II. El mRNA bacteriano vs. eucarionte. Inicio de la ... · Inicio de la traducción procarionte. 1. Retomar las últimas diapositivas de la clase pasada (Ribosomas y mRNA) y consultar

TraducciónII. El mRNA bacteriano vs. eucarionte.

Inicio de la traducción procarionte. 1. Retomar las últimas diapositivas de la clase pasada (Ribosomas y mRNA) y consultar el libro GENES IX: p. 132-140; 151-153; p. 161-163

2. Ver generalidades de la Traducción y repasar El inicio de la traducción bacteriano en el libro GENES IX: 153-161

3. Contestar el cuestionario correspondiente a la Clase II que estará disponible en el Classroom.

Antes de la siguiente clase leer en el libro GENES IX la parte correspondiente a inicio de la traducción eucarionte: p. 164-167 (Cap. 8.9).

5’

3’

Mensaje que se debe interpretarLos tRNAs ya están cargados con sus aa.El mRNA ya está sintetizado.

Todos los aa-tRNAs tienen la misma estructura tridimensional.

El mRNA tiene extremos 5’ y 3’ y contiene el marco de lectura abierto ORF. Las secuencias que rodean el ORF son la 5’UTR y la 3’UTR.

El mRNA puede presentar cierta estructura secundaria.

¿Qué diferencias hay entre el mRNA de bacteria y eucarionte?

¿Cómo reconoce el ribosoma por dónde empezar la interpretación?

¿Qué relevancia tienen las regiones 5’UTR y 3’UTR?

Tres posibles marcos de lectura

¿Qué determina cuál es el correcto en un mRNA?

Estructura del RNA mensajero

Alberts et al., 3rd ed.

En Procariontes:

La subunidad 30S reconoce la secuencia Shine-Dalgarno y ubica al AUG en el sitio P

En Eucariontes:

La subunidad 40S es reclutada al 5’ cap lejos del codón de inicio AUG

El marco abierto de lectura lo define el AUG de inicio

Bacteria

Eucariontes

SD: Shine-Dalgarno

Secuencia Kozak

GTPsubunidades ribosomamRNAtRNAi-metfactores de inicio

INICIO de la Traducciónv Se requieren subunidades ribosomales separadasv La subunidad pequeña debe reconocer al mRNAv El tRNA aminoacilado (fmet-tRNAmet o met-tRNA) debe colocarse en la posición P de la subunidad ribosomal pequeñav Ocurre el reconocimiento codón-anticodón de iniciov Ocurre hidrólisis de GTP

50S

30S

IF3

IF3

mRNAAUG5’

3’

S-D

IF3AUG

5’

3’

S-D

Complejos de pre-Inicio (pre-ICs) Procariontes

30S-Pre-IC

En procariontes el factor de inicio IF3 al unirse a la subunidad 30S (sitio E) no permite su re-asociación con la subunidad 50S.

El rRNA 16S, que forma parte de 30S, tiene en su extremo 3’ una secuenciacomplementaria a Shine-Dalgarno (S-D) del mRNA bacteriano. Dado que S-D se encuentra 10 nt hacia el 5’ desde el AUG, el codon de inicio queda ubicado en el sitio P de la subunidad 30S.

Complejos de Inicio (ICs)

IF1

IF2fMet GTP

IF3AUG

5’

3’

S-D30S-Pre-IC

IF3AUG

5’

3’

S-D IF1

IF2fMet GTP

30S-IC

Procariontes

El tRNA iniciador que lleva formil-Metionina (fMet-tRNA) es reconocido por el factor de inicio IF2 unido a GTP.

El factor IF1 se une al sitio A de la subunidad 30S.

Solo queda disponible el sitio P de la subunidad 30S para que se una el complejo ternario fMet-tRNA:IF2:GTP y se produzca una unión estable medianteapareamiento codón-anticodón.

Complejos de Inicio (ICs) Procariontes

50S

IF3AUG

5’

3’

S-D IF1

IF2fMet GTP

30S-IC

IF3AUG

5’

3’

S-D IF1

IF2fMet GTP

AUG5’

3’

S-D

fMetGTPIF2

GDPIF2

IF3

IF1

70S-IC

Una vez que se ha dado el apareamientocorrecto codón-anticodón, se propicia la unión de la subnidad 50S.

Esta unión promueve la hidrólisis de GTP y la disociación de los IFs.

