UNIVERSIDADE NILTON LINS INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE PROTEASE E LIPASE SOBRE A DIGESTIBILIDADE DE INGREDIENTES DA DIETA EM JUVENIS DE PIRARUCU (Arapaima gigas) ALINE MARCULINO DE ALCÂNTARA Manaus, Amazonas 2012
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UNIVERSIDADE NILTON LINS INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE PROTEASE E LIPASE SOBRE A
DIGESTIBILIDADE DE INGREDIENTES DA DIETA EM JUVENIS DE
PIRARUCU (Arapaima gigas)
ALINE MARCULINO DE ALCÂNTARA
Manaus, Amazonas
2012
ALINE MARCULINO DE ALCÂNTARA
INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE PROTEASE E LIPASE SOBRE A
DIGESTIBILIDADE DE INGREDIENTES DA DIETA EM JUVENIS DE
PIRARUCU (Arapaima gigas)
Orientadora: Drª Elizabeth Gusmão Affonso
Coorientador: M.Sc. Eduardo Ono
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação em
Aquicultura da Universidade Nilton
Lins como parte dos requisitos para
obtenção de título de Mestre em
Aquicultura
Manaus, Amazonas
2012
BANCA JULGADORA
Membros titulares:
_______________________________________
Dra. Priscila Vieira e Rosa - (UFLA) Lavras-MG
________________________________________________
Dra. Ana Cristina Belarmino de Oliveira (UFAM)
_______________________________________
Dr. Jony koji Dairiki (EMBRAPA)
Membros suplentes:
_______________________________________
Dr. André Moreira Bordinhon (UFAM/HUMAITÁ)
_______________________________________________
Dr. Frank George Guimarães Cruz (UFAM)
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A318i Alcântara, Aline Marculino.
Influência da adição de protease e lipase sobre a digestibilidade de ingredientes da dieta em juvenis de pirarucu (Arapaima gigas). / Aline Marculino de Alcântara. – Manaus: UNL, 2012.
51f.; 30 cm. Dissertação (Mestrado em Aquicultura) – Universidade Nilton Lins,
alternativos. 4. Nutrição. I. Influência da adição de protease e lipase sobre a digestibilidade de ingredientes da dieta em juvenis de pirarucu (Arapaima gigas). II. Universidade Nilton Lins.
CDU 639.3.043
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Sinopse: Estudou-se a influência da adição de enzimas exógenas
sobre a digestibilidade de dietas, contendo dois ingredientes
alternativos, farinha de carne e ossos e farinha de vísceras de aves,
Tabela 4. Dietas experimentais dos diferentes tratamentos utilizando ingredientes
semipurificados e o ingrediente teste (FVA= farinha de vísceras de aves e FCO =
farinha de carne e ossos), com e sem adição de enzimas exógenas..........................
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Tabela 5. Variáveis físicas e químicas da água dos tanques monitorados durante
todas as fases experimentais. FVA= farinha de vísceras de aves e FCO = farinha de
carne e ossos. Média ± desvio padrão....................................................................
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Tabela 6. Coeficiente de digestibilidade aparente (%) da matéria seca (MS), extrato
etéreo (EE), proteína bruta (PB), extrato não nitrogenado (ENN) e energia bruta
(EB) das dietas com 30% de farinha de vísceras de aves (FVA) e farinha de carne e
ossos (FCO), com níveis crescentes de protease e lipase exógenas, para juvenis de
pirarucu. Média ± desvio padrão.............................................................................
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Tabela 7. Coeficientes de digestibilidade aparente (CDA%) da matéria seca (MS),
matéria mineral (MM), extrato etéreo (EE), proteína bruta (PB) e energia bruta (EB)
da farinha de vísceras de aves e farinha de carne e ossos, com níveis crescentes
de protease e lipase exógenas, para juvenis de pirarucu. A dieta 0 (controle) é sem
enzima exógena. Média ± desvio padrão.....................................................................
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Cenário da aquicultura
A aquicultura é a atividade de produção animal que vem crescendo, cada vez
mais, no mundo inteiro (FAO, 2012). No ano de 2010, houve um recorde na produção,
com cerca de 60 milhões de toneladas de produtos oriundos da aquicultura. Segundo a
FAO (2012), durante o período de 2012 a 2021, o comércio mundial de peixe para
consumo humano deverá se expandir até 25 %. Neste cenário, os países da América
do Sul vêm ganhando força na produção aquícola, destacando-se o Brasil e o Peru,
como os dois países emergentes.
De acordo com as estatísticas do Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA,
2012), no ano de 2010 houve um incremento significativo desta atividade no Brasil.
Entre os anos de 2008 e 2010, a produção passou de 365.366 t para 479.398 t, um
incremento de 31,2% (MPA, 2012). Em 2010, a região que mais contribuiu com a
produção nacional foi o sul, com 133.425,1 t, seguida pelas regiões Nordeste, Sudeste,
Centro-Oeste e Norte com 78.578,5 t, 70.915,2 t, 69.840,1 t e 41.581,1 t
respectivamente.
