III-3. Fotossíntese

Grupo 1:

Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243

Bioquímica Experimental II, PL2, 2011/2012, Professor: Carlos Farinha

Objectivos

DQB-Licenciatura em Bioquímica 2

• Testar a libertação de dioxigénio pelos cloroplastos isolados usando

oxidantes de Hill;

• Medir o transporte electrónico fotossintético utilizando a autoxidação

de um aceitador terminal de electrões (viologénio de metilo);

• Ensaio espectrofotométrico da reacção de Hill;

• Determinação do conteúdo de clorofila dos cloroplastos.

Resumo


Isolamento dos cloroplastos

Ensaios usando oxidantes de Hill e

viologénio de metilo no eléctrodo de

oxigénio

Ensaio espectrofotométrico da

reacção de Hill

Determinação do conteúdo de

clorofila dos cloroplastos

Determinação do Conteúdo de

Clorofila dos Cloroplastos


Abs652 nm= 0,760

ε solução de acetona = 34,5 mg-1 mL cm-1

Abs = ε l c 0,760 = 34,5 × 1 × c ⇔

⇔ c = 0,022 mg mL-1

Em 0,2 mL de suspensão:

ci Vi = cf Vf

ci × 0,2 = 0,022 × 25 ⇔ ci = 2,75 mg mL-1

Em 25 mL de

acetona

Massa de Clorofila por Ensaio

5

No ensaio, são colocados:

1 mL de meio de reação

0,1 ou 0,050 mL de suspensão de cloroplastos

0,850 mL de água

cclorofila = 2,75 mg mL-1

Logo, em 0,1 mL de suspensão:

E em 0,050 mL de suspensão:

Concentração de

clorofila na suspensão suspensão

clorofila

clorofila V

m=c

mg 0,275=m⇔0,1

m=2,75 clorofila

clorofila

mg 0,138=m⇔0,050

m=2,75 clorofila

clorofila

Quantidade de oxigénio por quadrícula


[O2] (25ºC) = 0,253 µmol/mL

Logo, em 2 mL, a quantidade de oxigénio é:

µmol 0,506 =) n(O

2

) n(O=0,253

Vtotal

) n(O=][O

2

222

Dos 0 aos 100% de oxigénio encontram-

se 50 quadriculas:

50 quadrículas 0,506 µmol

1 quadrícula

50 q

uadrí

cula

s

x

quadrícula/ O de mol 012,1 2x

Adição de

Ditionito de

Sódio

Figura 1. Registo obtido pelo

eléctrodo de oxigénio

Reagentes de Hill

7

Reação de Hill: 222e

2 O2

1 +A H A +OH-

Reagentes de Hill

Aceitadores artificiais de

electrões

DCPIP

Ferricianeto

Figura 2. Estrutura molecular

do DCPIP

Figura 3. Estrutura molecular

do ferricianeto

Oxidantes de Hill

8

DCPIP

10 µL

DCPIP

20 µL

DCPIP 40 µL

DCPIP

40 µL

DCPIP

40 µL

DCPIP

+ 50 µL

DCMU

Sem

Luz

40 µL

DCPIP Figura 4. Registo obtido pelo eléctrodo de oxigénio para o DCPIP.

Oxidantes de Hill

9

Ensaios com DCPIP

Adição de 40µL de DCPIP

1 quadrícula 1012 nmol de O2

11 quadrículas

10 mm 1 minuto

7 mm

y

2O de nmol 1113y

xminutos 7,0=x

)(×Δ

)(=)(

2

clorofilamt

Onsefotossíntev

1-1-mgmin nmol 5782

275,07,0

1113)(

sefotossíntev

11 quad.

7 mm

Figura 5. Medição do declive

do DCPIP.

