daerah gugus fungsi vibrasi ulur gugus NH, amida B daerah CH2 ulur

asimetris, amida I merupakan daerah vibrasi ulur gugus C=O, amida II adalah daerah NH

tekuk yang berikatan dengan CN ulur, dan amida III merupakan gugus CN ulur dengan NH

tekuk (Sai dan Babu, 2001; Coates, 2010; Kong dan Yu, 2007).


Keterangan :A (merah) : spektrum serapan standar kolagen

B (biru) : spektrum serapan sampel kolagen Gambar 2. Overlay spektrum serapan standar kolagen dan sampel kolagen hasil

isolasi dari kulit babi

Uji pH

Uji pH dilakukan dengan membandingkan pH sampel dan pH standar kolagen. pH

yang diperoleh pada larutan standar adalah 6,70 sementara pH pada larutan sampel kolagen

adalah 6,87. Nilai pH standar dan sampel kolagen pada penelitian ini sesuai dengan syarat

mutu kolagen yang ditetapkan oleh Badan Standardisasi Nasional (2014) yaitu antara 6,5 – 8.

Pewarnaan Casson’s trichrome

Uji pendeteksian kolagen menggunakan casson’s trichrome solution yang terdiri dari

aquadest (200 ml), phosphotungistic acid (1 gram), orange G (2 gram), anilin blue (1 gram),

dan acid fuchsine (3 gram). Pewarnaan kolagen dengan menggunakan Casson’s trichrome

menunjukkan jaringan kolagen babi hasil isolasi terwarnai biru dan merah. Warna biru berasal

dari pewarna anilin blue yang menunjukkan adanya jaringan kolagen, sedangkan warna

merah berasal dari phosphotungistic acid dan orange G yang mewarnai sitoplasma, otot, dan

inti sel (Kiernan, 1990).

Gambar 3. Pewarnaan sampel kolagen babi dengan Casson’s trichrome

A

B


Analisis kadar air

Berdasarkan hasil uji dari sampel kolagen hasil isolasi kulit babi, angka kadar air yang

diperoleh adalah 1,186% pada uji I dan 1,662% pada uji II. Angka rata-rata yang diperoleh

adalah 1,424%. Hal ini menunjukkan angka kadar air sampel sudah memenuhi syarat BSN

(2014) yaitu ≤12.

Analisis kadar abu

Analisis kadar abu dilakukan untuk mengetahui apakah di dalam sampel masih

terkandung mineral lain seperti silikat, kalsium, kalium, dan sebagainya. Jika nilai kadar abu

masih tinggi,berarti proses ekstraksi tidak berjalan sempurna. Pada uji kadar abu sampel

kolagen yang dilakukan secara 2 siklus diperoleh nilai sebesar 0,23% dan 0,49% . Nilai kadar

abu sudah memenuhi kriteria syarat mutu kolagen berdasarkan BSN (2014) yaitu ≤ 1,0.

Uji viskositas

Pengukuran menggunakan viskometer Ostwald dengan tiga kali pengukuran terhadap larutan

sampel diperoleh nilai 0,9121 cP; 1,1121 cP; dan 1,022 cP. Nilai viskositas yang rendah

menunjukkan fluida cair (encer), hal ini disebabkan karena pelarutan sampel menggunakan

air panas, sehingga kemungkinan terjadi degradasi ikatan hidrogen pada kolagen.

Optimasi Waktu Hidrolisis

Hidrolisis dilakukan melalui proses deaminasi gugus amin pada kolagen dengan HCL

6N yang disertai pemanasan pada suhu 110°C untuk memutus rantai ikatan peptida pada

kolagen agar terbentuk senyawa-senyawa tunggal asam amino. Waktu hidrolisis yang diuji

adalah pada 22, 23, 24, dan 25 jam. Hidrolisis dengan waktu 24 jam memberikan luas puncak

yang paling besar dan paling sesuai dengan pustaka yang diacu yaitu Schrieber & Gareis

(2007) dibandingkan hasil hidrolisis 22, 23, dan 25 jam. Pada kromatogram 22,23, dan 25 jam

asam amino tidak terpisah secara sempurna. Sehingga waktu paling optimal untuk

menghidrolisis kolagen adalah 24 jam.