Queda formado el Complejo de Inicio de la Traducción con el fMet-tRNA establemente colocado en el sitio P del ribosoma 70S donde se encuentra el AUG.

Los sitios A y E están disponibles ahora. A partir de aquí el marco de lectura se leerá en el sentido 5’ → 3’ de manera no sobrelapada cada tres nucleótidos.

Papel de los factores de inicio de Traducción

Factor FunciónIF1 Previene unión de

tRNAs en el sitio A de la subunidad 30S

IF2 GTPasa; ComplejoTernario (TC) con fMet-tRNAi

f-Met y GTP

IF3 Evita re-asociación de subunidadesribosomales; Revisa el reconocimiento codon-anticodon

Factor FuncióneIF1 Complejo multi-factor (MFC) con eIF2,

eIF3, eIF5, Met-tRNAiMet;

Reconocimiento codon-anticodon

eIF1A Previene unión de tRNAs en el sitio A de la subunidad 40S

eIF2a Une el Met-tRNAiMet, GTP y la

subunidad 40S en al sitio P formandocomplejo 43S.Subunidad reguladora: a; actividadGTPasa: g; union a eIF5: b

eIF2b

eIF2g

eIF2B(a,b,d) GEF, Intercambia GDP/GTP para eIF2

eIF5 Estimula actividad GTPasa de eIF2. Parte del MFC

eIF5B Analogo IF2. Une eIF1A. ActividadGTPasa en la formación de 80S.

eIF3(9-12 subunidades)

Múltiples subunidades con diferentesfunciones. Parte del MFC

Procariontes Eucariontes

tRNA iniciadorIF2/eIF2GTP

Complejo Ternario (TC)

El ribosoma tiene sitios con función definida para la traducción

Centro peptidiltransferasa (PTC)

Subunidadpequeña

Proteínanaciente

mRNA

Canal de salida para el péptido naciente

Centro decodificador

Sitios A, P, y E para aa-tRNAs

La estructura de ribosomas procariontes y eucariontes es similar porque se han conservado estos sitios y funciones

¿Cómo funciona el ribosoma?

SarcinRicinLoop

Mediante sus rRNAs y sus proteínas

rRNA (gris)Proteínas S (subunidad 30S)Proteínas L (subunidad 50S)

Función Genética: Centro decodificador

Subunidad 30S ó 40S

Nature Reviews | Molecular Cell Biology

a

bC1054

tRNA

G530

mRNA A1492A1493

A1493

A1492G530

G530

C1054 G34

C518

C518S50 (S12)

P48(S12)

A36 A35U1

U2

U3S12

ASLBase pair I Base pair II Base pair III

EF-GElongation factor G (GTPase), known as EF-2 in other kingdoms, binds to the ribosome and promotes tRNA and mRNA translocation powered by GTP hydrolysis.

Stop codonA codon that codes for the end of the message that is recognized by the release factor.

Release factor(RF). A protein factor that recognizes a stop codon in mRNA and catalyses the deacylation of the peptidyl-tRNA.

GTPase centreThe region of the ribosome 50S subunit that includes the sarcin–ricin RNA and stimulates the GTPase activity of elongation factors.

Stem-loopThe structure that is formed when a self-complementary nucleic acid sequence forms a duplex joined by a loop.

Type I A–minor interactionA specific hydrogen-bonding interaction between an A base and a G–C base pair through the minor groove of duplex RNA.

Watson–Crick base pairsThe complementary hydrogen bond between bases A and T (or U) and G and C that form duplex nucleic acids.

genetic and biochemical experiments12 had implicated in decoding — alter their conformations to interact with the anticodon7 (FIG. 2). In the absence of the A site mRNA and anticodon ligands, these three bases point away from the codon–anticodon binding site. However, when the cognate complex between tRNA and mRNA binds to the A site, these three bases reorientate to interact within the minor groove of the three-base-pair helix that is formed by the codons and anticodons.

On codon–anticodon recognition, A1493 makes a type I A–minor interaction13 with a first base pair made by the anticodon with the codon. This interaction consists of three hydrogen bonds between A1493 and the minor groove base pair that is identical for all four Watson–Crick base pairs and is not possible for any non-cognate base pairs. Hence, this interaction in the minor groove not only stabilizes the complex of a Watson–Crick base pair, but this conformational change in A1493 also appears to occur only in the presence of Watson–Crick base pairing7. The orientation and interactions between the anticodon stem-loop of a tRNA bound to the 70S ribo-some and the mRNA codon are observed to be identical to what was seen in the previous complex with the 30S subunit alone5.