Dentre as espécies mais produzidas no Brasil, destacam-se, em ordem
crescente, a tilápia (Oreochromis niloticus), a carpa (Cyprinus carpio) e o tambaqui
(Colossoma macropomum), que atingiram elevados índices entre 2008 e 2010, o que
faz da piscicultura a modalidade mais representativa da aquicultura brasileira, com
cerca de 83,3% da produção nacional (MPA, 2012). A distribuição da produção
aquícola, entre as regiões brasileiras, depende não somente dos fatores climáticos
específicos de cada área geográfica, como também, das espécies de peixe que melhor
se adaptam às condições ambientais da região (Sebrae, 2012).
O Tambaqui (C. macropomum) e o matrinxã (Brycon amazonicus) são as duas
espécies mais cultivadas na região Norte. Somente no estado do Amazonas, de cada
cinco tambaquis consumidos na cidade de Manaus, quatro são provenientes da
aquicultura (Dairiki e Silva, 2011). Este é o estado com maior consumo per capita do
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Brasil, com 30 kg/hab./ano (Gandra, 2010), comparado com a média brasileira que é de
9,75 kg/hab./ano (MPA, 2012).
Atualmente, além destas duas espécies, o pirarucu, Arapaima gigas, um peixe
endêmico da região amazônica, vem demonstrando grande potencial para a
piscicultura brasileira. É previsto que nos próximos anos, a ictiofauna brasileira passará
a contribuir, fortemente, com o desempenho nacional da aquicultura (Kubitza et al.,
2007; Ono, 2011; MPA, 2012). Para isto, grandes investimentos em pesquisas vêm
sendo feitos, o que deverá gerar novas tecnologias de produção para espécies com
potencial como o pirarucu.
1.2 Pirarucu (Arapaima gigas)
O pirarucu, um Osteoglossiforme da família Arapaimatidae, distribui-se entre os
afluentes da margem esquerda dos rios Solimões e Amazonas, da bacia hidrográfica
dos rios Araguaia-Tocantins, além dos países da América do Sul, tais como, Peru,
Colômbia, Equador e Guianas. Esta espécie é o maior exemplar da ictiofauna de águas
interiores do Brasil, podendo alcançar cerca de 3 m de comprimento e 200 kg de peso
vivo (Sebrae, 2010a; Ono, 2011). Atualmente, o pirarucu vem atraindo a atenção dos
piscicultores e empresas aquícolas de todo o Brasil, devido seu rápido crescimento e
ganho de peso, podendo alcançar até 10 kg de peso vivo no primeiro ano de cultivo, e
sua aceitação no mercado nacional e internacional (Pereira-Filho et al., 2003; Ono et
al., 2004; Ono, 2005; 2011; Sebrae, 2010a).
Durante seu processo evolutivo, esta espécie desenvolveu um conjunto de
adaptações anatômicas, fisiológicas, comportamentais e metabólicas específicas para
adaptar-se aos ambientes aquáticos tropicais amazônicos. A modificação da bexiga
natatória é um exemplo, pois a vascularização deste órgão torna possível a respiração
aérea do pirarucu, a cada 5 a 15 minutos, sendo esta uma característica importante em
ambientes com baixos níveis de oxigênio na água (Ono et al., 2004; Ono, 2005; 2011;
Marmontel, 2006; Castello, 2008).
A maturidade sexual ocorre com, aproximadamente, 5 anos de idade, tendo um
comportamento reprodutivo que inclui formação de casais monogâmicos, construção
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de ninhos e cuidado parental dos ovos e da prole. (Marmontel, 2006). Com o início da
enchente, o macho e a fêmea constroem ninhos no leito das margens alagadas, onde a
fêmea deposita os ovos e o macho os fertiliza. A eclosão ocorre, aproximadamente,
uma semana após o depósito, e o macho cuida da prole por cerca de três meses nas
florestas alagadas e abundantes em alimento (Arantes, 2009).
Em ambiente natural, o pirarucu alimenta-se, na fase juvenil, principalmente, de
pequenos insetos e detritos orgânicos (Piatam, 2008), sendo, na idade adulta,
essencialmente, carnívoro, alimentando-se de peixes menores (Oliveira et al., 2005).
Atualmente, no estado do Amazonas, sua comercialização é proibida, no
período de defeso reprodutivo (1º de dezembro a 31 de maio), respaldada pela Portaria
Nº 08, da gerência estadual do IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos
Recursos Naturais Renováveis) de 1996, devido às evidências sobre a diminuição dos
estoques desta espécie a cada ano. Essa proibição estadual se complementa à
Instrução Normativa Nº. 01, de 1º de junho de 2005, do IBAMA, que proíbe por mais
seis meses, o transporte, armazenagem e comercialização desta espécie, em toda a
região amazônica, sendo, portanto, sua captura proibida o ano todo.