Tabel 1. Data variasi waktu hidrolisis terhadap luas puncak senyawa derivat yang terbentuk Waktu Hidrolisis

(jam) Luas Puncak (mV/s)

Hidroksiprolin Glisin Prolin 22 94073 203781 365141 23 57014 156464 201178 24 63202 238078 141636 25 24087 155995 80549


Pembentukan Senyawa Derivat

Proses derivatisasi asam amino dilakukan pada suhu ruang dengan prosedur pre-kolom

dan menggunakan penderivat FMOC-Cl (9-Fluorenilmetoksikarbonil-klorida). Reaksi

derivatisasi yang terjadi merupakan reaksi substitusi dimana gugus Cl yang dimiliki FMOC-

Cl akan digantikan oleh gugus amin primer dan sekunder asam amino. Derivatisasi asam

amino dengan FMOC-Cl membutuhkan pH alkali basa (pH ≥ 8), sementara larutan uji

kolagen memiliki pH berkisar antara 6,5–8 akibat proses pelarutan dalam dapar asetat. Oleh

karena itu diperlukan penambahan dapar basa untuk menaikkan pH larutan uji. Pada proses

derivatisasi ini, digunakan dapar borat pH 9 untuk mengalkalikan kolagen.

Pemilihan volume pereaksi dilakukan melalui perhitungan stokiometri terlebih dahulu

untuk mengetahui berapa volume pereaksi yang dibutuhkan untuk menghasilkan derivat yang

optimum dan stabil. Pada penelitian ini dengan 300 µL larutan uji kolagen yang digunakan

maka dibutuhkan 300 µL penderivat FMOC-Cl dan 300 µL dapar borat.

Penetapan Panjang Gelombang Analisis

Pemilihan panjang gelombang analisis yang optimum sangat penting dilakukan dalam

analisis menggunakan KCKT detektor fluoresensi, hal ini bertujuan untuk meningkatkan

selektivitas dan sensitivitas senyawa yang akan dianalisis. Pada panjang gelombang eksitasi

dilakukan penyesuaian dengan spektrofotometer UV-Vis dan panjang gelombang emisi

dengan detektor fluoresensi. Hasil optimasi panjang gelombang menunjukkan pada panjang

gelombang eksitasi 265 dan emisi 320 nm memberikan luas puncak yang paling besar

dibandingkan kromatogram emisi 325 dan 330 nm.

Tabel 2. Data variasi panjang gelombang emisi terhadap luas puncak senyawa derivat yang terbentuk

Panjang Gelombang Luas Puncak (mV/s) Eksitasi (nm) Emisi (nm) Hidroksiprolin Glisin Prolin

265 320 63202 238078 141636 325 16392 16196 9343 330 - 14817 3902

Pencarian Kondisi Analisis Optimum

Asam amino yang diderivatisasi dari kolagen merupakan senyawa polar sehingga

diperlukan fase gerak yang polar juga. Oleh karena itu, pada penelitian ini digunakan fase

gerak dapar asetat-asetonitril yang bersifat polar, dengan begitu akan diperoleh pemisahan

yang baik dengan waktu retensi yang tidak lama.

Pada fase gerak dapar asetat (pH 4,2)-asetonitril (55:45) ketiga senyawa asam amino

yaitu glisin, prolin, dan hidroksiprolin muncul dan terjadi pemisahan yang paling baik


dibandingkan dengan kromatogram fase gerak (60:40) dan (65:35). Hal ini dikarenakan pada

komposisi 60:40 dan 65:35 fase gerak kurang polar karena memiliki komposisi dapar asetat

yang lebih besar, sehingga senyawa memiliki afinitas yang kecil terhadap fase gerak dan

menyebabkan komponen asam amino tidak terpisah secara baik.

Setelah itu dilakukan optimasi terhadap laju alir dengan variasi 0,8 mL/menit; 1,0

mL/menit; dan 1,2 mL/menit. Hasil optimal yang diperoleh adalah dengan laju alir 0,8

mL/menit karena menghasilkan resolusi paling besar (> 1,5) sehingga menunjukkan

terjadinya pemisahan yang baik serta memberikan nilai HETP yang lebih kecil dan jumlah

lempeng teoritis lebih besar yang menunjukkan adanya efisiensi kolom.

Uji Kesesuaian Sistem

Uji kesesuaian sistem yang dilakukan 6 kali berturut-turut pada penyuntikan larutan

standar kolagen dengan kondisi analisis optimum terpilih dihasilkan nilai koefisien variasi

untuk asam amino hidroksiprolin, glisin, dan prolin masing-masing adalah 0,88% ; 0,49% ;

dan 1,40%. Berdasarkan percobaan tersebut memberikan hasil yang sesuai dengan

persyaratan yaitu koefisien variasi (KV) tidak lebih dari 2,0%. Selain itu ke-6 hasil

penyuntikkan memiliki nilai efisiensi kolom yang baik dan resolusi yang lebih besar dari 1,5.

Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas

Berdasarkan hasil perhitungan statistik regresi linear diperoleh persamaan garis kurva

kalibrasi untuk hidroksiprolin adalah y=1655,4x + 26980, untuk glisin adalah y=9351,2x +

30431, dan untuk prolin adalah y=5824,4x + 38859. Dari pengujian linearitas menghasilkan

nilai koefisein korelasi (r) untuk hidroksiprolin, glisin, dan prolin berturut-turut adalah

0,9981; 0,9979; dan 0,9985.

Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa nilai koefisien korelasi tidak ≥ 0,999 hal ini

disebabkan pada saat pembuatan larutan kurva kalibrasi ketiga larutan asam amino dicampur

sekaligus, tidak dilakukan terpisah, selain itu pengaruh dari proses derivatisasi juga dapat

menyebabkan nilai koefisien korelasi kurang dari 0,999.

Penentuan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)

Berdasarkan hasil uji linearitas hidroksiprolin, glisin, dan prolin memberikan nilai

batas deteksi (LOD) berturut-turut sebesar 0,900 µg/mL; 0,990 µg/mL; dan 0,998 µg/mL.

Sementara, nilai batas kuantitasi (LOQ) untuk hidroksiprolin, glisin, dan prolin berturut-turut

sebesar 3,001 µg/mL; 3,301 µg/mL; dan 3,327 µg/mL. Berdasarkan hasil tersebut, nilai LOQ

tidak memasuki rentang konsentrasi yang digunakan pada uji kurva kalibrasi. Nilai LOQ

sendiri memiliki hubungan dengan hasil uji linearitas, dimana dari hasil uji linearitas yang


sudah dilakukan tidak memenuhi persyaratan sehingga mempengaruhi pula terhadap hasil

LOD dan LOQ yang diperoleh.

Penetapan Kadar Asam Amino Glisin, Prolin, dan Hidroksiprolin pada Sampel Kolagen

Hasil Isolasi dari Kulit Babi

Penetapan kadar dihitung berdasarkan persamaan regresi linear masing-masing asam

amino. Berdasarkan hasil yang diperoleh, kadar rata-rata asam amino hidroksiprolin, glisin,

dan prolin berturut-turut adalah 11,303% ± 0,354%; 33,663% ± 0,215%; dan 12,333% ±

0,128%. Rata-rata kadar asam amino hidroksiprolin, glisin, dan prolin yang diperoleh

mendekati nilai kadar kolagen berdasarkan Schrieber & Gareis (2007) yaitu kadar glisin 33%,

prolin 11%, dan hidroksiprolin 10%. Adanya peningkatan kadar kolagen hasil isolasi

disebabkan karena sampel yang digunakan adalah kulit babi, yang memiliki kadar protein yang

memang lebih tinggi.

Kesimpulan

Diperoleh ekstrak dan isolat kolagen yang di isolasi dari kulit babi dengan nilai

rendemen sebesar 0,974% (bb) yang dikonfirmasi dengan analisis gugus fungsi menggunakan

FTIR dan pewarnaan Casson’s trichrome.

Kondisi optimum untuk analisis penetapan kadar asam amino glisin, prolin, dan

hidroksiprolin dari kolagen yang diisolasi dari kulit babi menggunakan KCKT dengan

detektor fluoresensi pada λex = 265 nm dan λem = 320 nm, Kolom YMC-Triart®C18 (panjang

kolom 250 nm, ukuran diameter dalam 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm) adalah dengan fase

gerak dapar asetat (pH 4,2)-asetonitril (55:45) dan laju alir 0,8 ml/menit. Kondisi optimum

untuk hidrolisis kolagen dengan HCl 6N disertai pemanasan pada suhu 110°C selama 24 jam.

Larutan kolagen kemudian ditambahkan dapar borat pH 9 dan diderivatisasi dengan FMOC-

Gambar 4. Kromatogram standar kolagen 10 µg/mL

dengan waktu hidrolisis 24 jam yang telah diderivatisasi

dengan FMOC-Cl pada optimasi fase gerak dapar asetat-

asetonitril (55:45) dan laju alir 0,8 ml/menit

Gambar 5. Kromatogram sampel kolagen hasil isolasi

dari kulit babi yang telah diderivatisasi dengan FMOC-

Cl pada kondisi analisis optimum terpilih


Cl masing-masing sebanyak 300 µL, selanjutnya disuntikkan ke alat KCKT dengan volume

penyuntikkan 20,0 µL.

Berdasarkan hasil analisis, asam amino pada kolagen hasil isolasi dari kulit babi

diperoleh kadar rata-rata asam amino hidroksiprolin, glisin, dan prolin berturut-turut adalah

11,303% ± 0,354%; 33,663% ± 0,215%;dan 12,333% ± 0,128%.