The formation of a correct Watson–Crick base pair at the second position of the anticodon is stabilized and detected by a change of conformation (from syn to anti) in G530. This allows G530 to interact with A1492, which in turn forms a type II A–minor interaction with the second codon–anticodon base pair in the minor groove7. As with the type I A–minor interaction, the type II A–minor interaction will work with any of the four Watson–Crick base pairs but not with a non-Watson–Crick base pair. This conformational change in the 16S rRNA and the conformational change that results from the recognition of the first codon–anticodon recognition constitute the first step in a signal that the correct base pairs have been delivered. By contrast, the interactions between a small

subunit with a third base pair in the anticodon helix is significantly less specific, consistent with the observation that wobble base pairs (for example, GU base pairs) can occupy this position.

The importance of the conformational changes that these three bases induce by cognate codon–anticodon interactions is reinforced by the mechanism of action of the antibiotic paromomycin. It induces miscoding errors through binding to the 30S ribosomal subunit and by inducing the same conformational changes in the three bases that are produced by formation of Watson–Crick base pairs at codon positions 1 and 2, even in the presence of mismatches or no bound substrate14.

How the delivery of a correct anticodon is commu-nicated to the GTPase centre15 is partly answered by the observation that global changes in the overall con-formation of the small subunit accompany the local conformational changes that occur in the A site when the small subunit interacts with the cognate codon–anti-codon complex14. The ‘head’ domain of the small subunit rotates towards the large subunit when cognate inter-actions occur at the A site, which results in it clamping down on the tRNA-binding site. Although these con-formational changes do not occur with non-cognate codon–anticodon complexes in the A site, they do occur with non-cognate complexes in the presence of paro-momycin, again suggesting that these conformational changes are functionally significant.

Signalling correct codon–anticodon interactions. The recognition of correct codon–anticodon interactions is communicated to the GTPase centre in the large ribo-somal subunit ~70 Å away. This causes the hydrolysis of GTP on the EF-Tu and its subsequent release, followed by accommodation of tRNA in the A site. The ques-tion arises as to how the conformational changes in the rRNA that were induced by correct codon–anticodon interactions are transmitted. Some tantalizing clues have

Figure 2 | Recognition of codon–anticodon interactions by the ribosome. a | Cartoon of the decoding site of the 30S subunit, showing the codon of mRNA in the A site (purple) and the tRNA anticodon stem-loop (ASL; gold). Crucial bases of the 16S RNA (grey) that bind to and stabilize the tRNA–mRNA complex are shown in red. Protein S12 (orange) is in the area. The magenta spheres are thought to be magnesium ions. b | Details of minor groove recognition at the first (I), second (II) and third (III) base pairs between codon and anticodon. In base pair I, A1493 is shown making a type I A–minor interaction with A36 from the tRNA and U1 from the mRNA. In base pair II, A1492 makes a type II A–minor interaction with A35 and U2 is stabilized by G530. In base pair III, no restrictive interactions are seen with G34 and U3. Figure reproduced with permission from REF. 7 � (2001) American Association for the Advancement of Science.

R E V I E W S

244 | MARCH 2008 | VOLUME 9 www.nature.com/reviews/molcellbio

El centro decodificadorinvolucra al rRNA 16S (proca) o 18S (euca)

Se puede observar en la imagen a la izquierda cómo hay mayor distancia entre la base 3’ del codón y la 5’ del anticodón (posición III, Bamboleo) ubicando G530 del rRNA 16S entre estas dos bases. Mientras, en la posición I, A1493 y en la posición II, A1492 no permiten desapareamientos.

Esto es otro punto de FIDELIDAD en Tradución

Knoops et al. WIREs RNA 2011

Función Enzimática: Centro Peptidil transferasa

Subunidad 50S ó 60SEl centro PTC involucra al rRNA 23S (proca) o 28S (euca)

El canal de salida para el péptido naciente involucra algunas proteínas ribosomales

Función de máquina molecular: Translocación

+Subunidad 30S ó 40S Subunidad 50S ó 60S

Es aquí donde se garantiza el NO SOBRELAPAMIENTO del Códico Genético