Esta portaria não abrange as áreas de produção em cativeiro e de pesca
manejada, que são no total de nove, autorizadas pelo IBAMA, em distintos municípios
do estado como, por exemplo, as Reservas de Desenvolvimento Sustentável de
Mamirauá e Amanã, e o Parque Nacional do Jaú (Amazonas) (Marmontel, 2006; IDSM,
2011). Porém, a pesca continua sendo feita, permanentemente, de forma ilegal
(Arantes, 2007).
Uma alternativa seria a produção desta espécie em cativeiro, cujo potencial
zootécnico tem apresentado resultados positivos (Sebrae, 2010b; Ono, 2011). Um
levantamento de mercado realizado pelo Sebrae (Rondônia e Acre), em várias cidades
brasileiras, indicou grande aceitação do pirarucu de cativeiro (Kubitza et al., 2007; Ono,
2011), cuja produção passou de 7,4 para 10,4 toneladas, entre os anos de 2008 e 2010
(MPA, 2012), expandido-se por diferentes regiões do país (Sebrae, 2010b).
Apesar dos avanços no cultivo do pirarucu, existem dificuldades tecnológicas
quanto a sua reprodução artificial, que representa um desafio para sua criação, pois
afeta diretamente a produção de alevinos, que depende, ainda, da reprodução natural
deste peixe em cativeiro (Ono, 2011). Além disso, deve-se observar as questões
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relacionadas à nutrição do pirarucu, uma vez que peixes carnívoros exigem altas taxas
de proteína na dieta (Ono e Oliveira, 2008; Castillo, 2012). Ono e Oliveira (2008)
observaram que o pirarucu é uma espécie que aceita bem as rações ofertadas, e
considerando o teor de proteína bruta, que varia de 40 a 45 % (Sebrae, 2010a; Castillo,
2012), obtém-se resultados de desempenho produtivo satisfatórios.
1.3 Nutrição de peixes carnívoros
A nutrição e a alimentação são dois fatores importantes na aquicultura, pois
influenciam no crescimento, na reprodução e na saúde dos organismos cultivados (Lall
e Tibbetts, 2009). Sussel (2008) resalta que existe uma diferença básica entre estes
dois fatores, apesar de serem relacionados entre si. A alimentação está relacionada à
forma e ao tipo de alimento ingerido e a nutrição, especificamente, ao conteúdo em
nutrientes e energia deste alimento.
Em condições de cultivo, o conhecimento sobre características biológicas
(Silveira et al., 2009) e fisiológica digestiva (Hardy, 2011) da espécie é necessário, pois
o alimento natural, neste ambiente, é escasso, sendo essencial o fornecimento de uma
dieta nutricionalmente completa e balanceada para uma produção zootécnica mais
eficiente (Silveira et al., 2009; Hardy, 2011).
O hábito alimentar é uma característica importante no cultivo de peixes, pois
pode afetar o seu desempenho produtivo, devido o aproveitamento dos nutrientes das
dietas (NRC, 1993; Gatlin III, 2010). Peixes carnívoros aproveitam melhor os alimentos
de origem animal, necessitando de conteúdo proteico elevado na ração, quando
criados em cativeiro (Kubitza, 2004; Ribeiro et al., 2010), e isto reflete a estrutura
adaptativa de seu trato digestório, caracterizada por um intestino curto (Rotta, 2003;
Boscolo et al., 2011).
As proteínas são nutrientes indispensáveis para o desenvolvimento das
funções vitais dos organismos vivos, e precisam ser disponibilizadas nas dietas (NRC,
1993; Carvalho, 2011).
A farinha de peixe é o componente das rações, que possui o perfil de
aminoácidos mais próximo das necessidades dos peixes e camarões cultivados,
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representando a principal fonte proteica de origem animal, além de ter elevada
palatabilidade e valor nutricional de qualidade. Contudo, nem sempre é possível
usufruir da qualidade nutritiva desse ingrediente (Hardy, 2006), visto que existe uma
grande variação na qualidade dos produtos de origem animal, devido ao tipo de
processamento os quais são submetidos (Teixeira et al., 2006; Eyng et al., 2009).
Os elevados preços deste ingrediente, associados à dificuldade em se obter
uma farinha de peixe de valor biológico comprovado, causam um impacto sobre os
custos de produção em sistemas intensivos de criação (Sucasas, 2011). Pesquisas têm
sido realizadas, visando a substituição total ou parcial da farinha de peixe em dietas
para peixes carnívoros, com resultados favoráveis (Oliveira, 2003; Fonseca, 2004; Silva
et al., 2008; Fabregat et al., 2011).
Em geral, os custos com alimentação em cultivo intensivo de peixes são muito
elevados (Kubitza, 2009), por isso, são conduzidos estudos com a finalidade de reduzi-
los, tornando a atividade mais rentável. A inclusão de alimentos alternativos nas
formulações das dietas para peixes pode ser uma saída importante para o futuro da
aquicultura mundial (Pascoal et al., 2006; Glencross et al., 2007; Finkler et al., 2010;
Sucasas, 2011; Oujifard et al., 2012). Desta forma, a inclusão de farinha de peixe,
deverá funcionar apenas para equilibrar o balanço aminoacídico das dietas, suprindo a
ausência de algum constituinte importante para o crescimento dos peixes (Carvalho,
2011; Sucasas, 2011).