Saran

Untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan analisis terhadap asam amino alanin

yang terkandung pada kolagen babi, serta perlu dilakukan validasi metode analisis terhadap

metode yang telah diperoleh, dan pengembangan metode analisis kadar asam amino utama

dalam kolagen babi dengan menggunakan penderivat lain.

Daftar Acuan

[AOAC] Association of Official Analytical Chemyst. (2005). Official Methods of Analysis

(18 Edn). Maryland (US): Published by The Association of Official Analytical Chemist Inc.

Braithwaite, A., dan Smith, F.J. (1999). Chromatographic Methods (5th ed.). Dordrecht:

Kluwer Academic Publishers. [BSN] Badan Standardisasi Nasional. (2014). Kolagen Kasar dari Sisik Ikan – Syarat Mutu

dan Pengolahan: SNI 8076-2014 (id): Badan Standardisasi Nasional. Chang, P., Chang, S., Chen, H., & Ho, Y. (2003). Quantification of Collagen in Tissues Using

Stable Isotope Labeling and LC-MS, 1-9. Retrieved from http://www.rdoffice.ndhu.edu.tw/ezfiles/5/1005/form/275/form_69_5366939_38609.pdf

Gómez-Guillén, M., Giménez, B., López-Caballero, M., Montero, M. (2011). Functional and

Bioactive Properties of Collagen and Gelatin from Alternative Sources. A review. Food Hydrocoll. 25 : 1813-1827.

Harmita. (2006a). Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok: Departemen Farmasi FMIPA

Universitas Indonesia. Hartati, I. (2010). Kajian Produksi Kolagen dari Limbah Sisik Ikan secara Enzimatis.

Semarang: Skripsi Fakultas Teknik, Universitas Wahid Hasyim. Jamilah B, Hartina MRU, Hashim M, Sazili AQ. (2013). Properties of collagen from

barramundi (Lates calcarifer) skin. International Food Research Journal, 20(2):835-842.


Kiernan, J.A. (1990). Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. Great Britain: Pergamon Pr.

Kupiec, T. (2004). Quality-Control Analytical Methods: High-Performance Liquid

Chromatography. International Journal of Pharmaceutical Compounding, 8(3): 223-227.

Lestari, Tiska. (2007). Isolasi dan Karakterisasi Kolagen dari Tulang Ikan Tuna (Thunnus

albacares) sebagai Bahan Baku Industri Farmasi. Depok: Skripsi Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia.

McCullagh, J., Marom, A., & Hedges, R. (2010). Radiocarbon Dating of Individual Amino

Acids from Archeological Bone Collagen, Proceedings of the 20th International Radiocarbon Conference, 52(2), 620-634.

McNair, H.M., dan Miller, J.M. (1998). Basic Gas Chromatography. New York: John Willey

& Sons. Meyer, M. & Schropfer, M. (2013). Collagen Materials - Collagen Processing.Technical

Freedom and Scientific Challenges when Transforming Collagen into Final Materials. Rahadini, I.R. (2007). Isolasi dan Karakterisasi Kolagen dari Gelembung Renang Ikan Mas

(Cyprinus carplo) sebagai Bahan Baku Industri Farmasi. Depok: Skripsi Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia.

Ramshaw JA., Peng Y., Glattauer V., Werkmeister JA. (2009). Collagens As Biomaterials. J.

Mater. Sci. Mater. Med, 20 (1) : S3-S8 Schrieber, R., Gareis, H. (2007). Gelatine Handbook Theory and Industrial Practice. Whiley :

VCH, Weinheim. Silvipriya, K., Kumar, K., Bhat, A., Kumar, B., John, A., & Lakshmanan, P. (2015).

Collagen: Animal Sources and Biomedical Application. Journal Of Applied Pharmaceutical Science, 5(03), 123-127. http://dx.doi.org/10.7324/japs.2015.50322

Summerfield, A., Meurens, F., & Ricklin, M. (2015). The Immunology of The Porcine Skin

and Its Value as a Model for Human Skin. Molecular Immunology, 66(1), 14-21. http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2014.10.023

Szpak., Paul. (2011). Fish Bone Chemistry and Ultrastructure Implications for Taphonomy

and Stable Isotope Analysis. Journal of Archaelogical Science, 38 (12): 3358-3372. Yang, H. & Shu, Z. (2014). The Extraction of Collagen Protein from Pig skin. Journal of

Chemical and Pharmaceutical Research, 6(2), 683-687. http://dx.doi.org/0975-738. .


Isolasi, Pemurnian, dan Karakterisasi Kolagen dari Kulit ...

Documents