DCPIP – resultados obtidos

10

Ensaios V(adicionado)

/µL n(O2) /mol

Tempo

/min

v(fotossíntese) /

nmol min-1mg-1

DCPIP

10 303,6 0,5 2208

20 657,8 0,5 4784

40 1113 0,7 5783

50 DCMU + 40

DCPIP 1063 0,5 7728

• A velocidade de fotossíntese aumenta com o volume adicionado de DCPIP

• Ao adicionar DCMU não devia ocorrer formação de O2

Quadro 1. Registo dos resultados para o DCPIP

Oxidantes de Hill

11

Ferricianeto

10 µL

Ferricianeto

20 µL

Ferricianeto

40 µL

Ferricianeto

20 µL

Ferricianeto

40 µL

Ferricianeto +

50 µL DCMU

Figura 6. Registo obtido pelo eléctrodo de oxigénio para o ferricianeto.

Oxidantes de Hill

12

Ensaios com Ferricianeto

Adição de 40µL de Ferricianeto

1 quadrícula 1012 nmol de O2

13 quadrículas

10 mm 1 minuto

16 mm

y

2O de nmol 1316y

x

minutos 6,1=x

)(×Δ

)(=)(

2

clorofilamt

Onsefotossíntev

1-1-mgmin nmol 2990

275,06,1

1316)(

sefotossíntev

16 mm

13 quad.

Figura 7. Medição do declive do

ferricianeto.

Ferricianeto – resultados obtidos

13


/µL n(O2) /nmol Tempo /min

v(fotossíntese) /

nmol min-1mg-1

Ferricianeto

20 404,8 0,6 2450

40 1316 1,6 2990

50 DCMU + 40

ferricianeto 506,0 0,2 9200

• A velocidade de fotossíntese aumenta com o volume adicionado de

ferricianeto;

• Ao adicionar DCMU não devia ocorrer formação de O2

Quadro 2. Registo dos resultados para o ferricianeto

Comparação entre Ferricianeto e DCPIP

14


/µL

n(O2)

/nmol

Tempo

/min

v(fotossíntese) /

nmol min-1mg-1

DCPIP

10 mM

10 303,6 0,5 2208

20 657,8 0,5 4784

40 1113 0,7 5783

50 DCMU + 40

DCPIP 1063 0,5 7728

Ferricianet

o

10 mM

20 404,8 0,6 2450

40 1316 1,6 2990

50 DCMU + 40

ferricianeto 506,0 0,2 9200

Quadro 3. Comparação dos resultados entre o ferricianeto e o DCPIP


Ensaio espectrofotométrico

Reacção de Hill Quadro 4. Valores de absorvência registados



Figura 8. Gráfico correspondente ao ensaio 1, da absorvência

de DCPIP em função do tempo.

Declive



Figura 9. Gráfico correspondente ao ensaio 2, da absorvência de

DCPIP em função do tempo.

Declive



Figura 10. Gráfico correspondente ao ensaio 3, da absorvência de

DCPIP em função do tempo.

Média das absorvências:

Declive

𝑥 =0,0186 + 0,0228 + 0,0364

3

⇔ 𝑥 ≈ 0,0259



Cálculo da variação da concentração em função do tempo:

Lei de Lambert-Beer

Volume total dos reagentes que se adicionou na cuvette:

𝐴𝑏𝑠 = 𝑐𝜀𝑙 ⇔𝐴𝑏𝑠

𝑡=

𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃

𝑡𝜀𝑙 ⇔


𝑡=𝐴𝑏𝑠

𝑡×1

𝜀𝑙⇔

⇔[𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃]

𝑡= 0,0259 ×

1

16000×1⇔

[𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃]

𝑡≈ 1,62 × 10−6 M s-1

V = 1,5 + 0,020 + 1,4 + 0,050 = 2,97 mL



Número de moles de DCPIP reduzido por segundo:

Pela estequiometria da reacção de Hill:

𝑐 =𝑛

𝑉⇔


𝑡=𝑛𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃

𝑡×1

𝑉 ⇔

𝑛𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃𝑡

=𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃

𝑡× 𝑉 ⇔

⇔𝑛𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃

𝑡= 1,62 × 10−6 × 2,97 × 10−3 ⇔

𝑛𝐷𝐶𝑃𝐼𝑃

𝑡≈ 4,81 nmol s-1

⇔n=4,81×10-91×12⇔n≈2,40×10-9 mol ⇔ 2,40×10-9 mol s-1

DCPIP O2

1 mol — ½ ⇔

4,81 × 10-9 mol — 𝑛

𝑛 =4,81×10−9

1×

1

2⇔ 𝑛 ≈ 2,40 × 10−9 mol

⇔ 2,40 × 10−9 mol s-1



Cálculo da massa de clorofila:

𝐶𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 =𝑚𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎

𝑉⇔ 𝑚𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 = 𝐶𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 × 𝑉 ⇔

⇔ 𝑚𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 = 2,75 × 2,0 × 10−2 ⇔ 𝑚𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 ≈ 0,055 mg

V = 20 µL = 2,0 × 10-2 mL

[Clorofila] = 2,75 mg mL-1

Velocidade fotossintética:

𝑣 ≈1,44×10−7

0,055≈ 2,62 µmol min-1 mg-1


Comparação entre valores

Eléctrodo de oxigénio: v = > 5,78 µmol min-1 mg-1

Espectrofotometria: v = 2,62 µmol min-1 mg-1

VDCPIP/ μL v / µµol min-1 mg-1

10 2,21

20 4,78

40 5,78

Quadro 6. Volumes de DCPIP e respectivas velocidades – eléctrodo de oxigénio

Mesma ordem de grandeza

Valores em concordância

Viologénio de metilo (VM2+

)


• Aceitador terminal de electrões;

• Aceita electrões do PS I, ficando reduzido e obtém-se formação de O2 com a

estequiometria normal da reacção de Hill.

• No entanto, o O2 é consumido por outras duas reacções:

Autoxidação do viologénio de metilo:

𝟐𝑶𝟐 + 𝟐𝑽𝑴+ → 𝟐𝑽𝑴𝟐+ + 𝟐𝑶𝟐.−

Dismutação do radical superóxido:

𝟐𝑶𝟐.− + 𝟐𝑯+ → 𝑯𝟐𝑶𝟐 +𝑶𝟐

𝑯𝟐𝑶+ 𝟐𝑽𝑴𝟐+ → 𝟐𝑽𝑴𝟐+ + 𝟏 𝟐 𝑶𝟐 + 𝟐𝑯+


)


• Através da soma das 3 reacções anteriores obtém-se a estequiometria de

consumo de O2

Foi o que se registou no eléctrodo de oxigénio

𝑯𝟐𝑶+ 𝟏 𝟐 𝑶𝟐 → 𝑯𝟐𝑶𝟐

0,5 mol de O2 são consumidos por par de electrões transferidos

VM


)


• Cálculo das velocidades fotossintéticas

Foram feitos ensaios com diferentes quantidades de viologénio

de metilo até se registar uma estabilização no consumo de O2

De seguida, adicionou-se azeto de sódio

Inibe o catalase, evitando a

síntese de O2 através da

degradação do H2O2

Azeto de sódio


)


• 1º Ensaio

[O2]

/ m

ol

Vpapel / min

25 μL

VM

50 μL

NaN3

7 quadrículas

10 mm

100𝜇𝐿 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑝𝑙𝑎𝑠𝑡𝑜𝑠 = 0,1 𝑚𝐿

𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 = 2,75 𝑚𝑔 𝑚𝐿

𝑚 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 = 2,75 × 0,1 = 0,275 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎

7 𝑞𝑢𝑎𝑑𝑟í𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 = 7 × 1,012 × 10−8 = 70,84 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑂2 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜

Figura 11. Ensaio 1 do Viologénio de Metilo.