1.4 Ingredientes alternativos de origem animal
Alguns ingredientes de origem animal, utilizados como matéria-prima para a
fabricação de rações, apresentam alto teor proteico, ácidos graxos, minerais e
vitaminas bem balanceados. No entanto, podem ter composição variada em gorduras,
cinzas e aminoácidos, afetando o desempenho produtivo dos peixes (Pezzato et al.,
2002; Signor, 2010), uma vez que uma ração é tão boa quanto os seus ingredientes
(Glencross, 2007).
Farinha de vísceras de aves, um subproduto da indústria abatedoura,
representa um importante componente das rações destinadas à piscicultura (Signor et
al., 2007). Seus níveis proteicos podem variar entre 55 a 68 %, porém, são deficientes
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dos aminoácidos essenciais metionina, lisina e triptofano (Faria et al., 2002). É
considerada uma boa alternativa para substituir a farinha de peixe em rações para
espécies carnívoras.
Segundo Oliveira (2003) e Boscolo et al. (2005), a farinha de vísceras de aves
é uma fonte proteica de boa digestibilidade, padrão em aminoácidos adequado e alta
disponibilidade de fósforo. Finkler et al. (2010) avaliaram o desempenho produtivo de
híbridos de piavuçu (Leporinus macrocephalus) e piapara (Leporinus elongatus),
quando submetidos a dietas com diferentes níveis de inclusão de farinha de vísceras
em substituição à farinha de peixe, e concluíram que a substituição é possível em até
50%, sem que haja prejuízo no desempenho e sobrevivência dos animais. Signor et al.
(2007), avaliando a inclusão de farinha de vísceras na alimentação de juvenis de
piavuçu, verificaram que, sob as condições experimentais testadas, o nível de 20% de
inclusão, melhorou o desempenho dos peixes. Faria et al. (2002), ao incluírem nas
dietas de tilápias a farinha de vísceras de aves, com a finalidade de avaliar o
desempenho zootécnico, características de carcaça e digestibilidade, concluíram que, a
inclusão de 20% do ingrediente resultou num melhor desempenho dos peixes.
A farinha de carne e ossos é outro ingrediente alternativo de origem animal de
destaque nas formulações de rações para peixes (Kubitza, 2007; 2009). Dos
subprodutos de abatedouro, é o que apresenta alto valor proteico, porém, é
considerado um ingrediente de baixa qualidade biológica, quando comparado à farinha
de peixe (Pezzato et al., 2002; Campestrini, 2005a).
O Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), por meio da
Instrução Normativa Nº 34 de 28/05/2008, enfatizado por Eyng et al. (2011), estabelece
os critérios para obtenção da farinha de carne e ossos e define sua composição. Deve
conter ossos e resíduos de tecidos dos animais, estando livres de cascos, chifres,
pêlos, conteúdo estomacal e sangue. Campestrini (2005a) ressalta que os resíduos
contidos nas farinhas devem ser observados minuciosamente, pois, dependendo de
suas proporções, podem alterar a digestibilidade pelos peixes.
Bureau et al. (2000) testaram a inclusão de farinha de carne e ossos nas
rações para truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), e obtiveram resultados positivos
sobre o desempenho zootécnico desta espécie. Graeff e Serafini (2012) avaliando o
desempenho zootécnico de carpas (Cyprinus carpio) submetidas à alimentação com
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substituições de farelo de soja por farinha de carne e ossos, observaram desempenho
satisfatório dos peixes. Signor et al. (2010) afirma que a farinha de carne e ossos pode
ser incluída nas dietas de tilápias, em até 15 %, e que o aumento de inclusão é
proporcional ao aumento do comprimento padrão dos peixes. Lazzari et al. (2007)
avaliaram a utilização de diferentes ingredientes na alimentação de jundiá (Rhamdia
quelen), dentre eles, a farinha de carne e ossos, que mostrou-se eficiente como
substituto da farinha de peixe em rações para juvenis desta espécie.
Apesar dos bons resultados obtidos com a utilização desses subprodutos nas
rações para peixes, ainda há possibilidade de melhorar a digestibilidade destes
compostos, buscando máximo aproveitamento dos nutrientes, com a suplementação de
enzimas exógenas.
1.5 Uso de enzimas exógenas nas rações
A nutrição animal tem se beneficiado, de forma significativa, dos avanços da
engenharia genética no mundo inteiro. A manipulação de enzimas exógenas, com
funções específicas no aproveitamento de nutrientes, principalmente pelos animais
monogástricos, possibilita maior aplicação dos ingredientes utilizados nas formulações
de rações para peixes (Araújo et al., 2007; Stech, 2009b).
O hábito alimentar de uma espécie influencia, diretamente, a ação enzimática,
sobre o alimento ingerido e a forma de aproveitamento dos nutrientes da dieta
fornecida. Isso ocorre, porque o valor nutricional de um alimento não depende apenas
do seu teor de nutrientes, mas também da habilidade do animal em digerir e assimilar
os nutrientes (Santos 2007; Gatlin III, 2010).
As enzimas são proteínas com função catalisadora, acelerando,a velocidade
natural das reações químicas das células, fazendo com que estas ocorram com a
rapidez que a célula exige. Como qualquer catalisador, a enzima também permanece
intacta durante a reação química, podendo ser recuperada ao final, já que não é
consumida durante a reação (Sartori, 1999; Kieling, 2002; Campestrini et al., 2005b).
A inclusão de enzimas digestivas exógenas em rações para peixes é de
interesse para o setor aquícola (Silva et al., 2007; Caruso et al., 2009). Apesar das
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dificuldades tecnológicas, devido à baixa estabilidade ao calor, decorrentes dos
processos utilizados para a produção de rações para organismos aquáticos
(peletização e extrusão), a prática de adição de enzimas às dietas, para fins
experimentais, é uma realidade não só no Brasil, mas em países da Europa (Freitas et
al., 2000; Stech, 2009b; Yildirim e Turan, 2010).
As enzimas exógenas aumentam a digestibilidade e a eficiência dos alimentos,
reduzindo a ação de inibidores de crescimento, sobretudo os polissacarídeos não
amiláceos (PNA’s), ajudando as enzimas endógenas nos processos digestivos
(Lecznieski, 2006; Sinha et al., 2011). Esses polissacarídeos, ou fibras não amiláceas,
representam um problema para os animais, pois, quando não digeridos, aumentam a
viscosidade do quimo intestinal, causando prejuízos em seu desempenho produtivo
(Brito et al., 2008).
De acordo com a sua finalidade, as enzimas usadas em rações para
monogástricos podem ser de dois tipos: enzimas destinadas a complementar,
quantitativamente, as próprias enzimas digestivas endógenas dos animais (proteases,
amilases, fitases, etc.) e enzimas que esses animais não podem sintetizar (β-
glucanases, pentosanases e α-galactosidases) (Henn, 2002; Araújo et al., 2007).
O uso de aditivos enzimáticos, em rações para peixes carnívoros, tem
proporcionado resultados positivos, sob condições experimentais, em relação ao
melhor aproveitamento dos nutrientes pelo organismo animal (Soares, 2008). Apesar
de não possuírem função nutricional direta, como descreve Campestrini et al. (2005b),
o processo digestivo nos peixes melhora a digestibilidade dos nutrientes presentes na
dieta.
Dentre as enzimas exógenas mais utilizadas na nutrição de espécies
herbívoras e onívoras, destaca-se a fitase, cuja função específica é hidrolisar a
molécula de ácido fítico dos ingredientes de origem vegetal (Henn, 2002; Bock et al.,
2006, Ai et al., 2007). Para espécies carnívoras, faz-se uso de outras enzimas, sendo
protease e lipase as mais utilizadas (Lecznieski, 2006).
As enzimas proteolíticas, proteases, proteinases ou peptidases são sinônimos
para as enzimas que hidrolisam ligações peptídicas. Em animais aquáticos, tripsina,
quimiotripsina e elastase, que atuam em grupamentos lisina ou arginina, fenilalanina e
elastina respectivamente, compreendem, entre os teleósteos, as proteases do trato
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digestivo. São as mais citadas e estudadas nessa família (Bezerra et al., 2001; Amorim
et al., 2011). Soares et al. (2008) adicionaram protease exógena e avaliaram sua
influência sobre o aproveitamento dos nutrientes numa dieta elaborada com
ingredientes de origem vegetal, por meio do desempenho de juvenis de tucunaré
(Cichla sp.). Esses autores observaram melhoras significativas nos índices de
conversão alimentar, ganho de peso e crescimento específico dos peixes.
Segundo Silva (2005) e Gonçalves (2007), as lipases (triacilglicerol éster
hidrolases) são enzimas que catalisam, entre outras reações, a hidrólise das ligações
éster de lipídios, gerando álcoois e ácidos graxos. Essas têm considerável importância
fisiológica e industrial, constituindo um dos grupos biocatalizadores mais relevantes,
com aplicação biotecnológica. Cavero (2004), avaliando o efeito da adição de protease
e lipase exógenas na ração para juvenis de pirarucu, concluiu que essas enzimas
influenciaram o desempenho zootécnico dos animais e que a lipase exógena, nas
rações, potencializou a digestão dos lipídios, disponibilizando energia não-protéica.
Silva et al. (2007) estudaram a suplementação de dietas, com um complexo
multienzimático, contendo lipase, para juvenis de tambaqui, e puderam concluir que
houve um incremento na digestibilidade aparente das rações, aumentando o
aproveitamento dos nutrientes e energia bruta desta forma.