)


10 𝑚𝑚 − 1 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜 10𝑚𝑚 − 𝑥

𝑥 = 1 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜

Num minuto consome-se 70,84 nmol de O2

𝑣 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑠𝑠𝑖𝑛𝑡é𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑉𝑀 =70,84

0,275= 258 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑂2𝑚𝑖𝑛−1𝑚𝑔−1

𝑣 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑠𝑠𝑖𝑛𝑡é𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑁𝑎𝑁3 = 293 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑂2𝑚𝑖𝑛−1𝑚𝑔−1


)


Aumento do volume

de viologénio de

metilo (aceitador de

electrões)

Aumento do

consumo de

oxigénio

Maior

velocidade

fotossintética

Era o esperado

Quadro 7. Valores de velocidade fotossintética para o viologénio de metilo e do azeto de sódio

Ensaio

Vfotossintética VM

/ nmol O2 min-1 mg-1

Vfotossintética NaN3

/ mol O2 min-1 mg-1

25 μL VM + 50 μL NaN3 258 293

50 μL VM + 50 μL NaN3 373 274

100 μL VM + 50 μL NaN3 291 323


)


Azeto de sódio Inibe o catalase

Impede a

formação de

oxigénio

Pela

degradação

do H2O2

Só há consumo de

oxigénio

Aumento do consumo

de oxigénio com a

presença de azeto

Observou-se

para os ensaios

1 e 3

Não se

observou para

o ensaio 2

Mais VM

Menos NaN3

Actividade do PS I


VM

DCMU

Asc - DCPIP

[O2]

/ m

ol

Vpapel / min

Figura 12. Ensaio da actividade do PS I.

Actividade do PS I


𝑣 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑠𝑠𝑖𝑛𝑡é𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑃𝑆 𝐼𝐼 + 𝑃𝑆 𝐼 =59,5

0,1375= 430 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑂2𝑚𝑖𝑛−1𝑚𝑔−1

𝑣 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑠𝑠𝑖𝑛𝑡é𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑃𝑆 𝐼 =157

0,1375= 1140 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑂2𝑚𝑖𝑛−1𝑚𝑔−1

Antes

DCMU

Quantidade de

O2 consumida é

inferior

Depois

DCMU

Sem

DCMU Não inibição do

PS II

Síntese

O2

Equilíbrio

entre síntese

e consumo de

O2

Actividade do PS I


Síntese de O2

Quando se inibiu o PSII

(com DMCU) apenas se

regista o consumo de O2

e, assim, o declive é mais

acentuado

Figura 12. Transporte electrónico e geração de NADPH e ATP nos cloroplastos. PQ: plastoquinona; PC: plastociana; fd: ferredoxina; DCMU: 3-(3,4-diclorofenilo)-1,1-dimetilureia.

Conclusão


• A velocidade fotossintética aumenta com o aumento da concentração do

reagente de Hill;

• Era de esperar que com o aumento do volume de VM houvesse uma maior

velocidade fotossintética, devido ao aumento do consumo de oxigénio, no

entanto isso não se verificou;

• Com o azeto de sódio é esperado que aumentasse o consumo de oxigénio, no

entanto este facto só se observou para os ensaios 1 e 3;

• A velocidade de consumo é mais acentuada quando apenas se fornece o

substrato ao PS I;

• O método do eléctrodo de oxigénio é mais rigoroso que o método

espectrofotométrico.

Referências


• Lodish, et al. (2008). Molecular Cell Biology, Sixth Edition. New York: W. H. Freeman

and Company.

• Nelson, D., Cox, M. (2008). Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition. New

York: W. H. Freeman and Company.

• Allen, J., & Holmes, N. (1999). Electron transport and redox titration, in Photosynthesis

energy transduction: a practical approach. Oxford: IRL Press.

• Plummer, D. (1987). An Introduction to Practical Biochemistry . London: McGraw-Hill.

III-3. Fotossíntese

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