1.6 Digestibilidade de nutrientes em dietas para peixes
Em estudos de nutrição animal, os coeficientes de digestibilidade aparente são,
geralmente, utilizados com o objetivo de determinar o valor nutricional de um alimento
(Gonçalves e Carneiro, 2003). Segundo o NRC (1993), a digestibilidade é definida pela
biodisponibilidade de nutrientes ou de energia para a alimentação de peixes. Tucker e
Hargreaves (2004) afirmam que os coeficientes de digestibilidade são um indicador do
valor biológico de um ingrediente.
A digestibilidade abrange dois processos: a digestão, que corresponde à
hidrólise das moléculas complexas dos alimentos, e a absorção de pequenas
moléculas como aminoácidos e ácidos graxos, ocorrendo no intestino dos peixes
(Santos, 2007).
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É necessário quantificar os coeficientes de digestibilidade dos nutrientes e
energia dos ingredientes de uma dieta, para que seja otimizado o aproveitamento de
nutrientes, bem como, minimizar as perdas de nitrogênio e fósforo para o ambiente.
(Oliveira et al., 2008; França- Segundo, 2009).
Segundo Bomfim e Lanna (2004), alguns fatores que influenciam a
digestibilidade aparente dos alimentos para peixes são: metodologia empregada na
determinação dos coeficientes, espécie e idade do peixe, composição da dieta,
temperatura da água e processamento do alimento.
Além desses aspectos, existe uma classificação destacada por Martínez
(1993), na qual divide esses fatores em duas categorias: aqueles relacionados
diretamente ao peixe – condições ambientais a que estão submetidos, estado
fisiológico e tamanho – e aqueles em que o alimento fornecido é o foco – tamanho da
partícula e quantidade ingerida.
Por outro lado, o tipo de alimento ingerido, a atividade das enzimas digestivas e
o tempo de exposição às enzimas endógenas, no trato digestório do peixe influenciam
a digestibilidade aparente (Gatlin III, 2010), visto que as enzimas digestivas variam com
o hábito alimentar e a composição da dieta das diferentes espécies (Cyrino et al.,
2010).
O NRC (1993) define dois métodos principais para determinar os coeficientes
de digestibilidade aparente em peixes: método direto e indireto. Segundo Santos
(2007), o método direto apresenta duas dificuldades que limitam sua aplicação, que
são os cálculos de todo alimento ingerido e de todo material fecal, correspondente à
dieta devidamente ingerida. Ainda é uma metodologia aberta a discussões, já que, de
acordo com o NRC (1993), os peixes podem ser comprometidos, fisiologicamente,
devido à imobilização a que são submetidos, para a coleta de fezes. Por sua vez, o
método indireto envolve a utilização de um marcador não digerível, que é incluído na
dieta alimentar nas proporções de 0,5 a 1,0 %. Sendo o marcador mais comumente
utilizado, o óxido de cromo (NRC, 1993). O uso de óxido de cromo (Cr2O3) como
indicador externo inerte possibilita a utilização de água corrente, uma vez que as
perdas de fezes podem ser calculadas, proporcionando significativa redução no
estresse (Klontz, 1995 apud Vidal Jr. et al., 2004). Nesse método, não é necessária
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mensuração de todo o alimento ingerido e nem a coleta total de material excretado
(Santos, 2007).
A coleta de fezes é feita de forma parcial, por meio de um sistema, denominado
Guelph modificado, que consiste de um aquário cilíndrico de fibra de vidro e fundo
cônico. O abastecimento de água é contínuo e superior, enquanto o escoamento de
água ocorre por meio de um cano lateral, que conduz o excedente de água para fora
do cone (Lima e Ludke, 2011).
Pesquisas voltadas para a determinação dos coeficientes de digestibilidade do
pirarucu ainda são incipientes. Ono et al. (2008) avaliaram a digestibilidade aparente de
nutrientes e energia de dietas para juvenis de pirarucu, testando oito dietas, com quatro
relações de energia digestível por grama de proteína bruta (ED:PB), 11; 10,1; 9 e 8
kcal/g, e concluíram que esta relação influencia diretamente na digestibilidade dos
macronutrientes das dietas. Segundo Souza (2007), a melhor relação ED:PB na dieta
para juvenis de pirarucu é de 9 kcal/g. Fonseca (2004) avaliou a digestibilidade de
juvenis de pirarucu, submetidos a dietas com substituição de farinha de peixe por
proteína de origem vegetal, com e sem adição de protease exógena, e concluiu que a
substituição até 60% não afetou a digestibilidade aparente dos nutrientes, e que, a
adição da enzima não influenciou a digestibilidade nas dietas. Castillo (2012) estudou a
exigência proteica na alimentação de juvenis de pirarucu, avaliando desempenho
zootécnico e digestibilidade das dietas, e concluiu que o nível ótimo de proteína bruta
na dieta para obtenção do máximo desempenho, em boas condições fisiológicas, foi de
44,9 %.
Assim, pelo exposto, e devido a importância do pirarucu para a aquicultura
brasileira, o presente estudo pretende contribuir com as informações sobre os aspectos
nutricionais desta espécie, avaliando fontes alternativas de proteína animal de baixo
valor biológico, associadas à utilização de aditivos enzimáticos.
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2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar a eficácia das enzimas exógenas, protease e lipase, como aditivos na
dieta de pirarucus, a fim de melhorar a digestibilidade de ingredientes de baixa
qualidade proteica.
2.2 Específicos
Determinar os coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes e
energia de dietas contendo farinha de vísceras de aves (com e sem adição de enzimas
exógenas, protease e lipase).
Determinar os coeficientes de digestibilidade aparente (CDA’s) dos nutrientes
e energia da dieta referência para obtenção dos CDA’s dos ingredientes testados.
Determinar os coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes e
energia de dietas contendo farinha de carne e ossos (com e sem adição de enzimas
exógenas, protease e lípase).
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3. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi realizado nas dependências da Estação Experimental de
Piscicultura da Coordenação de Tecnologia e Inovação (COTI) do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus-AM.
3.1 Dietas experimentais
As dietas experimentais foram elaboradas de acordo com a metodologia de
Bureau (2006), compostas por 70% de produtos purificados (dieta referência) e 30% do
ingrediente-teste (Tabela 1). Os ingredientes purificados foram cuidadosamente
manuseados, sendo misturados ao Premix vitamínico/mineral e ao óxido de cromo
(Cr2O3), que funcionou como marcador externo para avaliar a digestibilidade das
rações. Dessa forma, caracterizando o método indireto de determinação do Coeficiente
de Digestibilidade Aparente (CDA), descrito pelo NRC (1993).
Uma vez que dietas purificadas são pouco palatáveis para peixes, o que pode
reduzir o consumo e o ganho de peso, é recomendável a adição de algum ingrediente
como a farinha de peixe, óleo de peixe, etc (NRC, 1993). Estas dietas, acrescidas de
ingredientes menos padronizados, são chamadas de semipurificadas. Neste estudo
foram acrescidos: óleo de canola e gordura de aves (Tabela 1).
Os ingredientes foram misturados e peletizadas num moedor de carne (marca
CAF modelo 22-S), e os pellets formados foram secos a 40 ºC, por 24 h, em estufa de
ventilação forçada, e armazenados em sacos plásticos, devidamente limpos, até sua
utilização.
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Tabela 1. Composição da dieta referência (%) utilizada na elaboração das dietas experimentais.
Ingrediente Dieta referência (%) Dietas
experimentais (%)
Caseína 44,0 -
Gelatina 10,5 -
Dextrina 20,0 -
Carboximetil celulose 2,0 -
Celulose 12,0 -
Premix vitamínico/mineral1 1,0 -
Marcador externo2 0,5 -
Óleo de canola 5,0 -
Gordura de aves 5,0 -
Dieta referência 70
Ingrediente avaliado 30
Total 100 100
1 Enriquecimento de microminerais e vitaminas em mg/kg de ração: manganês (26); zinco (140); ferro
(100); cobre (14); cobalto (0,2); iodo (0,6); selênio (0,6), Vit. A (10.000 UI); Vit D3 (4.000 UI); Vit E (100 mg); Vit K (5 mg); Vit B1 (25 mg); Vit B2 (25 mg); Vit B6 (25 mg); Vit B12 (30 mg); niacina (100 mg); ácido fólico (5 mg); ácido pantotênico (50 mg); biotina (0,8 mg); colina (2000 mg ); inositol (50 mg); Vit C (350 mg). 2 Foi utilizado o óxido de cromo (Cr2O3).
A composição centesimal das dietas experimentais foi determinada no
Laboratório de Nutrição de Peixes da COTI/INPA, conforme metodologia descrita pela
A.O.A.C (2000), para proteína bruta (PB), por meio do método de micro-Kjeldahl,
extrato etéreo ou fração lipídica (EE), pelo método de Soxhlet, e Cinza (CZ),
determinada em amostras incineradas. A Umidade (UM) das rações foi determinada
submetendo a amostra à temperatura de 105° C até peso constante. O extrato não-
nitrogenado ou carboidratos solúveis (ENN) foi obtido segundo a equação: ENN% =
100 – (%UM + %PB + %FB + %EE + %CZ).
Os experimentos foram realizados em três fases. Na 1ª fase, foi elaborada a
dieta referência, isenta de farinha de vísceras de aves/farinha de carne e ossos, a fim
de obter o coeficiente de digestibilidade aparente desta, sem a influência destes
ingredientes, assim como das enzimas exógenas lipase e protease. Para as fases
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subsequentes, foram elaboradas as dietas experimentais, na proporção 70:30 (70% de
produtos purificados e 30% de ingrediente-teste), cujas composições centesimais estão
demonstradas nas Tabelas 2 (2ª fase) e 3 (3ª fase).
Tabela 2. Composição centesimal das dietas experimentais, dieta referência e da
farinha de vísceras de aves (FVA). Matéria seca (MS), Cinzas (CZ), proteína bruta
(PB), extrato etéreo (EE), Umidade (UM), extrato não nitrogenado (ENN) e energia
As coletas de fezes foram realizadas 30 minutos após a alimentação, com
horários pré-estabelecidos. As fezes foram coletadas, cuidadosamente, para que não
houvesse contaminação por sobras de ração, evitando interferências nos resultados da
análise. Por decantação, as fezes eram depositadas em tubos coletores e, em seguida,
congeladas até o final do período experimental, onde eram liofilizadas e,
posteriormente, utilizadas para as análises bromatológicas.
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3.3 Coeficientes de Digestibilidade Aparente (CDA) da ração
A análise da composição centesimal das amostras (umidade, proteína bruta,
extrato etéreo, extrativo não nitrogenado e matéria mineral), de cada uma das dietas
experimentais e das fezes coletadas, correspondentes às 15 dietas avaliadas (a
dieta-referência e as 14 contendo o ingrediente-teste), foi realizada segundo
metodologia descrita pela A.O.A.C. (2000). A energia bruta dos ingredientes e das
fezes foi estimada com base em valores de energia obtidos pela NRC (1993), onde
as proteínas, extrato etéreo e carboidratos apresentam valores de 5,64; 9,44, e 4,11
kcal/g respectivamente.
Os coeficientes de digestibilidade aparente da matéria seca, proteína bruta,
gordura, extrativo não nitrogenado, e energia das dietas foram calculados pelo
método proposto por Bureau et al. (1999), utilizando-se, como marcador inerte, o
óxido de cromo (Cr2O3) nas rações.
O cálculo do valor dos coeficientes de digestibilidade aparente (CDA’s) da
matéria seca (MS), energia e dos macro e micronutrientes (Nutr.) foi realizado de
acordo com as seguintes equações descritas por Bureau et al. (1999) e Forster,
(1999):
CDAingrediente = [CDAteste x Dteste x (0,7 x MSref + 0,3 x MSingr) – (0,7 x Dref x
CDAref)] / (0,3 x Dingr)
Onde:
CDAingrediente = Coeficiente de digestibilidade aparente do ingrediente testado;
CDAteste = Coeficiente de digestibilidade aparente da ração teste;
Dteste = % de nutriente ou energia da ração teste com base em matéria seca.
MSref = Matéria seca da ração de referência;
MSingr = Matéria seca do ingrediente testado;
Dref = % de nutriente ou energia da ração teste com base em matéria original;
CDAref. = Coeficiente de digestibilidade aparente da ração de referência;
Dingr = % de nutriente ou energia do ingrediente testado com base em matéria
original.
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Para o cálculo dos CDA’s da ração teste e ração de referência foram utilizadas
as seguintes equações, após a determinação das concentrações do marcador inerte
(Cr2O3):
CDAteste = 100 x [1 - (%Cr2O3 dieta / %Cr2O3 fezes) x (%nutriente fezes /
%nutriente ração teste)].
CDAref = 100 x [1 - (%Cr2O3 dieta / %Cr2O3 fezes) x (%nutriente fezes /
%nutriente ração de referência)]
3.4 Qualidade de água
Foram monitoradas, durante toda a fase experimental, as variáveis físicas e
químicas da água: temperatura, condutividade, oxigênio dissolvido, pH, utilizando
sondas multiparamétricas da YSI, sendo determinados diariamente. As
concentrações de amônia total (NH3 + NH4+) (mg/L) e nitrito(NO2-) (mg/L) pelos
métodos colorimétricos de Verdouw et al. (1978) e Boyd e Tucker (1992)
respectivamente, alcalinidade total e dureza total (mg CaCO3 /L) por titulação
descrita por Boyd e Tucker (1992) e gás carbônico (mg/L) segundo Boyd e Tucker
(1992) modificado, sendo todas estas análises realizadas semanalmente.
3.5 Análises Estatísticas
Os dados de digestibilidade e das variáveis físicas e químicas da água foram
submetidos à ANOVA (Análise de Variância) pelo programa SAEG (Sistemas para
Análises Estatísticas e Genéticas), Versão 9.1, desenvolvido pela Universidade
Federal de Viçosa (2007) e as médias dos tratamentos quando diferentes, foram
submetidas ao teste de Tukey ao nível de 5% de significância.
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Durante todas as fases experimentais, as variáveis físicas e químicas da água
permaneceram constantes, estando dentro dos limites aceitáveis para peixes
tropicais (Kubitza, 2003) e para esta espécie (Ono, 2011). Os valores médios estão
representados na Tabela 5.
Tabela 5. Variáveis físicas e químicas da água dos tanques monitorados durante todas as fases experimentais. FVA= farinha de vísceras de aves e FCO = farinha de carne e ossos. Média ± desvio padrão.